RU2811576C1 - Набор олигонуклеотидов для полногеномной амплификации респираторно-синцитиальных вирусов типов А и В - Google Patents
Набор олигонуклеотидов для полногеномной амплификации респираторно-синцитиальных вирусов типов А и В Download PDFInfo
- Publication number
- RU2811576C1 RU2811576C1 RU2023117385A RU2023117385A RU2811576C1 RU 2811576 C1 RU2811576 C1 RU 2811576C1 RU 2023117385 A RU2023117385 A RU 2023117385A RU 2023117385 A RU2023117385 A RU 2023117385A RU 2811576 C1 RU2811576 C1 RU 2811576C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- seq
- rsvbseq
- rsvaseq
- genome
- amplification
- Prior art date
Links
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 title claims abstract description 37
- 230000003321 amplification Effects 0.000 title claims abstract description 29
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 title claims abstract description 29
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 title claims description 14
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 14
- 241001514767 Respiratory syncytial virus type A Species 0.000 claims abstract description 3
- 241000165108 Respiratory syncytial virus type B Species 0.000 claims abstract description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 abstract description 16
- 238000013412 genome amplification Methods 0.000 abstract description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 14
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 11
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 6
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 5
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 5
- 238000012070 whole genome sequencing analysis Methods 0.000 description 5
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 description 4
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 3
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 3
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 description 2
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037798 influenza B Diseases 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 1
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 description 1
- 241000713196 Influenza B virus Species 0.000 description 1
- 241000701076 Macacine alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 206010061603 Respiratory syncytial virus infection Diseases 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 208000037797 influenza A Diseases 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 229960000402 palivizumab Drugs 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 229940125575 vaccine candidate Drugs 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к набору праймеров для амплификации геномов респираторно-синцитиального вируса (РСВ) А и B для последующего секвенирования. Предложен набор, включающий 24 праймера для выявления респираторно-синцитиального вируса типа А и 24 праймера для выявления респираторно-синцитиального вируса типа В. Технический результат состоит в обеспечении возможности эффективной высокоспецифичной полногеномной амплификации респираторно-синцитиального вируса типов А и В для последующего секвенирования. 2 ил., 2 табл.
Description
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к набору праймеров для амплификации геномов респираторно-синцитиального вируса (РСВ) А и B для последующего секвенирования.
Респираторно-синцитиальный вирус (РСВ, RSV) - один из главных патогенов среди респираторных вирусов, приводящих к госпитализации младенцев и детей младшего возраста. Для лечения тяжелых случаев заболевания существует эффективная терапия - моноклональные антитела паливизумаб, однако из-за высокой стоимости, их применение ограничено группами населения, проживающими в условиях с хорошо развитой медицинской помощью, где возможна диагностика заболевания и проведение такой дорогостоящей терапии. На данный момент не существует вакцины, предотвращающей инфицирование РСВ, однако, несколько кандидатных вакцинных препаратов, предназначенные, в том числе для вакцинирования маленьких детей, пожилых людей и беременных женщин находятся на разных стадиях клинических исследований. Вероятно, эффективная безопасная вакцина будет доступна в ближайшем будущем.
Для разработки вакцинных и терапевтических препаратов важно наблюдение за эволюцией вируса, вызывающего инфекцию. Использование данных полногеномного секвенирования помогает создать вакцину с наиболее актуальным составом и оценить возможность ее глобального использования. С помощью наблюдения за вирусами методами полногеномного секвенирования возможно отслеживать распространение вариантов вирусов и контролировать изменения генетического кода вируса. Таким образом, данные секвенирования используются для лучшего понимания того, как вирус может повлиять на общественное здоровье. Полногеномное секвенирование респираторно-синцитиального вируса решает важную задачу предоставления данных для создания эффективных препаратов для предупреждения и лечения инфицирования, вызванного РСВ.
