RU2805863C1 - Способ генотипирования гена TLR6 по полиморфизму rs5743810 и набор олигонуклеотидных праймеров и зондов для его реализации - Google Patents
Способ генотипирования гена TLR6 по полиморфизму rs5743810 и набор олигонуклеотидных праймеров и зондов для его реализации Download PDFInfo
- Publication number
- RU2805863C1 RU2805863C1 RU2023109454A RU2023109454A RU2805863C1 RU 2805863 C1 RU2805863 C1 RU 2805863C1 RU 2023109454 A RU2023109454 A RU 2023109454A RU 2023109454 A RU2023109454 A RU 2023109454A RU 2805863 C1 RU2805863 C1 RU 2805863C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- polymorphism
- probes
- allele
- seq
- tlr6
- Prior art date
Links
- 102220641961 Toll-like receptor 6_S249P_mutation Human genes 0.000 title claims abstract description 51
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 title claims abstract description 21
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 16
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 title claims abstract description 15
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 title claims abstract description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title description 13
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims abstract description 64
- 101150095338 TLR6 gene Proteins 0.000 claims abstract description 38
- 239000013615 primer Substances 0.000 claims abstract description 25
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 25
- 239000012620 biological material Substances 0.000 claims abstract description 21
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 16
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 claims abstract description 13
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 13
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 13
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 claims abstract description 11
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 11
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims abstract description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims abstract description 6
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 claims abstract description 6
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000005447 environmental material Substances 0.000 claims abstract 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 20
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 8
- 101100153385 Homo sapiens TLR6 gene Proteins 0.000 claims description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 17
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 15
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 13
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 13
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 10
- 108020000411 Toll-like receptor Proteins 0.000 description 9
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 7
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 7
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 7
- 238000012175 pyrosequencing Methods 0.000 description 7
- 102000002689 Toll-like receptor Human genes 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 5
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 5
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 5
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 5
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- 101000669406 Homo sapiens Toll-like receptor 6 Proteins 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 3
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 3
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- 206010071602 Genetic polymorphism Diseases 0.000 description 2
- 101000848922 Homo sapiens Protein FAM72A Proteins 0.000 description 2
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 2
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 2
- 108010057466 NF-kappa B Proteins 0.000 description 2
- 102000003945 NF-kappa B Human genes 0.000 description 2
- 102100034514 Protein FAM72A Human genes 0.000 description 2
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- 102100039387 Toll-like receptor 6 Human genes 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 238000012405 in silico analysis Methods 0.000 description 2
- 208000030603 inherited susceptibility to asthma Diseases 0.000 description 2
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 2
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 2
- 230000004199 lung function Effects 0.000 description 2
- 102000007863 pattern recognition receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010089193 pattern recognition receptors Proteins 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 206010003559 Asthma late onset Diseases 0.000 description 1
- 206010006448 Bronchiolitis Diseases 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 208000028964 Congenital reticular ichthyosiform erythroderma Diseases 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 102100024521 Ficolin-2 Human genes 0.000 description 1
- 101710155249 Ficolin-2 Proteins 0.000 description 1
- 208000034826 Genetic Predisposition to Disease Diseases 0.000 description 1
- 101100481583 Homo sapiens TLR1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000831567 Homo sapiens Toll-like receptor 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000669447 Homo sapiens Toll-like receptor 4 Proteins 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 206010040070 Septic Shock Diseases 0.000 description 1
- 101150016743 TLR1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100024333 Toll-like receptor 2 Human genes 0.000 description 1
- 102100039360 Toll-like receptor 4 Human genes 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000009313 farming Methods 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 108091005434 innate immune receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 1
- 230000036457 multidrug resistance Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000036303 septic shock Effects 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ генотипирования аллелей A и G гена TLR6 по полиморфизму rs5743810, включающий: экстракцию ДНК из биологического материала, проведение ПЦР в режиме реального времени с применением реакционной смеси, содержащей набор нуклеотидных праймеров и зондов SEQ ID NO: 1-4, амплификацию, анализ и интерпретацию результатов, где наличие аллеля А гена TLR6 по полиморфизму rs5743810 определяется посредством оценки кривых накопления флуоресцентных сигналов по каналу для флуорофора FAM, а наличие в образце экологического материала аллели G гена TLR6 по полиморфизму rs5743810 определяется посредством оценки кривых накопления флуоресцентных сигналов по каналу для флуорофора R6G. Предложен набор олигонуклеотидных праймеров и зондов для применения в способе генотипирования. Изобретение позволяет детектировать аллели rs5743810-A и rs5743810-G гена TLR6 в образцах биологического материала методом ПЦР в режиме реального времени. 2 н. и 3 з.п. ф-лы, 1 табл., 6 пр.
Description
Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к определению аллелей гена человека TLR6 по однонуклеотидному полиморфизму rs5743810 в образах биологического материала методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени. Изобретение предназначено для определения аллелей гена TLR6 по однонуклеотидному полиморфизму rs5743810 и может применяться в исследованиях по изучению влияния однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) в генах врожденного иммунитета на возникновение и течение мультифакторных заболеваний.
