RU2799432C1 - Method of obtaining exosomes origining from mesenchymal stem cells and a cultural solution produced from them - Google Patents
Method of obtaining exosomes origining from mesenchymal stem cells and a cultural solution produced from them Download PDFInfo
- Publication number
- RU2799432C1 RU2799432C1 RU2022111154A RU2022111154A RU2799432C1 RU 2799432 C1 RU2799432 C1 RU 2799432C1 RU 2022111154 A RU2022111154 A RU 2022111154A RU 2022111154 A RU2022111154 A RU 2022111154A RU 2799432 C1 RU2799432 C1 RU 2799432C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- exosomes
- stem cells
- cell
- mesenchymal stem
- cells
- Prior art date
Links
Images
Abstract
Description
Область техникиTechnical field
По настоящей заявке испрашивается приоритет и преимущество Корейской патентной заявки No. 10-2020-0062365, поданной в Корейское ведомство по интеллектуальной собственности 25 мая 2020 г., полное содержание которой приведено в настоящем описании в качестве ссылки.The present application claims the priority and benefit of Korean Patent Application No. 10-2020-0062365, filed with the Korean Intellectual Property Office on May 25, 2020, the contents of which are incorporated herein by reference.
Настоящее изобретение относится к способу получения экзосом, происходящих из мезенхимальных стволовых клеток.The present invention relates to a method for obtaining exosomes derived from mesenchymal stem cells.
Уровень техникиState of the art
Обнаружено, что существует несколько типов предшественников в костном мозге человека, и среди них, предшественники, имеющие мультипотентность, называют мезенхимальными стволовыми клетками (MSC). Известно, что мезенхимальные стволовые клетки присутствуют не только в костном мозге, но также в большинстве органов организма, таких как жир, печень и мышца.It has been found that there are several types of progenitors in human bone marrow, and among them, progenitors having multipotency are called mesenchymal stem cells (MSCs). It is known that mesenchymal stem cells are present not only in the bone marrow, but also in most organs of the body, such as fat, liver, and muscle.
Известно, что мезенхимальные стволовые клетки имеют способность к самостоятельной пролиферации, могут дифференцировать в остеобласты, хондроциты, миоциты, стромальные клетки костного мозга, фибробласты сухожилий-связок, адипоциты и т.п., и имеют противовоспалительную и иммуномодулирующую способность как высоко пролиферативные адгерентные клетки. В частности, мезенхимальные стволовые клетки имеют иммуносупрессивные эффекты, такие как ингибирование пролиферации и дифференцировки T-клеток и B-клеток, и ингибирование функций иммуноцитов, таких как дендритные клетки, клетки естественные киллеры (NK) и макрофаги.It is known that mesenchymal stem cells have the ability to self-proliferation, can differentiate into osteoblasts, chondrocytes, myocytes, bone marrow stromal cells, tendon-ligament fibroblasts, adipocytes, etc., and have anti-inflammatory and immunomodulating ability as highly proliferative adherent cells. In particular, mesenchymal stem cells have immunosuppressive effects such as inhibition of T cell and B cell proliferation and differentiation, and inhibition of immunocyte functions such as dendritic cells, natural killer (NK) cells and macrophages.
Эти мезенхимальные стволовые клетки привлекли внимание из-за различных факторов (паракринных/секреторных факторов), которые мезенхимальные стволовые клетки секретируют, например, хемокины, цитокины, факторы роста и т.п., представляют эффекты стволовых клеток, а не функции дифференцировки самих мезенхимальных стволовых клеток. Кроме того, известно, что мезенхимальные стволовые клетки секретируют не только эти факторы, но также внеклеточные везикулы (EV), и известно, что внеклеточные везикулы влияют на различные аспекты, такие как судьба, функция и дифференцировка клеток, посредством межклеточной передачи сигналов.These mesenchymal stem cells have attracted attention because of the various factors (paracrine/secretory factors) that mesenchymal stem cells secrete, e.g. chemokines, cytokines, growth factors, etc., represent the effects of stem cells and not the differentiation functions of mesenchymal stem cells themselves. cells. In addition, mesenchymal stem cells are known to secrete not only these factors, but also extracellular vesicles (EVs), and extracellular vesicles are known to influence various aspects such as cell fate, function, and differentiation through intercellular signaling.
Среди различных факторов, экзосома представляет собой везикулу, состоящую из липидного бислоя, и входит в состав материалов, которые клетки секретируют внеклеточно. Известно, что экзосома служит для транспорта (передачи) белка, биоактивного липида и РНК (мкРНК), которые являются внутриклеточными биомолекулами, чтобы осуществлять функциональную роль опосредования коммуникации клетка-клетка и клеточного иммунитета. Эти экзосомы исследовали в качестве биомаркеров для неврологических заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера, и использовали также для разработки системы доставки лекарственного средства, такой как наноноситель специфического лекарственного средства, благодаря наличию достаточно высокой избирательной способности к проникновению, чтобы проникать через гематоэнцефалический барьер (BBB), который разделяет спинномозговую жидкость и кровь.Among various factors, the exosome is a vesicle composed of a lipid bilayer and is part of the materials that cells secrete extracellularly. It is known that the exosome serves to transport (transfer) protein, bioactive lipid and RNA (miRNA), which are intracellular biomolecules, to fulfill the functional role of mediating cell-cell communication and cellular immunity. These exosomes have been investigated as biomarkers for neurological diseases such as Alzheimer's disease and have also been used to develop a drug delivery system such as a specific drug nanocarrier by having a high enough permeation selectivity to cross the blood-brain barrier (BBB), which separates cerebrospinal fluid and blood.
Между тем, известно, что экзосомы, секретированные из мезенхимальных стволовых клеток, вовлечены в коммуникацию клетка-клетка, и для них показана терапевтическая эффективность в регенеративной медицине, которую имеют стволовые клетки, и недавно активно проводили исследования терапевтических эффектов для различных заболеваний с использованием экзосом, секретированных мезенхимальными стволовыми клетками, без использования самих мезенхимальных стволовых клеток.Meanwhile, exosomes secreted from mesenchymal stem cells are known to be involved in cell-cell communication and have been shown to have therapeutic efficacy in regenerative medicine that stem cells have, and research on therapeutic effects for various diseases using exosomes has been actively conducted recently. secreted by mesenchymal stem cells, without using the mesenchymal stem cells themselves.
Однако ультрацентрифугирование, наиболее часто используемое среди способов выделения экзосом, имеет то преимущество, что большое количество экзосом можно выделять за один раз, однако, имеет ту проблему, что необходимо дорогостоящее оборудование, много времени занимает выделение экзосом, физическое повреждение может происходить с экзосомами из-за сильного центрифугирования, и в частности, чистота выделенных экзосом уменьшается и т.п. Среди способов облегчения этих проблем, присутствует способ аффинности к PS, который увеличивает чистоту экзосом, выделенных с использованием материала, который специфически связывается с фосфатидилсерином (PS), представляющим собой белок, присутствующий на мембране экзосом, но в то время как этим способом можно выделять экзосомы высокой чистоты, по сравнению со способом ультрацентрифугирования, существует тот недостаток, что выход является низким. Кроме того, способ получения экзосом с использованием хроматографии на колонке опубликован в связанной области техники, однако имеет ту проблему, что липопротеины, имеющие размер и плотность, сходные с экзосомами, суспендированные в растворе культуры клеток или крови, элюируются вместе.However, ultracentrifugation, which is the most commonly used method for isolating exosomes, has the advantage that a large number of exosomes can be isolated at one time, however, has the problem that expensive equipment is needed, it takes a long time to isolate exosomes, physical damage can occur to exosomes due to due to strong centrifugation, and in particular, the purity of the isolated exosomes decreases, etc. Among the ways to alleviate these problems is the PS affinity method, which increases the purity of exosomes isolated using a material that specifically binds to phosphatidylserine (PS), which is a protein present on the membrane of exosomes, but while this method can isolate exosomes high purity, compared with the ultracentrifugation method, there is a disadvantage that the yield is low. In addition, a method for producing exosomes using column chromatography has been published in the related art, but has the problem that lipoproteins having a size and density similar to exosomes suspended in a cell culture solution or blood are eluted together.
Таким образом, существует необходимость в разработке способа выделения, способного к получению экзосом высокой чистоты в высокой концентрации из мезенхимальных стволовых клеток, без примесей.Thus, there is a need to develop an isolation method capable of obtaining exosomes of high purity at high concentration from mesenchymal stem cells without impurities.
ОписаниеDescription
Техническая проблемаTechnical problem
Способ получения, в соответствии с иллюстративным вариантом осуществления настоящего изобретения, разработан для решения вышеупомянутых проблем в связанной области техники, и предназначен для выделения экзосом с высокой чистотой и высокой концентрацией из мезенхимальных стволовых клеток, без примесей.The production method according to an exemplary embodiment of the present invention is designed to solve the above problems in the related art, and is designed to isolate exosomes in high purity and high concentration from mesenchymal stem cells without impurities.
Настоящее изобретение выполнено в попытке предоставления способа получения экзосом, происходящих из мезенхимальных стволовых клеток.The present invention has been made in an attempt to provide a method for obtaining exosomes derived from mesenchymal stem cells.
Настоящее изобретение выполнено в попытке предоставления культурального раствора, включающего экзосомы, происходящие из мезенхимальных стволовых клеток, полученные с использованием данного способа получения.The present invention has been made in an attempt to provide a culture solution comprising exosomes derived from mesenchymal stem cells obtained using this production method.
Настоящее изобретение выполнено в попытке предоставления фармацевтической композиции, включающей экзосомы, полученные с использованием данного способа получения, в качестве активного ингредиента.The present invention has been made in an attempt to provide a pharmaceutical composition comprising exosomes obtained using this production method as an active ingredient.
Настоящее изобретение выполнено в попытке предоставления косметической композиции, включающей экзосомы, полученные с использованием данного способа получения, в качестве активного ингредиента.The present invention has been made in an attempt to provide a cosmetic composition comprising exosomes obtained using this production method as an active ingredient.
Техническое решениеTechnical solution
Для решения вышеописанных проблем, иллюстративный вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу получения экзосом, происходящих из мезенхимальных стволовых клеток, включающему: получение образца из мезенхимальных стволовых клеток; субкультивирование образца клеток в среде Игла в модификации Дульбекко (DMEM) с низким содержанием глюкозы; культивирование субкультивированных клеток в субстратной среде, содержащей фермент, ингибирующий синтез белка, и затем получение культурального раствора клеток; и выделение экзосом из культурального раствора клеток.To solve the above problems, an exemplary embodiment of the present invention relates to a method for obtaining exosomes derived from mesenchymal stem cells, including: obtaining a sample from mesenchymal stem cells; subculturing the cell sample in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) with low glucose content; culturing the subcultured cells in a substrate medium containing an enzyme that inhibits protein synthesis, and then obtaining a cell culture solution; and isolation of exosomes from the cell culture solution.
