RU2803796C1 - Способ дифференцированного применения данных секвенирования днк для пациентов после трансплантации почки - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к медицине, трансплантологии, онкологии, может быть использовано для диагностики наследственных форм рака органов репродуктивной системы у пациентов после трансплантации. У пациентов после трансплантации почки не ранее чем через 60 дней выполняют забор венозной крови у пациентов, далее - выделение ДНК из полученных образцов; подготовка библиотек ДНК; секвенирование ДНК - секвенирование белок-кодирующих генов человека методом парно-концевых прочтений с использованием целевого обогащения геномной ДНК. Идентификация отклонений осуществляется путем выявления патогенных мутаций в генах BRCA1 и BRIP 1, на основе биоинформатического анализа данных секвенирования ДНК. В случае обнаружения ранее не описанного в литературе варианта в гетерозиготном состоянии во 2-м экзоне (из 20) в гене BRIP1, приводящего к замене аминокислоты лизин на аспарагин в положении 14 (p.Lys14Asn, мутация типа миссенс), предрасположенность к раку молочной железы (114480; AD), изменение ДНК (hg19) изменение транскрипта и изменение белка -chr17:g.59938859C>A ENST00000259008.2: c.42G>T ENSP00000259008.2: p.Lys14Asn, необходимо сопоставить результат с клиническими данными обследования онколога и врача-генетика. В случае обнаружения ранее описанного варианта (rs80357906) в гетерозиготном состоянии в 20-м экзоне гена BRCA1, приводящего к сдвигу рамки считывания, начиная с 1777 кодона, и преждевременной терминации синтеза белка (p.Gln1777ProfsTer74, мутация типа фреимшифт). Являющегося абсолютно патогенным в ассоциированном наследовании заболеваний наследственного рака молочной железы и яичников, тип 1 (604370; AD), - консультация врача онколога и трансплантолога для решения вопроса о превентивном оперативном лечении и коррекции иммуносупрессивной терапии. 2 пр.

Description

Изобретение относится к медицине, трансплантологии, онкологии, может быть использовано для диагностики наследственных форм рака органов репродуктивной системы (рака молочной железы и рака яичников) у пациентов после трансплантации почки. Основано на выявлении патогенных гетерозиготных вариантов в гене BRIP 1 и BRCA1. Изобретение обеспечивает выявление предрасположенности к раку молочной железы и раку яичников у пациентов после трансплантации почки.

Анализ более чем полувекового опыта трансплантации аллогенных органов в клиниках мира показывает постепенное увеличение популяции людей, живущих с пересаженными органами: в 2002 г. число таких пациентов составило 150 тыс. (Sayegh, Carpenter, 2004), к 2010 году оно увеличилось втрое. По всему миру за последние 45 лет (с 1967 по 2013 г.) было проведено более 100000 трансплантаций сердца (Messer, S. Normothermic donor heart perfusion: current clinical experience and the future / S. Messer, A. Ardehali, S. Tsui // Transp.Int. - 2015. - Vol. 28, N. 6. - P. 634-642.) Согласно данным International Pancreas Transplant Registry (IPTR), с 1966 г. по 2008 г. в мире было выполнено более 30000 трансплантаций поджелудочной железы. Из них количество наблюдений в США составило 22000 и более 8000 в других странах. За период 2004-2008 гг. наиболее частым видом была симультанная трансплантация комплекса поджелудочная железа-почка (73%) (Gruessner А.С., Sutherland D.E. Pancreas transplant outcomes for United States (US) cases as reported to the United Network for Organ Sharing (UNOS) and the International Pancreas Transplant Registry (IPTR), Clin. Transpl. 2008. 45-56). В настоящее время в мировой практике проводятся операции по пересадке почки, печени, поджелудочной железы, сердца, легких, комплекса «сердце-легкие». Реже выполняются операции по пересадке тонкой кишки, конечностей, лица. В России осуществляется трансплантация всех жизненно важных органов: почки, печени, поджелудочной железы, сердца и легких.