Толл-подобные рецепторы (TLR) рецепторы врожденного иммунитета, располагающиеся как на поверхности, так и внутри клетки и распознающие патоген, проникающий в организм. TLR распознают не только экзогенные молекулярные паттерны, связанные с патогеном (PAMPs), но и эндогенные молекулы, связанные с повреждением (DAMPs), которые высвобождаются из поврежденных или умирающих клеток. Активированные TLR с помощью PAMPs или DAMPs инициируют сигнальные каскады, такие как ядерный фактор-каппа В (NFkB), пути митоген-ассоциированной протеинкиназы (МАРК) и интерферона (IFN), и способствуют секреции цитокинов и хемокинов, которые регулируют иммунные и воспалительные реакции, направленные на элиминацию патогенов.
Показана связь SNP в генах TLR с предрасположенностью к возникновению и тяжелому течению мультифакторных заболеваний. Определение аллелей SNP в генах TLR может использоваться для предупреждения тяжелого течения инфекционных заболеваний.
Аллели риска в комплексе с другими факторами могут привести к тяжелому течению инфекционных заболеваний. Установлено, что лица с аллелем rs5743808-A наиболее подвержены множественной лекарственной устойчивости при туберкулезе. Аллель Т в полиморфизме rs5743810 гена TLR6, который комплементарен аллелю A (rs5743810-A) при анализе последовательности в обратном направлении, является протективным (защитным) аллелем от возникновения бронхиальной астмы в детском возрасте. Аллель rs5743810-C, который является комплементарным аллелю G (rs5743810-G) при анализе последовательности в обратном направлении, наоборот, является маркером риска возникновения бронхиальной астмы [Lau MY, Dharmage SC, Burgess JA, Win AK, Lowe AJ, Lodge C, Perret J, Hui J, Thomas PS, Morrison S, Giles GG, Hopper J, Abramson MJ, Walters EH, Matheson MC. The interaction between farming/rural environment and TLR2, TLR4, TLR6 and CD 14 genetic polymorphisms in relation to early- and late-onset asthma. Sci Rep.2017 Mar 6; 7:43681. doi: 10.1038/srep43681. PMID: 28262750; PMCID: PMC5337969. Lauhkonen E, Koponen P, Vuononvirta J, Teräsjärvi J, Nuolivirta K, Toikka JO, et al. (2016) Gene Polymorphism of Toll-Like Receptors and Lung Function at Five to Seven Years of Age after Infant Bronchiolitis. PLoS ONE 11(1): e0146526. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0146526].
Детекция аллелей полиморфизма rs5743810 гена TLR6 позволит на ранних этапах определить вероятность возникновения заболеваний и их диагностирование и оказывать более эффективную медицинскую помощь пациентам.
Из уровня техники известны маркеры для оценки риска сепсиса [публикация WO 2008107377, дата приоритета 02.03.2007, дата публикации 09.12.2008], где для выявления риска развития у субъекта тяжелого сепсиса или септического шока определяют наличия вариант нуклеиновой кислоты, в том числе, rs5743810 TLR6. Данное решение не предусматривает возможности генотипирования указанного полиморфизма.
Известны варианты нуклеиновых кислот в генах толл-подобных рецепторов, ассоциированные с измененным врожденным иммунитетом [публикация WO 2007025989, дата подачи 30.08.2006, дата публикации 08.03.2007, дата приоритета 02.09.2005], где наличие минорного аллеля полиморфизма TLR6rs5743810 (экзон1) свидетельствует о более высокой предрасположенности к ревматоидному артриту. Упомянутое решение реализуется в формате мультиплекс, определяет полиморфизм rs5743810 гена TLR6 среди прочих и не применяется для целей генотипирования.
По патенту US 20110020803 (дата подачи заявки 29.09.2008, дата публикации 27.01.2011) известны маркеры для прогнозирования функции легких и колонизации инфекционным агентом, которые позволяют определять присутствие или отсутствие одного или более вариантов нуклеиновой кислоты в гене или комбинации генов. Данное решение также не позволяет дифференцировать полиморфизм rs5743810 по аллелям А или G гена TLR6, что не позволяет однозначно интерпретировать аллель по этому полиморфизму.
Известен способ прогнозирования развития иммунного ответа на биофармацевтическое лечение или диагностическое моноклональное антитело у субъекта путем идентификации одного или нескольких полиморфизмов, таких как SNP, присутствующих в одном или нескольких генах рецептора распознавания образов (PRR), где определяют наличие полиморфизма rs5743810 гена TLR6 посредством ПЦР, проводимой в формате мультиплекс [патент US 20100311052, дата подачи 26.06.2008, дата публикации 09.12.2010].
Также определение полиморфизма rs5743810 гена TLR6 посредством ПЦР, проводимой в формате мультиплекс реализовано в способы определения функционального полиморфизма фиколина-2 для прогнозирования исхода трансплантации почки [патент ЕР 2508618, дата подачи заявки 04.04.2011, дата публикации 10.10.2012].
Упомянутые выше решения реализуются в формате мультиплекс и позволяют определять ген TLR6, полиморфизм rs5743810 гена TLR6 без возможности генотипирования указанного полиморфизма.
