RU2807923C1 - Method of female fertility diagnostics - Google Patents
Method of female fertility diagnostics Download PDFInfo
- Publication number
- RU2807923C1 RU2807923C1 RU2023104412A RU2023104412A RU2807923C1 RU 2807923 C1 RU2807923 C1 RU 2807923C1 RU 2023104412 A RU2023104412 A RU 2023104412A RU 2023104412 A RU2023104412 A RU 2023104412A RU 2807923 C1 RU2807923 C1 RU 2807923C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- nad
- concentration
- follicular fluid
- eggs
- fertility
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 27
- 230000035558 fertility Effects 0.000 title claims abstract description 13
- 210000001733 follicular fluid Anatomy 0.000 claims abstract description 21
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 21
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 claims abstract description 3
- VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N n'-amino-n-iminomethanimidamide Chemical compound N\N=C\N=N VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N 0.000 claims abstract description 3
- BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N renifolin D Natural products CC(=C)[C@@H]1Cc2c(O)c(O)ccc2[C@H]1CC(=O)c3ccc(O)cc3O BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N 0.000 claims abstract description 3
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-O NAD(+) Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-O 0.000 claims abstract 5
- 125000003831 tetrazolyl group Chemical group 0.000 claims abstract 2
- 229950006238 nadide Drugs 0.000 claims description 15
- 238000005070 sampling Methods 0.000 claims description 2
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 abstract description 11
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 abstract description 10
- 230000032683 aging Effects 0.000 abstract description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 6
- 230000007170 pathology Effects 0.000 abstract description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 230000033616 DNA repair Effects 0.000 abstract description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 abstract description 2
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 abstract 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 description 16
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 16
- 231100000535 infertility Toxicity 0.000 description 16
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 14
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N NAD zwitterion Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 13
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 10
- 208000007984 Female Infertility Diseases 0.000 description 9
- 206010021928 Infertility female Diseases 0.000 description 9
- 230000003325 follicular Effects 0.000 description 7
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 5
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 4
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 4
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 4
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 4
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 4
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 4
- 208000012404 paroxysmal familial ventricular fibrillation Diseases 0.000 description 4
- 208000002500 Primary Ovarian Insufficiency Diseases 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 230000027758 ovulation cycle Effects 0.000 description 3
- 206010036601 premature menopause Diseases 0.000 description 3
- 208000017942 premature ovarian failure 1 Diseases 0.000 description 3
- DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N Nicotinamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 2
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 2
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 2
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000000423 cell based assay Methods 0.000 description 2
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000011990 functional testing Methods 0.000 description 2
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 208000021267 infertility disease Diseases 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000004899 motility Effects 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 230000016087 ovulation Effects 0.000 description 2
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 2
- 230000009933 reproductive health Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 2
- 102000014777 Adipokines Human genes 0.000 description 1
- 108010078606 Adipokines Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000012673 Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010079345 Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 description 1
- 208000001145 Metabolic Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 1
- 206010033266 Ovarian Hyperstimulation Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 201000000690 abdominal obesity-metabolic syndrome Diseases 0.000 description 1
- 239000000478 adipokine Substances 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 210000003756 cervix mucus Anatomy 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000000857 drug effect Effects 0.000 description 1
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 1
- 210000004696 endometrium Anatomy 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 231100000502 fertility decrease Toxicity 0.000 description 1
- 229940028334 follicle stimulating hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000005802 health problem Effects 0.000 description 1
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 1
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000003771 laboratory diagnosis Methods 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 229960003966 nicotinamide Drugs 0.000 description 1
- 235000005152 nicotinamide Nutrition 0.000 description 1
- 239000011570 nicotinamide Substances 0.000 description 1
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 1
- 230000004796 pathophysiological change Effects 0.000 description 1
- 210000004197 pelvis Anatomy 0.000 description 1
- 230000007425 progressive decline Effects 0.000 description 1
- 230000025915 regulation of apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 210000004994 reproductive system Anatomy 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 238000011121 vaginal smear Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- -1 β-FGF Chemical compound 0.000 description 1
Abstract
Description
Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно к лабораторным методам исследования в области биохимии, патологической физиологии, репродуктивной медицине.The present invention relates to medicine, namely to laboratory research methods in the field of biochemistry, pathological physiology, and reproductive medicine.