Секвенирование генома вируса требует определенного количества ДНК или РНК для достаточного покрытия и достоверности результатов. Обычно содержание вирусных нуклеиновых кислот в образце низкое, преобладают нуклеиновые кислоты инфицированных клеток и других микроорганизмов. Специфическая амплификация вирусных нуклеиновых кислот помогает увеличить количество вирусной ДНК или РНК до уровня, который можно эффективно секвенировать. Таким образом, амплификация позволяет селективно увеличить количество вирусной ДНК или РНК, исключая при этом другие примеси. Требования к методу полногеномной амплификации вирусных нуклеиновых кислот следующие: праймеры, комплементарные наиболее консервативным участкам генома, оптимизированная эффективная ПЦР всех фрагментов генома, отсутствие неспецифической амплификации. В случае соблюдения данных условий вся последовательность генома будет многократно умножена, и такой образец может быть подготовлен для полногеномного секвенирования с использованием реагентов для приготовления библиотек.
Для решения задачи полногеномного секвенирования респираторно-синцитиального вируса известен подход Langedijk A.C. [1], использованный в исследовании генетического разнообразия РСВ «INFORM». Также опубликована панель олигонуклеотидов для полногеномной амплификации в работе Agoti C.N. [2]. При использовании указанных методов, вирусные геномы амплифицируются в виде четырех-шести перекрывающихся фрагментов, смесь которых в дальнейшем используется для приготовления библиотек для секвенирования.
Однако амплифицирование длинных фрагментов ДНК на матрице вирусной РНК не всегда проходит успешно, особенно для первичных клинических образцов (оро- и назофарингеальные мазки) из-за деградации вирусной РНК. Поэтому при работе с заявляемым набором размер амплифицированных фрагментов не превышает 1,5 тысячи п.о., что позволяет эффективно амплифицировать вирусный геном в случае образцов с частично деградированной РНК.
Размер ампликонов заявляемого набора схож с размером ампликонов общеизвестной панели для полногеномной амплификации SARS-CoV-2 «Midnight», что позволяет решить проблему неудобства использования различных протоколов фрагментации для разных ампликонов в ходе приготовления библиотек для секвенирования. Геном РСВ, амплифицированный при помощи данной панели олигонуклеотидов может быть процессирован по широко используемым для SARS-CoV-2 протоколам без дополнительной оптимизации методов для дальнейшего секвенирования на платформах Illumina, Oxford Nanopore, BGI.
Также преимуществом предлагаемой панели является мультиплексная амплификация - амплификация 12 фрагментов происходит в одной пробирке, в то время как в указанных выше методах предлагается амплифицировать каждый фрагмент генома отдельно. Недавно разработанная методика Dong X [3] решает эту проблему, так как авторы показывают эффективную мультиплексную полногеномную амплификацию, однако, протокол сохраняет недостатки описанных выше протоколов из-за амплификации длинных фрагментов.
Также известен набор оптимизированных зондов и праймеров, а также способы их использования для связывания, обнаружения, дифференциации, выделения и секвенирования вирусов гриппа А; гриппа В и респираторно-синцитиального вируса [4].
Также известна группа праймеров для секвенирования следующего поколения (NGS) и набор для выявления возбудителей респираторных вирусов [5]. Группа праймеров состоит из 594 последовательностей праймеров. Согласно изобретению 594 праймера специально разработаны для геномов вирусов гриппа А, гриппа В, синцитиальных вирусов и новых коронавирусов,
Недостатком данного технического решения является сложность реализации такой панели и высокая вероятность неспецифической амплификации, например, человеческих нуклеиновых кислот. При одновременном использовании такого большого количества олигонуклеотидов (594) значительно возрастает количество возможных комбинаций для их неспецифического попарного отжига. В случаях, когда олигонуклеотиды неспецифично отжигаются достаточно близко (продукт может быть амплифицирован в ходе реакции) на нуклеиновых кислотах образца, происходит нецелевая амплификация. Нецелевая амплификация приводит к нецелевому секвенированию, потере части данных и, следовательно, неоптимальной трате средств.