Известны наборы реагентов для определения аллелей SNP методом ПЦР в режиме реального времени. Наборы реагентов включают в себя олигонуклеотиды для детекции нескольких специфичных аллелей в исследуемых образцах и отличаются удобством для пользователя. Для выбранных мишеней детекции не всегда подтверждена связь с заболеванием и поэтому такие наборы не всегда могут использоваться в клинической практике, но используются в научно-исследовательских целях. Из уровня техники также известен набор реагентов «ThermoFisher Scientific С_30687121_20» для определения аллелей rs5743565 гена TLR1 rhttps://www.thermoflsher.com/order/genome-database/details/genotyping/C_30687121 20?CID=&ICID=&subtype=#more-information-section]. Однако данное решение не предназначено для определения аллелей полиморфизма rs5743810 гена TLR6.
Также генотипирование локусов rs5743810 выполняли с применением реагентов для выделения ДНК («РИБО-преп»), амплификации и пробоподготовки («ПИРО-преп») производства Центрального НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора («АмплиСенс», Россия) методом пиросеквенирования с использованием реагентов PyroMark Q96 и системы генетического анализа PyroMark Q24 («Qiagen», Германия) [М.А. Карнаушкина, А.С. Гурьев, К.О. Миронов, Е.А. Дунаева, В.И. Корчагин, О.Ю. Бобкова, И.С. Васильева, Д.В. Кассина, М.М. Литвинова. Ассоциации полиморфизмов генов толл-подобных рецепторов и активности нетоза как прогностические критерии тяжести течения пневмонии. http://www.stm-journal.ru/ru/numbers/2021/3/1723/html]. Согласно описанному способу были определены rs5749810-A и rs5743810-G гена TLR6 методом пиросеквенирования, что делает его более затратным и трудоемким.
Таким образом, существует потребность в расширении точного диагностического инструментария, позволяющего в короткие сроки и с наименьшими затратами генотипировать аллели гена TLR6 по полиморфизму rs5743810 для своевременного и адекватного назначения диагностических, терапевтических и профилактических мероприятий, а также для дальнейшего изучения врожденного иммунитета и механизма возникновения и течения мультифакторных заболеваний.
Технический результат заявляемого изобретения направлен на генотипирование аллелей А и G гена TLR6 по полиморфизму rs5743810, а именно определение rs5743810-A и rs5743810-G гена TLR6, в образцах биологического материала ДНК с использованием широко распространенных методик и доступного оборудования.
Заявленный технический результат достигается за счет проведения полимеразной цепной реакции (далее - ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени с применением реакционной смеси, содержащей набор уникальных синтезированных нуклеотидных праймеров и конформационно-блокированных зондов, а генотипирование осуществляют посредством оценки кривых накопления флуоресцентных сигналов по соответствующим каналам для флуорофоров, а именно: для rs5743810-A по каналу FAM, для rs5743810- G по каналу R6G.
Упомянутый набор синтезированных нуклеотидных праймеров и зондов позволяет эффективно детектировать полиморфный нуклеотид rs5743810 в последовательности ДНК и имеет следующий олигонуклеотидный состав:
прямой праймер 3810-F - SEQ ID NO: 1,
обратный праймер 3810-R - SEQ ID NO: 2,
флуоресцентный зонд 3810-А - SEQ ID NO: 3,
флуоресцентный зонд 3810-G - SEQ ID NO: 4.
Праймеры представляют собой последовательности олигонуклеотидов для амплификации фрагмента, включающей полиморфизм rs5743810, флуоресцентные зонды являются олигонуклеотидами, содержащими флуорофор, гаситель флуоресценции, позволяющими детектировать аллели в амплифицированный фрагмент.
Заявляемый набор олигонуклеотидных праймеров и зондов разработан на основе проведенного анализа последовательностей: гена TLR6 toll like receptor 6 (Homo sapiens (human)), Gene ID: 10333, NC_000004.12, GRCh38.p14 (GCF_000001405.40), представленных в базе данных National Center for Biotechnology Information (NCBI) [NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/10333], и не имеющих гомологии с другими последовательностями ДНК. В результате выбран фрагмент для детекции участка, содержащего rs5743810 гена TLR6 к которому подобраны прямой и обратный праймеры для амплификации фрагмента длиной 84 пары оснований, а также флуоресцентные зонды для детекции аллелей А и G выбранного SNP: прямой праймер 3810-F - SEQ ID NO: 1; обратный праймер 3810-R - SEQ ID NO: 2; флуоресцентный зонд 3810-А - SEQ ID NO: 3; флуоресцентный зонд 3810-G - SEQ ID NO: 4.
При этом зонды содержат конформационно-блокированные нуклеотиды, которые позволяют повысить стабильность дуплекса с ДНК-мишенью. Флуоресцентный зонд 3810-А содержит 5 блокаторов, которые расположены в положении 2, 6, 8, 12, 14. Флуоресцентный зонд 3810-G содержит 4 блокатора, которые расположены в положении 4, 7, 11, 13.
