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KR101527880B1 - Composition for skin-regeneration, skin-whitening, anti-oxidation or wound healing comprising culture medium of adipose-derived stem cell-T cell - Google Patents

Composition for skin-regeneration, skin-whitening, anti-oxidation or wound healing comprising culture medium of adipose-derived stem cell-T cell Download PDF

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KR101527880B1
KR101527880B1 KR20130043536A KR20130043536A KR101527880B1 KR 101527880 B1 KR101527880 B1 KR 101527880B1 KR 20130043536 A KR20130043536 A KR 20130043536A KR 20130043536 A KR20130043536 A KR 20130043536A KR 101527880 B1 KR101527880 B1 KR 101527880B1
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KR
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Grant
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whitening
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김동완
박한나
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창원대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 지방유래줄기세포에 T 항원을 도입한 ADSC-T 세포의 배양액을 유효성분으로 포함하는, 피부재생용, 미백용 또는 항산화용 조성물에 관한 것이다. The present invention relates to the culture of T-ADSC the introduction of the T antigen in the adipose derived stem cells, the composition for skin regeneration, whitening or antioxidant comprising as an active ingredient. 본 발명에 따른 지방유래줄기 세포주(ADSC-T)의 배양액은 콜라겐 배양에서 콜라겐의 탄력증가 및 창상수축효과를 피부재생에 우수한 효과를 보이고, 또한 타이로시네이즈 활성 및 멜라닌 활성을 저해함으로써 피부 미백에 훌륭한 효과를 보이고, DPPH 라디칼 저해함으로써 항산화 효과에 탁월하며, 나아가 섬유아세포의 세포 이동성을 증가시킴으로써 상처 치료에 현저한 효과를 가지고 있으므로, 피부재생, 미백, 항산화 또는 상처치료에 유용하게 이용될 수 있다. Culture of the adipose derived stem cells (ADSC-T) according to the invention show an excellent effect of resilience and wound contraction effect of collagen in skin regeneration in collagen culture, and skin lightening by inhibiting the tyrosinase activity and melanin activated when the tie show an excellent effect on, so DPPH by radical inhibiting and excellent in antioxidant activity and has a marked effect on wound healing by further increasing the cell mobility of fibroblast cells, may be useful to skin regeneration, whitening, anti-oxidation or wound healing .

Description

지방유래줄기세포에 T 항원을 도입한 ADSC-T 세포의 배양액을 유효성분으로 포함하는, 피부재생용, 미백용, 항산화용 또는 상처 치료용 조성물{Composition for skin-regeneration, skin-whitening, anti-oxidation or wound healing comprising culture medium of adipose-derived stem cell-T cell} Adipose derived stem cells in culture media containing T-cells of ADSC to introduce the T antigen as an active ingredient, a composition for antioxidant or for wound for skin regeneration, whitening, treatment {Composition for skin-regeneration, skin-whitening, anti- oxidation or wound healing comprising culture medium of adipose-derived stem cell-T cell}

본 발명은 지방유래줄기세포에 T 항원을 도입한 ADSC-T 세포(Adipose-derived stem cell-T cell)의 배양액을 유효성분으로 포함하는, 피부재생용, 미백용, 항산화용 또는 상처 치료용 조성물에 관한 것이다. The present invention, a composition for antioxidant or wound for for skin regeneration, whitening, treatment comprising the culture medium of the ADSC-T cells (Adipose-derived stem cell-T cell) incorporating the T antigen as the active ingredient in the adipose derived stem cells relate to.

21세기 의학 및 삶의 질의 향상으로 인간평균수명은 100세를 바라보고 있다. 21st century medicine and improve quality of life, human life expectancy is looking at 100 years of age. 인간수명이 늘어남에 따라 질병예방과 노화방지에 관한 관심도가 커지고 있다. The concern about the anti-aging and disease prevention has increased along the increasing human life. 사람의 신체피부는 시간이 지남에 따라 외부자극과 신체피부노화에 의해서 주름, 기미, 재생력이 떨어지는 현상 등이 나타난다. From the body's skin and wrinkles by stimulating the external body skin aging, blemishes, and regeneration phenomenon when falling over time. 이는 신체노화를 눈으로 확인할 수 있는 요소가 되며, 이러한 피부노화방지에 관한 관심도는 매우 크며, 사람들은 피부노화를 방지하기 위하여 치료제 및 화장품을 사용하고 있다. This is a factor that can determine the body's aging eyes, this concern relates to the prevention of skin aging is very large, people are using drugs and cosmetics to prevent skin aging. 이러한 관심도에 따라 화장품 회사들은 지속적으로 신규물질에 관하여 탐색하고 있다. According to this interest cosmetics companies continue to explore and about the new material.