Одной из важнейших проблем здравоохранения остается бесплодие. В мире от бесплодия страдает 12-15% супружеских пар, т.е. проблема является глобальной и затрагивает, по некоторым оценкам, до 90 миллионов человек. В большинстве случаев механизмом развития женского бесплодия является нарушение овуляции, что составляет 25% известных причин женского бесплодия. В современном мире вспомогательные репродуктивные технологии (ВРТ) решают глобальную проблему - рождение желанных детей у пациенток с нарушенной фертильностью. К сожалению, яичники уже при рождении девочки имеют фиксированное количество ооцитов, которые постепенно истощаются в течение всей репродуктивной жизни, в отличие от мужчин, где репродуктивное здоровье может сохраниться до глубокой старости. Практически репродуктивный возраст женщин начинает угасать в возрасте 35 лет и заканчивается истощением фолликулов в пределах 53-55 лет, что приводит к прогрессирующему уменьшению яичников, фолликулярного резерва, сопровождающихся снижением количества и качества ооцитов. Несмотря на достижения в области репродуктивной медицины, остается сложной задачей для диагностики и лечения женского бесплодия. В России число женщин с первичным бесплодием за последние 20 лет увеличилось в 1,9 раза. Одним из важных признаков первичного женского бесплодия является неспособность женщины забеременеть в течение одного года активной половой жизни, без применения контрацепции.Infertility remains one of the most important health problems. In the world, 12-15% of married couples suffer from infertility, i.e. the problem is global and affects up to 90 million people, according to some estimates. In most cases, the mechanism of development of female infertility is a violation of ovulation, which accounts for 25% of the known causes of female infertility. In the modern world, assisted reproductive technologies (ART) solve a global problem - the birth of desired children in patients with impaired fertility. Unfortunately, already at birth, a girl’s ovaries have a fixed number of oocytes, which are gradually depleted throughout their reproductive life, in contrast to men, where reproductive health can persist into old age. In practice, the reproductive age of women begins to fade at the age of 35 and ends with the depletion of follicles within 53-55 years, which leads to a progressive decrease in the ovaries and follicular reserve, accompanied by a decrease in the quantity and quality of oocytes. Despite advances in reproductive medicine, the diagnosis and treatment of female infertility remains a challenge. In Russia, the number of women with primary infertility has increased 1.9 times over the past 20 years. One of the important signs of primary female infertility is the inability of a woman to become pregnant within one year of active sexual activity, without the use of contraception.
В этой связи актуальна разработка и внедрение передовых технологий, направленных на совершенствование методов лабораторной диагностики бесплодия. Никотинамидным коферментам (никотинамидадениндинуклеотиду окисленному и восстановленному - НАД+ и НАДН) принадлежит уникальная роль в формировании, созревании, старении ооцитов, что определяет репродуктивное здоровье женщин. Качество яичников важно для формирования общей фертильности женщины.In this regard, the development and implementation of advanced technologies aimed at improving methods for laboratory diagnosis of infertility is relevant. Nicotinamide coenzymes (oxidized and reduced nicotinamide adenine dinucleotide - NAD + and NADH) play a unique role in the formation, maturation, and aging of oocytes, which determines the reproductive health of women. The quality of the ovaries is important for a woman’s overall fertility.
Одним из критериев диагностики женского бесплодия является функциональные тесты: измерение базальной температуры, гистологические исследования влагалищных мазков и эндометрия, измерение вязкости цервикальной слизи. Они позволяют косвенно судить о характере гормональной секреции яичников и процессов овуляции [К.Н. Жмакин и др. Гинекологическая эндокринология, М., стр. 186., 1980].One of the criteria for diagnosing female infertility is functional tests: measurement of basal temperature, histological examination of vaginal smears and endometrium, measurement of cervical mucus viscosity. They allow us to indirectly judge the nature of hormonal secretion of the ovaries and ovulation processes [K.N. Zhmakin et al. Gynecological endocrinology, M., p. 186., 1980].
Функциональные тесты имею свои недостатки:Functional tests have their drawbacks:
1. Тесты носят лишь ориентировочный характер, и не дают возможности выявить функциональные и патофизиологические изменения в самих яйцеклетках.1. Tests are only indicative and do not make it possible to identify functional and pathophysiological changes in the eggs themselves.
2. Субъективный характер, низкая точность.2. Subjective nature, low accuracy.
