RU2807806C1 - pGEM-TCRAC-sjTREC-sjKREC RECOMBINANT PLASMID DNA CONTAINING NUCLEOTIDE SEQUENCES OF THE T-LYMPHOCYTE Α-RECEPTOR GENE LOCUS AND SIGNAL FRAGMENTS OF THE T- AND B-CELL RECEPTOR EXCISION RINGS - Google Patents
pGEM-TCRAC-sjTREC-sjKREC RECOMBINANT PLASMID DNA CONTAINING NUCLEOTIDE SEQUENCES OF THE T-LYMPHOCYTE Α-RECEPTOR GENE LOCUS AND SIGNAL FRAGMENTS OF THE T- AND B-CELL RECEPTOR EXCISION RINGS Download PDFInfo
- Publication number
- RU2807806C1 RU2807806C1 RU2022132020A RU2022132020A RU2807806C1 RU 2807806 C1 RU2807806 C1 RU 2807806C1 RU 2022132020 A RU2022132020 A RU 2022132020A RU 2022132020 A RU2022132020 A RU 2022132020A RU 2807806 C1 RU2807806 C1 RU 2807806C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- tcrac
- excision
- dna
- pgem
- sjkrec
- Prior art date
Links
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims abstract description 36
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title claims abstract description 33
- 108091008875 B cell receptors Proteins 0.000 title claims abstract description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 18
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 title abstract description 13
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 title description 43
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 title 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 22
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims abstract description 3
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 9
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 claims description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims 1
- 238000007847 digital PCR Methods 0.000 abstract description 14
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 abstract description 8
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 8
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 abstract description 6
- 238000011002 quantification Methods 0.000 abstract description 5
- 239000013641 positive control Substances 0.000 abstract description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 abstract description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 2
- 230000011664 signaling Effects 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 210000003370 receptor cell Anatomy 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 15
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 12
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 8
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 description 4
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 4
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 4
- 230000002992 thymic effect Effects 0.000 description 4
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 2
- 208000028529 primary immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 1
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 1
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 101000634835 Homo sapiens M1-specific T cell receptor alpha chain Proteins 0.000 description 1
- 101000634836 Homo sapiens T cell receptor alpha chain MC.7.G5 Proteins 0.000 description 1
- 102100029450 M1-specific T cell receptor alpha chain Human genes 0.000 description 1
- 108020005196 Mitochondrial DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 1
- 208000031951 Primary immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 108700042075 T-Cell Receptor Genes Proteins 0.000 description 1
- 101150117115 V gene Proteins 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011304 droplet digital PCR Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 1
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 1
- 230000009675 homeostatic proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical class N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000013081 microcrystal Substances 0.000 description 1
- 239000002055 nanoplate Substances 0.000 description 1
- 230000009707 neogenesis Effects 0.000 description 1
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 239000012925 reference material Substances 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000011476 stem cell transplantation Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
Abstract
Description
Изобретение относится к области генной инженерии, молекулярной и клеточной биологии и предназначено для оценки специфичности и чувствительности праймеров и зондов, разрабатываемых для оценки количества копий Т-лимфоцитарного α-рецептора и сигнального фрагмента эксцизионного кольца Т-клеточного рецептора в образцах ДНК человека, т.е. выступающим в качестве стандартизированного положительного контрольного образца ДНК.The invention relates to the field of genetic engineering, molecular and cellular biology and is intended to evaluate the specificity and sensitivity of primers and probes developed to estimate the copy number of the T-lymphocyte α-receptor and the signal fragment of the T-cell receptor excision ring in human DNA samples, i.e. . serving as a standardized positive control DNA sample.
Т-лимфоциты (Т-клетки) играют ключевую роль в клеточном иммунном ответе [1, 2], поскольку они распознают специфические антигенные пептиды, связанные с главными комплексами гистосовместимости (ГКГС) [3, 4]. Это распознавание регулируется гетеродимерным αβ Т-клеточным рецептором [2]. Внутри цепи TCRβ определяющая комплементарность область (CDR) 1 и петли CDR2 TCR контактируют с альфа-спиралями ГКГС, в то время как гипервариабельные области CDR3 взаимодействуют в основном с пептидом [1, 2]. Как в цепях TCRα, так и в цепях TCRβ петли CDR3 имеют наибольшее разнообразие последовательностей и являются основными детерминантами специфичности связывания с рецептором. CDR1 и CDR2 определяются геном V, используемым в TCR, тогда как CDR3 определяется как V, (D в TCRβ), так и J, а также добавлением и удалением нуклеотидов на стыках VD и DJ (VJ в альфа-цепочка), то есть подвергаются так называемой V(D)J рекомбинации [1]. T lymphocytes (T cells) play a key role in the cellular immune response [1, 2], as they recognize specific antigenic peptides associated with major histocompatibility complexes (MHC) [3, 4]. This recognition is regulated by the heterodimeric αβ T cell receptor [2]. Within the TCRβ chain, complementarity determining region (CDR) 1 and TCR CDR2 loops contact MHC alpha helices, while CDR3 hypervariable regions interact primarily with the peptide [1, 2]. In both the TCRα and TCRβ chains, the CDR3 loops have the greatest sequence diversity and are the major determinants of receptor binding specificity. CDR1 and CDR2 are defined by the V gene used in the TCR, while CDR3 is defined by both V, (D in TCRβ) and J, and the addition and deletion of nucleotides at the junctions of VD and DJ (VJ in the alpha strand), i.e. subject to so-called V(D)J recombination [1].