기존의 미백, 항노화 효과 물질을 살펴보면 먼저 미백기능 물질은 알부틴(arbutin)과 아스코르브산(ascorbic acid) 유도체 셀리나(selina) 등이 사용되고 있다. Looking at the existing whitening, anti-aging effect whitening material first material is used such as arbutin (arbutin) and ascorbic acid (ascorbic acid) derivative Selina (selina).

피부색소침착 은 멜라닌형성세포(melanocyte)에서 멜라닌(melanin) 생산과 관련하여 일어난다. Skin discoloration takes place in relation to the melanin (melanin) produced in melanin forming cells (melanocyte). 이는 외부의 자극(UV, 염증)과 체내 활성산소에 의해서 멜라닌 생산이 증가한다. This increase in melanin production by the body and the active oxygen of the external magnetic pole (UV, inflammation). 멜라닌 생성 과정 은 타이로신(tyrosine)이 도파(dopa)를 거쳐 도파퀴논(Dopaquinone)으로 산화하여 도파크롬(Dopachrome)에서 5,6-다이하이드록시인돌-2-카복실산(5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid)으로 되어 최종 유멜라닌(Eumelanin)이 생산된다. Melanogenesis process tyrosine (tyrosine) the waveguide (dopa) via oxidation with dopa quinone (Dopaquinone) the waveguide chromium (Dopachrome) in 5,6-hydroxy-indole-2-carboxylic acid (5,6-dihydroxyindole-2- is a carboxylic acid) is produced the final eumelanin (eumelanin). 타이로신이 산화되어 도파퀴논의 형성과, 5,6-다이하이드록시인돌-2-카복실산이 형성되는 과정에서 작용하는 타이로시네이즈(tyrosinase) 효소는 멜라닌 생산에서 가장 중요한 효소이다. When a tie which acts in the course of tyrosine is oxidized to form the dopa quinone and forming discussion, 5,6-hydroxy-indole-2-carboxylic acid tyrosinase (tyrosinase) enzyme is the most important enzyme in the melanin production. 그러므로 미백효과 물질탐색에서 타이로시네이즈 억제 는 주요 표적이 된다. Therefore, when a tie in whitening substance navigation tyrosinase inhibition is the primary target.

노화방지 관련 물질 은 레티노이드(retinoid), 규산(silicic acid), 메발로노락톤(Mevalonolactone; mevalonic acid, MA), 아데노신(adenosine), 레티닐 팔미테이트(retinyl palmitate) 등이 있으며 이들은 피부세포재생조절, 콜라겐 생성 조절, 주름개선 등의 효과가 있다. Preventing age-related substance is a retinoid (retinoid), silicic acid (silicic acid), methoxy feet no lactone (Mevalonolactone; mevalonic acid, MA) , adenosine (adenosine), retinyl palmitate (retinyl palmitate), etc., and these skin cell renewal control , collagen control, there is an effect such as a wrinkle. 피부노화를 방지하기 위해서는 피부세포재생 활성화, 콜라겐 형성 촉진, 항산화 작용 등이 있다. In order to prevent the skin aging and the like activate skin cell renewal, collagen promoting, anti-oxidation action. 피부는 표피, 진피, 피하조직으로 이루어져 있으며 진피 속 섬유아세포(Fibroblast)는 피부노화에 큰 역할을 한다. The skin consists of epidermis, dermis, subcutaneous tissue, and dermis in fibroblasts (Fibroblast) plays an important role in skin aging. 섬유아세포의 수 감소로 인한 세포노화는 피부조직의 손상을 야기한다. Cell aging caused by the decrease in the number of fibroblasts causes damage to the skin tissue.

또한 피부상처회복 과정에서도 섬유아세포의 이동, 증식 및 상처부위의 수축 은 중요한 요소이다. In addition, the movement of fibroblasts in the process of recovering skin wounds, growth and contraction of the wound is an important factor. 섬유아세포(fibroblast)는 콜라겐 생성 에도 관여하며 콜라겐은 진피층의 90% 이상 구성되어 있으며, 이는 피부 보습 및 탄력에 영향을 미친다. Fibroblasts (fibroblast) is involved in the production of collagen and collagen consists of more than 90% of the dermis, which affects the skin moisture and elasticity.