На фоне увеличения численности пациентов с трансплантированными солидными органами пропорционально высоким стал риск развития онкологических заболеваний, которые становятся причиной низкого качества жизни и высокой смертности пациентов с пересаженными органами (Хубутия, М.Ш., «Трансплантация органов и тканей в многопрофильном научном центре», Москва, 2011 г. стр. 411-413).

Возникновение опухолей женской репродуктивной системы у пациенток с трансплантированными органами в настоящее время является констатируемым фактом. По результатам исследования Уэльского университета, среди 200000 случаев трансплантаций онкологические заболевания встречались в 22-26% случаев (Site-specific meta-SIRs for population-based studies of solid organ transplant recipients. [Modified from Lancet, 370, Grulich et al., 59-67. Copyright Elsevier (2007)]. Ежегодно в мире регистрируется 11 млн. новых случаев рака и более 6,6 млн. смертей в год от онкологических заболеваний у женщин. От 5 до 40% злокачественных новообразований всех анатомических локализаций имеют наследственную этиологию, и этот процент возрастает пропорционально росту общей заболеваемости. Рак молочной железы является одним из наиболее распространенных и наиболее смертоносных видов рака среди женщин. Заболеваемость раком молочной железы быстро растет во всем мире (2,1 миллиона новых случаев и 700000 смертей в год) [F. Bray, J. Ferlay, I. Soerjomataram, R. Siegel, L. Torre, A. Jemal, Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries., CA A J. Clin. 00 (2018) 1-31].

Белки BRCA1 и BRCA2 способствуют транскрипционной регуляции некоторых генов, участвующих в восстановлении повреждения ДНК, регуляции клеточного цикла и апоптозе. Белки BRCA необходимы для поддержания стабильности хромосом, тем самым защищая геном от повреждения [K. Yoshida, Y. Miki, Role of BRCA 1 and BRCA2 as regulators of DNA repair, transcription, and cell cycle in response to DNA damage, Cancer Sci. (2004)]. Мутации в генах BRCA1 и BRCA2 отвечают почти за половину наследственных мутаций при раке молочной железы [N. Tung, С.Battelli, В. Allen, R. Kaldate, S. Bhatnagar, K. Bowles, K. Timms, J.E. Garber, C. Herold, L. Ellisen, J. Krejdovsky, K. DeLeonardis, K. Sedgwick, K. Soltis, B. Roa, R.J. Wenstrup, A.R. Hartman, Frequency of mutations in individuals with breast cancer referred for BRCA1 and BRCA2 testing using next-generation sequencing with a 25-gene panel, Cancer. (2015).]. Мутации BRCA1 (5382insC, 4154delA, 185delAG) находят в 16% случаев рака молочной железы высокого риска в России [A.G. Iyevleva, E.N. Suspitsin, K. Kroeze, T.V. Gorodnova, A.P. Sokolenko, K.G. Buslov, D.A. Voskresenskiy, A.V. Togo, S.P. Kovalenko, N. van der Stoep, P. Devilee, E.N. Imyanitov, Non-founder BRCA1 mutations in Russian breast cancer patients, Cancer Lett. (2010)]. Модификации сдвига рамки считывания 5382insC в экзоне 20 являются наиболее частыми мутациями у пациентов, относящихся к славянским популяциям с раком молочной железы и раком яичников. Нами при обследовании группы пациенток по поводу рака молочной железы после трансплантации почки был обнаружен ген BRIP 1, ранее не описанный в литературе вариант в гетерозиготном состоянии во 2-м экзоне (из 20) в гене BRIP1, приводящий к замене аминокислоты лизин на аспарагин в положении 14 (p.Lys14Asn, мутация типа миссенс). Согласно клиническим рекомендациям Национальной онкологической сети США (NCCN), гетерозиготное носительство патогенных мутаций в гене BRIP1 ассоциировано с повышенным риском развития рака яичников и рака молочной железы, однако для оценки риска развития других типов рака, в том числе рака молочной железы, имеющихся литературных данных в настоящий момент в мировой практике недостаточно (Suszynska М, Ratajska М, Kozlowski P. BRIP1, RAD51C, and RAD51D mutations are associated with high susceptibility to ovarian cancer: mutation prevalence and precise risk estimates based on a pooled analysis of ~30,000 cases. J Ovarian Res. 2020 May 2;13(1):50. PMID: 32359370). Кроме того, патогенные варианты в этом гене могут приводить к анемии Фанкони, комплементационной группы J (OMIM: 609054). Вариант отсутствует в базе данных популяционных частот gnomAD. Результаты in silico алгоритмов предсказания эффекта вариантов свидетельствуют как о патогенном (MutationTaster), так и о безвредном (MetaSVM, SIFT) влиянии данной замены на структуру белка. Вариант затрагивает умеренно консервативную аминокислоту. В базе данных ClinVar вариант описан как вариант с неизвестной клинической значимостью (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/variation/1006522). В настоящее время задачи, решаемые методом секвенирования ДНК, имеют широкое применение в различных областях современной медицины и требуют объективной оценки эффективности.