3. Данные тесты используются при формировании групп женщин для дальнейшего углубленного исследования.3. These tests are used to form groups of women for further in-depth research.
Известен способ оценки состояния овариального резерва яичников, характеризующийся тем, что осуществляют трансвагинальную 2D-эхографию яичников с цветовым допплеровским картированием кровотока артерий стромы яичников. Определяется пульсаторный индекс и индекс резистентности для правого и левого яичников. Дополнительно рассчитывают отношение пульсаторного индекса к индексу резистентности для каждого яичника. Если отношение пульсаторного индекса к индексу резистентности для каждого яичника < 1.8, то диагностируют нормальный овариальный резерв яичников. Если отношение пульсаторного индекса к индексу резистентности для одного яичника или для каждого из них составляет ≥ 1.8, то диагностируют сниженный овариальный резерв яичников [патент RU 2646572, 2018].There is a known method for assessing the state of the ovarian reserve of the ovaries, characterized by the fact that transvaginal 2D echography of the ovaries is performed with color Doppler mapping of the blood flow of the arteries of the ovarian stroma. The pulsator index and resistance index are determined for the right and left ovaries. Additionally, the ratio of the pulsatory index to the resistance index is calculated for each ovary. If the ratio of the pulsatory index to the resistance index for each ovary is <1.8, then normal ovarian reserve is diagnosed. If the ratio of the pulsatory index to the resistance index for one ovary or for each of them is ≥ 1.8, then a reduced ovarian reserve is diagnosed [patent RU 2646572, 2018].
Недостаток данного способа - даже в случае сниженного овариального резерва, значения пульсаторного индекса и индекс резистентности могут находиться в пределах нормы, в связи с чем, не всегда по этим допплерометрическим критериям возможно оценить состояние овариального резерва.The disadvantage of this method is that even in the case of reduced ovarian reserve, the values of the pulsatory index and the resistance index may be within normal limits, and therefore, it is not always possible to assess the state of the ovarian reserve using these Doppler criteria.
Известен способ диагностики преждевременной недостаточности яичников. Проводится измерение фолликулостимулирующего гормона в сыворотке крови на 2-3 день менструального цикла, считают количество антральных фолликулов при проведении ультразвукового исследования яичников на 1-7 дни менструального цикла. Проводят вычисление нового индекса P=F/G, где Р - индекс морфофункционального состояния овариального резерва, F - суммарное количество антральных фолликулов во всем объеме яичников, G - концентрация ФСГ в сыворотке крови в мМЕд/мл, при значениях которого менее 2,2 диагностируют снижение овариального резерва и преждевременную недостаточность яичников [патент RU 2750159, 2021]. Способ позволяет на доклинической стадии выявить молодых женщин, угрожаемых по преждевременному истощению яичников, устранить необоснованное медикаментозное воздействие на организм пациенток с отсутствием перспективы естественного зачатия при снижении затрат на лечение бесплодия.There is a known method for diagnosing premature ovarian failure. Follicle-stimulating hormone is measured in the blood serum on days 2-3 of the menstrual cycle, and the number of antral follicles is counted during an ultrasound examination of the ovaries on days 1-7 of the menstrual cycle. A new index P=F/G is calculated, where P is the index of the morphofunctional state of the ovarian reserve, F is the total number of antral follicles in the entire volume of the ovaries, G is the concentration of FSH in the blood serum in mIU/ml, with values less than 2.2 diagnosing decreased ovarian reserve and premature ovarian failure [patent RU 2750159, 2021]. The method allows, at the preclinical stage, to identify young women at risk of premature ovarian failure, to eliminate unjustified drug effects on the body of patients with no prospect of natural conception while reducing the cost of infertility treatment.
Недостатками данного технического решения являются:The disadvantages of this technical solution are:
1. Данный способ ориентирован на пациенток в возрасте до 40 лет.1. This method is aimed at patients under the age of 40 years.
2. Основывается на пороговых значениях ключевых характеристик состояния репродуктивных значений обследуемых пациенток.2. Based on threshold values of key characteristics of the reproductive status of the examined patients.