В процессе реаранжировки TCR вырезанные фрагменты ДНК создают круги эксцизии Т-клеточных рецепторов (TREC), которые экспортируются в цитоплазму Т-клеток [5, 6]. В частности, сигнальный совместный TREC δRec-ψJα (sjTREC) продуцируется во время делеции TCRD и обнаруживается примерно в 70% (альфа-бета) αβ Т-клеток. Они считаются наиболее оптимальной мишенью для оценки продукции тимуса [7-9]. Кольца вырезания рекомбинации с удалением каппа (KREC) образуются во время перестройки BCR в наивных В-клетках и аналогичны TREC [10]. Сходным образом, sjKREC, образующийся во время реаранжировок intronRSS-Kde в локусе IGK, является надежной мишенью для оценки неогенеза В-клеток из костного мозга [11,12].During the process of TCR rearrangement, excised DNA fragments create T cell receptor excision circles (TRECs), which are exported into the cytoplasm of T cells [5, 6]. Specifically, the signaling joint TREC δRec-ψJα (sjTREC) is produced during TCRD deletion and is found in approximately 70% (alpha-beta) of αβ T cells. They are considered the most optimal target for assessing thymic production [7-9]. Kappa excision recombination excision rings (KRECs) are formed during BCR rearrangement in naïve B cells and are similar to TRECs [10]. Similarly, sjKREC, generated during intronRSS-Kde rearrangements at the IGK locus, is a reliable target for assessing B cell neogenesis from bone marrow [11,12].
Как TREC, так и KREC стабильны и нерепликативны, а затем разбавляются во время пролиферации клеток [13, 14]. Следовательно, анализы TREC и KREC широко применяются в различных клинических условиях для оценки продукции тимуса и костного мозга. Измерение уровней TREC и KREC в периферической крови можно использовать для скрининга первичных иммунодефицитных заболеваний.Both TREC and KREC are stable and non-replicative and then become diluted during cell proliferation [13, 14]. Consequently, TREC and KREC assays are widely used in various clinical settings to assess thymic and bone marrow production. Measurement of TREC and KREC levels in peripheral blood can be used to screen for primary immunodeficiency diseases.
Появление технологии цифровой ПЦР (digital PCR, dPCR), в том числе такого варианта как капельная цифровая ПЦР (digital droplet PCR, ddPCR), позволила получить точные (абсолютные) измерения количества копий участков ДНК (copy number variation, CNV) путём проведения двух флуоресцентных анализов (один для определения региона интереса, а другой для определения контрольного эталонного локуса с известным числом копий участка ДНК), одновременно протекающих в десятках тысяч независимых реакций (капель, лунок) [15,16]. Технология построена таким образом, чтобы в одной реакции участвовала в среднем одна молекула исходной ДНК. Тем самым достигается точная оценка числа молекул ДНК, содержащих исследуемый регион ДНК, в определенном объеме образца. Эта значительно отличает её от эмульсионной ПЦР, в результате которой получаются капли различного объема.The advent of digital PCR (dPCR) technology, including such a variant as digital droplet PCR (ddPCR), made it possible to obtain accurate (absolute) measurements of the copy number of DNA sections (copy number variation, CNV) by conducting two fluorescent analyzes (one to determine the region of interest, and the other to determine the control reference locus with a known number of copies of a DNA region), simultaneously occurring in tens of thousands of independent reactions (droplets, wells) [15,16]. The technology is designed in such a way that on average one molecule of the original DNA participates in one reaction. This achieves an accurate estimate of the number of DNA molecules containing the DNA region of interest in a certain volume of the sample. This significantly distinguishes it from emulsion PCR, which results in droplets of varying volumes.
Число копий по технологии dPCR рассчитывается путём сравнения количества флуоресцирующих молекул интересующего региона с количеством молекул эталонного локуса генома. Однако, в отличие от количественной ПЦР в режиме реального времени, измерение флуоресценции по технологии dPCR проводится не во время ПЦР, а «по конечной точке», т.е. по завершению ПЦР. Тем самым достигается высокая точность анализа, который позволяет определить целочисленное количество копий в локусах, по сравнению с другими технологиями [15-17].The copy number using dPCR technology is calculated by comparing the number of fluorescent molecules of the region of interest with the number of molecules of the reference locus of the genome. However, unlike quantitative real-time PCR, fluorescence measurement using dPCR technology is not carried out during PCR, but “at the end point”, i.e. upon completion of PCR. This achieves high accuracy of analysis, which allows one to determine the integer number of copies in loci, compared to other technologies [15-17].
В литературе описана плазмидная ДНК близкая к заявляемой по технической сущности, но предназначена для ПЦР в режиме реального времени [18]. Использование подобной плазмиды в системе цифровой ПЦР сложно контролировать количество копий участков ДНК плазмиды ввиду её размера, который составляет порядка 5 тыс. п.н., что значительно превышает объем формируемых капель. Других аналогичных или близких к заявляемой по технической сущности и функциональному назначению не описано.The literature describes plasmid DNA that is close to the claimed technical essence, but is intended for real-time PCR [18]. The use of such a plasmid in a digital PCR system is difficult to control the number of copies of DNA sections of the plasmid due to its size, which is about 5 thousand bp, which significantly exceeds the volume of the formed droplets. No other products similar or close to the claimed one in terms of technical essence and functional purpose have been described.
Задачей изобретения является получение плазмидной ДНК, которая служит в качестве контрольной ДНК для оценки чувствительности и специфичности праймеров и зондов, направленных на оценку количества копий гена Т-лимфоцитарного α-рецептора, а также сигнальных фрагментов эксцизионных колец Т и В-клеточного рецепторов при проведения цифровой ПЦР с абсолютной квантификацией в биологических образцах ДНК человека.The objective of the invention is to obtain plasmid DNA, which serves as control DNA for assessing the sensitivity and specificity of primers and probes aimed at assessing the number of copies of the T-lymphocyte α-receptor gene, as well as signal fragments of T and B-cell receptor excision rings when performing digital PCR with absolute quantification in biological samples of human DNA.