Известен способ прогнозирования риска возникновения злокачественных новообразований женских половых органов и молочных желез (RU 2578459, опубл. 27.03.2016). Для осуществления способа у женщин репродуктивного возраста выявляют признаки наследственных нарушений (ННСТ) соединительной ткани в разных системах и органах, как минимум одного генетического и как минимум одного анамнестического факторов тромбогенного риска (ФТР) и инфицирования генитального тракта. В соответствии с выявленными признаками устанавливают низкий, средний или высокий риск возникновения злокачественных новообразований женских половых органов и молочных желез. Недостатком данного способа является потребность в оценке сразу нескольких факторов, в том числе генетических, что длительно как по времени, так и по трудозатратам.

Известен способ прогнозирования наследственной предрасположенности к раку молочной железы на основе идентификации мутации в гене BLM (RU 2522501, опубл. 20.07.2014). Способ характеризуется тем, что проводят амплификацию коротких фрагментов гена BLM протяженностью до 200 п. о., с последующим высокоразрешающим плавлением, включающим оптимизированный для гена BLM этап формирования гетеродуплексов: быстрый нагрев до 95°С и медленное снижение температуры до 50°С; выбирают один фрагмент с аберрантным профилем плавления для секвенирования, секвенируют выбранный фрагмент и при выявлении мутации гена BLM прогнозируют наследственную предрасположенность к раку молочной железы. Недостатком данного способа является потребность в секвенировании фрагмента ДНК, что увеличивает трудоемкость, время и стоимость анализа.

Известен способ диагностики предрасположенности к раку молочной железы (RU 2470998, опубл. 27.12.2012), взятый за прототип. Этот способ выявления повышенного риска заболевания субъекта-человека раком молочной железы основан на результатах анализа образца ДНК на наличие SNP в позициях 142, 355 и 4326 гена CYP1B1; делеционных вариантов 1100 delC, del5395, а также IVS2+1G>A гена СНЕК2 и замены С5972Т в гене BRCA2. При этом в способе определены комбинированные генотипы по всем указанным позициям трех названных генов, при которых риск развития рака молочной железы превышает сумму эффектов, определяемых соответствующими вариантами каждого из трех генов в отдельности, которые рассматриваются как признак особой предрасположенности субъекта к заболеванию (непропорционально высокого риска заболевания) раком молочной железы. Недостатком данного способа является сложность в расчете предрасположенности человека к раку молочной железы после проведения генотипирования, которая в конечном итоге может привести к неоднозначному интерпретированию полученных результатов. Кроме того, в одном гене анализируются сразу несколько мутаций в гене CYP1B1, а также делеция и нуклеотидные замены в других генах, что значительно увеличивает трудоемкость, стоимость и время анализа.

Наиболее близким к заявляемому решению является способ диагностики предрасположенности к раку молочной железы в русской популяции на основе ПЦР-ПДРФ. Автор(ы) (Попов Василий Николаевич (RU), Солодских Сергей Алексеевич (RU), Сыромятников Михаил Юрьевич (RU), Михайлов Андрей Анатольевич (RU), патент на изобретение RU 2723585 С2). Способ выявления предрасположенности к раку молочной железы на основе амплификации трех регионов генов BRCA1 и BRCA2 с последующим рестрикционным анализом амплифицированных регионов реализуется следующим образом:

1. Осуществляется выделение ДНК из крови пациента. Для этого могут быть использованы как методы органической экстракции, так и коммерческие доступные наборы для выделения ДНК и крови.