В иллюстративном варианте осуществления настоящего изобретения, при получении культурального раствора стволовых клеток, субстратная среда может дополнительно включать TNFα.In an exemplary embodiment of the present invention, upon receipt of the culture solution of stem cells, the substrate environment may further include TNFα.
В иллюстративном варианте осуществления настоящего изобретения, TNFα можно включать в концентрации 5-500 нг/мл.In an exemplary embodiment of the present invention, TNFα can be included at a concentration of 5-500 ng/ml.
В иллюстративном варианте осуществления настоящего изобретения, фермент, ингибирующий синтез белка, может представлять собой любое одно или два, или более, выбранные из группы, состоящей из циклогексимида, анизомицина, ауринтрикарбоновой кислоты, дифтерийного токсина, эдеина, фусидовой кислоты, пактамицина, пуромицина, рицина, фторида натрия, спарзомицина, тетрациклина и триходермы.In an exemplary embodiment of the present invention, the protein synthesis inhibitory enzyme may be any one or two or more selected from the group consisting of cycloheximide, anisomycin, aurine tricarboxylic acid, diphtheria toxin, edeine, fusidic acid, pactamycin, puromycin, ricin , sodium fluoride, sparsomycin, tetracycline and trichoderma.
В иллюстративном варианте осуществления настоящего изобретения, субстратная среда может иметь соотношение TNFα : фермент, ингибирующий синтез белка, 1:10-1:2000.In an exemplary embodiment of the present invention, the substrate medium may have a ratio of TNFα : enzyme that inhibits protein synthesis, 1:10-1:2000.
В иллюстративном варианте осуществления настоящего изобретения, время обработки TNFα и ферментом, ингибирующим синтез белка, может составлять 30-100 часов.In an exemplary embodiment of the present invention, the treatment time with TNFα and a protein synthesis inhibitory enzyme may be 30-100 hours.
В иллюстративном варианте осуществления настоящего изобретения, в культуральном растворе клеток, количество экзосом и содержание любого одного или нескольких из происходящего из экзосом белка и происходящей из экзосом РНК может быть увеличено.In an exemplary embodiment of the present invention, in a cell culture solution, the number of exosomes and the content of any one or more of an exosome-derived protein and an exosome-derived RNA can be increased.
В иллюстративном варианте осуществления настоящего изобретения, можно выделять 1,1 × 1011 или более экзосом на мл культурального раствора клеток.In an exemplary embodiment of the present invention, 1.1 x 10 11 or more exosomes per ml of cell culture solution can be isolated.
В иллюстративном варианте осуществления настоящего изобретения, при субкультивировании образца клеток, среда может включать один или несколько, выбранные из группы, состоящей из EGF, FGF-2, GDF11, KGF, HGF, PDGF, VEGF, IGF и TGF-b.In an exemplary embodiment of the present invention, when a cell sample is subcultured, the medium may include one or more selected from the group consisting of EGF, FGF-2, GDF11, KGF, HGF, PDGF, VEGF, IGF, and TGF-b.
В иллюстративном варианте осуществления настоящего изобретения, субкультивирование образца клеток можно проводить на протяжении 4-10 пассажей.In an exemplary embodiment of the present invention, subculture of a cell sample can be carried out for 4-10 passages.
В иллюстративном варианте осуществления настоящего изобретения, маркер для экзосом может представлять собой один или несколько, выбранные из группы, состоящей из CD63, CD9, CD81, S1PR1 и S1PR3.In an exemplary embodiment of the present invention, the exosome marker may be one or more selected from the group consisting of CD63, CD9, CD81, S1PR1 and S1PR3.
В иллюстративном варианте осуществления настоящего изобретения, при получении образца, мезенхимальные стволовые клетки можно получать из жировой ткани или плацентарной ткани.In an exemplary embodiment of the present invention, when obtaining a sample, mesenchymal stem cells can be obtained from adipose tissue or placental tissue.
В иллюстративном варианте осуществления настоящего изобретения, стволовая клетка может представлять собой эмбриональную стволовую клетку, взрослую стволовую клетку или индуцированную плюрипотентную стволовую клетку (IPS).In an exemplary embodiment of the present invention, the stem cell may be an embryonic stem cell, an adult stem cell, or an induced pluripotent stem cell (IPS).
Иллюстративный вариант осуществления настоящего изобретения относится к культуральному раствору, включающего экзосомы, происходящие из мезенхимальных стволовых клеток, полученные с использованием данного способа.An exemplary embodiment of the present invention relates to a culture solution comprising exosomes derived from mesenchymal stem cells obtained using this method.
Иллюстративный вариант осуществления настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции, включающей экзосомы, происходящие из мезенхимальных стволовых клеток, полученные с использованием данного способа, в качестве активного ингредиента.An exemplary embodiment of the present invention relates to a pharmaceutical composition comprising exosomes derived from mesenchymal stem cells obtained using this method as an active ingredient.
Иллюстративный вариант осуществления настоящего изобретения относится к косметической композиции, включающей экзосомы, происходящие из мезенхимальных стволовых клеток, полученные с использованием данного способа, в качестве активного ингредиента.An exemplary embodiment of the present invention relates to a cosmetic composition comprising exosomes derived from mesenchymal stem cells obtained using this method as an active ingredient.
Обеспечивающие преимущество эффектыBenefiting Effects
Способ получения экзосом, происходящих из мезенхимальных стволовых клеток, в соответствии с иллюстративным вариантом осуществления настоящего изобретения, имеет то преимущество, что экзосомы высокой чистоты можно получать с высоким выходом.The method for producing exosomes derived from mesenchymal stem cells according to an exemplary embodiment of the present invention has the advantage that high purity exosomes can be obtained in high yield.
Способ получения экзосом, происходящих из мезенхимальных стволовых клеток, в соответствии с иллюстративным вариантом осуществления настоящего изобретения, имеет то преимущество, что большое количество экзосом можно выделять посредством обработки субстратной среды TNFα и/или ферментом, ингибирующим синтез белка.The method for obtaining mesenchymal stem cell-derived exosomes according to an illustrative embodiment of the present invention has the advantage that a large number of exosomes can be isolated by treatment of the substrate medium with TNFα and/or a protein synthesis inhibitory enzyme.
Культуральный раствор, включающий экзосомы, происходящие из мезенхимальных стволовых клеток, в соответствии с иллюстративным вариантом осуществления настоящего изобретения, имеет то преимущество, что способность к дифференцировке и способность к пролиферации усилены.The culture solution including exosomes derived from mesenchymal stem cells according to an exemplary embodiment of the present invention has the advantage that differentiation ability and proliferation ability are enhanced.
Существует то преимущество, что можно предоставлять фармацевтическую композицию или косметическую композицию с использованием культурального раствора, в соответствии с иллюстративным вариантом осуществления настоящего изобретения, и фармацевтическая композиция имеет то преимущество, что вероятность возникновения побочных эффектов против лекарственного средства можно уменьшать, благодаря той характеристике, что экзосомы являются бесклеточными.There is an advantage that it is possible to provide a pharmaceutical composition or a cosmetic composition using a culture solution according to an exemplary embodiment of the present invention, and the pharmaceutical composition has the advantage that the possibility of side effects against a drug can be reduced due to the characteristic that exosomes are acellular.
Описание рисунковDescription of drawings
ФИГ. 1 представляет собой график, показывающий изменения уровня продукции экзосом стволовых клеток, в соответствии с соотношением TNFα и циклогексимида.FIG. 1 is a graph showing changes in the level of production of stem cell exosomes according to the ratio of TNFα to cycloheximide.
ФИГ. 2 представляет собой график, показывающий изменения уровня продукции экзосом с течением времени в мезенхимальных стволовых клетках, обработанных TNFα и циклогексимидом.FIG. 2 is a graph showing changes in the level of exosome production over time in mesenchymal stem cells treated with TNFα and cycloheximide.
ФИГ. 3 представляет собой график, показывающий концентрацию экзосом, в соответствии с примерами и сравнительными примерами по настоящему изобретению, измеренную посредством анализа траекторий движения наночастиц (NTA).FIG. 3 is a graph showing the concentration of exosomes according to the examples and comparative examples of the present invention measured by nanoparticle trajectory analysis (NTA).
ФИГ. 4 представляет собой график, показывающий концентрацию экзосом, в соответствии с примерами и сравнительными примерами по настоящему изобретению, измеренную посредством анализа Бредфорд.FIG. 4 is a graph showing the concentration of exosomes according to the Examples and Comparative Examples of the present invention, measured by the Bradford assay.
ФИГ. 5 представляет собой серию графиков, показывающих размер экзосом и гистограмму распределения частиц, в соответствии с размером, для экзосом из примера 14 (a), примера 15 (b) и сравнительного примера 1 (c), для примеров и сравнительных примеров по настоящему изобретению, измеренные посредством NTA.FIG. 5 is a series of graphs showing exosome size and particle distribution histogram, according to size, for exosomes from Example 14(a), Example 15(b), and Comparative Example 1(c), for Examples and Comparative Examples of the present invention, measured by NTA.
ФИГ. 6 представляет собой серию графиков, показывающих размер экзосом и гистограмму распределения частиц, в соответствии с размером, для экзосом из сравнительного примера 2 (d), сравнительного примера 3 (e) и сравнительного примера 4 (f), для примеров и сравнительных примеров по настоящему изобретению, измеренные посредством NTA.FIG. 6 is a series of graphs showing exosome size and particle distribution histogram according to size for exosomes from Comparative Example 2(d), Comparative Example 3(e), and Comparative Example 4(f), for the examples and comparative examples of the present invention measured by NTA.
ФИГ. 7 представляет собой серию графиков, показывающих размер экзосом и гистограмму распределения частиц, в соответствии с размером, для экзосом из сравнительного примера 5 (g), сравнительного примера 6 (h) и сравнительного примера 7 (i), для примеров и сравнительных примеров по настоящему изобретению, измеренные посредством NTA.FIG. 7 is a series of graphs showing the size of exosomes and a histogram of particle distribution, according to size, for the exosomes of Comparative Example 5 (g), Comparative Example 6 (h) and Comparative Example 7 (i), for the examples and comparative examples of the present invention measured by NTA.