Технический результат: получение плазмиды, несущей генетическую конструкцию pGEM-TCRAC-sjTREC-sjKREC, содержащую участок гена TCRAC, сигнальные фрагменты эксцизионных колец Т- и В-клеточного рецептора, обеспечивающую высокую достоверность оценки чувствительности и специфичности праймеров и зондов, разрабатываемых для оценки Т- и В-клеточного состава в биологических образцах ДНК человека.Technical result: production of a plasmid carrying the genetic construct pGEM-TCRAC-sjTREC-sjKREC, containing a region of the TCRAC gene, signal fragments of the excision rings of the T- and B-cell receptor, providing high reliability in assessing the sensitivity and specificity of primers and probes developed to evaluate T-cell receptors. and B-cell composition in human biological DNA samples.
Указанный результат достигается за счет содержания в плазмиде pGEM-TCRAC-sjTREC-sjKREC 1 копий участка гена TCRAC, 1 копии сигнального фрагмента эксцизионного кольца Т-клеточного рецептора и 1 копии сигнального фрагмента эксцизионного кольца В-клеточного рецептора.This result is achieved due to the content in the pGEM-TCRAC-sjTREC-sjKREC plasmid of 1 copy of the TCRAC gene region, 1 copy of the signal fragment of the T-cell receptor excision ring and 1 copy of the signal fragment of the B-cell receptor excision ring.
Описание изобретенияDescription of the invention
Предложена плазмидная генетическая конструкция pGEM-TCRAC-sjTREC-sjKREC, содержащая участок гена TCRAC, сигнальные фрагменты эксцизионных колец Т- и В-клеточного рецептора. ДНК плазмиды pGEM-TCRAC-sjTREC-sjKREC, выступает в качестве стандартизированного положительного контрольного образца ДНК для оценки чувствительности и специфичности праймеров и зондов, разрабатываемых для определения Т- и В-клеточного состава в биологических образцах ДНК человека. Подход с использованием плазмиды pGEM-TCRAC-sjTREC-sjKREC позволит изучить Т- и В-клеточного состав, при котором участок гена TCRAC выступает в качестве оценки общего количество ядро-содержащих клеток в изучаемом образце ДНК, тогда как сигнальные фрагменты TREC и KREC, образующиеся при Т- и В-лимфоцитопоэзе, соответственно, выступают в качестве контрольного уровня Т- и В-клеточного состава, соответственно. Таким образом, при определении соотношения TCRAC, TREC и KREC 1:1:1 указывает на высокую чувствительность и специфичность разрабатываемых праймеров и зондов.A plasmid genetic construct pGEM-TCRAC-sjTREC-sjKREC has been proposed, containing a region of the TCRAC gene and signal fragments of the T- and B-cell receptor excision rings. Plasmid DNA pGEM-TCRAC-sjTREC-sjKREC serves as a standardized positive control DNA sample for assessing the sensitivity and specificity of primers and probes developed to determine the T- and B-cell composition of human biological DNA samples. The approach using the pGEM-TCRAC-sjTREC-sjKREC plasmid will make it possible to study the T- and B-cell composition, in which the TCRAC gene region acts as an estimate of the total number of nucleated cells in the DNA sample being studied, while the TREC and KREC signal fragments formed in T- and B-lymphocytopoiesis, respectively, act as a control level of T- and B-cell composition, respectively. Thus, when determining the ratio of TCRAC, TREC and KREC, 1:1:1 indicates high sensitivity and specificity of the primers and probes being developed.
Исходным генетическим материалом для конструирования плазмиды pGEM-TCRAC-sjTREC-sjKREC служит плазмида pGEM-T Easy, размером 3015 п.н. (фиг. 1), имеющая нуклеотидную последовательность SEQID NO 1. Плазмида pGEM-TCRAC-sjTREC-sjKREC получена следующим образом.The starting genetic material for constructing the pGEM-TCRAC-sjTREC-sjKREC plasmid is the pGEM-T Easy plasmid, 3015 bp in size. (Fig. 1), having the nucleotide sequence SEQID NO 1. Plasmid pGEM-TCRAC-sjTREC-sjKREC was obtained as follows.
Для синтеза фрагментов TCRAC, TREC и KREC использовали полимеразную цепную реакцию (ПЦР)со следующими праймерами: TCRAC (TCRAC-F 5'-GGCATGCATGAGACCGTGACTTGCCAG-3' и TCRAC-R 5'-GGCATGCGCTGTTGTTGAAGGCGTTTGC-3'), TREC (5'-AAAGAGGGCAGCCCTCTCCAAGGC и TREC-R 5'-GGCTGATCTTGTCTGACATTTGC-3') и KREC (KREC-F 5'-CCCACTAGTTCAGCGCCCATTACGTTTCT-3' и KREC-R 5'-CCCACGCGTGTGAGGGACACGCAGCC-3'). ПЦР проводили на термоциклере T100 (Bio-Rad) с использованием высокоточной полимеразы Q5® High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs) согласно инструкции производителя по следующей программе: 98°С - 30 сек.; 35 циклов: 98°С - 10 сек., 65°С -30 сек., 72°С - 20 сек.; 72°С - 3 мин.To synthesize TCRAC, TREC and KREC fragments, polymerase chain reaction (PCR) was used with the following primers: TCRAC (TCRAC-F 5'-GGCATGCATGAGACCGTGACTTGCCAG-3' and TCRAC-R 5'-GGCATGCGCTGTTGTTGAAGGCGTTTGC-3'), TREC (5'-AAAGAGGGCAGCCCTCTCCAAGGC and TREC-R 5′-GGCTGATCTTGTCTGACATTTGC-3′ and KREC (KREC-F 5′-CCCACTAGTTCAGCGCCCATTACGTTTCT-3′ and KREC-R 5′-CCCACGCGTGTGAGGGACACGCAGCC-3′). PCR was carried out on a T100 thermal cycler (Bio-Rad) using high-precision polymerase Q5® High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs) according to the manufacturer's instructions using the following program: 98°C - 30 sec.; 35 cycles: 98°C - 10 sec., 65°C -30 sec., 72°C - 20 sec.; 72°C - 3 min.