Для подбора мишеней мест посадки олигонуклеотидов используют фрагменты референсного генома, взятые из базы данных NCBI dbSNP [NCBI dbSNP https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/обращено 12.12.2022]. Для поиска гомологичных областей применяют современные алгоритмы in silico анализа нуклеотидных последовательностей и программы, находящиеся в открытом доступе: Primer BLAST, Unipro UGENE. Состав набора о л иго нуклеотидных праймеров и зондов приведен в Таблице 1.
Анализ результатов продемонстрировал, что прямой праймер 3810-F (SEQ ID NO: 1) и обратный праймер 3810-R (SEQ ID NO: 2) амплифицируют участок гена человека TLR6, содержащий полиморфизм rs5743810 со 100% специфичностью. Также специфичность прямого и обратного праймеров подтверждена с помощью прямого метода пиросеквенирования нуклеотидных последовательностей.
Заявляемое изобретение является результатом научно-исследовательской работы лаборатории молекулярных методов изучения генетических полиморфизмов «Изучение генетической предрасположенности к мультифакторным заболеваниям», проведенной ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора (Москва, Россия).
В качестве биологического материала предпочтительно использовать венозную кровь.
ПЦР-исследование проводят в соответствии с МУ 1.3.2569-09 «Организация работ лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности». Для экстракции ДНК может быть использован комплект реагентов «РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) или любой аналогичный набор/комплект реагентов для выделения ДНК, в соответствии с инструкцией производителя. Оптимальная концентрация ДНК - 103-105 копий в 10 мкл. ПЦР в режиме реального времени проводится с применением заявляемого набора олигонуклеотидных праймеров и зондов для детекции аллелей полиморфизма rs5743810 гена человека TLR6, представленных в Таблице 1.
ПЦР проводят при следующих условиях:
Общий объем реакционной смеси - 25 мкл.
Компоненты ПЦР смешиваются следующим образом:
(a) 10 мкл смеси, содержащей:
- олигонуклеотидные праймеры SEQ ID NO NO: 1, 2 - по 0,07 мМ;
- флуоресцентные зонды SEQ ID NO NO: 3, 4 - по 0,02 мМ
- dNTPs - 0,44 мМ.
(b) реактив, содержащий рекомбинантный фермент Taq ДНК-полимеразу, например, 0,5 мкл «Полимераза TaqF» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, Россия) или любого аналогичного коммерческого набора в соответствии с инструкцией производителя.
(c) ПЦР-буфер, содержащий MgCl2, например, 5,0 мкл ПЦР-буфера «ОТ-ПЦР-смесь-2 FEP/FRT» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, Россия) или любого аналогичного коммерческого набора в соответствии с инструкцией производителя.
(d) экстрагированная из цельной крови человека ДНК - 10 мкл.
Амплификацию проводят на амплификаторе с возможностью детекции флуоресцентного сигнала как минимум по 2 каналам флуоресценции, например, «Rotor-Gene Q» («Qiagen», Германия) в соответствии с инструкцией производителя.
Амплификацию проводят по следующей программе: 1 цикл 95°С в течение 15 минут, 45 циклов при температуре 95°С - 10 секунд / 60°С - 20 секунд. Детекция флуоресценции проводится на этапе 60°С по каналу для флуорофора FAM - для rs5743810-А, по каналу для флуорофора R6G для rs5743810-G.
Анализ данных проводится на основе детекции амплификатором уровня флуоресцентного сигнала. Результаты интерпретируются на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции S-образной (сигмообразной) формы с установленной на соответствующем уровне пороговой линией. Это определяет наличие или отсутствие для анализируемого образца значения порогового цикла. В процессе амплификации ДНК зонды конкурируют за связывание с матрицей ДНК, содержащем два праймера SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2. При этом преимущество получает зонд, соответствующий представленному в образце аллели. Если присутствуют два аллеля полиморфизма, гибридизуются оба зонда.
Для каждого канала задают пороговую линию, соответствующую величине 10% от максимального сигнала флуоресценции образца среди образцов с определенным аллелем. Образцы, для которых кривые флуоресценции пересекают пороговую линию по каналу для детекции флуорофора FAM и при этом кинетика накопления флуоресцентного сигнала является экспоненциальной, содержат аллель А полиморфизма rs5743810 гена TLR6. Образцы, для которых кривые флуоресценции пересекают пороговую линию по каналу для детекции флуорофора R6G и при этом кинетика накопления флуоресцентного сигнала является экспоненциальной, содержат аллель G полиморфизма rs5743810 гена TLR6.
Образцы, для которых кривые флуоресценции пересекли пороговые линии по каналам для детекции флуорофоров FAM и R6G и при этом кинетика накопления флуоресцентного сигнала является экспоненциальной, содержат rs5743810-A и rs5743810-G.
Реализация заявляемого изобретения поясняется следующими примерами:
Пример 1. Получение набора олигонуклеотидных праймеров и зондов для генотипирования аллелей гена TLR6 по полиморфизму rs5743810
Для подбора целевых последовательностей - мест посадки олигонуклеотидов, использовали фрагменты гена TLR6 toll like receptor 6 (Homo sapiens (human)), Gene ID: 10333, NC_000004.12, GRCh38.p14 (GCF_000001405.40), представленных в базе данных National Center for Biotechnology Information (NCBI) [NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/10333], и не имеющих гомологии с другими последовательностями ДНК. Для поиска гомологичных областей использовали современные алгоритмы in silico анализа нуклеотидных последовательностей и программы Primer BLAST, Unipro UGENE, MEGA.