Наиболее близким аналогом изобретения является способ прогнозирования исходов программы ЭКО и ПЭ, сущность которого заключается в следующем: в фолликулярной жидкости определяют содержание ФНО-α и β-ФРФ. В дальнейшем рассчитывают прогностический индекс (ПИ) по формуле: ПИ=0,0027⋅Х+Y⋅(+8,9626⋅10-7⋅Y-3,0827⋅10-6⋅X)-0,1448, где X - количество ФНО-α, Y - количество β-ФРФ. Получение результата меньше, чем 0,3038 свидетельствует о благоприятном прогнозе для оплодотворения in vivo. При значении равном или большем, чем 0,3038 прогнозируют неблагоприятный исход оплодотворения in vivo [патент RU 2273031, 2006].The closest analogue of the invention is a method for predicting the outcomes of an IVF and ET program, the essence of which is as follows: the content of TNF-α and β-FGF is determined in the follicular fluid. Subsequently, the prognostic index (PI) is calculated using the formula: PI=0.0027⋅X+Y⋅(+8.9626⋅10-7⋅Y-3.0827⋅10-6⋅X)-0.1448, where X - the amount of TNF-α, Y - the amount of β-FGF. A result less than 0.3038 indicates a favorable prognosis for in vivo fertilization. If the value is equal to or greater than 0.3038, an unfavorable outcome of fertilization in vivo is predicted [patent RU 2273031, 2006].
Недостатками прототипа являются:The disadvantages of the prototype are:
1. ФНО-α и β-ФРФ могут содержаться не только в фолликулярной жидкости, но и образуются лейкоцитами, в частности нейтрофилами, моноцитами, лимфоцитами.1. TNF-α and β-FGF can be contained not only in follicular fluid, but are also formed by leukocytes, in particular neutrophils, monocytes, and lymphocytes.
2. Воспалительный процесс при заболеваниях малого таза приводит к естественному увеличению этих показателей. Возникает сложность интерпретации полученных результатов.2. The inflammatory process in diseases of the pelvis leads to a natural increase in these indicators. It becomes difficult to interpret the results obtained.
3. При ожирении жировая ткань выполняет функцию эндокринного органа. Жировая ткань непосредственно принимает участие в формировании метаболического синдрома, за счет адипокинов, цитокинов, в том числе ФНО-α и факторов роста, в том числе и β-ФРФ, что в свою очередь, ограничивает эффективность применения данного метода для прогноза исхода ЭКО.3. In obesity, adipose tissue performs the function of an endocrine organ. Adipose tissue is directly involved in the formation of metabolic syndrome, due to adipokines, cytokines, including TNF-α and growth factors, including β-FGF, which in turn limits the effectiveness of this method for predicting the outcome of IVF.
Хронологический возраст является наиболее важным предиктором скорости репродуктивного старения женщин. У женщин с бесплодием неясного генеза, которым применяются ВРТ, может наблюдаться слабый или преувеличенный ответ, низкое качество яйцеклеток, синдром гиперстимуляции яичников, а также изменения в структуре метаболитов фолликулярной жидкости.Chronological age is the most important predictor of the rate of reproductive aging in women. Women with unexplained infertility who undergo ART may experience a weak or exaggerated response, poor egg quality, ovarian hyperstimulation syndrome, and changes in the structure of follicular fluid metabolites.
Задачей изобретения является разработка способа диагностики фертильности ооцитов при женском бесплодии на основе определения уровня НАД+, позволяющего выявить нарушения окислительно-восстановительных процессов в яйцеклетках, в том числе сопряженных с патологией ооцитов, репарацией ДНК, регуляцией апоптоза и ранним старением яйцеклеток.The objective of the invention is to develop a method for diagnosing oocyte fertility in female infertility based on determining the level of NAD + , which makes it possible to identify disturbances in redox processes in eggs, including those associated with oocyte pathology, DNA repair, regulation of apoptosis and early aging of eggs.
Технический результат при использовании способа - повышение точности и специфичности диагностики за счет оценки редокс-потенциала в ооцитах и раннего старения яйцеклеток, упрощение способа.The technical result when using the method is to increase the accuracy and specificity of diagnosis by assessing the redox potential in oocytes and early aging of eggs, simplifying the method.