Технической проблемой является необходимость разработки набора олигонуклеотидов для полногеномной амплификации респираторно-синцитиального вируса типов А и В.
Технический результат состоит в обеспечении возможности эффективной высокоспецифичной полногеномной амплификации респираторно-синцитиального вируса типов А и В для последующего секвенирования.
Технический результат достигается тем, что набор олигонуклеотидов для полногеномной амплификации респираторно-синцитиального вируса типов А и В включает
праймеры для выявления респираторно-синцитиального вируса типа А со следующим нуклеотидным составом:
RSVAseq F1 5’-acgcgaaaaaatgcgtacaacaaac-3’ (SEQ ID NO:1)
RSVAseq F2 5’-aacggagcacaggagacagc-3’ (SEQ ID NO:2)
RSVAseq F3 5’-GtATcaTATCtgTcAAcTCaAtAGAtATaGAagtaaccAAaG-3’ (SEQ ID NO:3)
RSVAseq F4 5’-agatctgaacacacttgaaaatataacaaccac-3’ (SEQ ID NO:4)
RSVAseq F5 5’-ccaccacaaaacaacgccaa-3’ (SEQ ID NO:5)
RSVAseq F6 5’-tggagtcagtgtcttaaccagca-3’ (SEQ ID NO:6)
RSVAseq F7 5’-attcgaggtcattgcttgaatggt-3’ (SEQ ID NO:7)
RSVAseq F8 5’-gaacagactactactactaatttacttaaaaagataataagaagagc-3’ (SEQ ID NO:8)
RSVAseq F9 5’-gagtttcggttgcctaaaaaagtggat-3’ (SEQ ID NO:9)
RSVAseq F10 5’-tggtgatcccaacttgttatatcgaagt-3’ (SEQ ID NO:10)
RSVAseq F11 5’-ctttgatactagccctattaatcgcatattaacaga-3’ (SEQ ID NO:11)
RSVAseq F12 5’-cAATAGcacaTCaCTtTatTGcaTgCTtC-3’ (SEQ ID NO:12)
RSVAseq R1 5’-gattagcatcttctgtgattaataacatgccac-3’ (SEQ ID NO:13)
RSVAseq R2 5’-gcTTtCTTtGaTAattgggcTTgtTccc-3’ (SEQ ID NO:14)
RSVAseq R3 5’-tcctgagtaagggatgatttttgcatttg-3’ (SEQ ID NO:15)
RSVAseq R4 5’-ctgcatatgctgcagggtacaaa-3’ (SEQ ID NO:16)
RSVAseq R5 5’-ctatcacagtttcaatgtttgatatgctgca-3’ (SEQ ID NO:17)
RSVAseq R6 5’-tacaagcagtgcatggggtg-3’ (SEQ ID NO:18)
RSVAseq R7 5’-ccagtttattcaatatagcatagactttgacatcact-3’ (SEQ ID NO:19)
RSVAseq R8 5’-atgtgtgacggcatataatttctaggga-3’ (SEQ ID NO:20)
RSVAseq R9 5’-gcctctgtgaggaaatcaggagttc-3’ (SEQ ID NO:21)
RSVAseq R10 5’-caaatgtatctcattaagcttgggtatgagaataattc-3’ (SEQ ID NO:22)
RSVAseq R11 5’-CCtGCtCCtTCaCCTATgAATGc-3’ (SEQ ID NO:23)
RSVAseq R12 5’-acgagaaaaaaagtgtcaaaaactaatatctcgta-3’ (SEQ ID NO:24)
а также включающий праймеры для выявления респираторно-синцитиального вируса типа B со следующим нуклеотидным составом:
RSVBseq F1 5’-acgcgaaaaaatgcgtactacaaact-3’ (SEQ ID NO:25)
RSVBseq F2 5’-ctgctgtcatccagcaaatacact-3’ (SEQ ID NO:26)
RSVBseq F3 5’-ataacatctggcaccaacattatcaatcc-3’ (SEQ ID NO:27)
RSVBseq F4 5’-accatgaagacattcaaccccac-3’ (SEQ ID NO:28)
RSVBseq F5 5’-gcacaaaaccacgtccaaaaaatccac-3’ (SEQ ID NO:29)