В результате проведенного анализа выбран участок гомологичной последовательности, к которому подобрали праймеры и зонды для амплификации фрагмента длиной 84 пар оснований, а также флуоресцентные зонды для детекции аллелей А и G выбранного SNP: прямой праймер 3810-F - SEQ ID NO: 1; обратный праймер 3810-R - SEQ ID NO: 2; флуоресцентный зонд 3810-А - SEQ ID NO: 3; флуоресцентный зонд 3810-G - SEQ ID NO: 4. При этом каждый зонд содержат конформационно заблокированные нуклиотиды, а именно: флуоресцентный зонд 3810-А содержит 5 блокаторов, которые расположены в положении 2, 6, 8, 12, 14, а флуоресцентный зонд 3810-G содержит 4 блокатора, которые расположены в положении 4, 7, 11, 13.
Анализ упомянутых последовательностей с использованием ресурса Primer BLAST [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/] показал, что прямой 3810-F и обратный 3810-R праймеры амплифицируют участок, содержащий полиморфизм rs5743810 в гене TLR6 со 100% специфичностью.
Пример 2. Детекция аллелей А и G гена TLR6 по полиморфизму rs5743810 методом ПЦР в режиме реального времени
ПЦР в режиме реального времени проводили при следующих условиях.
Общий объем реакционной смеси - 25 мкл.
Компоненты ПЦР смешиваются следующим образом:
(a) 10 мкл смеси, содержащей:
- олигонуклеотидные праймеры: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 - по 0,07 мМ;
- флуоресцентные зонды SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 - по 0,02 мМ;
- dNTPs - 0,44 мМ.
(b) 0,5 мкл реактива «Полимераза TaqF» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия), содержащего рекомбинантный фермент Taq ДНК-полимеразу.
(c) 5,0 мкл ПЦР-буфера «ОТ-ПЦР-смесь-2 FEP/FRT» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия), содержащего MgCl2;
(d) экстрагированная из цельной венозной крови человека ДНК - 10 мкл.
ПЦР в режиме реального времени проводили с флуоресцентной детекцией результата на приборе с 5 каналами детекции - «Rotor-Gene Q» («Qiagen», Германия).
Подготовленный описанным способом материал, содержащий уникальные олигонуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 1-4, использовали для определения аллелей rs5743810 гена TLR6 в образцах биологического материала.
Пример 3. Генотипирование аллелей А и G гена TLR6 по полиморфизму rs5743810 в образцах биологического материала
Для определения аллелей rs5743810 гена человека TLR6 в образцах биологического материала выбрано 71 проба, для исследования использовали биологический материал - венозная кровь. Выделение ДНК проводили в соответствии с МУ 1.3.2569-09 «Организация работ лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности». Для экстракции ДНК использовали набор реагентов «РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) в соответствии с инструкцией производителя.
ПЦР-РРВ проводили в условиях, описанных в Примере 2, с использованием уникальных синтезированных олигонуклеотидных праймеров и зондов SEQ ID NO: 1-4.
Амплификацию проводили на приборе «Rotor-Gene Q» («Qiagen», Германия) по следующей программе: 1 цикл 95°С в течение 15 минут, 45 циклов при температуре 95°С - 10 секунд / 60°С - 20 секунд. Детекция флуоресцентного сигнала проводилась на этапе 60°С по каналу для флуорофора FAM - для алелля А, и по каналу для флуорофора R6G для алелля G.
При анализе результатов для каждого канала задали пороговую линию, соответствующую величине 10% от максимального сигнала флуоресценции образца среди образцов с определенным аллелем.
Для 22/71 образцов кривая флуоресценции пересекла пороговую линию по каналу для флуорофора FAM, для 49/71 образцов кривая флуоресценции пересекла пороговую линию по каналу для флуорофора R6G, при этом кинетика накопления флуоресцентных сигналов была экспоненциальной.
По каналу для флуорофора FAM определили наличие аллеля rs5743810-A, по каналу для флуорофора R6G определили наличие аллеля rs5743810-G полиморфизма.
Результаты исследования были подтверждены с помощью метода пиросеквенирования нуклеотидных последовательностей, которое выполнялось посредством системы генетического анализа PyroMark Q24 («Qiagen», Германия) в соответствии с инструкцией производителя.
Пример 4. Генотипирование аллелей А и G гена TLR6 по полиморфизму rs5743810 в образцах биологического материала
Для определения аллелей rs5743810 гена человека TLR6 в образцах биологического материала выбрано 27 проб, для исследования использовали биологический материал - цельная кровь. Выделение ДНК проводили в соответствии с МУ 1.3.2569-09 «Организация работ лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности». Для экстракции ДНК использовали набор реагентов «РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) в соответствии с инструкцией производителя.
ПЦР-РРВ проводили в условиях, описанных в Примере 2, с использованием уникальных синтезированных олигонуклеотидных праймеров и зондов SEQ ID NO: 1-4.