일반적으로, 지방줄기세포 배양액은 미백, 상처치유, 주름개선, 항노화 기능이 있다고 알려져 있으며 최근 의약품 및 화장료로서의 상업적으로 이용가치가 상승하고 있다. In general, fat stem cell culture are whitening, wound healing, anti-wrinkle, anti-aging functions that are known and are commercially valuable as the recent rise in pharmaceuticals and cosmetics. 지방줄기세포는 여러 성장인자 및 사이토카인(cytokine)을 생산한다고 알려져 있으며 지방줄기세포가 생산한 물질은 피부 미백, 재생, 항산화에 효과가 있는 물질을 포함하고 있다고 보고되었다. Fat stem cells are known to produce several growth factors and cytokines (cytokine) substances produced by fat stem cells have been reported to contain substances that are effective for skin whitening, regeneration, antioxidant.

한편, 줄기세포란 특정한 세포로 분화가 진행되지 않은 채 유지되다가, 필요한 경우 신경, 혈액, 연골 등 신체를 구성하는 모든 종류의 세포로 분화할 능력을 가진 세포를 말한다. On the other hand, the stem cells are maintained doedaga not proceed without differentiation into specific cell, said cell with the ability to differentiate into all types of cells that make up the nervous, blood, cartilage, such as physical, if necessary. 이러한 줄기세포를 얻을 수 있는 방법은 크게 두 가지가 있는데, 첫째는 수정란으로부터 발생한 배아로부터 얻는 것(배아줄기세포)이고, 둘째는 성인이 된 우리 몸의 각 부분에 간직되어 있는 줄기세포(성체줄기세포)를 회수하는 것이다. There is significant is how you can get these stem cells two things, first is to get from embryos generated from embryos (embryonic stem cells), the second is the stem, which is kept in each part of our body, the adult cells (adult stem to recover the cells). 기능적인 면에서 차이는 있지만 배아줄기세포나 성체줄기세포는 모두 여러 종류의 세포로 분화할 수 있는 특징을 가지고 있다. Differences in functionality, but embryonic stem cells or adult stem cells, all have features that can differentiate into several types of cells. 배아줄기세포는 분화능력이 매우 뛰어나고 텔로머가 긴 장점이 있으나, 윤리적인 문제를 안고 있고 세포를 다량획득하는 것이 어려운 단점이 있는 반면, 성체줄기세포는 세포수를 많이 얻을 수 있으나 타인에게 이식할 때 감염의 위험이나 분화능력이 상대적으로 떨어지는 단점을 가지고 있다. Embryonic stem cells are highly differentiated capabilities superior telomer is but a long advantage, while facing an ethical problem and that it is difficult to drawback of massive acquisition of cells, adult stem cells can get a lot of cells, but porting to others when it has the disadvantage that the risk of infection or differentiation capacity is relatively poor.

상기한 단점에도 불구하고 성체줄기세포는 의학적으로 적용하기에 대단히 안전한 것이 특징이다. Despite the above disadvantages, and adult stem cells it is characterized by extremely safe to apply to medical. 또한 지방유래줄기세포는 흡입지방으로부터 쉽게 수득할 수 있어 윤리문제가 없으며 수득이 용이하다는 장점이 있다. In addition, there is an advantage that the fat-derived stem cells are easily obtained can be easily obtained from liposuction there is no ethical problem.

지방에서 유래된 줄기세포(Primary ADSC)는 상업적으로 활용가치가 높으나, 느린 성장속도와 짧은 수명으로 인해서 줄기세포배양액의 대량생산이 용이하지 않다는 커다란 단점을 지니고 있다. Stem cells derived from fat (Primary ADSC) can have a significant commercial disadvantage to leverage a high but worth, due to the slow growth rate and short life is not easy for mass production of a stem cell culture.

상기한 단점을 극복하기 위해서, 본 발명자들은 시미안 바이러스(Simian virus; SV40)의 T 항원을 주입한 ADSC(Adipose-derived stem cell)-T 세포주(cell line)를 제작하였다. In order to overcome the above drawbacks, the present inventors have simian virus; was prepared ADSC (Adipose-derived stem cell) -T cell line (cell line) injected with T antigen (SV40 Simian virus). 상기 세포주는 제 1차(primary) ADSC 세포주와 비교하여 3배 증가한 증식속도 및 세포수명이 약 50배 정도 증가하였다. The cell line was increased by the first (primary) 3-fold increase in growth rate, and cell life is about 50 times as compared with the ADSC cells. 따라서, 본 발명은 ADSC-T 세포주의 제작을 통해 제 1차 ADSC 세포주가 가지고 있던 배양액의 대량생산에 있어서의 한계점을 보완한 것이다. Accordingly, the present invention is one produced through the ADSC-T cells compensate for the limitations in the mass production of culture medium was the first cell line has ADSC.