RSVBseq F6 5’-tggggtcagtgttttaaccagc-3’ (SEQ ID NO:30)
RSVBseq F7 5’-tcctcgcatcatgctaccca-3’ (SEQ ID NO:31)
RSVBseq F8 5’-gtgatgtaaaggtgtacgccatcttg-3’ (SEQ ID NO:32)
RSVBseq F9 5’-catctgcctaaaaaagtggatcttgaaatga-3’ (SEQ ID NO:33)
RSVBseq F10 5’-accttttttaatcttgatagtatcgatacggc-3’ (SEQ ID NO:34)
RSVBseq F11 5’-gacattgtgtttcaaaattgcataagttttggt-3’ (SEQ ID NO:35)
RSVBseq F12 5’-CAacTtTAcaccACcaCttCacatCa-3’ (SEQ ID NO:36)
RSVBseq R1 5’-gcatcttcagtgattaatagcataccacatag-3’ (SEQ ID NO:37)
RSVBseq R2 5’-gGgtTTTCTtgggtAgtTggcttT-3’ (SEQ ID NO:38)
RSVBseq R3 5’-agggaataattttagcattggtgatagca-3’ (SEQ ID NO:39)
RSVBseq R4 5’-attgttgccacatatactacagggaac-3’ (SEQ ID NO:40)
RSVBseq R5 5’-ctgctgttcttctgctggaattctataac-3’ (SEQ ID NO:41)
RSVBseq R6 5’-gcgacatatttgccccagctg-3’ (SEQ ID NO:42)
RSVBseq R7 5’-ttcatcacctgaattgttgttgggc-3’ (SEQ ID NO:43)
RSVBseq R8 5’-ggcatgtaatttctaggaaaactagtccatattagatc-3’ (SEQ ID NO:44)
RSVBseq R9 5’-agtctggagttctcctataaaagcttcg-3’ (SEQ ID NO:45)
RSVBseq R10 5’-gacatatgtttgtgaattgttccacaactg-3’ (SEQ ID NO:46)
RSVBseq R11 5’-aGGaAGcAtgCAaTAaAgtGAtgcaCta-3’ (SEQ ID NO:47)
RSVBseq R12 5’-acgagaaaaaaagtgtcaaaaactaatgtctcg-3’ (SEQ ID NO:48)
Заявляемый набор олигонуклеотидов для полногеномной амплификации геномов РСВ А и B для последующего секвенирования. В обоих случаях амплифицируются 12 перекрывающихся фрагментов генома, которые вместе составляют полный геном вируса. Длины амплифицирующихся фрагментов РСВ приведены в таблицах 1 и 2.
| Таблица 1 - Длины амплифицирующихся фрагментов РСВ А | |||||||
| 1 | 1314 | 5 | 1272 | 9 | 1453 | ||
| 2 | 1378 | 6 | 1505 | 10 | 1302 | ||
| 3 | 1389 | 7 | 1255 | 11 | 1484 | ||
| 4 | 1441 | 8 | 1384 | 12 | 1311 | ||
| Таблица 2 - Длины амплифицирующихся фрагментов РСВ В | |||||||
| 1 | 1308 | 5 | 1283 | 9 | 1435 | ||
| 2 | 1409 | 6 | 1410 | 10 | 1330 | ||
| 3 | 1339 | 7 | 1342 | 11 | 1299 | ||
| 4 | 1567 | 8 | 1318 | 12 | 1347 | ||
Из множественного выравнивания 1777 актуальных последовательностей генома RSV A и 1654 последовательностей генома RSV В были получены консенсусы, по котором производилась оценка консервативности участков. Подобранные олигонуклеотиды для полногеномной амплификации комплементарны наиболее консервативным участкам генома, вероятность комплементарности нуклеотидов праймеров консенсусам в большинстве случаев составила >99%
Из-за низкого %GC состава генома РСВ некоторые праймеры имеют GC состав ниже 40%, что в данном случае не влияет на эффективность амплификации, однако влияет на длину праймеров.