2. Проводятся 3 отдельные реакции ПЦР со следующими праймерами и условиями реакции.

Реакция №1 (анализ rs 1799966). Прямой праймер CCCTGCTCACACTTTCTTCC; обратный праймер AAGACAGAGCCCCAGAGTCA. Условия реакции: 94°С 4 мин, 35 циклов (94°С 30 сек 58°С 30 сек, 72°С 30 сек.), конечная элонгация: 72°С, 5 мин. В ходе реакции ПЦР формируется продукт ПЦР длиной 162 п. н., который используется для реакции рестрикции по следующей схеме: берут 10 мкл ПЦР продукта, добавляют 1,5 мкл 10Х реакционного буфера и 5-10 ед. рестриктазы Hinfl. Объем доводят до 15 мкл деионизированной водой. Инкубируют смесь в течение 1,5 часов при 37°С, фермент инактивируют нагревом до 75°С в течение 15 минут. Визуализацию продуктов рестрикции проводят с помощью электрофореза в 3% агарозном геле. В отсутствие мутации (в норме) будут два фрагмента рестрикции длиной 66 п. н. и 96 п. н. При наличии мутации на электрофореграмме будет виден продукт длиной 162 п. н.

Реакция №2 (анализ rs 1799967). Прямой праймер CAAATTCTTCTGGGGTCA; обратный праймер CCCAATTGAAAGTTGCAG. Условия реакции: 94°С 4 мин, 35 циклов (94°С 30 сек 56°С 30 сек, 72°С 30 сек.), конечная элонгация: 72°С 5 мин. В ходе реакции ПЦР формируется продукт ПЦР длиной 180 п. н., который используется для реакции рестрикции по следующей схеме: берут 10 мкл ПЦР продукта, добавляют 1,5 мкл 10Х реакционного буфера и 5-10 ед. рестриктазы Ncol. Объем доводят до 15 мкл деионизированной водой. Инкубируют смесь в течение 1,5 часов при 37°С, фермент инактивируют нагревом до 75°С в течение 15 минут. Визуализацию продуктов рестрикции проводят с помощью электрофореза в 3% агарозном геле. В отсутствие мутации будут два фрагмента рестрикции длиной 31 п. н. и 149 п. н. При наличии мутации (в норме) на электрофореграмме будет виден продукт длиной 180 п. н.

Реакция №3 (анализ rs 4987117). Прямой мутагенный праймер CTCTCTAGATAATGATGAATGTAGCG; обратный праймер GAAACTTTCTCCAATCCAGACA. Условия реакции: 94°С 4 мин, 35 циклов (94°С 30 сек 54°С 30 сек, 72°С 30 сек.), конечная элонгация: 72°С 5 мин. В ходе реакции ПЦР формируется продукт ПЦР длиной 112 п. н., который используется для реакции рестрикции по следующей схеме: берут 10 мкл ПЦР продукта, добавляют 1,5 мкл 10Х реакционного буфера и 5-10 ед. рестриктазы HspAI. Объем доводят до 15 мкл деионизированной водой. Инкубируют смесь в течение 1,5 часов при 37°С, фермент инактивируют нагревом до 75°С в течение 15 минут. Визуализацию продуктов рестрикции проводят с помощью электрофореза в 3% агарозном геле. В отсутствие мутации (в норме) будут два фрагмента рестрикции длиной 27 п. н. и 85 п. н. При наличии мутации на электрофореграмме будет виден продукт длиной 112 п. н. При выявлении мутации в ходе реакции №1 пациент имеет относительный риск развития наследственного рака молочной железы, в 6,95 раз больший, чем у людей, не имеющих этой мутации (OR=6,95).

При выявлении мутации в ходе реакции №2 пациент имеет относительный риск развития наследственного рака молочной железы, в 6,66 раз меньший, чем у людей, не имеющих этой мутации (OR=0,15).