ФИГ. 8 иллюстрирует Вестерн-блоттинг экзосом, в соответствии с примерами и сравнительными примерами по настоящему изобретению.FIG. 8 illustrates Western blotting of exosomes according to the examples and comparative examples of the present invention.
ФИГ. 9 иллюстрирует экзосомы по настоящему изобретению посредством фотографий просвечивающей микроскопии (TEM).FIG. 9 illustrates the exosomes of the present invention through transmission microscopy (TEM) photographs.
ФИГ. 10 иллюстрирует график для анализа экзосом по настоящему изобретению посредством способа Exoview.FIG. 10 illustrates a graph for the analysis of exosomes of the present invention by the Exoview method.
Способы осуществления изобретенияMethods for carrying out the invention
Далее в настоящем описании, настоящее изобретение описано более подробно.Further in the present description, the present invention is described in more detail.
Конкретные функциональные описания ниже проиллюстрированы только для описания иллюстративных вариантов осуществления, в соответствии с концепцией настоящего изобретения, и иллюстративные варианты осуществления, в соответствии с концепцией настоящего изобретения, могут быть воплощены в различных формах и не должны быть интерпретированы как ограниченные иллюстративными вариантами осуществления, описанными в настоящем описании.The specific functional descriptions below are only illustrated to describe exemplary embodiments, in accordance with the concept of the present invention, and exemplary embodiments, in accordance with the concept of the present invention, may be embodied in various forms and should not be interpreted as being limited to the exemplary embodiments described in the present description.
Поскольку иллюстративные варианты осуществления, в соответствии с концепцией настоящего изобретения, могут иметь различные изменения и могут иметь различные формы, конкретные иллюстративные варианты осуществления подробно описаны в настоящем описании. Однако, это не предназначено для ограничения иллюстративных вариантов осуществления, в соответствии с концепцией настоящего изобретения, конкретной описанной формой, и должно быть интерпретировано для включения всех модификаций, эквивалентов и заменителей, в содержание и объем настоящего изобретения.Since exemplary embodiments, in accordance with the concept of the present invention, may have various variations and may take various forms, specific exemplary embodiments are described in detail in the present description. However, this is not intended to limit exemplary embodiments, in accordance with the concept of the present invention, to the particular form described, and is to be interpreted to include all modifications, equivalents, and substitutes within the spirit and scope of the present invention.
Термины, используемые в настоящем описании, использованы только для описания конкретных иллюстративных вариантов осуществления и не предназначены для ограничения настоящего изобретения. Выражение в единственном числе включает выражение во множественном числе, если контекст явно не требует иного.The terms used in the present description are used only to describe specific illustrative embodiments and are not intended to limit the present invention. A singular expression includes a plural expression unless the context clearly requires otherwise.
Если не определено иное, все термины (включая технические и научные термины), используемые в настоящем описании, можно использовать в значении, которое может являться общепринятым в области, к которой относится настоящее изобретение. Кроме того, понятно, что термины, определенные в общеупотребительных словарях, не следует интерпретировать в идеализированном или избыточном смысле, если явно и конкретно указано иное.Unless otherwise defined, all terms (including technical and scientific terms) used in the present description, you can use the meaning that may be generally accepted in the field to which the present invention belongs. In addition, it is understood that terms defined in common dictionaries should not be interpreted in an idealized or redundant sense, unless explicitly and specifically stated otherwise.
Иллюстративный вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу получения экзосом, происходящих из мезенхимальных стволовых клеток, включающему: получение образца клеток из мезенхимальных стволовых клеток; субкультивирование образца клеток в среде Игла в модификации Дульбекко (DMEM) с низким содержанием глюкозы; культивирование субкультивированных клеток в субстратной среде, содержащей фермент, ингибирующий синтез белка, и затем получение культурального раствора клеток; и выделение экзосом из культурального раствора клеток.An exemplary embodiment of the present invention relates to a method for obtaining exosomes derived from mesenchymal stem cells, including: obtaining a cell sample from mesenchymal stem cells; subculturing the cell sample in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) with low glucose content; culturing the subcultured cells in a substrate medium containing an enzyme that inhibits protein synthesis, and then obtaining a cell culture solution; and isolation of exosomes from the cell culture solution.
При получении образца клеток из мезенхимальных стволовых клеток, клетки можно получать, позволяя образцу проходить через мембрану для центрифугирования полученного фильтрата. В этом случае, в качестве мембраны, можно использовать нейлон 50 мкм - 200 мкм, но мембрана не является конкретно ограниченной.When obtaining a cell sample from mesenchymal stem cells, cells can be obtained by allowing the sample to pass through the membrane to centrifuge the resulting filtrate. In this case, 50 µm to 200 µm nylon can be used as the membrane, but the membrane is not particularly limited.
В рамках изобретения, термин «центрифугирование» относится к приложению центробежной силы посредством вращения материала вокруг оси при способе выделения с использованием центрифуги. По настоящему изобретению, центрифугирование может представлять собой любое, выбранное из группы, состоящей из дифференциального центрифугирования, центрифугирования в градиенте плотности и газового центрифугирования.Within the scope of the invention, the term "centrifugation" refers to the application of centrifugal force by rotating the material about an axis in a centrifuge isolation method. According to the present invention, the centrifugation may be any one selected from the group consisting of differential centrifugation, density gradient centrifugation and gas centrifugation.
В рамках изобретения, термин «стволовые клетки» относится к клеткам, имеющим способность к дифференцировке в две или более новые клетки, в то же время имеющим способность к самовоспроизведению, и может быть классифицирован на тотипотентные стволовые клетки, плюрипотентные стволовые клетки и мультипотентные стволовые клетки. Чтобы быть распознанными как стволовые клетки, клетки должны постоянно воспроизводиться в недифференцированном состоянии, и должны являться способными к дифференцировке в специфические клетки в специфических условиях культивирования. Вышеописанные стволовые клетки недавно привлекли внимание в качестве кандидата на композицию клеточного лекарственного средства из-за их способности к дифференцировке и способности к самовоспроизведению, и проводили множество исследований. Присутствует то преимущество, что является возможным выделять из них экзосомы, содержащие генетическую информацию, белки и факторы роста стволовых клеток.Within the scope of the invention, the term "stem cells" refers to cells having the ability to differentiate into two or more new cells, while at the same time having the ability to reproduce itself, and can be classified into totipotent stem cells, pluripotent stem cells and multipotent stem cells. To be recognized as stem cells, cells must constantly reproduce in an undifferentiated state, and must be capable of differentiating into specific cells under specific culture conditions. The above-described stem cells have recently attracted attention as a cellular drug composition candidate because of their differentiation ability and self-reproducing ability, and many studies have been carried out. There is the advantage that it is possible to isolate from them exosomes containing genetic information, proteins and stem cell growth factors.
Стволовые клетки могут представлять собой стволовые клетки костного мозга, стволовые клетки пуповинной крови или происходящие из жировой ткани стволовые клетки, могут представлять собой стволовые клетки человеческого происхождения или животного происхождения, или растительного происхождения, и могут представлять собой, например, происходящие из жировой ткани человека стволовые клетки, но не являются ограниченными ими.The stem cells may be bone marrow stem cells, umbilical cord blood stem cells, or adipose tissue-derived stem cells, may be human or animal or plant derived stem cells, and may be, for example, human adipose tissue-derived stem cells. cells, but are not limited to them.
В рамках изобретения, термин «экзосомы» относится к малой везикуле, имеющей мембранную структуру, секретируемую из различных типов клеток, которые играют различные роли, такие как доставка составляющих мембраны, белков и РНК, посредством связывания с другими клетками и структурами.In the context of the invention, the term "exosomes" refers to a small vesicle having a membrane structure secreted from various cell types that play different roles such as delivering membrane constituents, proteins and RNA through binding to other cells and structures.
В рамках изобретения, «среда DMEM» относится к среде Игла в модификации Дульбекко, и является наиболее общеупотребительной средой для культивирования клеток животных. В ходе культивирования клеток животных, используют среду DMEM с низким содержанием глюкозы, однако, среда DMEM не является ограниченной этим, можно использовать также среду DMEM с высоким содержанием глюкозы, и после выращивания клеток в среде с высоким содержанием глюкозы до достижения 80% - 100% конфлюэнтности, клетки можно культивировать в среде с низким содержанием глюкозы. Когда клетки культивируют в среде, полученной посредством смешивания DMEM с высоким содержанием глюкозы и DMEM с низким содержанием глюкозы, присутствует то преимущество, что клетки можно получать быстро. Концентрация глюкозы в DMEM с низким содержанием глюкозы может составлять 800-1200 мг/л, и кроме того, клетки можно культивировать посредством добавления эмбриональной бычьей сыворотки в среду DMEM с низким содержанием глюкозы, но способ культивирования не является ограниченным этим.Within the scope of the invention, "DMEM medium" refers to Dulbecco's Modified Eagle's medium, and is the most commonly used medium for culturing animal cells. During the cultivation of animal cells, low glucose DMEM medium is used, however, DMEM medium is not limited to this, high glucose DMEM medium can also be used, and after growing cells in high glucose medium until reaching 80% - 100% confluency, cells can be cultured in low glucose media. When cells are cultured in a medium obtained by mixing high glucose DMEM and low glucose DMEM, there is an advantage that cells can be obtained quickly. The concentration of glucose in low glucose DMEM can be 800-1200 mg/L, and in addition, cells can be cultured by adding fetal bovine serum to low glucose DMEM, but the culture method is not limited to this.
В рамках изобретения, термин «культуральный раствор» относится к супернатанту культуры клеток, в которой мезенхимальные стволовые клетки культивируют с использованием культуральной среды для мезенхимальных стволовых клеток. Культуральный раствор мезенхимальных стволовых клеток содержит различные физиологически активные материалы, секретируемые из клеток в процессе культивирования мезенхимальных стволовых клеток.In the context of the invention, the term "culture solution" refers to a cell culture supernatant in which mesenchymal stem cells are cultured using a mesenchymal stem cell culture medium. The culture solution of mesenchymal stem cells contains various physiologically active materials secreted from the cells during the cultivation of mesenchymal stem cells.
Мембрана может составлять 50 мкм - 200 мкм, но не является конкретно ограниченной. Осадки клеток можно получать посредством центрифугирования фильтрата, который получают, позволяя образцу проходить через мембрану, при 100 xg - 500 xg в течение 5 минут - 30 минут. Кроме того, можно использовать мембрану, при условии, что мембрана представляет собой полупроницаемую мембрану, и может конкретно представлять собой нейлоновый мембранный фильтр, но не является конкретно ограниченной.The membrane may be 50 µm to 200 µm, but is not particularly limited. Cell pellets can be obtained by centrifuging the filtrate, which is obtained by allowing the sample to pass through the membrane, at 100 xg - 500 xg for 5 minutes - 30 minutes. In addition, a membrane can be used, as long as the membrane is a semi-permeable membrane, and may specifically be a nylon membrane filter, but is not particularly limited.