Амплификацию проводили на приборе «Rotor-Gene Q» («Qiagen», Германия) по следующей программе: 1 цикл 95°С в течение 15 минут, 45 циклов при температуре 95°С - 10 секунд / 60°С - 20 секунд. Детекция флуоресцентного сигнала проводилась на этапе 60°С по каналу для флуорофора FAM - для rs5743810-A, и по каналу для флуорофора R6G - для rs5743810-G.
При анализе результатов для каждого канала задали пороговую линию, соответствующую величине 10% от максимального сигнала флуоресценции образца среди образцов с определенным аллелем.
Для 27/27 образцов кривая флуоресценции пересекла пороговую линию по каналу для флуорофора FAM, что позволило определить наличие аллеля А полиморфизма rs5743810 гена TLR6 в 27 образцах из выборки.
Результаты исследования были подтверждены с помощью метода пиросеквенирования нуклеотидных последовательностей, которое выполнялось посредством системы генетического анализа PyroMark Q24 («Qiagen», Германия) в соответствии с инструкцией производителя.
Пример 5. Генотипирование аллелей А и G гена TLR6 по полиморфизму rs5743810 в образцах биологического материала
Для определения аллелей rs5743810 гена человека TLR6 в образцах биологического материала выбрано 32 пробы, для исследования использовали биологический материал -венозная кровь. Выделение ДНК проводили в соответствии с МУ 1.3.2569-09 «Организация работ лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности». Для экстракции ДНК использовали набор реагентов «РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) в соответствии с инструкцией производителя.
ПЦР-РРВ проводили в условиях, описанных в Примере 2, с использованием уникальных синтезированных олигонуклеотидных праймеров и зондов SEQ ID NO: 1-4.
Амплификацию проводили на приборе «Rotor-Gene Q» («Qiagen», Германия) по следующей программе: 1 цикл 95°С в течение 15 минут, 45 циклов при температуре 95°С -10 секунд / 60°С - 20 секунд. Детекция флуоресцентного сигнала проводилась на этапе 60°С по каналу для флуорофора FAM для rs5743810-A, и по каналу для флуорофора R6G для rs5743810-G.
При анализе результатов для каждого канала задали пороговую линию, соответствующую величине 10% от максимального сигнала флуоресценции образца среди образцов с определенным аллелем.
Для 32/32 образцов кривая флуоресценции пересекла пороговую линию по каналу для флуорофора R6G, что позволило определить наличие аллеля G полиморфизма rs5743810 гена TLR6 в 32 образцах из выборки.
Результаты исследования были подтверждены с помощью метода пиросеквенирования нуклеотидных последовательностей, которое выполнялось посредством системы генетического анализа PyroMark Q24 («Qiagen», Германия) в соответствии с инструкцией производителя.
Пример 6. Генотипирование аллелей А и G гена TLR6 по полиморфизму rs5743810 в образцах биологического материала
Для определения аллелей rs5743810 гена человека TLR6b образцах биологического материала выбрано 84 пробы, для исследования использовали биологический материал - цельная кровь. Выделение ДНК проводили в соответствии с МУ 1.3.2569-09 «Организация работ лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности». Для экстракции ДНК использовали набор реагентов «РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) в соответствии с инструкцией производителя.
ПЦР в режиме реального времени проводили в условиях, описанных в Примере 2, с использованием уникальных синтезированных олигонуклеотидных праймеров и зондов SEQ ID NO: 1-4.
Амплификацию проводили на приборе «Rotor-Gene Q» («Qiagen», Германия) по следующей программе: 1 цикл 95°С в течение 15 минут, 45 циклов при температуре 95°С 10 секунд / 60°С - 20 секунд. Детекция флуоресцентного сигнала проводилась на этапе 60°С по каналу для флуорофора FAM - для алелля А, и по каналу для флуорофора R6G - для алелля G.
При анализе результатов для каждого канала задали пороговую линию, соответствующую величине 10% от максимального сигнала флуоресценции образца среди образцов с определенным аллелем.
Для 26/84 образцов кривая флуоресценции пересекла пороговую линию по каналу для флуорофора FAM, для 43/84 образцов кривые флуоресценции пересекли пороговую линию по каналу для флуорофора R6G, для 15/84 образцов кривая флуоресценции пересекла пороговые линии по каналам для флуорофора FAM и R6G, при этом кинетика накопления флуоресцентных сигналов была экспоненциальной.
По каналу для флуорофора FAM определили наличие ДНК rs5743810-A, по каналу для флуорофора R6G определили наличие ДНК rs5743810-G, наличие сигналов по двум каналам для флуорофоров FAM и R6G одновременно подтвердили присутствие ДНК двух аллелей - rs5743810-А и rs5743810-G.
Результаты исследования были подтверждены с помощью метода пиросеквенирования нуклеотидных последовательностей, которое выполнялось посредством системы генетического анализа PyroMark Q24 («Qiagen», Германия) в соответствии с инструкцией производителя.
Таким образом, заявляемое изобретение позволяет детектировать аллели rs5743810-A и rs5743810-G гена TLR6 в образцах биологического материала. Набор уникальных синтезированных олигонуклеотидных праймеров и зондов SEQ ID NO: 1-4 не дает перекрестных реакций с другими последовательностями генома, амплифицирует последовательность, включающую rs5743810, со 100% специфичностью и позволяют однозначная интерпретировать полученные результаты.