При выявлении мутации в ходе реакции №3 пациент имеет относительный риск развития наследственного рака молочной железы, в 2,76 раз больший, чем у людей, не имеющих этой мутации (OR=2,76).

При выявлении мутации в ходе реакций №2 и №3 одновременно, пациент имеет относительный риск развития наследственного рака молочной железы, в 2,41 раз меньший, чем у людей, не имеющих этих мутаций (OR=0,414).

При выявлении мутации в ходе реакций №1 и №3 одновременно, пациент имеет относительный риск развития наследственного рака молочной железы, в 19, 18 раз больший, чем у людей, не имеющих этих мутаций (OR=19, 18).

При выявлении мутации в ходе реакций №1, №2 и №3 одновременно, пациент имеет относительный риск развития наследственного рака молочной железы, в 2,88 раз больший, чем у людей, не имеющих этих мутаций (OR=2,88).

Однако в данном способе в качестве группы контроля использовали образцы крови здоровых людей, время в зависимости от способа выделения ДНК из биологических образцов составляет от 4,5 до 6 часов, данный тип метода диагностики сложно считать точным в связи с относительностью рисков показателей наследственного рака молочной железы.

Метод полноэкзомного секвенирования - это секвенирование всех белок-кодирующих генов человека (приблизительно 20000), а секвенирование экзома с клинической целью - это секвенирование порядка 5000 генов, про которые на настоящий момент известна ассоциация с генетическими болезнями или признаками. Экзом составляет всего ~1% от полного генома человека, но приблизительно 85% всех болезнетворных вариантов находятся именно в белок-кодирующих областях. С помощью технологии секвенирования экзома можно определить последовательность 90-95% целевых участков человека, и некоторые участки поддаются секвенированию с помощью этой методики несколько хуже. Способность метода выявить болезнетворный вариант зависит от того, в каком участке он находится (Online Mendelian Inheritance in Man, OMIM. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim/). Метод предназначен для поиска однонуклеотидных замен в кодирующих участках генов человека. Некоторые другие типы генетических вариантов могут быть выявлены, но поддаются обнаружению с меньшей вероятностью, чем однонуклеотидные замены: это относится, в частности, к коротким делециям или вставкам (инделам) и изменениям числа коротких тандемных повторов (Database of Single Nucleotide Polymorphisms (dbSNP). http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/).

Результативность обследования сильно зависит от наличия информации о варианте во внешних базах данных клинической информации, а также от изученности генетического заболевания пациента. В настоящий момент изучение генетических заболеваний является приоритетным направлением исследований во всем мире, и базы данных с клинической информацией постоянно пополняются. В практике клинического секвенирования экзома процент диагностированных случаев растет с каждым годом, поэтому в некоторых случаях переанализ данных секвенирования через некоторое время может привести к установлению диагноза, даже если изначально он не был поставлен.