Субкультивирование осадков клеток может включать антибиотик. Антибиотик может представлять собой пенициллин и/или стрептомицин, но не является ограниченным ими. Клетки можно разводить до концентрации 1×105 клеток/1 мл среды в 100-150 мм чашке Петри для культивирования клеток, и можно культивировать в инкубаторе с 3% - 10%, конкретно, 5% CO2 при температуре 30°C - 40°C, конкретно, 37°C. Кроме того, клетки можно культивировать даже в бутыли простой формы без использования чашки Петри для культивирования клеток, и клетки можно стабильно поддерживать в течение длительного периода времени, так что присутствует то преимущество, что можно получать большое количество культурального раствора клеток.Subculture of cell pellets may include an antibiotic. The antibiotic may be, but is not limited to, penicillin and/or streptomycin. Cells can be diluted to a concentration of 1×105 cells/1 ml of medium in a 100-150 mm cell culture petri dish, and can be cultured in an incubator with 3% - 10%, specifically 5% CO 2 at 30°C - 40°C C, specifically 37°C. In addition, cells can be cultured even in a plain-shaped bottle without using a cell culture petri dish, and cells can be stably maintained for a long period of time, so that there is an advantage that a large amount of cell culture solution can be obtained.
Субкультивирование образца осадка клеток в среде можно проводить на протяжении 4-10 пассажей. Существуют те проблемы, что когда клетки подвергаются пролиферации на протяжении 4 или менее пассажей, степень экспрессии может быть низкой, поскольку клетки не пролиферируют, и когда клетки подвергаются пролиферации на протяжении 10 или более пассажей, клетки могут осуществлять сверхэкспрессию.Subculture of the cell pellet sample in the medium can be carried out for 4-10 passages. There are problems that when cells proliferate for 4 passages or less, the degree of expression may be low because the cells do not proliferate, and when cells proliferate for 10 or more passages, the cells may overexpress.
При субкультивировании образца осадка клеток, среда DMEM может включать любой один или два, или более, выбранные из группы, состоящей из фактора роста и дифференцировки 11 (GDF11), эпидермального фактора роста (EFG), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), фактора роста кератиноцитов (KGF), фактора роста гепатоцитов (HGF), трансформирующего фактора роста-бета (TGF-b), фактора роста фибробластов 2 (FGF-2), инсулинового фактора роста (IGF) и фактора роста тромбоцитов (PDGF).When subculturing a cell pellet sample, the DMEM medium may include any one or two or more selected from the group consisting of growth and differentiation factor 11 (GDF11), epidermal growth factor (EFG), vascular endothelial growth factor (VEGF), growth factor keratinocyte growth factor (KGF), hepatocyte growth factor (HGF), transforming growth factor-beta (TGF-b), fibroblast growth factor 2 (FGF-2), insulin growth factor (IGF), and platelet growth factor (PDGF).
При субкультивировании образца осадка клеток, является предпочтительным, чтобы клетки культивировали посредством замены среды каждые 70-75 часов до 80% - 100% конфлюэнтности. Конкретно, является предпочтительным, чтобы клетки культивировали посредством замены среды каждые 72 часа, и когда среду заменяют в пределах 70 часов, существует та проблема, что осадок высокой чистоты невозможно получить, и когда среду заменяют через каждый интервал, превышающий 75 часов, существует та проблема, что осадок высокой концентрации невозможно получить. Субкультивирование для выделения экзосом высокой чистоты, происходящих из мезенхимальных стволовых клеток по настоящему изобретению, имеет то преимущество, что является возможным усиливать способность к дифференцировке и способность к пролиферации экзосом, с амплификацией в то же время мезенхимальных стволовых клеток.When subculturing a cell pellet sample, it is preferable that the cells are cultured by medium change every 70-75 hours to 80%-100% confluency. Specifically, it is preferable that the cells are cultured by changing the medium every 72 hours, and when the medium is changed within 70 hours, there is a problem that a high purity precipitate cannot be obtained, and when the medium is changed every interval exceeding 75 hours, there is a problem that a high concentration precipitate cannot be obtained. Subculturing to isolate high purity exosomes derived from the mesenchymal stem cells of the present invention has the advantage that it is possible to enhance the differentiation ability and the proliferation ability of exosomes while amplifying the mesenchymal stem cells at the same time.
«Культуральный раствор» относится к супернатанту культуры клеток, в которой мезенхимальные стволовые клетки культивируют с использованием культуральной среды для мезенхимальных стволовых клеток. Культуральный раствор мезенхимальных стволовых клеток содержит различные физиологически активные материалы, секретируемые из клеток в процессе культивирования мезенхимальных стволовых клеток."Culture solution" refers to a cell culture supernatant in which mesenchymal stem cells are cultured using a mesenchymal stem cell culture medium. The culture solution of mesenchymal stem cells contains various physiologically active materials secreted from the cells during the cultivation of mesenchymal stem cells.
Субстратная среда может представлять собой бессывороточную субстратную среду или субстратную среду с сывороткой. В качестве субстратной среды, используют среду DMEM с низким содержанием глюкозы, но субстратная среда не ограничена этим, и используют среду DMEM с высоким содержанием глюкозы, или можно использовать среду, включающую как среду DMEM с низким содержанием глюкозы, так и среду DMEM с высоким содержанием глюкозы.The substrate medium may be a serum-free substrate medium or a serum-containing substrate medium. As the substrate medium, a low glucose DMEM medium is used, but the substrate medium is not limited to this, and a high glucose DMEM medium is used, or a medium including both a low glucose DMEM medium and a high glucose DMEM medium can be used. glucose.
В иллюстративном варианте осуществления настоящего изобретения, фермент, ингибирующий синтез белка, включенный в субстратную среду, может представлять собой любой, выбранный из группы, состоящей из циклогексимида, анизомицина, ауринтрикарбоновой кислоты, дифтерийного токсина, эдеина, фусидовой кислоты, пактамицина, пуромицина, рицина, фторида натрия, спарзомицина, тетрациклина и триходермы, но без ограничения ими, и может быть заменен на любой фермент, ингибирующий биосинтез белка, способный осуществлять такой же механизм. Конкретно, является предпочтительным, чтобы фермент, ингибирующий синтез белка, представлял собой циклогексимид.In an exemplary embodiment of the present invention, the protein synthesis inhibitory enzyme included in the substrate medium may be any one selected from the group consisting of cycloheximide, anisomycin, aurine tricarboxylic acid, diphtheria toxin, edeine, fusidic acid, pactamycin, puromycin, ricin, sodium fluoride, sparsomycin, tetracycline and trichoderma, but without limitation, and can be replaced by any enzyme that inhibits protein biosynthesis, capable of performing the same mechanism. Specifically, it is preferred that the protein synthesis inhibiting enzyme is cycloheximide.
При получении культурального раствора клеток из иллюстративного варианта осуществления настоящего изобретения, субстратная среда может дополнительно включать TNFα. TNFα можно включать в концентрации 5-500 нг/мл.When preparing a cell culture solution from an exemplary embodiment of the present invention, the substrate medium may further include TNFα. TNFα can be included at a concentration of 5-500 ng/ml.
В иллюстративном варианте осуществления настоящего изобретения, субстратная среда может иметь соотношение TNFα : фермент, ингибирующий синтез белка, 1:10-1:2000. Соотношение добавления TNFα : фермент, ингибирующий синтез белка, может составлять 1:1-1:2000, конкретно, 1:10-1:1000, и более конкретно, 1:20-1:500, и может составлять 1:50-1:200. Когда доля добавления фермента, ингибирующего синтез белка, ниже, чем доля TNFα, существует та проблема, что размер и количество экзосом, подлежащих экстракции, могут являться маленькими, и когда соотношение добавления TNFα : фермент, ингибирующий синтез белка, составляет более чем 1 : 2000, существует та проблема, что амплификация осадка клеток может быть ингибирована из-за того, что доля фермента, ингибирующего синтез белка, является избыточной. Конкретно, когда включены как TNFα, так и фермент, ингибирующий синтез белка, существует то преимущество, что экзосомы можно экстрагировать с высокой концентрацией и высокой чистотой, поскольку размер и количество экзосом, подлежащих экстракции из стволовых клеток, и содержание происходящего из экзосом белка или происходящей из экзосом РНК увеличены, по сравнению с значениями, когда добавляют только TNFα или добавляют только фермент, ингибирующий синтез белка.In an exemplary embodiment of the present invention, the substrate medium may have a ratio of TNFα : enzyme that inhibits protein synthesis, 1:10-1:2000. The addition ratio of TNFα : protein synthesis inhibiting enzyme may be 1:1-1:2000, specifically 1:10-1:1000, and more specifically 1:20-1:500, and may be 1:50-1 :200. When the addition ratio of the protein synthesis-inhibiting enzyme is lower than that of TNFα, there is a problem that the size and number of exosomes to be extracted may be small, and when the addition ratio of TNFα : protein synthesis-inhibiting enzyme is more than 1 : 2000 , there is a problem that the amplification of the cell pellet may be inhibited due to the fact that the proportion of the enzyme that inhibits protein synthesis is excessive. Specifically, when both TNFα and a protein synthesis inhibitory enzyme are included, there is an advantage that exosomes can be extracted in high concentration and high purity, since the size and number of exosomes to be extracted from stem cells and the content of exosome-derived or from RNA exosomes are increased compared to values when only TNFα is added or only an enzyme inhibiting protein synthesis is added.
В иллюстративном варианте осуществления настоящего изобретения, время обработки TNFα и/или ферментом, ингибирующим синтез белка, может представлять собой культивирование клеток в течение 30-100 часов.In an exemplary embodiment of the present invention, the time of treatment with TNFα and/or protein synthesis inhibitory enzyme may be culturing cells for 30-100 hours.
Когда время обработки TNFα и/или ферментом, ингибирующим синтез белка, составляет менее чем 30 часов, существует та проблема, что осадок стволовых клеток может не подвергаться достаточному культивированию, и когда время обработки составляет более чем 100 часов, существует та проблема, что клетки могут осуществлять сверхэкспрессию из-за избыточно длительного времени культивирования.When the treatment time with TNFα and/or the protein synthesis inhibitory enzyme is less than 30 hours, there is a problem that the stem cell pellet may not be cultured sufficiently, and when the treatment time is more than 100 hours, there is a problem that the cells may overexpress due to excessively long culture time.