Фрагменты ДНК ожидаемого размера выделяли из агарозного геля с помощью набора реагентов Cleanup Mini (Евроген). На первом этапе фрагмент TREC клонировали в векторе pGEM-T Easy (Promega) с использованием 2× буфера и T4 ДНК-лигазы, поставляемой вместе с вектором (EcoRV, pGEM®-T Easy Vector System I) (фиг.2). После отбора рекомбинантных плазмидных клонов было проведено секвенирование по Сенгеру с использованием универсальных праймеров M13-F 5'-GTAAAACGACGGCCAGTG-3' и M13-R 5'-GGAAACAGCTATGACCATG-3'.DNA fragments of the expected size were isolated from the agarose gel using the Cleanup Mini reagent kit (Evrogen). In the first step, the TREC fragment was cloned into the pGEM-T Easy vector (Promega) using 2× buffer and T4 DNA ligase supplied with the vector (EcoRV, pGEM®-T Easy Vector System I) (Fig. 2). After selection of recombinant plasmid clones, Sanger sequencing was performed using universal primers M13-F 5'-GTAAAACGACGGCCAGTG-3' and M13-R 5'-GGAAACAGCTATGACCATG-3'.
Выбранный после этого плазмидный клон был использован для клонирования фрагмента TCRAC по сайту эндонуклеазы рестрикции SphI. Для этого плазмидную ДНК и ПЦР-фрагмент подвергали гидролизу SphI (СибЭнзайм), очищали через гель (Cleanup Mini (Евроген)) и лигировали с помощью T4 ДНК-лигазы (Thermo Fisher Scientific). После отбора рекомбинантных клонов повторяли секвенирование. На третьем этапе KREC клонировали по сайтам SpeI и MluI. Для этого проводили гидролиз плазмидной ДНК и соответствующего ПЦР-фрагмента с помощью эндонуклеаз рестрикции SpeI (New England Biolabs) и MluI (СибЭнзайм), проводили очистку и лигирование как на предыдущих этапах. Для клонирования и наработки плазмидной ДНК использовали химически- или электрокомпетентные клетки E.coli штамма TOP10.The plasmid clone then selected was used to clone the TCRAC fragment at the Sph I restriction endonuclease site. For this, the plasmid DNA and the PCR fragment were subjected to Sph I hydrolysis (SibEnzyme), gel purified (Cleanup Mini (Evrogen)) and ligated with T4 DNA -ligase (Thermo Fisher Scientific). After selection of recombinant clones, sequencing was repeated. At the third stage, KREC was cloned at the Spe I and Mlu I sites. For this, the plasmid DNA and the corresponding PCR fragment were hydrolyzed using restriction endonucleases Spe I (New England Biolabs) and Mlu I (SibEnzyme), purification and ligation were carried out as in the previous stages . For cloning and production of plasmid DNA, chemically or electrocompetent cells of E. coli strain TOP10 were used.
Полученная в результате плазмида pGEM-TCRAC-sjTREC-sjKREC, имеющая нуклеотидную последовательность SEQID NO 2, несущая локус гена Т-лимфоцитарного α-рецептора и сигнальные фрагменты эксцизионных колец Т и В-клеточного рецепторов (фиг. 3), характеризуется следующими признаками:The resulting plasmid pGEM-TCRAC-sjTREC-sjKREC, having the nucleotide sequence SEQID NO 2, carrying the T-lymphocyte α-receptor gene locus and signal fragments of the T and B-cell receptor excision rings (Fig. 3), is characterized by the following features:
- имеет размер 3870 п.н.;- has a size of 3870 bp;
- состоит из следующих элементов:- consists of the following elements:
а) фрагмент последовательности гена TCRAC (367 п.н.), локус сигнального фрагмента эксцизионного кольца TREC (375 п.н.) и локус сигнального фрагмента эксцизионного кольца KREC (148 п.н.).a) a fragment of the TCRAC gene sequence (367 bp), the TREC excision ring signal fragment locus (375 bp) and the KREC excision ring signal fragment locus (148 bp).
б) фрагмента плазмиды pGEM-T Easy (3015 п.н.), содержащего ген устойчивости к ампицилину AmpR, необходимый для селекции целевых плазмид на этапе клонирования, ориджины репликации плазмиды ori и f1 ori, а также промотор и оператор lac-оперона бактерий. b) a fragment of the pGEM-T Easy plasmid (3015 bp), containing the ampicillin resistance gene AmpR, necessary for the selection of target plasmids at the cloning stage, the origins of replication of the plasmid ori and f1 ori, as well as the promoter and operator of the bacterial lac operon.
в) последовательности Т3 (19 п.н.) и SP6 (19 п.н.) промоторов, а также сайты отжига универсальных праймеров M13 fwd (17 п.н.) и M13 rev (17 п.н.) по обе стороны от генетической конструкции фрагмента гена TCRAC, сигнальных фрагментов TREC и KREC.c) sequences of T3 (19 bp) and SP6 (19 bp) promoters, as well as annealing sites of universal primers M13 fwd (17 bp) and M13 rev (17 bp) on both sides from the genetic design of the TCRAC gene fragment, TREC and KREC signal fragments.