ОГРАНИЧЕНИЯ МЕТОДА ПОЛНОЭКЗОМНОГО СЕКВЕНИРОВАНИЯ

Ввиду некоторых технических ограничений секвенирование экзома не может покрыть 100% целевых участков. Мы обеспечиваем необходимое для достоверного обнаружения гетерозиготных вариантов покрытие: не менее 10х для 90% целевых участков. Частота ошибочно обнаруженных вариантов при секвенировании экзома в среднем составляет не больше 1%, но в отдельных участках может достигать 5%, поэтому релевантные варианты рекомендуется подтверждать независимым секвенированием по Сэнгеру или другими референсными методами, если такая возможность существует. Некоторые типы вариантов поддаются выявлению методом экзомного секвенирования плохо, в том числе структурные изменения хромосом (инверсии, транслокации, делеции), полиплоидия, анэуплоидия, протяженные участки триплетных и других повторов, варианты в генах с наличием в геноме близкого по последовательности псевдогена или паралога, варианты в GC-богатых участках, варианты в интронах за пределами стандартных сайтов сплайсинга, а также эпигенетические варианты. Метод имеет ограниченную чувствительность в отношении вариантов в состоянии мозаицизма. Чувствительность и специфичность обнаружения вариантов, находящихся в областях сегментарных дупликаций, могут быть низкими. Результаты клинического секвенирования всегда интерпретируются в контексте клинической картины, семейной истории и других лабораторных данных. Изучаются только варианты, которые потенциально могут иметь отношение к заболеванию пациента. Результаты секвенирования экзома могут быть интерпретированы неверно, если предоставленная информация ошибочна или неполна. Некоторые медицинские процедуры, такие как пересадка костного мозга или переливание крови, могут привести к неверным результатам. Редкие безвредные варианты могут быть классифицированы неверно. Выявленные варианты не всегда объясняют все клинические проявления у пациента. Предоставление большего количества клинически значимой информации может помочь более точной оценке значимости выявленных вариантов. (Genome Aggregation Database (gnomAD). http://gnomad.broadinstitute.org/; ClinVar. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/; Clinical Genome Resourse, ClinGene. https://www.clinicalgenome.org/; Ensembl. http://www.ensembl.org/index.html; Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the Ameri can College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology. Genet Med. 2015).

ПОБОЧНО ВЫЯВЛЕННЫЕ ВАРИАНТЫ

Побочно выявленные рекомендации

ACMG разработал рекомендации (Recommendations for reporting of secondary findings in clinical exome and genome sequencing, 2016 update (ACMG SF v2.0): a policy statement of the American College of Medical Genetics and Genomics. Genet Med. 2017) по предоставлению информации пациенту о патогенных и вероятно патогенных вариантах, присутствующих в некоторых генах (АСТА2, АСТС1, АРС, АРОВ, АТР7В, BMPR1A, BRCA1, BRCA2, CACNA1S, COL3A1, DSC2, DSG2, DSP, FBN1, GLA, KCNH2, KCNQ1, LDLR, LMNA, MEN 1, MLH1, MSH2, MSH6, MUTYH, MYBPC3, MYH11, MYH7, MYL2, MYL3, NF2, ОТС, PCSK9, РКР2, PMS2, PRKAG2, PTEN, RBI, RET, RYR1, RYR2, SCN5A, SDHAF2, SDHB, SDHC, SDHD, SMAD3, SMAD4, STK11, TGFBR1, TGFBR2, ТМЕМ43, TNNI3, TNNT2, ТР53, ТРМ1, TSC1, TSC2, VHL, WT1). Эти гены связаны с определенными генетическими заболеваниями, нуждающимися в медицинском контроле.

Раскрытие сущности изобретения

Технический результат - выявление предрасположенности к раку молочной железы и раку яичников у пациентов после трансплантации почки, включающем выделение ДНК из крови пациента, достигается путем дифференцированного применения данных полного секвенирования экзома. Идентификация мутаций в описываемом способе осуществляется путем выявления патогенных мутаций в генах BRCA1 и BRIP 1 на основе биоинформатического анализа данных секвенирования ДНК. Технический результат достигается тем, что:

- Выполняется забор венозной крови у пациентов (не ранее чем через 60 дней после трансплантации почки);

- Осуществляется выделение ДНК из полученных образцов;

- Подготовка библиотек ДНК;

- Секвенирование экзома; Секвенирование белок-кодирующих генов человека методом парно-концевых прочтений проводится с использованием целевого обогащения геномной ДНК. С использованием прибора (системы целевого обогащения) llumina NovaSeq 6000,среднее покрытие - процент целевых нуклеотидов с покрытием >10Х составил 98.9%, данные секвенирования анализируются с помощью автоматизированного алгоритма, заключающего в себя оценку параметров качества секвенирования (модуль FASTQC); удаление адаптеров и последовательностей с низким качеством (модуль SEQPURGE); выравнивание прочтения на версию hg19 генома человека (модуль BWA MEM); фильтрацию оптических и ПЦР дубликатов (модуль SAMBLASTER); локальную оптимизацию выравнивании (модуль ABRA2); обнаружение вариантов и их фильтрация согласно качеству (пакет FREEBAYES) и аннотацию вариантов относительно баз данных с клинической информацией (модуль ENSEMBL-VEP).