В иллюстративном варианте осуществления настоящего изобретения, выделение экзосом может включать: получение первого супернатанта посредством центрифугирования собранного культурального раствора стволовых клеток при 200-400 xg в течение 5-20 минут; получение второго супернатанта посредством центрифугирования первого супернатанта при 1800-2300 xg в течение 5-30 минут; получение осадка экзосом посредством центрифугирования или ультрацентрифугирования второго супернатанта при 90000-110000 xg в течение 50-100 минут и удаления супернатанта; и суспендирования полученного осадка экзосом в буфере PBS, и выделение частиц экзосом. Когда частицы экзосом выделены, суспензию можно обрабатывать ультразвуковыми волнами.In an exemplary embodiment of the present invention, isolation of exosomes may include: obtaining a first supernatant by centrifuging the harvested stem cell culture solution at 200-400 xg for 5-20 minutes; obtaining a second supernatant by centrifuging the first supernatant at 1800-2300 xg for 5-30 minutes; obtaining exosome sediment by centrifuging or ultracentrifuging the second supernatant at 90,000-110,000 xg for 50-100 minutes and removing the supernatant; and suspending the resulting exosome pellet in PBS buffer, and isolating the exosome particles. Once the exosome particles have been isolated, the suspension can be treated with ultrasonic waves.
Когда осадок экзосом получают и суспендируют в буфере PBS, и затем не обрабатывают ультразвуковыми волнами, существует та проблема, что экзосомы высокой чистоты невозможно экстрагировать из-за плотно спрессованного осадка. Таким образом, только когда частицы экзосом выделяют из полученного осадка экзосом, существует то преимущество, что можно экстрагировать частицы экзосом высокой чистоты.When the exosome pellet is prepared and suspended in PBS buffer and then not treated with ultrasonic waves, there is a problem that high purity exosomes cannot be extracted due to the densely packed pellet. Thus, only when the exosome particles are isolated from the obtained exosome pellet, there is an advantage that high purity exosome particles can be extracted.
В иллюстративном варианте осуществления настоящего изобретения, получение образца клеток из мезенхимальных стволовых клеток может включать разделение образца на небольшие фрагменты и обработку небольших фрагментов в течение 20-40 минут посредством добавления к ним коллагеназы. Затем, ферментную реакцию можно инактивировать посредством добавления в нее DMEM, и в этом случае, является возможным избирательно дополнительно включать 10% эмбриональную бычью сыворотку (FBS). Кроме того, после центрифугирования при 200-400 xg в течение 3-20 минут, образец клеток можно получать посредством отбрасывания супернатанта, экстракции частиц осадка клеток, и суспендирования частиц осадка в FBS и в среде Игла в модификации Дульбекко (DMEM).In an exemplary embodiment of the present invention, obtaining a cell sample from mesenchymal stem cells may include dividing the sample into small fragments and treating the small fragments for 20-40 minutes by adding collagenase thereto. Then, the enzyme reaction can be inactivated by adding DMEM to it, in which case it is possible to selectively further include 10% fetal bovine serum (FBS). In addition, after centrifugation at 200-400 xg for 3-20 minutes, a cell sample can be obtained by discarding the supernatant, extracting the cell pellet particles, and suspending the pellet particles in FBS and Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM).
Получение образца клеток может дополнительно включать ресуспендирование полученного образца клеток, и затем рассев ресуспендированных клеток. Когда дополнительно включают рассев ресуспендированных клеток, существует то преимущество, что является возможным предотвращать агрегацию частиц осадка клеток в буфере FBS при суспендировании.Obtaining a cell sample may further include resuspending the resulting cell sample, and then seeding the resuspended cells. When the sieving of resuspended cells is additionally included, there is the advantage that it is possible to prevent cell pellet particles from aggregating in the FBS buffer during suspension.
В иллюстративном варианте осуществления настоящего изобретения, при получении образца, мезенхимальные стволовые клетки могут быть извлечены из жировой ткани или плацентарной ткани.In an exemplary embodiment of the present invention, when obtaining a sample, mesenchymal stem cells can be extracted from adipose tissue or placental tissue.
Происходящие из жировой ткани стволовые клетки, которые могут быть извлечены из жировой ткани, означают происходящие из жировой ткани стволовые клетки человека, происходящие из жировых клеток человека. Поэтому, существует то преимущество, что является возможным экстрагировать экзосомы, содержащие генетическую информацию, белки и факторы роста из жировых клеток.Adipose-derived stem cells, which can be extracted from adipose tissue, means human adipose-derived stem cells derived from human fat cells. Therefore, there is an advantage that it is possible to extract exosomes containing genetic information, proteins and growth factors from fat cells.
В иллюстративном варианте осуществления настоящего изобретения, стволовая клетка может представлять собой эмбриональную стволовую клетку, взрослую стволовую клетку или индуцированную плюрипотентную стволовую клетку (IPS).In an exemplary embodiment of the present invention, the stem cell may be an embryonic stem cell, an adult stem cell, or an induced pluripotent stem cell (IPS).
В иллюстративном варианте осуществления настоящего изобретения, в культуральном растворе клеток, количество экзосом и содержание любого одного или нескольких из происходящего из экзосом белка и происходящей из экзосом РНК может быть увеличено.In an exemplary embodiment of the present invention, in a cell culture solution, the number of exosomes and the content of any one or more of an exosome-derived protein and an exosome-derived RNA can be increased.
В иллюстративном варианте осуществления настоящего изобретения, можно выделять 1,1 × 1010 или более экзосом на мл культурального раствора клеток. Более конкретно, можно выделять 1,2 × 1012 или менее экзосом на мл культурального раствора клеток.In an exemplary embodiment of the present invention, 1.1 x 10 10 or more exosomes per ml of cell culture solution can be isolated. More specifically, 1.2 x 10 12 or less exosomes per ml of cell culture solution can be isolated.
Когда экзосомы, выделенные посредством способа, в соответствии с иллюстративным вариантом осуществления настоящего изобретения, обрабатывают ДНКазой I, существует то преимущество, что чистота увеличивается на 10% или более.When exosomes isolated by the method according to an exemplary embodiment of the present invention are treated with DNase I, there is an advantage that the purity is increased by 10% or more.
Иллюстративный вариант осуществления настоящего изобретения относится к культуральному раствору, включающему экзосомы высокой чистоты, происходящие из мезенхимальных стволовых клеток, полученные с использованием данного способа.An exemplary embodiment of the present invention relates to a culture solution comprising high purity exosomes derived from mesenchymal stem cells obtained using this method.
В иллюстративном варианте осуществления настоящего изобретения, в культуральном растворе можно увеличивать количество экзосом и содержание любого одного или нескольких из происходящего из экзосом белка и происходящей из экзосом РНК.In an exemplary embodiment of the present invention, the number of exosomes and any one or more of exosome-derived protein and exosome-derived RNA can be increased in the culture solution.
Кроме того, для анализа состояния экзосом, экзосомы можно метить флуоресцентным материалом, так что существует то преимущество, что уровень экстракции можно указывать посредством измерения значения флуоресцентного сигнала экзосом, меченных флуоресцентным материалом, для анализа состояния экзосом.In addition, to analyze the status of exosomes, exosomes can be labeled with a fluorescent material, so there is an advantage that the extraction level can be indicated by measuring the fluorescent signal value of exosomes labeled with a fluorescent material to analyze the status of exosomes.
В рамках изобретения, термин «флуоресцентный материал» относится к материалу, который образует свет посредством изменения физических условий и химической обработки. Например, флуоресцентный материал может представлять собой флуоресцентный белок, такой как зеленый флуоресцентный белок (GFP), желтый флуоресцентный белок (YFP) и красный флуоресцентный белок (RFP), или может представлять собой фотобелок или люциферазу.In the context of the invention, the term "fluorescent material" refers to a material that produces light through changes in physical conditions and chemical processing. For example, the fluorescent material may be a fluorescent protein such as green fluorescent protein (GFP), yellow fluorescent protein (YFP), and red fluorescent protein (RFP), or may be a photoprotein or luciferase.
Кроме того, в экзосомах, меченных флуоресцентным материалом, флуоресцентный материал локализован отдельно в экзосомах, или экзосомы, меченные флуоресцентным материалом, могут включать слитый белок, в котором связаны мембранный белок и флуоресцентный материал. Слитый белок имеет то преимущество, что количество и значение сигнала экзосом можно точно идентифицировать, поскольку флуоресцентный материал может связываться с мембранным белком непосредственно или посредством линкера.Furthermore, in exosomes labeled with fluorescent material, the fluorescent material is localized separately within the exosomes, or exosomes labeled with fluorescent material may include a fusion protein in which the membrane protein and the fluorescent material are linked. The fusion protein has the advantage that the amount and value of the exosome signal can be accurately identified because the fluorescent material can bind to the membrane protein directly or via a linker.
Иллюстративный вариант осуществления настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции, включающей экзосомы, происходящие из мезенхимальных стволовых клеток, полученных с использованием способа, в качестве активного ингредиента.An exemplary embodiment of the present invention relates to a pharmaceutical composition comprising exosomes derived from mesenchymal stem cells obtained using the method as an active ingredient.
В фармацевтической композиции по настоящему изобретению, можно использовать общеизвестный и общеупотребительный адъювант, и дополнительный пригодный носитель или разбавитель. Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно использовать в форме твердого вещества, раствора, эмульсии, диспергирующего вещества, мицеллы, липосомы и т.п., и композиция, полученная в этом случае, включает фармацевтическую композицию по настоящему изобретению, в качестве активного ингредиента, вместе с органическим или неорганическим носителем или наполнителем, пригодным для энтерального или парентерального введения. Активный ингредиент можно смешивать, например, с обычными нетоксичными фармацевтически приемлемыми носителями для таблеток, гранул, капсул, суппозиториев, растворов, эмульсий, суспензий и любой другой формы, подходящей для использования. Носители, которые можно использовать, включают глюкозу, лактозу, гуммиарабик, желатин, маннит, крахмальный клейстер, трисиликат магния, тальк, кукурузный крахмал, коллоидный диоксид кремния, картофельный крахмал, мочевину, триглицериды со средней длиной цепи, декстран и другие носители, пригодные для использования в изготовлении препаратов, в твердой, полутвердой или жидкой форме. Кроме того, можно использовать вспомогательные, стабилизирующие, загущающие и окрашивающие средства, и ароматизирующие средства.In the pharmaceutical composition of the present invention, a commonly known and commonly used adjuvant and an additional suitable carrier or diluent may be used. The pharmaceutical composition of the present invention can be used in the form of a solid, solution, emulsion, dispersant, micelles, liposomes, and the like, and the composition obtained in this case includes the pharmaceutical composition of the present invention as an active ingredient, together with an organic or inorganic carrier or excipient suitable for enteral or parenteral administration. The active ingredient can be mixed, for example, with conventional non-toxic pharmaceutically acceptable carriers for tablets, granules, capsules, suppositories, solutions, emulsions, suspensions, and any other form suitable for use. Carriers that can be used include glucose, lactose, gum arabic, gelatin, mannitol, starch paste, magnesium trisilicate, talc, corn starch, colloidal silicon dioxide, potato starch, urea, medium chain triglycerides, dextran, and other carriers suitable for use in the manufacture of preparations, in solid, semi-solid or liquid form. In addition, auxiliary, stabilizing, thickening and coloring agents, and flavoring agents can be used.