Изобретение иллюстрируется следующими фигурами:The invention is illustrated by the following figures:
фиг. 1. Схематическое изображение создания плазмиды;fig. 1. Schematic representation of plasmid creation;
фиг. 2. Графическая карта исходной плазмиды pGEM-T Easy;fig. 2. Graphic map of the original plasmid pGEM-T Easy;
фиг. 3. Графическая карта оригинальной рекомбинантной плазмидной ДНК pGEM-TCRAC-sjTREC-sjKREC, содержащую фрагмент гена TCRAC, и сигнальные фрагменты TREC и KREC;fig. 3. Graphic map of the original recombinant plasmid DNA pGEM-TCRAC-sjTREC-sjKREC, containing a fragment of the TCRAC gene, and signal fragments TREC and KREC;
фиг. 4. Проверка работоспособности предложенной системы методом цифровой капельной ПЦР кольцевой плазмиды pGEM-TCRAC-sjTREC-sjKREC;fig. 4. Testing the performance of the proposed system using digital droplet PCR of the circular plasmid pGEM-TCRAC-sjTREC-sjKREC;
фиг. 5. Проверка работоспособности предложенной системы методом цифровой капельной ПЦР с градиентом разведения кольцевой плазмиды pGEM-TCRAC-sjTREC-sjKREC.fig. 5. Testing the performance of the proposed system using digital droplet PCR with a dilution gradient of the circular plasmid pGEM-TCRAC-sjTREC-sjKREC.
Для лучшего понимания сущности предлагаемого изобретения оно иллюстрируются следующими примерами конкретного осуществления.For a better understanding of the essence of the proposed invention, it is illustrated by the following examples of specific implementation.
Пример. Подтверждение пригодности разрабатываемых праймеров и зондов для оценки Т- и В-клеточного состава в образцах ДНК человека, а также их специфичности с помощью плазмиды pGEM-TCRAC-sjTREC-sjKREC.Example. Confirmation of the suitability of the developed primers and probes for assessing the T- and B-cell composition in human DNA samples, as well as their specificity using the pGEM-TCRAC-sjTREC-sjKREC plasmid.
Генотипирование с помощью набора проб осуществляли по модифицированному протоколу генотипирования методом dPCR и ddPCR следующим образом:Genotyping using the sample set was carried out using a modified dPCR and ddPCR genotyping protocol as follows:
1. В качестве материала для исследования можно использовать препарат ДНК индивида, выделенный из биообразца любым способом, позволяющим использование ДНК в качестве матрицы в полимеразной цепной реакции. Основным требованием к качеству используемой ДНК является отсутствие каких-либо признаков деградации (разрушения) ДНК. Проверка на качество ДНК обязательна с помощью любого метода ДНК электрофореза, при котором должен присутствовать только высокомолекулярный бэнд тотальной ДНК, отсутствие бэндов примесей РНК и любых «шмеров» - признаков деградации ДНК. Выполнение данного требования необходимо во избежание неточности измерений количества копий мтДНК.1. As a material for research, you can use a DNA preparation of an individual, isolated from a biosample by any method that allows the use of DNA as a template in a polymerase chain reaction. The main requirement for the quality of the DNA used is the absence of any signs of DNA degradation (destruction). Testing for DNA quality is mandatory using any DNA electrophoresis method, in which only a high molecular weight band of total DNA should be present, no bands of RNA impurities and any “shmears” - signs of DNA degradation. Compliance with this requirement is necessary to avoid inaccuracy in mtDNA copy number measurements.
2. Образец исследуемой ДНК необходимо развести до рабочей концентрации, варьирующей от 5 до 100 нг/мкл, для удобства последующих манипуляций. В реакционную смесь могут входить безнуклеазная вода, буферы для фермента рестрикции и иные компоненты, рекомендованные производителем.2. The DNA sample under study must be diluted to a working concentration varying from 5 to 100 ng/μl for the convenience of subsequent manipulations. The reaction mixture may include nuclease-free water, restriction enzyme buffers and other components recommended by the manufacturer.
3. Реакционная смесь для проведения мультиплексной цифровой ПЦР состоит из двух объемов мастер-микса производителя dPCR или ddPCR, мультиплекса из праймеров и зондов для исследуемых генов TCRAC, TREC и KREC, безнуклеазной воды и фрагментированного образца ДНК. Оптимальная концентрация ДНК выбирается согласно рекомендациям производителя прибора dPCR или ddPCR.3. The reaction mixture for multiplex digital PCR consists of two volumes of the dPCR or ddPCR manufacturer’s master mix, a multiplex of primers and probes for the genes under studyTCRAC,TREC and KREC, nuclease-free water and fragmented DNA sample. The optimal DNA concentration is selected according to the recommendations of the dPCR or ddPCR instrument manufacturer.
4. Использовали следующие пары праймеров и зонды:4. The following primer pairs and probes were used:
1. Для проверки наличия TCRAC 5'- TGGCCTAACCCTGATCCTCTT-3', 5'- GGATTTAGAGTCTCTCAGCTGGTACAC-3', и зонда 5'-HEX-TCCCACAGATATCCAGAACCCTGACCC-BHQ1-3'.1. To check the presence of TCRAC 5'-TGGCCTAACCCTGATCCTCTT-3', 5'-GGATTTAGAGTCTCTCAGCTGGTACAC-3', and probe 5'-HEX-TCCCACAGATATCCAGAACCCTGACCC-BHQ1-3'.
2. Для проверки наличия сигнального фрагмента эксцизионного кольца TREC 5'- CACATCCCTTTCAACCATGCT-3' и 5'- TGCAGGTGCCTATGCATCA-3', и зонда 5'-FAM-ACACCTCTGGTTTTTGTAAAGGTGCCCACT-BHQ1-3'.2. To check the presence of the signal fragment of the TREC excision ring 5'-CACATCCCTTTCAACCATGCT-3' and 5'-TGCAGGTGCCTATGCATCA-3', and the probe 5'-FAM-ACACCTCTGGTTTTTGTAAAGGTGCCCACT-BHQ1-3'.