Праймеры для амплификации РСВ типа А обеспечивают полногеномную амплификацию всех вариантов РСВ типа А с перекрытием ампликонов в 60-160 оснований (в среднем ≈100 оснований). Длина ампликонов генома РСВ А составляет 1255-1505 п.о. Праймеры для амплификации РСВ типа В обеспечивают полногеномную амплификацию всех вариантов РСВ В с перекрытием ампликонов в 70-190 оснований (в среднем ≈120 оснований). Длина ампликонов генома РСВ В составляет 1283-1567 п.о.
Программа термоциклирования: обратная транскрипция при 45°С - 30 мин, денатурация при 95°С в течение 5 мин, затем 40 циклов при 95°С - 15 с, 60°С - 30 с, 72°С - 30 с. Оптимальное количество олигонуклеотидов на реакцию: 100 nM праймеров. Для амплификации необходимо использовать высокоточную полимеразу.
Заявляемое изобретение поясняется примером.
При использовании предлагаемой панели олигонуклеотидов для полногеномной амплификации удается достичь секвенирования всей последовательности генома РСВ с достаточным покрытием всех его частей. Для полногеномной амплификации вируса РСВ А в ПЦР необходимо одновременно использовать праймеры SEQ ID NO:1 - SEQ ID NO:24. Для полногеномной амплификации генома вируса РСВ В необходимо одновременно использовать праймеры SEQ ID NO:25 - SEQ ID NO:48. Успешная амплификация генома РСВ позволяет многократно увеличить содержание в образце ДНК, комплементарной вирусной РНК, что позволяет многократно прочитать геном вируса и уверенно отличать возникшие в геноме мутации от ошибок секвенирования. Однако, для такой работы необходимо отбирать наилучшие по данным ПЦР образцы - с наименьшим Cq, вне зависимости от набора, выбранного для детекции вируса. Пример покрытия генома отсеквенированного образца РСВ А, амплифицированного с помощью предлагаемой панели олигонуклеотидов для полногеномной амплификации представлен на фиг. 1. Пример покрытия генома отсеквенированного образца РСВ В, амплифицированного с помощью предлагаемой панели олигонуклеотидов для полногеномной амплификации представлен на фиг. 2. Из полученных ампликонов может быть приготовлена библиотека для секвенирования с использованием реагентов “Nextera DNA Flex Library Prep Kit” (Illumina) или аналогичных для последующего секвенирования на приборе Illumina - например, на платформе MiSeq.
Список литературы
1. Langedijk, A. C., Lebbink, R. J., Naaktgeboren, C., Evers, A., Viveen, M. C., Greenough, A., Heikkinen, T., Stein, R. T., Richmond, P., Martinón-Torres, F., Nunes, M., Hosoya, M., Keller, C., Bauck, M., Cohen, R., Papenburg, J., Pernica, J., Hennus, M. P., Jin, H., ... Bont, L. J. (2020). Global molecular diversity of RSV - the "INFORM RSV" study. BMC Infectious Diseases, 20(1), [450]. https://doi.org/10.1186/s12879-020-05175-4.
2. Agoti, C. N., Otieno, J. R., Munywoki, P. K., Mwihuri, A. G., Cane, P. A., Nokes, D. J., Kellam, P., & Cotten, M. (2015). Local evolutionary patterns of human respiratory syncytial virus derived from whole-genome sequencing. Journal of virology, 89(7), 3444-3454. https://doi.org/10.1128/JVI.03391-14.
3. Xiaomin Dong, Yi-Mo Deng, Ammar Aziz, Paul Whitney, Julia Clark, Patrick Harris, Catherine Bautista, Anna-Maria Costa, Gregory Waller, Andrew J Daley, Megan Wieringa, Tony Korman, Ian G. Barr, A simplified, amplicon-based method for whole genome sequencing of human respiratory syncytial viruses, Journal of Clinical Virology, Volume 161, 2023, 105423, ISSN 1386-6532, https://doi.org/10.1016/j.jcv.2023.105423.