Предлагаемый способ диагностики женской фертильности осуществляется следующим образом: образцы яйцеклеток получают путем трансвагинальной пункции. На гинекологическом кресле проводят забор фолликулярной жидкости с использованием влагалищного датчика и установленной на нем специальной насадки для пункционной иглы. Весь период забора проводят строго под контролем ультразвукового аппарата «Voluson Е8», с применением трансвагинального 4D-датчика. Фолликулярную жидкость аспирируют с помощью вакуум отсоса под давлением 80 мм рт. ст. Сбор аспирированной фолликулярной жидкости проводят в стерильные разовые пробирки. Полученную фолликулярную жидкость передают эмбриологу для идентификации и выделения из нее ооцитов.The proposed method for diagnosing female fertility is carried out as follows: egg samples are obtained by transvaginal puncture. On a gynecological chair, follicular fluid is collected using a vaginal sensor and a special attachment for a puncture needle installed on it. The entire sampling period is carried out strictly under the control of the Voluson E8 ultrasound device, using a transvaginal 4D sensor. Follicular fluid is aspirated using vacuum suction under a pressure of 80 mmHg. Art. The collection of aspirated follicular fluid is carried out in sterile disposable tubes. The resulting follicular fluid is transferred to the embryologist for identification and isolation of oocytes from it.
Для измерения концентрации НАД+ в фолликулярной жидкости используют колориметрический метод (NAD/NADH Cell-Based Assay Kit, Cayman Chemical, США) на 96-луночном планшетном анализаторе, способном измерять оптическую плотность при 450 нм в соответствии с инструкцией производителя. Фолликулярную жидкость инкубируют при температуре 37°С, центрифугируют в объеме не менее 300 мкл в течение 10-15 минут, надосадочную жидкость в объеме 100 мкл переносят в 96-луночный планшет. Каждую реакцию проводят в двух репликах. После промывки и лизиса 100 мкл супернатанта переносят в соответствующие лунки планшета. После инкубации в течение 30 мин с реагентом - солями тетразолия измеряют оптическую плотность каждого образца при длине волны 450 нм, затем определяют концентрацию восстановленного формазана, по которой рассчитывают концентрацию никотинамидадениндинуклеотида окисленного НАД+ в клеточном лизате [Kit Booklet NAD/NADH Cell-Based Assay Kit, Cayman Chemical, 2017]. При значении концентрации НАД+ в интервале, равном 56-76 нмоль/мг белка фолликулярной жидкости, диагностируют фертильность ооцитов.To measure the concentration of NAD + in follicular fluid, a colorimetric method (NAD/NADH Cell-Based Assay Kit, Cayman Chemical, USA) is used on a 96-well plate analyzer capable of measuring optical density at 450 nm in accordance with the manufacturer's instructions. Follicular fluid is incubated at a temperature of 37°C, centrifuged in a volume of at least 300 μl for 10-15 minutes, the supernatant in a volume of 100 μl is transferred into a 96-well plate. Each reaction is carried out in two replicates. After washing and lysis, 100 μl of the supernatant is transferred to the appropriate wells of the plate. After incubation for 30 min with the reagent - tetrazolium salts, the optical density of each sample is measured at a wavelength of 450 nm, then the concentration of reduced formazan is determined, from which the concentration of nicotinamide adenine dinucleotide oxidized NAD + in the cell lysate is calculated [Kit Booklet NAD/NADH Cell-Based Assay Kit , Cayman Chemical, 2017]. When the NAD + concentration is in the range of 56-76 nmol/mg follicular fluid protein, oocyte fertility is diagnosed.
Разработанный способ диагностики рекомендуется применять для оценки женской фертильности в клинической гинекологии, репродуктологии как эффективный дополнительный метод диагностики женского бесплодия неясной этиологии. Данный метод позволяет определить энергетический потенциал ооцитов и прогнозировать раннее старение ооцитов со снижением процесса фертилизации, а также о возможном прогнозе при оплодотворении и особенности проведении ЭКО у пациенток.The developed diagnostic method is recommended for use in assessing female fertility in clinical gynecology and reproductive medicine as an effective additional method for diagnosing female infertility of unknown etiology. This method allows us to determine the energy potential of oocytes and predict early aging of oocytes with a decrease in the fertilization process, as well as a possible prognosis for fertilization and the specifics of IVF in patients.
Предлагаемым способом была проведена оценка фертильности у 20 фертильных и 45 бесплодных женщин. Анализ результатов показал достоверные изменения в показателях фолликулярной жидкости и концентрации НАД+ у обследованных пациентов по возрастным категориям (таблица). Если показатели не входят в диапазон референсных значений, то отмечается высокая вероятность снижения оплодотворяющей способности ооцитов.Using the proposed method, fertility was assessed in 20 fertile and 45 infertile women. Analysis of the results showed significant changes in follicular fluid and NAD + concentrations in the examined patients by age category (table). If the indicators are not within the range of reference values, then there is a high probability of a decrease in the fertilizing ability of oocytes.