Фармацевтическую композицию можно использовать посредством составления в форме перорального состава, такого как порошок, гранула, пилюля, капсула, суспензия, эмульсия, сироп и аэрозоль, препарат для наружного применения, суппозиторий и стерильный раствор для инъекций, в соответствии с типичным способом. Конкретно, когда получают фармацевтическую композицию, фармацевтическую композицию можно получать с использованием общеупотребительного разбавителя или наполнителя, такого как наполнитель, расширитель, связывающее средство, увлажняющее средство, дезинтегрирующее средство и поверхностно-активное вещество. Твердый состав для перорального введения включает таблетку, пилюлю, порошок, гранулу, капсулу и т.п., и твердый состав можно получать посредством смешивания по меньшей мере одного наполнителя, например, крахмала, карбоната кальция, сахарозы или лактозы, желатина и т.п., с фармацевтической композицией по настоящему изобретению. Кроме того, в дополнение к простым наполнителям, можно использовать также смазывающие средства, такие как стеарат магния и тальк. Жидкий состав для перорального введения соответствует суспензии, жидкости для внутреннего применения, эмульсии, сиропу и т.п., и жидкий состав может включать, в дополнение к воде и вазелиновому маслу, которые являются простыми общеупотребительными разбавителями, различные наполнители, например, увлажняющее средство, подсластитель, ароматизатор, консервант, и т.п. Примеры состава для парентерального введения включают водный стерильный раствор, неводный растворитель, суспензию, эмульсию, лиофилизированный препарат и суппозиторий. В качестве неводного растворителя и суспензии, можно использовать пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительное масло, такое как оливковое масло, пригодный для инъекции сложный эфир, такой как этилолеат, и т.п. В качестве основы суппозитория, можно использовать витепсол, макрогол, Tween 61, масло какао, лауриновый жир, глицерожелатин, и т.п.The pharmaceutical composition can be used by formulating in the form of an oral formulation such as powder, granule, pill, capsule, suspension, emulsion, syrup and aerosol, topical preparation, suppository and sterile injection according to a typical method. Specifically, when a pharmaceutical composition is prepared, the pharmaceutical composition can be prepared using a commonly used diluent or excipient such as a filler, an extender, a binder, a wetting agent, a disintegrant, and a surfactant. The solid composition for oral administration includes a tablet, pill, powder, granule, capsule, and the like, and the solid composition can be obtained by mixing at least one excipient, for example, starch, calcium carbonate, sucrose or lactose, gelatin, and the like. ., with the pharmaceutical composition of the present invention. Furthermore, in addition to simple fillers, lubricating agents such as magnesium stearate and talc can also be used. The liquid formulation for oral administration corresponds to a suspension, an oral liquid, an emulsion, a syrup, and the like, and the liquid formulation may include, in addition to water and paraffin oil, which are simple, commonly used diluents, various excipients, such as a moisturizer, sweetener, flavoring agent, preservative, etc. Examples of a formulation for parenteral administration include an aqueous sterile solution, a non-aqueous solvent, a suspension, an emulsion, a lyophilized preparation, and a suppository. As the non-aqueous solvent and suspension, propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like can be used. As a suppository base, Witepsol, Macrogol, Tween 61, cocoa butter, lauric fat, glycerogelatin, etc. can be used.
Способ введения фармацевтической композиции в соответствии с настоящим изобретением включает, но без ограничения, пероральное, внутривенное, внутримышечное, внутриартериальное, интрамедуллярное, интратекальное, интракардиальное, чрескожное, подкожное, внутрибрюшинное, интраназальное, энтеральное, местное, подъязычное или ректальное введение. Пероральное или парентеральное введение является предпочтительным. В рамках изобретения, термин «парентеральное» включает способы подкожной, внутрикожной, внутривенной, внутримышечной, внутрисуставной, интрасиновиальной, интрастернальной, интратекальной, внутриочаговой и интракраниальной инъекции или инфузии. Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно также вводить в форме суппозитория для ректального введения.The route of administration of the pharmaceutical composition according to the present invention includes, but is not limited to, oral, intravenous, intramuscular, intra-arterial, intramedullary, intrathecal, intracardiac, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, enteral, topical, sublingual, or rectal administration. Oral or parenteral administration is preferred. Within the scope of the invention, the term "parenteral" includes subcutaneous, intradermal, intravenous, intramuscular, intraarticular, intrasynovial, intrasternal, intrathecal, intralesional and intracranial injection or infusion methods. The pharmaceutical composition of the present invention may also be administered in the form of a rectal suppository.
Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно вводить посредством любого устройства, так чтобы активный материал можно было переносить в клетку-мишень. Предпочтительным способом введения и составом является инъекция. Препарат для инъекции можно получать посредством использования водного растворителя, такого как физиологический солевой раствор, раствор Рингера, раствор Хенкса или стерильный водный раствор, растительного масла, такого как оливковое масло, сложного эфира высшей жирной кислоты, такого как этилолеат, неводного растворителя, такого как этанол, бензиловый спирт, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль или глицерин, и т.п., и для трансмукозального введения, можно использовать неинвазивное средство, широко известное в данной области, являющееся пригодным для барьера, через который должна проходить инъекция, и препарат для инъекции, может, кроме того, включать фармацевтический носитель, такой как аскорбиновая кислота, гидросульфит натрия, BHA, токоферол, ЭДТА, и т.п., в качестве стабилизатора для предотвращения дегенерации, эмульгатор, забуферивающее средство для контроля pH и консервант для подавления роста микроорганизмов, такой как нитрат фенилртути, тимеросал, хлорид бензалкония, фенол и крезол, бензиловый спирт.The pharmaceutical composition of the present invention can be administered by any device so that the active material can be transferred to the target cell. The preferred route of administration and formulation is injection. The preparation for injection can be prepared by using an aqueous solvent such as physiological saline, Ringer's solution, Hank's solution or a sterile aqueous solution, a vegetable oil such as olive oil, a higher fatty acid ester such as ethyl oleate, a non-aqueous solvent such as ethanol , benzyl alcohol, propylene glycol, polyethylene glycol or glycerin, etc., and for transmucosal administration, a non-invasive agent widely known in the art can be used, which is suitable for the barrier through which the injection must pass, and the preparation for injection can, furthermore, include a pharmaceutical carrier such as ascorbic acid, sodium hydrosulfite, BHA, tocopherol, EDTA, and the like as a stabilizer to prevent degeneration, an emulsifier, a pH buffering agent, and a preservative to inhibit the growth of microorganisms, such as phenylmercury nitrate, thimerosal, benzalkonium chloride, phenol and cresol, benzyl alcohol.
Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может меняться, в зависимости от различных факторов, включая активность конкретного используемого эффективного ингредиента, возраста, массы тела, общего состояния здоровья, пола, диеты, времени введения, способа введения, скорости выведения, комбинации лекарственных средств и тяжести конкретного заболевания, подлежащего предотвращению или лечению, и доза фармацевтической композиции меняется, в зависимости от состояния и массы тела пациента, степени заболевания, формы лекарственного средства, способа и длительности введения, но может быть подходящим образом выбрана специалистом в данной области, и может составлять 0,0001-50 мг/кг или 0,001-50 мг/кг ежесуточно. Введение можно проводить один раз в сутки и можно разделять на несколько раз. Доза не предназначена для ограничения объема настоящего изобретения никаким образом.The pharmaceutical composition of the present invention may vary, depending on various factors, including the activity of the specific effective ingredient used, age, body weight, general health, sex, diet, time of administration, route of administration, rate of elimination, drug combination, and severity of the particular disease. to be prevented or treated, and the dosage of the pharmaceutical composition varies depending on the condition and body weight of the patient, the degree of disease, the form of the drug, the method and duration of administration, but can be appropriately selected by a person skilled in the art, and can be 0.0001 -50 mg/kg or 0.001-50 mg/kg daily. The introduction can be carried out once a day and can be divided into several times. The dose is not intended to limit the scope of the present invention in any way.
Иллюстративный вариант осуществления настоящего изобретения относится к косметической композиции, включающей экзосомы, происходящие из мезенхимальных стволовых клеток, полученные с использованием данного способа, в качестве активного ингредиента.An exemplary embodiment of the present invention relates to a cosmetic composition comprising exosomes derived from mesenchymal stem cells obtained using this method as an active ingredient.
Косметическая композиция, в соответствии с настоящим изобретением, может представлять собой любой состав, выбранный из группы, состоящей из лосьона для кожи, смягчающего средства для кожи, тоника для кожи, вяжущего средства, лосьона, косметического молочка, увлажняющего лосьона, питательного лосьона, массажного крема, питательного крема, увлажняющего крема, крема для рук, основы под макияж, эссенции, питательной эссенции, маски, мыла, очищающей пены, очищающего лосьона, очищающего крема, лосьона для тела, очищающего средства для тела, очищающего средства, средства для ухода, косметического раствора, косметической маски, мази, геля, средства для растирания, жидкости, пластыря и спрея, но без ограничения конкретным составом, и может иметь состав типичной косметической композиции.The cosmetic composition according to the present invention may be any composition selected from the group consisting of skin lotion, skin emollient, skin tonic, astringent, lotion, cosmetic milk, moisturizing lotion, nourishing lotion, massage cream , nourishing cream, moisturizing cream, hand cream, foundation, essence, nourishing essence, mask, soap, cleansing foam, cleansing lotion, cleansing cream, body lotion, body cleanser, cleanser, care product, cosmetic solution, cosmetic mask, ointment, gel, rubbing agent, liquid, patch and spray, but not limited to a specific composition, and may have the composition of a typical cosmetic composition.