--->
<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_2" fileName="rs5743810"
softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="1.0.0"
productionDate="2023-04-12">
<ApplicationIdentification>
<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>
<ApplicationNumberText>no</ApplicationNumberText>
<FilingDate>2023-04-11</FilingDate>
</ApplicationIdentification>
<ApplicantFileReference>01</ApplicantFileReference>
<ApplicantName languageCode="ru">ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии
Роспотребнадзора</ApplicantName>
<ApplicantNameLatin>FBUN CRIE</ApplicantNameLatin>
<InventionTitle languageCode="ru">Способ генотипирования гена TLR6 по
полиморфизму rs5743810 и набор олигонуклеотидных праймеров и зондов
для его реализации</InventionTitle>
<SequenceTotalQuantity>4</SequenceTotalQuantity>
<SequenceData sequenceIDNumber="1">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>29</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..29</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>rs5743810</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ctatgtggttgagggtaaaattcagtaag</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="2">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>26</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..26</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>rs5743810</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tgaatgatgacaactgtcaagttttc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="3">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>15</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..15</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>rs5743810</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>aaggttgaacctctg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="4">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>14</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..14</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>rs5743810</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>aggttggacctctg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
</ST26SequenceListing>
<---
Claims (10)
1. Способ генотипирования аллелей A и G гена TLR6 по полиморфизму rs5743810, включающий: экстракцию ДНК из биологического материала, проведение ПЦР в режиме реального времени с применением реакционной смеси, содержащей набор нуклеотидных праймеров и зондов SEQ ID NO: 1-4, амплификацию, анализ и интерпретацию результатов, где наличие аллеля А гена TLR6 по полиморфизму rs5743810 определяется посредством оценки кривых накопления флуоресцентных сигналов по каналу для флуорофора FAM, а наличие в образце экологического материала аллели G гена TLR6 по полиморфизму rs5743810 определяется посредством оценки кривых накопления флуоресцентных сигналов по каналу для флуорофора R6G.
2. Способ генотипирования по п. 1, где наличие в образце биологического материала аллеля А гена TLR6 по полиморфизму rs5743810 и аллеля G гена TLR6 по полиморфизму rs5743810 определяется посредством оценки кривых накопления флуоресцентных сигналов по каналам FAM и R6G одновременно.
3. Способ генотипирования по пп. 1 и 2, где для анализа результатов задают пороговую линию, соответствующую величине 10% от максимального сигнала флуоресценции образца среди образцов с определенным аллелем.
4. Набор олигонуклеотидных праймеров и зондов для применения в способе генотипирования по пп. 1 и 2, имеющий следующий нуклеотидный состав:
прямой праймер 3810-F - SEQ ID NO: 1;
обратный праймер 3810-R - SEQ ID NO: 2;
флуоресцентный зонд 3810-А - SEQ ID NO: 3;
флуоресцентный зонд 3810-G - SEQ ID NO: 4,
при этом флуоресцентный зонд 3810-А содержит конформационно-блокированные нуклеотиды, расположенные в положении 2, 6, 8, 12, 14, а флуоресцентный зонд 6790-G содержит конформационно-блокированные нуклеотиды, расположенные в положении 4, 7, 11, 13.
5. Набор олигонуклеотидных праймеров и зондов по п. 4, где для создания прямого и обратного праймеров, флуоресцентных зондов используют фрагмент гена TLR6 Homo sapiens.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2805863C1 true RU2805863C1 (ru) | 2023-10-24 |
Family
ID=
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2835399C1 (ru) * | 2024-09-12 | 2025-02-25 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Курский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ генотипирования однонуклеотидного варианта rs1052133 (C>G) гена OGG1 человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008107377A2 (en) * | 2007-03-02 | 2008-09-12 | Innogenetics N.V. | Combinations of markers for sepsis risk assessment |
| US20100311052A1 (en) * | 2007-06-29 | 2010-12-09 | Biomonitor A/S | Prognostic method for the determination of the suitability of biopharmaceutical treatment |
| EP2508618A1 (en) * | 2011-04-04 | 2012-10-10 | Innogenetics N.V. | Methods and means for determining a functional polymorphism in ficolin-2 for predicting the outcome of kidney transplantation |
| RU2641033C1 (ru) * | 2017-05-17 | 2018-01-15 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний" (НИИ КПССЗ) | Способ прогнозирования риска развития синдрома полиорганной недостаточности у пациентов после коронарного шунтирования |