Сущность изобретения поясняется следующими клиническими примерами.The essence of the invention is illustrated by the following clinical examples.
Пример 1.Example 1.
Супружеская пара Н. обратилась в клинику ВРТ «Семья» г. Уфы по поводу первичного бесплодия в течение 2 лет. Возраст супруги 28 лет, супруга 29 лет. При проведении обследования при стандартном лабораторном исследовании эякулята не было выявлено отклонений от нормы, эякулят оценивался как фертильный. У супруги при обследовании патология: Спаечная болезнь органов малого таза. Вторичное бесплодие. При проведении обследования ооциотов у супруги концентрация НАД+ составила 76 нмоль/мг белка.Married couple N. turned to the ART clinic “Semya” in Ufa regarding primary infertility for 2 years. The age of the wife is 28 years, the wife is 29 years old. During the examination, a standard laboratory study of the ejaculate revealed no deviations from the norm; the ejaculate was assessed as fertile. During examination, the wife had a pathology: Adhesive disease of the pelvic organs. Secondary infertility. When examining oocytes, the wife's NAD + concentration was 76 nmol/mg protein.
Заключение: Спаечная болезнь органов малого таза. Вторичное бесплодие. У супруга: нормозооспермия. Фолликулярный резерв яичников не нарушен. В результате культивирования ооцитов были получены эмбрионы и осуществлен их перенос.Conclusion: Adhesive disease of the pelvic organs. Secondary infertility. My husband has normozoospermia. The follicular reserve of the ovaries is not impaired. As a result of oocyte cultivation, embryos were obtained and their transfer was carried out.
Пример 2.Example 2.
Супружеская пара Г. обратилась в клинику ВРТ «Семья» г. Уфы по поводу первичного бесплодия в течение 2-х лет. Возраст супруги 26 лет, супруга 32 года. При проведении обследования эякулята супруга, эякулят оценивают как инфертильный. Женский фактор трубное бесплодие. Результат проведенного анализа уровня НАД+ фолликулярной жидкости составил 56 нмоль/мг белка. У супруга при стандартном лабораторном исследовании эякулята не было выявлено отклонений от нормы: показатель подвижности составил 48% (категория А - 31%, категория В - 17%), показатель сперматозоидов с нормальной морфологией 27%, концентрация 46 млн/мл.Married couple G. turned to the ART clinic “Semya” in Ufa regarding primary infertility for 2 years. The age of the wife is 26 years, the wife is 32 years old. When examining the spouse's ejaculate, the ejaculate is assessed as infertile. Female factor tubal infertility. The result of the analysis of the level of NAD + follicular fluid was 56 nmol/mg protein. The husband's standard laboratory examination of the ejaculate revealed no abnormalities: the motility rate was 48% (category A - 31%, category B - 17%), the rate of sperm with normal morphology was 27%, the concentration was 46 million/ml.
Заключение: Женский фактор трубное бесплодие. Фолликулярный резерв яичников у пациентки не нарушен. В результате культивирования ооцитов были получены эмбрионы и осуществлен их перенос.Conclusion: Female factor tubal infertility. The patient's ovarian follicular reserve is not impaired. As a result of oocyte cultivation, embryos were obtained and their transfer was carried out.
Пример 3.Example 3.
Супружеская пара Б. обратилась в клинику ВРТ «Семья» г. Уфы по поводу бесплодия в течение 2 лет. Возраст супруги 40 лет, супруга 38 лет. Менструальный цикл регулярный. У супруга при стандартном лабораторном исследовании эякулята не было выявлено отклонений от нормы: показатель подвижности составил 46% (категория А - 30%, категория В - 16%), показатель сперматозоидов с нормальной морфологией 25%, концентрация 44 млн/мл. У женщины патологии со стороны репродуктивной системы не было выявлены.Married couple B. turned to the Semya ART clinic in Ufa about infertility for 2 years. The age of the wife is 40 years, the husband is 38 years old. The menstrual cycle is regular. The husband's standard laboratory examination of the ejaculate revealed no abnormalities: the motility rate was 46% (category A - 30%, category B - 16%), the rate of sperm with normal morphology was 25%, the concentration was 44 million/ml. No pathologies of the reproductive system were identified in the woman.