Добавки также не являются ограниченными каждым составом, и можно добавлять обычные добавки в области косметологии. Примеры обычных добавок в области косметологии включают одно или несколько, выбранные из группы, состоящей из антибиотика, связующего вещества, дезинтегрирующего средства, разбавителя, вещества, способствующего скольжению, стабилизатора, консерванта, отдушки, масла, воды, поверхностно-активного вещества, увлажняющего средства, низшего спирта, загустителя, хелатирующего агента, пигмента и антисептического средства.The additives are also not limited to each formulation, and conventional cosmetic additives can be added. Examples of conventional cosmetic additives include one or more selected from the group consisting of an antibiotic, a binder, a disintegrant, a diluent, a glidant, a stabilizer, a preservative, a fragrance, an oil, water, a surfactant, a moisturizer, lower alcohol, thickener, chelating agent, pigment and antiseptic.
Далее в настоящем описании, настоящее изобретение подробно описано со ссылкой на примеры и сравнительные примеры. Однако, следующие примеры и сравнительные примеры предназначены только для иллюстрации настоящего изобретения, и содержание настоящего изобретения не является ограниченным следующими примерами.Hereinafter in the present description, the present invention is described in detail with reference to examples and comparative examples. However, the following examples and comparative examples are only intended to illustrate the present invention, and the content of the present invention is not limited to the following examples.
1. Выделение и культивирование происходящих из жировой ткани человека мезенхимальных стволовых клеток1. Isolation and cultivation of human adipose-derived mesenchymal stem cells
Жировую ткань обычно можно получать посредством липосакции, однако способ не является ограниченным этим. Происходящие из жировой ткани человека мезенхимальные стволовые клетки выделяли из жировой ткани, полученной посредством липосакции, следующим образом:Adipose tissue can usually be obtained through liposuction, however, the method is not limited to this. Human adipose-derived mesenchymal stem cells were isolated from liposuction-derived adipose tissue as follows:
Выделенную жировую ткань промывали фосфатно-солевым буфером (PBS). После того, как промытую жировую ткань разделяли на небольшие фрагменты, к ним добавляли 0,1% коллагеназу типа II. После обработки ткани при 37°C в течение 30 минут, ферментную реакцию инактивировали посредством добавления в нее 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) и среды Игла в модификации Дульбекко (DMEM) с низким содержанием глюкозы (содержащей 10% FBS DMEM с низким содержанием глюкозы), и центрифугирование проводили дважды при 300 xg в течение 10 минут. После отбрасывания супернатанта и суспендирования оставшегося осадка в содержащей 10% FBS DMEM с низким содержанием глюкозы, осадок собирали посредством центрифугирования фильтрата, который пропускали через 100 мкм нейлоновую мембрану, при 300 xg в течение 10 минут.The isolated adipose tissue was washed with phosphate buffered saline (PBS). After the washed adipose tissue was divided into small fragments, 0.1% type II collagenase was added to them. After tissue treatment at 37°C for 30 minutes, the enzyme reaction was inactivated by adding 10% fetal bovine serum (FBS) and low glucose Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) (containing 10% FBS low glucose DMEM). ), and centrifugation was performed twice at 300 xg for 10 minutes. After discarding the supernatant and suspending the remaining pellet in low glucose DMEM containing 10% FBS, the pellet was collected by centrifuging the filtrate, which was passed through a 100 μm nylon membrane, at 300 xg for 10 minutes.
Далее, после суспендирования осадка клеток в DMEM с низким содержанием глюкозы (полной среде) включающей 10% эмбриональную бычью сыворотку (FBS), дополненную пенициллином и стрептомицином, осадок клеток разводили при концентрации 1 X 105 клеток/1 мл среды в 150-мм чашке Петри для культивирования клеток, и культивировали при 37°C в инкубаторе с 5% CO2.Next, after suspending the cell pellet in low glucose DMEM (complete medium) containing 10% fetal bovine serum (FBS) supplemented with penicillin and streptomycin, the cell pellet was diluted at a concentration of 1
Среду меняли на свежую полную среду каждые 72 часа, клетки выделяли с использованием трипсина-ЭДТА во временной точке, когда концентрация клеток превышала 80%, и затем субкультивировали при концентрации 1 X 105 клеток/1 мл среды в новой 150-мм чашке Петри для культивирования клеток.The medium was changed to fresh complete medium every 72 hours, the cells were isolated using trypsin-EDTA at the time point when the cell concentration exceeded 80%, and then subcultured at a concentration of 1
2. Амплификация мезенхимальных стволовых клеток2. Amplification of mesenchymal stem cells
Для выделения экзосом из культивированных стволовых клеток, способность к дифференцировке и способность к пролиферации усиливали посредством субкультивирования мезенхимальных стволовых клеток на протяжении 4-10 пассажей с заменой в то же время среды каждые 72 часа до 80% - 100% конфлюэнтности в полной среде, дополненной 5 нг/мл EGF, в ходе субкультивирования.For the isolation of exosomes from cultured stem cells, differentiation capacity and proliferation capacity were enhanced by subculturing mesenchymal stem cells for 4-10 passages while changing medium every 72 hours to 80%-100% confluence in complete medium supplemented with 5 ng/ml EGF, during subculturing.
3. Изменение уровня продукции экзосом стволовых клеток, в соответствии с соотношением TNFa и циклогексимида, добавленных в субстратную среду3. Change in the level of production of stem cell exosomes, in accordance with the ratio of TNFa and cycloheximide added to the substrate medium
Мезенхимальные стволовые клетки 100% конфлюэнтности (5 × 106 клеток), которые культивировали в 100-мм чашке Петри, промывали три раза с использованием PBS, и субстратную среду заменяли на DMEM с низким содержанием глюкозы. Концентрацию экзосом, выделенных из мезенхимальных стволовых клеток, обработанных совместно с использованием TNFα, измеряли посредством NTA, посредством увеличения концентрации циклогексимида с обработкой в то же время субстратной среды с использованием TNFα при концентрации 50 нг/мл.100% confluent mesenchymal stem cells (5 x 10 6 cells) that were cultured in a 100 mm Petri dish were washed three times with PBS and the substrate medium was changed to low glucose DMEM. The concentration of exosomes isolated from mesenchymal stem cells co-treated with TNFα was measured by NTA by increasing the concentration of cycloheximide while treating the substrate medium with TNFα at a concentration of 50 ng/ml.
При фиксированной концентрации 50 нг/мл TNFα, мезенхимальные стволовые клетки обрабатывали с использованием концентрации циклогексимида 50 нг/мл циклогексимида, что представляет собой соотношение 1:1, 250 нг/мл циклогексимида, что представляет собой соотношение 1:5, 1000 нг/мл циклогексимида, что представляет собой соотношение 1:20, 5000 нг/мл циклогексимида, что представляет собой соотношение 1:100, 25000 нг/мл циклогексимида, что представляет собой соотношение 1:500, 50000 нг/мл циклогексимида, что представляет собой соотношение 1:1000, и 100000 нг/мл циклогексимида, что представляет собой соотношение 1:2000. После культивирования мезенхимальных стволовых клеток в течение 48 часов, культуральный раствор стволовых клеток собирали, и затем чистые экзосомы выделяли следующим образом. Культуральный раствор мезенхимальных стволовых клеток собирали, и затем центрифугировали при 300 xg в течение 10 минут, и супернатант отделяли, и затем отделенный супернатант центрифугировали при 2000 xg в течение 20 минут, и затем супернатант отделяли. После того, как отделенный супернатант снова ультрацентрифугировали при 100000 xg в течение 70 минут, осадок (экзосомы), от которого был удален супернатант, суспендировали в PBS и обрабатывали ультразвуком для выделения частиц экзосом, и концентрацию выделенных экзосом измеряли посредством анализа траекторий движения наночастиц (NTA). Результаты измерений посредством NTA показаны в таблице 1.At a fixed concentration of 50 ng/ml TNFα, mesenchymal stem cells were treated using a cycloheximide concentration of 50 ng/ml cycloheximide, which is a 1:1 ratio, 250 ng/ml cycloheximide, which is a 1:5 ratio, 1000 ng/ml cycloheximide , which is a ratio of 1:20, 5000 ng/ml cycloheximide, which is a ratio of 1:100, 25,000 ng/ml cycloheximide, which is a ratio of 1:500, 50,000 ng/ml cycloheximide, which is a ratio of 1:1000 , and 100,000 ng/ml cycloheximide, which is a ratio of 1:2000. After culturing the mesenchymal stem cells for 48 hours, the stem cell culture solution was collected, and then pure exosomes were isolated as follows. The mesenchymal stem cell culture solution was collected and then centrifuged at 300 xg for 10 minutes, and the supernatant was separated, and then the separated supernatant was centrifuged at 2000 xg for 20 minutes, and then the supernatant was separated. After the separated supernatant was again ultracentrifuged at 100,000 xg for 70 minutes, the pellet (exosomes) from which the supernatant was removed were suspended in PBS and sonicated to isolate exosome particles, and the concentration of the isolated exosomes was measured by nanoparticle trajectory analysis (NTA). ). The measurement results by NTA are shown in Table 1.
Со ссылкой на следующую таблицу 1, можно подтвердить, что можно выделять от 1,58X109±3,2×109 до 1,26×1011±2,8×109 частиц на мл культурального раствора клеток.With reference to the following Table 1, it can be confirmed that 1.58× 10 9 ±3.2×10 9 to 1.26×10 11 ±2.8×10 9 particles per ml of cell culture solution can be isolated.
4. Выделение экзосом стволовых клеток, в соответствии с временем обработки TNFa и циклогексимидом, добавленными в субстратную среду4. Isolation of stem cell exosomes according to treatment time with TNFa and cycloheximide added to the substrate medium
После обработки субстратной среды из примера 3 с использованием TNFα (50 нг/мл) и циклогексимида (5000 нг/мл), экзосомы стволовых клеток выделяли из культурального раствора после культивирования при 37°C в инкубаторе с 5% CO2, и концентрация экзосомы измерена посредством анализа траекторий движения наночастиц (NTA) и показана в таблице 2.After treating the substrate medium of Example 3 with TNFα (50 ng/mL) and cycloheximide (5000 ng/mL), stem cell exosomes were isolated from the culture solution after culturing at 37° C. in a 5% CO 2 incubator, and the exosome concentration was measured through nanoparticle trajectory analysis (NTA) and is shown in Table 2.