3. Для проверки наличия KREC 5'- TCCCTTAGTGGCATTATTTGTATCACT-3' и 5'- AGGAGCCAGCTCTTACCCTAGAGT-3', и зонда 5'-FAM-TCTGCACGGGCAGCAGGTTGG-BHQ1-3'.3. To check for the presence of KREC 5'- TCCCTTAGTGGCATTATTTGTATCACT-3' and 5'- AGGAGCCAGCTCTTACCCTAGAGT-3', and probe 5'-FAM-TCTGCACGGGCAGCAGGTTGG-BHQ1-3'.
1. Протокол программы ПЦР основан по принципу стандартной 2 шаговой ПЦР, включающая: этап денатурации при +94°С - +98°С, этап отжига и элонгации при +57°С. Этап денатурации может варьировать от 20 сек до 1 мин, оптимальным является 30 сек. Этап отжига и элонгации может длиться от 20 сек до 2 мин, оптимальным является 1 мин. Этап «горячего старта» и «горячего завершения» может быть добавлен согласно протоколу производителя. Хранение готовых продуктов ПЦР может происходить от +4°С до +12°С, до суток.1. The protocol of the PCR program is based on the principle of standard 2-step PCR, including: a denaturation stage at +94°C - +98°C, an annealing and elongation stage at +57°C. The denaturation stage can vary from 20 seconds to 1 minute, with 30 seconds being optimal. The annealing and elongation stage can last from 20 seconds to 2 minutes, 1 minute is optimal. A hot start and hot end step can be added according to the manufacturer's protocol. Storage of finished PCR products can take place from +4°C to +12°C, up to 24 hours.
2. Общая методическая постановка dPCR (ddPCR) и получение сигналов флуоресценции производится согласно протоколу производителя технологии ddPCR (капельное, микрофлюидная) или dPCR (на микрокристалле, нанопланшете, иное) [19, 20]. Основным требованием для оценки сигналов флуоресценции нанореакций является достаточное общее количество нанореакций, которое должно превышать более 10000 капель на реакцию для адекватной оценки результатов, а также разведение плазмиды от 10 фг до 1,3 пг, согласно линейной модели, рассчитанной при получении результатов серий разведения плазмиды (фиг. 5). Примеры получаемых результатов представлены на фиг. 4-5. Соотношение копий TCRAC, sjTREC и sjKREC составляет 1:1:1. Таким образом, доказано, что созданная плазмидная конструкция действительно обеспечивает возможность оценки специфичности и чувствительности разрабатываемых праймеров и зондов для оценки Т- и В-клеточного состава в образцах ДНК человека. Следовательно, их можно использовать для исследования чувствительности и специфичности разрабатываемых олигонуклеотидных праймеров и зондов для оценки Т- и В-клеточного состава в образцах ДНК человека.2. The general methodological setting of dPCR (ddPCR) and obtaining fluorescence signals is carried out according to the protocol of the manufacturer of the ddPCR (droplet, microfluidic) or dPCR (on a microcrystal, nanoplate, etc.) technology [19, 20]. The main requirement for assessing the fluorescence signals of nanoreactions is a sufficient total number of nanoreactions, which must exceed more than 10,000 drops per reaction to adequately evaluate the results, as well as a dilution of the plasmid from 10 fg to 1.3 pg, according to the linear model calculated when obtaining the results of the plasmid dilution series (Fig. 5). Examples of the results obtained are presented in Fig. 4-5. The copy ratio of TCRAC, sjTREC and sjKREC is 1:1:1. Thus, it has been proven that the created plasmid construct actually provides the ability to assess the specificity and sensitivity of the developed primers and probes for assessing the T- and B-cell composition in human DNA samples. Therefore, they can be used to study the sensitivity and specificity of developing oligonucleotide primers and probes for assessing T and B cell composition in human DNA samples.
Источники информации, принятые во внимание при составлении описания:Sources of information taken into account when compiling the description:
1. Davis MM, Bjorkman PJ. T-Cell Antigen Receptor Genes and T-cell Recognition. Nature (1988) 334:395-402. doi: 10.1038/334395a01. Davis MM, Bjorkman PJ. T-Cell Antigen Receptor Genes and T-cell Recognition. Nature (1988) 334:395–402. doi: 10.1038/334395a0
2. Krogsgaard M, Davis MM. How T Cells 'See' Antigen. Nat Immunol (2005) 6:239-45. doi: 10.1038/ni11732. Krogsgaard M, Davis MM. How T Cells 'See' Antigen. Nat Immunol (2005) 6:239–45. doi: 10.1038/ni1173
3. Rowen L, Koop BF, Hood L, Even J, Kanellopoulos J, Kourilsky P. The Complete 685-Kilobase DNA Sequence of the Human Beta T Cell Receptor Locus. Sci (80- ) (1999) 272:1755-62. doi: 10.1126/science.272.5269.17553. Rowen L, Koop BF, Hood L, Even J, Kanellopoulos J, Kourilsky P. The Complete 685-Kilobase DNA Sequence of the Human Beta T Cell Receptor Locus. Sci (80- ) (1999) 272:1755-62. doi: 10.1126/science.272.5269.1755
4. Glanville J, Huang H, Nau A, Hatton O, Wagar LE, Rubelt F, et al. Identifying Specificity Groups in the T Cell Receptor Repertoire. Nature (2017) 547:94-8. doi: 10.1038/nature229764. Glanville J, Huang H, Nau A, Hatton O, Wagar LE, Rubelt F, et al. Identifying Specificity Groups in the T Cell Receptor Repertoire. Nature (2017) 547:94–8. doi: 10.1038/nature22976