Результат проведенного анализа уровень НАД+ в фолликулярной жидкости составил 46 нмоль/мг белка. На основании полученных данных диагностируется снижение фолликулярного резерва яичников, фертильность ооцитов снижена. В результате культивирования ооцитов эмбрионы не были получены.The result of the analysis, the level of NAD + in the follicular fluid was 46 nmol/mg protein. Based on the data obtained, a decrease in the ovarian follicular reserve is diagnosed, and oocyte fertility is reduced. No embryos were obtained as a result of oocyte culture.
Пример 4.Example 4.
Супружеская пара Н. обратилась в клинику ВРТ г. Уфы по поводу первичного бесплодия в течение 5 лет. Возраст супруги 33 лет, супруга 28 года. При проведении обследования эякулята супруга, эякулят оценивают как фертильный. У супруги при обследовании выявлена патология женского бесплодия воспалительного происхождения (хронического сальпингоофоритат).Married couple N. turned to the ART clinic in Ufa regarding primary infertility for 5 years. The age of the wife is 33 years, the wife is 28 years old. When examining the spouse's ejaculate, the ejaculate is assessed as fertile. An examination of the wife revealed a pathology of female infertility of inflammatory origin (chronic salpingoophoritis).
При проведении обследования фолликулярной жидкости у супруги концентрация НАД+ составила 81,2 нмоль/мг белка. Диагностируется у пациентки снижение фолликулярного резерва.When examining the follicular fluid of the wife, the NAD + concentration was 81.2 nmol/mg protein. The patient is diagnosed with decreased follicular reserve.
Заключение: Диагностирован женский фактор бесплодия - хронический сальпингоофорит, фолликулярный резерв яичников снижен. У супруга нормоспермия. В результате культивирования ооцитов не произошло, эмбрионы получены не были.Conclusion: The female factor of infertility was diagnosed - chronic salpingoophoritis, the follicular reserve of the ovaries was reduced. My husband has normospermia. As a result of oocyte cultivation, no embryos were obtained.
Таким образом, приведенные примеры демонстрируют, что предлагаемый метод определения НАД+ позволяет выявить фолликулярный резерв яйцеклеток, репродуктивный потенциал обследуемых женщин, связанных с женским фактором бесплодия неясной этиологии и неудачными исходами ВРТ.Thus, the above examples demonstrate that the proposed method for determining NAD + allows us to identify the follicular reserve of eggs, the reproductive potential of the examined women associated with female factor infertility of unknown etiology and unsuccessful outcomes of ART.
Преимущества заявляемого метода:Advantages of the proposed method:
1. Данный метод является эффективным биомаркером диагностики идиопатического женского бесплодия, а также перспективным предиктором позитивного/негативного исхода ЭКО.1. This method is an effective biomarker for diagnosing idiopathic female infertility, as well as a promising predictor of positive/negative IVF outcome.
2. На основе данного метода возможен первичный скрининг образцов фолликулярной жидкости, определение потенциала фертильности во время репродуктивного старения женщин.2. Based on this method, primary screening of follicular fluid samples and determination of fertility potential during reproductive aging of women is possible.