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008107377A2 (en) * | 2007-03-02 | 2008-09-12 | Innogenetics N.V. | Combinations of markers for sepsis risk assessment |
| US20100311052A1 (en) * | 2007-06-29 | 2010-12-09 | Biomonitor A/S | Prognostic method for the determination of the suitability of biopharmaceutical treatment |
| EP2508618A1 (en) * | 2011-04-04 | 2012-10-10 | Innogenetics N.V. | Methods and means for determining a functional polymorphism in ficolin-2 for predicting the outcome of kidney transplantation |
| RU2641033C1 (ru) * | 2017-05-17 | 2018-01-15 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний" (НИИ КПССЗ) | Способ прогнозирования риска развития синдрома полиорганной недостаточности у пациентов после коронарного шунтирования |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| М.А. Карнаушкина и др., Ассоциации полиморфизмов генов толл-подобных рецепторов и активности нетоза как прогностические критерии тяжести течения пневмонии, том 13, номер 3 (2021), весь документ, http://www.stm-journal.ru/ru/numbers/2021/3/1723/html. Сташкевич Д.С. и др., СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА ГЕНЕТИЧЕСКОГО ПОЛИМОРФИЗМА TOLL-ПОДОБНЫХ РЕЦЕПТОРОВ 2 И 6 В АССОЦИАЦИИ С ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТЬЮ К НЕСПЕЦИФИЧЕСКОМУ ЯЗВЕННОМУ КОЛИТУ И СИНДРОМУ РАЗДРАЖЕННОГО КИШЕЧНИКА У РУССКИХ ЧЕЛЯБИНСКОЙ ОБЛАСТИ, Российский иммунологический журнал, 2022, т. 25, 3, с. 328-332. * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2835399C1 (ru) * | 2024-09-12 | 2025-02-25 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Курский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ генотипирования однонуклеотидного варианта rs1052133 (C>G) гена OGG1 человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени |
| RU2843692C1 (ru) * | 2024-10-15 | 2025-07-17 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора) | Способ генотипирования полиморфизма rs12143842 гена NOS1AP и набор олигонуклеотидных праймеров и зондов для его реализации |
| RU2843693C1 (ru) * | 2024-12-25 | 2025-07-17 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора) | Способ генотипирования полиморфизма rs2074238 в гене KCNQ1 и набор олигонуклеотидных праймеров и зондов для его реализации |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20100240057A1 (en) | Methods and compositions for the diagnosis and treatment of chronic myeloid leukemia and acute lymphoblastic leukemia | |
| EP2847593A1 (en) | Methods for predicting and detecting cancer risk | |
| AU2012212499A1 (en) | Method for discovering pharmacogenomic biomarkers | |
| US20100304996A1 (en) | B cell signature associated with tolerance in transplant recipients | |
| KR102041001B1 (ko) | Ｆｌｔ３ 유전자 변이 정량분석방법 및 분석 키트 | |
| US20200216903A1 (en) | Mitochondrial Disease Genetic Diagnostics | |
| US11535897B2 (en) | Composite epigenetic biomarkers for accurate screening, diagnosis and prognosis of colorectal cancer | |
| RU2805863C1 (ru) | Способ генотипирования гена TLR6 по полиморфизму rs5743810 и набор олигонуклеотидных праймеров и зондов для его реализации | |
| RU2805860C1 (ru) | Способ генотипирования гена TLR2 по полиморфизму rs3804100 и набор олигонуклеотидных праймеров и зондов для его реализации | |
| RU2805862C1 (ru) | Способ генотипирования гена TLR4 по полиморфизму rs4986790 и набор олигонуклеотидных праймеров и зондов для его реализации | |
| KR101532308B1 (ko) | 복부비만 예측용 ｓｎｐ 마커 및 이의 용도 | |
| RU2805864C1 (ru) | Способ генотипирования гена TLR8 по полиморфизму rs3764880 и набор олигонуклеотидных праймеров и зондов для его реализации | |
| RU2805861C1 (ru) | Способ генотипирования гена TLR2 по полиморфизму rs5743708 и набор олигонуклеотидных праймеров и зондов для его реализации | |
| RU2805859C1 (ru) | Способ генотипирования гена TLR1 по полиморфизму rs5743551 и набор олигонуклеотидных праймеров и зондов для его реализации | |
| CN106811545B (zh) | 一种预测高甘油三酯血症的易感性的方法与试剂 | |
| TWI661050B (zh) | 評估子宮頸癌風險之方法 | |
| US20120264633A1 (en) | Methods for detecting thrombocytosis using biomarkers | |
| KR102268059B1 (ko) | 운동 민감도 예측용 조성물, 키트, 및 이를 이용한 방법 | |
| WO2010142751A1 (en) | In vitro diagnosis/prognosis method and kit for assessment of chronic antibody mediated rejection in kidney transplantation | |
| RU2843692C1 (ru) | Способ генотипирования полиморфизма rs12143842 гена NOS1AP и набор олигонуклеотидных праймеров и зондов для его реализации | |
| JP2022025456A (ja) | 多発性硬化症を検査する方法 | |
| RU2749465C1 (ru) | Способ определения генетических маркеров для оценки полигенного риска развития рака молочной железы (гормон-негативного и гормон-позитивного подтипов) | |
| RU2802421C1 (ru) | Набор реактивов для одновременного выявления пяти основных соматических мутаций Ph-негативных миелопролиферативных новообразований и способ диагностики на его основе | |
| RU2753002C1 (ru) | Способ определения генетических маркеров для оценки полигенного риска развития гормон-позитивного подтипа рака молочной железы | |
| WO2023011624A1 (en) | Compositions and methods for fast multiplexed screening and monitoring of npm1 mutations |