5. Livak F, Schatz DG. Identification of V(D)J recombination coding end intermediates in normal thymocytes. J Mol Biol. (1997) 267:1-9. doi: 10.1006/jmbi.1996.08345. Livak F, Schatz DG. Identification of V(D)J recombination coding end intermediates in normal thymocytes. J Mol Biol. (1997) 267:1-9. doi: 10.1006/jmbi.1996.0834
6. Takeshita S, Toda M, Yamagishi H. Excision products of the T cell receptor gene support a progressive rearrangement model of the alpha/delta locus. EMBO J. (1989) 8:3261-70. doi: 10.1002/j.1460-2075.1989.tb08486.x6. Takeshita S, Toda M, Yamagishi H. Excision products of the T cell receptor gene support a progressive rearrangement model of the alpha/delta locus. EMBO J (1989) 8:3261–70. doi: 10.1002/j.1460-2075.1989.tb08486.x
7. Ye P, Kirschner DE. Reevaluation of T cell receptor excision circles as a measure of human recent thymic emigrants. J Immunol. (2002) 168:4968-79. doi: 10.4049/jimmunol.168.10.49687. Ye P, Kirschner DE. Reevaluation of T cell receptor excision circles as a measure of human recent thymic emigrants. J Immunol. (2002) 168:4968–79. doi: 10.4049/jimmunol.168.10.4968
8. Hazenberg MD, Verschuren MC, Hamann D, Miedema F, van Dongen JJ. T cell receptor excision circles as markers for recent thymic emigrants: basic aspects, technical approach, and guidelines for interpretation. J Mol Med. (2001) 79:631-40. doi: 10.1007/s0010901002718. Hazenberg MD, Verschuren MC, Hamann D, Miedema F, van Dongen JJ. T cell receptor excision circles as markers for recent thymic emigrants: basic aspects, technical approach, and guidelines for interpretation. J Mol Med. (2001) 79:631–40. doi: 10.1007/s001090100271
9. Barbaro M, Ohlsson A, Borte S, Jonsson S, Zetterstrom RH, King J, et al. Newborn screening for severe primary immunodeficiency diseases in Sweden-a 2-year pilot TREC and KREC screening study. J Clin Immunol. (2017) 37:51-60. doi: 10.1007/s10875-016-0347-59. Barbaro M, Ohlsson A, Borte S, Jonsson S, Zetterstrom RH, King J, et al. Newborn screening for severe primary immunodeficiency diseases in Sweden-a 2-year pilot TREC and KREC screening study. J Clin Immunol. (2017) 37:51–60. doi: 10.1007/s10875-016-0347-5
10. Siminovitch KA, Bakhshi A, Goldman P, Korsmeyer SJ. A uniform deleting element mediates the loss of kappa genes in human B cells. Nature. (1985) 316:260-2. doi: 10.1038/316260a010. Siminovitch KA, Bakhshi A, Goldman P, Korsmeyer SJ. A uniform deleting element mediates the loss of kappa genes in human B cells. Nature. (1985) 316:260-2. doi: 10.1038/316260a0
11. van Zelm MC, van der Burg M, Langerak AW, van Dongen JJ. PID comes full circle: applications of V(D)J recombination excision circles in research, diagnostics and newborn screening of primary immunodeficiency disorders. Front Immunol. (2011) 2:12. doi: 10.3389/fimmu.2011.0001211. van Zelm MC, van der Burg M, Langerak AW, van Dongen JJ. PID comes full circle: applications of V(D)J recombination excision circles in research, diagnostics and newborn screening of primary immunodeficiency disorders. Front Immunol. (2011) 2:12. doi: 10.3389/fimmu.2011.00012
12. van Zelm MC, Szczepanski T, van der Burg M, van Dongen JJ. Replication history of B lymphocytes reveals homeostatic proliferation and extensive antigen-induced B cell expansion. J Exp Med. (2007) 204:645-55. doi: 10.1084/jem.2006096412. van Zelm MC, Szczepanski T, van der Burg M, van Dongen JJ. Replication history of B lymphocytes reveals homeostatic proliferation and extensive antigen-induced B cell expansion. J Exp Med. (2007) 204:645–55. doi: 10.1084/jem.20060964
13. Kong FK, Chen CL, Six A, Hockett RD, Cooper MD. T cell receptor gene deletion circles identify recent thymic emigrants in the peripheral T cell pool. Proc Natl Acad Sci USA. (1999) 96:1536-40. doi: 10.1073/pnas.96.4.153613. Kong FK, Chen CL, Six A, Hockett RD, Cooper MD. T cell receptor gene deletion circles identify recent thymic emigrants in the peripheral T cell pool. Proc Natl Acad Sci USA. (1999) 96:1536–40. doi: 10.1073/pnas.96.4.1536
14. Livak F, Schatz DG. T-cell receptor alpha locus V(D)J recombination by-products are abundant in thymocytes and mature T cells. Mol Cell Biol. (1996) 16:609-18. doi: 10.1128/MCB.16.2.60914. Livak F, Schatz DG. T-cell receptor alpha locus V(D)J recombination by-products are abundant in thymocytes and mature T cells. Mol Cell Biol. (1996) 16:609-18. doi: 10.1128/MCB.16.2.609
15. Hindson B.J. et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number // Anal. Chem. 2011. Vol. 83, № 22. P. 8604-8610.15. Hindson B.J. et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number // Anal. Chem. 2011. Vol. 83, No. 22. P. 8604-8610.
16. Pinheiro L.B. et al. Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification // Anal. Chem. 2012. Vol. 84, № 2. P. 1003-1011.16. Pinheiro L.B. et al. Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification // Anal. Chem. 2012. Vol. 84, No. 2. P. 1003-1011.