4. Оптимизированные зонды и праймеры, а также методы их использования для связывания, обнаружения, дифференциации, выделения и секвенирования гриппа A; грипп B и респираторно-синцитиального вируса: международная заявка WO2014066749, опубл. 01.05.2014.
5. Группа праймеров для секвенирования следующего поколения (NGS) и набор для выявления возбудителей респираторных вирусов: заявка CN113151598, Китайская Народная Республика, заявл. 20.04.2021, опубл. 23.07.2021.
Claims (51)
- Набор олигонуклеотидов для полногеномной амплификации респираторно-синцитиального вируса типов А и В, включающий
- праймеры для выявления респираторно-синцитиального вируса типа А со следующим нуклеотидным составом:
- RSVAseq F1 5’-acgcgaaaaaatgcgtacaacaaac-3’ (SEQ ID NO:1)
- RSVAseq F2 5’-aacggagcacaggagacagc-3’ (SEQ ID NO:2)
- RSVAseq F3 5’-GtATcaTATCtgTcAAcTCaAtAGAtATaGAagtaaccAAaG-3’ (SEQ ID NO:3)
- RSVAseq F4 5’-agatctgaacacacttgaaaatataacaaccac-3’ (SEQ ID NO:4)
- RSVAseq F5 5’-ccaccacaaaacaacgccaa-3’ (SEQ ID NO:5)
- RSVAseq F6 5’-tggagtcagtgtcttaaccagca-3’ (SEQ ID NO:6)
- RSVAseq F7 5’-attcgaggtcattgcttgaatggt-3’ (SEQ ID NO:7)
- RSVAseq F8 5’-gaacagactactactactaatttacttaaaaagataataagaagagc-3’ (SEQ ID NO:8)
- RSVAseq F9 5’-gagtttcggttgcctaaaaaagtggat-3’ (SEQ ID NO:9)
- RSVAseq F10 5’-tggtgatcccaacttgttatatcgaagt-3’ (SEQ ID NO:10)
- RSVAseq F11 5’-ctttgatactagccctattaatcgcatattaacaga-3’ (SEQ ID NO:11)
- RSVAseq F12 5’-cAATAGcacaTCaCTtTatTGcaTgCTtC-3’ (SEQ ID NO:12)
- RSVAseq R1 5’-gattagcatcttctgtgattaataacatgccac-3’ (SEQ ID NO:13)
- RSVAseq R2 5’-gcTTtCTTtGaTAattgggcTTgtTccc-3’ (SEQ ID NO:14)
- RSVAseq R3 5’-tcctgagtaagggatgatttttgcatttg-3’ (SEQ ID NO:15)
- RSVAseq R4 5’-ctgcatatgctgcagggtacaaa-3’ (SEQ ID NO:16)
- RSVAseq R5 5’-ctatcacagtttcaatgtttgatatgctgca-3’ (SEQ ID NO:17)
- RSVAseq R6 5’-tacaagcagtgcatggggtg-3’ (SEQ ID NO:18)
- RSVAseq R7 5’-ccagtttattcaatatagcatagactttgacatcact-3’ (SEQ ID NO:19)