Claims (1)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2807923C1 true RU2807923C1 (en) | 2023-11-21 |
Family
ID=
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU724127A1 (en) * | 1977-02-10 | 1980-03-30 | Всесоюзный Научно-Исследовательский Институт Акушерства И Гинекологии | Ovary function determining method |
| RU2367949C1 (en) * | 2008-04-03 | 2009-09-20 | Любовь Фёдоровна Курило | Diagnostic technique for reproductive ovarian potency |
| RU2625723C1 (en) * | 2016-08-08 | 2017-07-18 | Общество с ограниченной ответственностью "ЦЕНТР РЕПРОДУКЦИИ ЧЕЛОВЕКА И ЭКО" | Method of pre-clinical diagnostics of premature of ovarians in women of reproductive age |
| RU2639917C1 (en) * | 2016-06-24 | 2017-12-25 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства имени В.Н. Городкова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method for ovarian reserve evaluation in prematurely-born teenage girls |
| US20200340059A1 (en) * | 2015-10-19 | 2020-10-29 | Celmatix Inc. | Methods and systems for assessing infertility as a result of declining ovarian reserve and function |
| RU2791586C1 (en) * | 2022-03-18 | 2023-03-10 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Уральский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО УГМУ Минздрава России) | Method for assessing the risk of premature reduction of ovarian reserve |
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU724127A1 (en) * | 1977-02-10 | 1980-03-30 | Всесоюзный Научно-Исследовательский Институт Акушерства И Гинекологии | Ovary function determining method |
| RU2367949C1 (en) * | 2008-04-03 | 2009-09-20 | Любовь Фёдоровна Курило | Diagnostic technique for reproductive ovarian potency |
| US20200340059A1 (en) * | 2015-10-19 | 2020-10-29 | Celmatix Inc. | Methods and systems for assessing infertility as a result of declining ovarian reserve and function |
| RU2639917C1 (en) * | 2016-06-24 | 2017-12-25 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства имени В.Н. Городкова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method for ovarian reserve evaluation in prematurely-born teenage girls |
| RU2625723C1 (en) * | 2016-08-08 | 2017-07-18 | Общество с ограниченной ответственностью "ЦЕНТР РЕПРОДУКЦИИ ЧЕЛОВЕКА И ЭКО" | Method of pre-clinical diagnostics of premature of ovarians in women of reproductive age |
| RU2791586C1 (en) * | 2022-03-18 | 2023-03-10 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Уральский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО УГМУ Минздрава России) | Method for assessing the risk of premature reduction of ovarian reserve |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| PERRONE R. et al. CD38 regulates ovarian function and fecundity via NAD+ metabolism. BioRxiv. 2023, 539779, p.1-41. JIRGE P.R. Poor ovarian reserve. J Hum Reprod Sci. 2016, 9(2), p.63-69. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Esim et al. | Diagnosis of premature rupture of membranes by identification of β-HCG in vaginal washing fluid | |
| Kubota et al. | Evaluation of insulin‐like growth factor binding protein‐1 as a diagnostic tool for rupture of the membranes | |
| RU2430379C1 (en) | Method of predicting pregnancy in programme of extracorporal fertilisation and transfer of embryos in standard long protocol of superovulation stimulation | |
| Flaws et al. | Ovarian volume and menopausal status | |
| Campbell et al. | Biomarkers of ovulation, endometrial receptivity, fertilisation, implantation and early pregnancy progression | |
| RU2807923C1 (en) | Method of female fertility diagnostics | |
| RU2526823C1 (en) | Diagnostic technique for external genital endometriosis | |
| RU2363001C1 (en) | Way of diagnostics of external genital endometriosis | |
| RU2625723C1 (en) | Method of pre-clinical diagnostics of premature of ovarians in women of reproductive age | |
| RU2670672C1 (en) | Method for prediction of preterm delivery at gestation period of 24-34 weeks | |
| Yu et al. | Investigating the infertile couple | |
| US5972594A (en) | Method for screening for reproductive tract inflammation and preeclampsia using neutrophil defensins | |
| US20070141655A1 (en) | Multi symptom medical test to diagnose causes of vaginitis | |
| RU2495431C1 (en) | Method for prediction of developing reproductive disorders | |
| Dunphy et al. | The interaction of parameters of male and female fertility in couples with previously unexplained infertility | |
| Niklasson et al. | Lactate dehydrogenase and its isoenzymes in vaginal fluid in vaginitis/vaginosis cases and in healthy controls | |
| RU2391664C2 (en) | Method of vagina infection diagnostics | |
| RU2785487C1 (en) | Method for predicting ejaculate infertility in men | |
| RU2312354C1 (en) | Method for diagnosing estrogen- and progesteron-dependent genitalia abnormalities | |
| RU2797507C1 (en) | Method for prediction of effectiveness of assisted reproductive technologies | |
| RU2574669C2 (en) | Instant diagnostic technique for female endocrine infertility | |
| FARAG et al. | Assessment of urea and creatinine in vaginal washing fluid as a method for diagnosis of premature rupture of membranes | |
| SU1273799A1 (en) | Method of diagnosis of endometriosis | |
| Yan et al. | Combined quantitative detection of IGFBP--1/fFn for predicting premature rupture of membranes and preterm delivery | |
| RU2646473C1 (en) | Method for endometriopathy prediction in women with reproductive disturbances |