Со ссылкой на следующую таблицу 2, можно подтвердить, что когда субстратную среду обрабатывали с использованием TNFα (50 нг/мл) и циклогексимида (5000 нг/мл) в течение 30 часов - 100 часов, выделяли 1,1 × 1011 или более экзосом на мл культурального раствора клеток.With reference to the following Table 2, it can be confirmed that when the substrate medium was treated with TNFα (50 ng/mL) and cycloheximide (5000 ng/mL) for 30 hours to 100 hours, 1.1 x 10 11 or more exosomes were isolated per ml of cell culture solution.
5. Выделение экзосом стволовых клеток, в соответствии с типом добавки к субстратной среде5. Isolation of stem cell exosomes, according to the type of addition to the substrate medium
Мезенхимальные стволовые клетки 100% конфлюэнтности (1,5 × 107 клеток), культивированные в 150-мм чашке Петри, промывали три раза с использованием PBS. Мезенхимальные стволовые клетки, культивированные в среде, замененной на DMEM с низким содержанием глюкозы, культивировали в течение 48 часов в среде, в которую добавляли TNFα (50 нг/мл) и циклогексимид (5 мкг/мл) в комбинации (Пример 14), в среде, в которую добавляли циклогексимид (5 мкг/мл) (Пример 15), в среде, в которую добавляли TNFα (50 нг/мл) (Сравнительный пример 1), в среде, в которую добавляли 1 мкМ стауроспорин (Сравнительный пример 2), в среде, в которую добавляли 2 мкМ стауроспорин (Сравнительный пример 3), в среде, в которую добавляли тапсигаргин (5 мкМ) (Сравнительный пример 4), в истощенной по аминокислотам среде (сбалансированном солевом растворе Хенкса (HBSS)) (Сравнительный пример 5), в истощенной по глюкозе среде [истощенных по глюкозе средам (Gluc(-))](Сравнительный пример 6) и в субстратной среде (10% PBS, DMEM с низким содержанием глюкозы) (Сравнительный пример 7). Затем, экзосомы выделяли из культуральных сред посредством вышеописанного способа выделения.100% confluent mesenchymal stem cells (1.5 x 10 7 cells) cultured in a 150 mm Petri dish were washed three times with PBS. Mesenchymal stem cells cultured in medium replaced with low glucose DMEM were cultured for 48 hours in medium supplemented with TNFα (50 ng/ml) and cycloheximide (5 μg/ml) in combination (Example 14), in a medium to which cycloheximide (5 μg/ml) was added (Example 15), a medium to which TNFα (50 ng/ml) was added (Comparative Example 1), a medium to which 1 μM staurosporine was added (Comparative Example 2) , in a medium to which 2 μM staurosporine was added (Comparative Example 3), in a medium to which thapsigargin (5 μM) was added (Comparative Example 4), in an amino acid depleted medium (Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)) (Comparative Example 5), in glucose-depleted media [glucose-depleted media (Gluc(−))] (Comparative Example 6) and in substrate media (10% PBS, low glucose DMEM) (Comparative Example 7). Then, the exosomes were isolated from the culture media by the isolation method described above.
Для выделенных экзосом, количество частиц и размер частиц количественно оценивали посредством анализа траекторий движения наночастиц (NTA), и белки количественно оценивали посредством анализа Бредфорд. Кроме того, маркер экзосом измеряли с использованием Вестерн-блоттинга. Количество частиц выделенных экзосом проиллюстрировано на ФИГ. 3 и 4, и показано в следующей таблице 3. Количество белков и размер частиц экзосом показаны на ФИГ. 5-7 и в таблице 4. Кроме того, экспрессия маркеров экзосом CD63, рецептора 1 сфингозин-1-фосфата (S1PR1) и рецептора 3 сфингозин-1-фосфата (S1PR3) проиллюстрирована на ФИГ. 8.For isolated exosomes, particle number and particle size were quantified by nanoparticle trajectory analysis (NTA), and proteins were quantified by Bradford analysis. In addition, the exosome marker was measured using Western blotting. The number of particles of isolated exosomes is illustrated in FIG. 3 and 4, and shown in the following table 3. The number of proteins and particle size of exosomes are shown in FIG. 5-7 and Table 4. In addition, expression of the CD63 exosome markers, sphingosine-1-phosphate receptor 1 (S1PR1) and sphingosine-1-phosphate receptor 3 (S1PR3) is illustrated in FIG. 8.
Частицы размера с значением моды 141,6±58,4 нм индуцированы из мезенхимальных стволовых клеток в условиях обработки с использованием TNFα (50 нг/мл) и циклогексимида (5 мкг/мл) из примера 14, и показаны в таблице 4 и ФИГ. 5A. Со ссылкой на ФИГ. 9, частицы экзосом были окружены липидной бислойной мембраной, и экспрессию CD63, который является маркером для экзосом, подтверждали посредством трансмиссионной электронной микроскопии (TEM). Со ссылкой на ФИГ. 10, в тесте экспрессии поверхностного маркера экзосом с использованием Exoview, для экзосом, происходящих из мезенхимальных стволовых клеток, показаны маркеры экзосом из числа кластера дифференцировки 63 (CD63), кластера дифференцировки 9 (CD9) и кластера дифференцировки 81 (CD81).Particle size with a mode value of 141.6 ± 58.4 nm induced from mesenchymal stem cells under treatment conditions using TNFα (50 ng/ml) and cycloheximide (5 μg/ml) from example 14, and are shown in table 4 and FIG. 5A. With reference to FIG. 9, the exosome particles were surrounded by a lipid bilayer membrane, and the expression of CD63, which is a marker for exosomes, was confirmed by transmission electron microscopy (TEM). With reference to FIG. 10, in the exosome surface marker expression test using Exoview, for exosomes derived from mesenchymal stem cells, exosome markers from differentiation cluster 63 (CD63), differentiation cluster 9 (CD9), and differentiation cluster 81 (CD81) are shown.
Следует понимать, что вышеуказанное является иллюстрацией настоящего изобретения, и его не следует рассматривать как ограниченное конкретными описанными вариантами осуществления, и что модификации описанных вариантов осуществления, так же как другие варианты осуществления, предназначены для включения в объем прилагаемой формулы изобретения. Изобретение определено посредством следующей формулы изобретения, с включенными в нее эквивалентами пунктов формулы изобретения.It should be understood that the foregoing is illustrative of the present invention and should not be construed as being limited to the specific embodiments described, and that modifications of the described embodiments, as well as other embodiments, are intended to be included within the scope of the appended claims. The invention is defined by the following claims, with the equivalents of the claims included.
Claims (18)
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR10-2020-0062365 | 2020-05-25 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2799432C1 true RU2799432C1 (en) | 2023-07-05 |
Family
ID=
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2019107939A1 (en) * | 2017-11-29 | 2019-06-06 | 재단법인 아산사회복지재단 | Composition for promoting production of stem cell-derived exosome |
| KR102096150B1 (en) * | 2018-01-05 | 2020-04-02 | 재단법인 아산사회복지재단 | Composition for Improving Skin Conditions, or Preventing or Treating Skin Diseases comprising Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesenchymal Stem Cells pre-treated with Interferon-gamma, and Exosomes derived therefrom |
| RU2766707C1 (en) * | 2020-11-13 | 2022-03-15 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова» (МГУ) | Drug for treatment of tissue fibrosis based on components of secretome of mesenchymal stromal cells, method for obtaining and applying remedy |
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2019107939A1 (en) * | 2017-11-29 | 2019-06-06 | 재단법인 아산사회복지재단 | Composition for promoting production of stem cell-derived exosome |
| KR102096150B1 (en) * | 2018-01-05 | 2020-04-02 | 재단법인 아산사회복지재단 | Composition for Improving Skin Conditions, or Preventing or Treating Skin Diseases comprising Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesenchymal Stem Cells pre-treated with Interferon-gamma, and Exosomes derived therefrom |
| RU2766707C1 (en) * | 2020-11-13 | 2022-03-15 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова» (МГУ) | Drug for treatment of tissue fibrosis based on components of secretome of mesenchymal stromal cells, method for obtaining and applying remedy |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| HARRELL C.R. et al., Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes and Other Extracellular Vesicles as New Remedies in the Therapy of Inflammatory Diseases, Cells, 2019, vol. 8, N. 12, 1605. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11879138B2 (en) | Method for preparing mesenchymal stem cell-derived exosomes and culture solution produced from the same | |
| US10071050B2 (en) | Cosmetic composition containing exosomes extracted from stem cell for skin whitening, antiwrinkle or regeneration | |
| KR101663912B1 (en) | Cosmetic composition containing exosomes extracted from stem cell for skin whitening, antiwrinkle or regeneration | |
| KR101629151B1 (en) | Composition including stem cell-derived exosome for inducing adipogenic differentiation and adipose tissue regeneration | |
| KR101422559B1 (en) | Culture medium of adipose-derived stem cell, method for preparing the same, and composition for promoting hair growth comprising the same | |
| RU2715866C2 (en) | Mesenchymal stromal cells for treating sepsis | |
| KR101980453B1 (en) | Composition For Promoting Production of Stem Cell-derived Exosomes | |
| EP4219686A1 (en) | Composition for promoting production of stem cell-derived exosomes and increasing stemness | |
| US20210361715A1 (en) | Use of exosome derived from mesenchymal stem cells co-cultured with melatonin in prevention and treatment of chronic kidney disease | |
| KR20190118523A (en) | A method for inducing transdifferentiation of immune cell based on exosome | |
| CN117157054A (en) | Composition for regenerating, whitening, antioxidant or treating wound comprising stem cell-derived exosomes as active ingredient and use thereof | |
| KR20150088374A (en) | Stem cell medium containing cell growth factors from human adipose derived stem cells and cosmetic composition for improvement atopic syndrom prepared therefrom | |
| RU2799432C1 (en) | Method of obtaining exosomes origining from mesenchymal stem cells and a cultural solution produced from them | |
| KR101564325B1 (en) | Composition for prevention or treatment of inflamatory disease comprising culture medium of adipose-derived stem cell-T cell | |
| KR101527880B1 (en) | Composition for skin-regeneration, skin-whitening, anti-oxidation or wound healing comprising culture medium of adipose-derived stem cell-T cell | |
| KR102693872B1 (en) | Pharmaceutical composition for preventing or treating atopic dermatitis comprising clonal stem cells | |
| KR102424333B1 (en) | Method for mass production of high-purity extracellular vesicles derived from stem cells using peptides | |
| CN117757740A (en) | Preparation and application of bone marrow mesenchymal stem cell exosome for treating diabetes | |
| CN117917964A (en) | Dermatological composition comprising extracellular vesicles derived from koji |