- Осуществляется биоинформатическая обработка результатов.

Данные секвенирования были проанализированы с помощью автоматизированного алгоритма, заключающего в себя оценку параметров качества секвенирования (модуль FASTQC); удаление адаптеров и последовательностей с низким качеством (модуль SEQPURGE); выравнивание прочтения на версию hg19 генома человека (модуль BWA MEM); фильтрацию оптических и ПЦР дубликатов (модуль SAMBLASTER); локальную оптимизацию выравнивания (модуль ABRA2); обнаружение вариантов и их фильтрация согласно качеству (пакет FREEBAYES) и аннотация вариантов относительно баз данных с клинической информацией (модуль ENSEMBL-VEP). Алгоритм был протестирован на экзомных данных, для которых существует расшифровка генома «золотого стандарта» (данные Genome in a Bottle). Чувствительность алгоритма составила 98,6%, и средняя специфичность - 99,1%. При поиске клинически значимых генетических вариантов были отфильтрованы варианты, не влияющие на структуру белка и при этом не отмеченные как патогенные в базе данных ClinVar, а также все варианты, не отмеченные как патогенные в базе данных ClinVar, с максимальной частотой встречаемости в популяциях более 2%. Во всех генах, потенциально имеющих отношение к заболеванию пациента, каждый из вариантов был проанализирован на предмет влияния на структуру и функцию белка, эволюционную консервативность позиции, клинический статус, частоту встречаемости и тип наследования соответствующего гена и классифицирован в одну из пяти категорий (патогенные варианты, вероятно патогенные варианты, варианты неопределенного значения, вероятно безвредные варианты, безвредные) в соответствии с рекомендациями ACMG (Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology. Genet Med. 2015). Варианты из категории «Патогенные варианты», «Вероятно патогенные варианты» и «Варианты неопределенного значения» включены в заключение в формате, соответствующем рекомендациям HGVS. В случае выявления предрасположенности к раку молочной железы или раку яичников пациенту рекомендуется консультация онколога, врача-генетика и трансплантолога для определения дальнейшей тактики лечения и стратегии превентивной терапии онкологических рисков по результатам дообследования.

Claims (7)

1. Способ дифференцированного применения данных секвенирования ДНК для пациентов после трансплантации почки с целью диагностики наследственных форм рака органов репродуктивной системы: рака молочной железы и рака яичников, который включает:
2. - забор венозной крови у пациентов не ранее чем через 60 дней после трансплантации почки;
3. - выделение ДНК из полученных образцов;
4. - подготовка библиотек ДНК;
5. - секвенирование ДНК - секвенирование белок-кодирующих генов человека методом парно-концевых прочтений с использованием целевого обогащения геномной ДНК, при этом идентификация отклонений осуществляется путем выявления патогенных мутаций в генах BRCA1 и BRIP 1 на основе биоинформатического анализа данных секвенирования ДНК:
6. в случае обнаружения ранее не описанного в литературе варианта в гетерозиготном состоянии во 2-м экзоне из 20 в гене BRIP1, приводящего к замене аминокислоты лизин на аспарагин в положении 14 (p.Lys14Asn, мутация типа миссенс), для определения предрасположенности к раку молочной железы (114480; AD), изменение ДНК (hg19), изменение транскрипта и изменение белка chr17:g.59938859C>A ENST00000259008.2: c.42G>T ENSP00000259008.2: p.Lys14Asn, необходимо сопоставить результат с клиническими данными обследования онколога и врача-генетика;
7. в случае обнаружения ранее описанного варианта (rs80357906) в гетерозиготном состоянии в 20-м экзоне гена BRCA1, приводящего к сдвигу рамки считывания, начиная с 1777 кодона, и преждевременной терминации синтеза белка (p.Gln1777ProfsTer74, мутация типа фреимшифт), являющегося абсолютно патогенным в ассоциированном наследовании заболеваний наследственного рака молочной железы и яичников, тип 1 (604370; AD), назначается консультация врача онколога и трансплантолога для решения вопроса о превентивном оперативном лечении и коррекции иммуносупрессивной терапией.