- RSVAseq R8 5’-atgtgtgacggcatataatttctaggga-3’ (SEQ ID NO:20)
- RSVAseq R9 5’-gcctctgtgaggaaatcaggagttc-3’ (SEQ ID NO:21)
- RSVAseq R10 5’-caaatgtatctcattaagcttgggtatgagaataattc-3’ (SEQ ID NO:22)
- RSVAseq R11 5’-CCtGCtCCtTCaCCTATgAATGc-3’ (SEQ ID NO:23)
- RSVAseq R12 5’-acgagaaaaaaagtgtcaaaaactaatatctcgta-3’ (SEQ ID NO:24),
- а также включающий праймеры для выявления респираторно-синцитиального вируса типа B со следующим нуклеотидным составом:
- RSVBseq F1 5’-acgcgaaaaaatgcgtactacaaact-3’ (SEQ ID NO:25)
- RSVBseq F2 5’-ctgctgtcatccagcaaatacact-3’ (SEQ ID NO:26)
- RSVBseq F3 5’-ataacatctggcaccaacattatcaatcc-3’ (SEQ ID NO:27)
- RSVBseq F4 5’-accatgaagacattcaaccccac-3’ (SEQ ID NO:28)
- RSVBseq F5 5’-gcacaaaaccacgtccaaaaaatccac-3’ (SEQ ID NO:29)
- RSVBseq F6 5’-tggggtcagtgttttaaccagc-3’ (SEQ ID NO:30)
- RSVBseq F7 5’-tcctcgcatcatgctaccca-3’ (SEQ ID NO:31)
- RSVBseq F8 5’-gtgatgtaaaggtgtacgccatcttg-3’ (SEQ ID NO:32)
- RSVBseq F9 5’-catctgcctaaaaaagtggatcttgaaatga-3’ (SEQ ID NO:33)
- RSVBseq F10 5’-accttttttaatcttgatagtatcgatacggc-3’ (SEQ ID NO:34)
- RSVBseq F11 5’-gacattgtgtttcaaaattgcataagttttggt-3’ (SEQ ID NO:35)
- RSVBseq F12 5’-CAacTtTAcaccACcaCttCacatCa-3’ (SEQ ID NO:36)
- RSVBseq R1 5’-gcatcttcagtgattaatagcataccacatag-3’ (SEQ ID NO:37)
- RSVBseq R2 5’-gGgtTTTCTtgggtAgtTggcttT-3’ (SEQ ID NO:38)
- RSVBseq R3 5’-agggaataattttagcattggtgatagca-3’ (SEQ ID NO:39)
- RSVBseq R4 5’-attgttgccacatatactacagggaac-3’ (SEQ ID NO:40)
- RSVBseq R5 5’-ctgctgttcttctgctggaattctataac-3’ (SEQ ID NO:41)
- RSVBseq R6 5’-gcgacatatttgccccagctg-3’ (SEQ ID NO:42)
- RSVBseq R7 5’-ttcatcacctgaattgttgttgggc-3’ (SEQ ID NO:43)
- RSVBseq R8 5’-ggcatgtaatttctaggaaaactagtccatattagatc-3’ (SEQ ID NO:44)
- RSVBseq R9 5’-agtctggagttctcctataaaagcttcg-3’ (SEQ ID NO:45)
- RSVBseq R10 5’-gacatatgtttgtgaattgttccacaactg-3’ (SEQ ID NO:46)
- RSVBseq R11 5’-aGGaAGcAtgCAaTAaAgtGAtgcaCta-3’ (SEQ ID NO:47)
- RSVBseq R12 5’-acgagaaaaaaagtgtcaaaaactaatgtctcg-3’ (SEQ ID NO:48).