17. Usher C.L. et al. Structural forms of the human amylase locus and their relationships to SNPs, haplotypes and obesity // Nat. Genet. Nature Publishing Group, 2015. Vol. 47, № 8. P. 921-925.17. Usher C.L. et al. Structural forms of the human amylase locus and their relationships to SNPs, haplotypes and obesity // Nat. Genet. Nature Publishing Group, 2015. Vol. 47, No. 8. P. 921-925.
18. Sottini A. et al. Simultaneous quantification of recent thymic T-cell and bone marrow B-cell emigrants in patients with primary immunodeficiency undergone to stem cell transplantation // Clin. Imm. 2010. 136(2), 217-227.18. Sottini A. et al. Simultaneous quantification of recent thymic T-cell and bone marrow B-cell emigrants in patients with primary immunodeficiency undergone to stem cell transplantation // Clin. Imm. 2010. 136(2), 217-227.
19. Dong L. et al. Comparison of four digital PCR platforms for accurate quantification of DNA copy number of a certified plasmid DNA reference material // Sci. Rep. Nature Publishing Group, 2015. Vol. 5, № 1. P. 1-11.19. Dong L. et al. Comparison of four digital PCR platforms for accurate quantification of DNA copy number of a certified plasmid DNA reference material // Sci. Rep. Nature Publishing Group, 2015. Vol. 5, No. 1. P. 1-11.
20. Farr R.J. et al. Comparative analysis of diagnostic platforms for measurement of differentially methylated insulin DNA // J. Biol. Methods. Journal of Biological Methods, 2019. Vol. 6, № 2. P. 113.20. Farr R.J. et al. Comparative analysis of diagnostic platforms for measurement of differentially methylated insulin DNA // J. Biol. Methods. Journal of Biological Methods, 2019. Vol. 6, No. 2. P. 113.
Claims (5)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2807806C1 true RU2807806C1 (en) | 2023-11-21 |
Family
ID=
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2587540C1 (en) * | 2015-08-06 | 2016-06-20 | Общество с ограниченной ответственностью "АБВ-ТЕСТ" | Method of diagnosing condition of immune system of patient and set of primers, probes and standard samples for quantitative estimation of dna molecules trec, krec and number of genome equivalents of dna |
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2587540C1 (en) * | 2015-08-06 | 2016-06-20 | Общество с ограниченной ответственностью "АБВ-ТЕСТ" | Method of diagnosing condition of immune system of patient and set of primers, probes and standard samples for quantitative estimation of dna molecules trec, krec and number of genome equivalents of dna |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| KOOP B.F. et al. The human T-cell receptor TCRAC/TCRDC (C alpha/C delta) region: organization, sequence, and evolution of 97.6 kb of DNA, Genomics, 1994, vol. 19, N. 3, pp. 478-493. PROFAIZER T., SLEV P., A Multiplex, Droplet Digital PCR Assay for the Detection of T-Cell Receptor Excision Circles and Kappa-Deleting Recombination Excision Circles, Clin Chem, 2020, vol. 66, N. 1, pp. 229-238. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP3277294B1 (en) | Method of identifying human compatible t cell receptors specific for an antigenic target | |
| US20080286777A1 (en) | Method of Determining the Diversity of T Lymphocytes in a Biological Sample | |
| EP3715455A1 (en) | Highly-multiplexed simultaneous detection of nucleic acids encoding paired adaptive immune receptor heterodimers from many samples | |
| US20100311054A1 (en) | Compositions and Methods for the Detection of Human T Cell Receptor Variable Family Gene Expression | |
| JP2013528355A (en) | Ankylosing spondylitis primer and ankylosing spondylitis diagnostic method using the same | |
| CN110628890B (en) | Sequencing quality control standard product and application and product thereof | |
| JP2001516594A (en) | DNA bracketing locus matching standard for electrophoresis | |
| JP2005514956A (en) | Methods for detection of fetal DNA and quantification of alleles | |
| WO2012037880A1 (en) | Dna tag and application thereof | |
| SA111320572B1 (en) | A PCR sequencing method based on DNA molecular tag technique and DNA incomplete shearing strategy | |
| CN104357569B (en) | A kind of detection method of the deaf mutant gene clamping down on polymerase chain reaction (PCR) based on peptide nucleic acid(PNA) (PNA) | |
| US20220155319A1 (en) | Use of nanoexpression to interrogate antibody repertoires | |
| US20210102246A1 (en) | Genetic test for detecting congenital adrenal hyperplasia | |
| KR20190116989A (en) | PCR primer set for HLA gene, and sequence analysis method using the same | |
| US20190153528A1 (en) | Method for target specific rna transcription of dna sequences | |
| WO2018113799A1 (en) | Method and test kit for constructing simplified genomic library | |
| CN109593758A (en) | Multi-primers group and the method that human B cell's immune group library is constructed based on high-flux sequence using the primer sets | |
| Peake | The polymerase chain reaction. | |
| CN105803054A (en) | Kit and use thereof in detection of orofacial clefts related genes | |
| RU2807806C1 (en) | pGEM-TCRAC-sjTREC-sjKREC RECOMBINANT PLASMID DNA CONTAINING NUCLEOTIDE SEQUENCES OF THE T-LYMPHOCYTE Α-RECEPTOR GENE LOCUS AND SIGNAL FRAGMENTS OF THE T- AND B-CELL RECEPTOR EXCISION RINGS | |
| CN112292600A (en) | System for identifying antigens recognized by T cell receptors expressed on tumor infiltrating lymphocytes | |
| AU2017217868A1 (en) | Method for target specific RNA transcription of DNA sequence | |
| CN116445478B (en) | Primer combination for constructing IGHV gene library and application thereof | |
| CN117512085B (en) | Primer group and kit for detecting HLA-DPB1 genotyping | |
| EP4373957A1 (en) | Method for the identification of the whole sequence of the variable region of the heavy and light chains of immunoglobulins |