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2811576C1 true RU2811576C1 (ru) | 2024-01-15 |
Family
ID=
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2460803C2 (ru) * | 2010-10-27 | 2012-09-10 | Российская Федерация, от имени которой выступает Министерство промышленности и торговли Российской Федерации (Минпромторг России) | Способ дифференциальной диагностики респираторных вирусных инфекций методом мультиплексной пцр с детекцией в режиме реального времени и перечень последовательностей для его осуществления |
| CN107058619A (zh) * | 2017-03-10 | 2017-08-18 | 中国农业科学院特产研究所 | 牛呼吸道合胞体病毒nano‑PCR检测试剂盒及其制备方法 |
| RU2021120509A (ru) * | 2018-12-21 | 2023-01-23 | БАЙОНТЕК ЮЭс ИНК. | Способ и системы для прогнозирования специфических для hla класса ii эпитопов и охарактеризации cd4+ t-клеток |
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2460803C2 (ru) * | 2010-10-27 | 2012-09-10 | Российская Федерация, от имени которой выступает Министерство промышленности и торговли Российской Федерации (Минпромторг России) | Способ дифференциальной диагностики респираторных вирусных инфекций методом мультиплексной пцр с детекцией в режиме реального времени и перечень последовательностей для его осуществления |
| CN107058619A (zh) * | 2017-03-10 | 2017-08-18 | 中国农业科学院特产研究所 | 牛呼吸道合胞体病毒nano‑PCR检测试剂盒及其制备方法 |
| RU2021120509A (ru) * | 2018-12-21 | 2023-01-23 | БАЙОНТЕК ЮЭс ИНК. | Способ и системы для прогнозирования специфических для hla класса ii эпитопов и охарактеризации cd4+ t-клеток |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Delwart | Viral metagenomics | |
| AU2015336086C1 (en) | Compositions and methods for detecting an RNA virus | |
| Tao et al. | Application of CRISPR-Cas12a enhanced fluorescence assay coupled with nucleic acid amplification for the sensitive detection of African swine fever virus | |
| Belák | Molecular diagnosis of viral diseases, present trends and future aspects: A view from the OIE Collaborating Centre for the Application of Polymerase Chain Reaction Methods for Diagnosis of Viral Diseases in Veterinary Medicine | |
| Bochkov et al. | Molecular epizootiology of avian infectious bronchitis in Russia | |
| Marcacci et al. | Genome characterization of feline morbillivirus from Italy | |
| KR20180052317A (ko) | 메르스 코로나바이러스 검출용 프라이머 세트 및 이의 용도 | |
| US20180237835A1 (en) | Methods of analyzing virus-derived therapeutics | |
| Radford et al. | Endemic infection of a cat colony with a feline calicivirus closely related to an isolate used in live attenuated vaccines | |
| CA2035471A1 (en) | Techniques for the amplification of nucleic acid | |
| Dabrowska et al. | Efficacy of antiviral drugs against the omicron variant of SARS-CoV-2 | |
| RU2811576C1 (ru) | Набор олигонуклеотидов для полногеномной амплификации респираторно-синцитиальных вирусов типов А и В | |
| Deshpande et al. | Detection of MEF-1 laboratory reference strain of poliovirus type 2 in children with poliomyelitis in India in 2002 & 2003 | |
| Chittoor-Vinod | Molecular biology of PCR testing for COVID-19 diagnostics | |
| WO1996025909A2 (es) | Procedimientos de amplificacion de genoma y mezclas de oligonucleotidos iniciadores para la deteccion y la identificacion de agentes infecciosos relacionados | |
| US7361747B2 (en) | Isolation and characterization of the precursor virus of human SARS virus: SARS-associated corona virus-like virus | |
| ES2676245T3 (es) | Cebadores y procedimientos para detectar variantes del virus de la hepatitis C (VHC) humano en una muestra aislada | |
| KR101617142B1 (ko) | 개선된 검출 정확성을 제공해 줄 수 있는 핵산검사 기반의 조류 인플루엔자 바이러스 검출 키트 | |
| RU2694499C1 (ru) | Тест-система для обнаружения генома возбудителя коронавирусной инфекции у крупного рогатого скота с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени | |
| FI95398B (fi) | Menetelmä ihmisen nuhaviruksen serotyypittämiseksi | |
| Warneford-Thomson et al. | COV-ID: A LAMP sequencing approach for high-throughput co-detection of SARS-CoV-2 and influenza virus in human saliva | |
| EP3066216A1 (en) | Hcv genotyping algorithm | |
| Sabri et al. | Genetic variants of COVID-19 and vaccination. Is there a Correlation? | |
| Pereira | An Automated Strategy to Handle Antigenic Variability in Immunisation Protocols, Part I: Nanopore Sequencing of Infectious Agent Variants | |
| Doerr | Replacement of biologic by molecular techniques in diagnostic virology: Thirty years after the advent of PCR technology—do we still need conventional methods? |