이에 본 발명자는 상기와 같은 피부재생, 미백, 항산화 및 상처치료에 있어서의 문제점을 해결하기 위한 연구를 수행한 결과, 지방유래줄기세포에 T항원을 도입한 ADSC-T(adipose-derived stem cell-T) 세포주를 확립하고, ADSC-T 세포 배양액의 피부재생, 미백, 항산화 및 상처 치료 효과를 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다. The present inventors skin regeneration as described above, whitening, anti-oxidation and wound a result of the studies for solving the problems in the treatment, adipose derived stem cells, the T-T ADSC (adipose-derived stem introduce the antigen in the cell- T) by establishing a cell line, and determine the skin regeneration, whitening, anti-oxidation and wound healing effects of ADSC-T cell culture, and completed the present invention.

본 발명의 목적은 지방유래줄기세포에 T항원을 도입한 ADSC-T 세포(adipose-derived stem cell-T cell)의 배양액을 유효성분으로 포함하는, 피부재생용, 미백용, 항산화용 화장료 조성물 또는 식품 조성물을 제공하는 것이다. An object of the present invention is fat-derived stem cells, T antigen to introduce a ADSC-T cells (adipose-derived stem cell-T cell) culture solution for comprising as an active ingredient, skin regeneration cosmetic preparation for, whitening, anti-oxidation for the composition or of the to provide a food composition.

본 발명의 다른 목적은 지방유래줄기세포에 T항원을 도입한 ADSC-T 세포(adipose-derived stem cell-T cell)의 배양액을 유효성분으로 포함하는, 상처치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다. Another object of the invention is to provide a pharmaceutical composition for wound healing containing the culture medium of the ADSC-T cells (adipose-derived stem cell-T cell) incorporating the T antigen in fat-derived stem cells as an active ingredient.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 지방유래줄기세포에 T항원을 도입한 ADSC-T 세포(adipose-derived stem cell-T cell)의 배양액을 유효성분으로 포함하는, 피부재생용, 미백용, 항산화용 화장료 조성물 또는 식품 조성물을 제공한다. For to solve the above problems, the present invention provides for a skin regeneration comprising the culture medium of the ADSC-T cells (adipose-derived stem cell-T cell) incorporating the T antigen in fat-derived stem cells as an active ingredient, whitening, It provides an antioxidant cosmetic composition or a food composition.

본 발명은 지방유래줄기세포에 T항원을 도입한 ADSC-T 세포(adipose-derived stem cell-T cell)의 배양액을 유효성분으로 포함하는, 상처치료용 약학적 조성물을 제공한다. The present invention provides a pharmaceutical composition for wound healing containing the culture medium of the T-ADSC cells (adipose-derived stem cell-T cell) incorporating the T antigen in fat-derived stem cells as an active ingredient.

본 발명에 따른 지방유래줄기 세포주(ADSC-T)의 배양액은 콜라겐 배양에서 콜라겐의 탄력증가 및 창상수축효과를 가지고 있어 피부재생에 우수한 효과를 보이고, 타이로시네이즈 활성 및 멜라닌 생산을 저해함으로써 피부 미백에 훌륭한 효과를 보이고, DPPH 라디칼 활성을 저해함으로써 항산화 효과에 탁월하며, 나아가 섬유아세포의 세포 이동성을 증가시킴으로써 상처 치료에 현저한 효과를 가지고 있으므로, 피부재생, 미백, 항산화 또는 상처치료에 유용하게 이용될 수 있다. Culture of the adipose derived stem cells (ADSC-T) according to the invention has got the resilience and wound contraction effect of collagen in the collagen culture showed an excellent effect on skin regeneration, skin by inhibiting the tyrosinase activity and melanin production in Thailand It shows an excellent effect in bleaching, since by inhibiting the DPPH radical activity has a marked effect on the wound healing, by, and superior to the antioxidant effect, and further increasing the cell mobility of the fibroblasts, usefully in skin regeneration, whitening, anti-oxidation or wound healing It can be.

도 1A는 흡입지방조직으로부터 분리한 모든 세포를 플레이트에 도말한 후 현미경으로 관찰한 도이며, 도 1B는 부유세포를 제거한 후 플레이트에 부착된 세포만을 계대 배양한 후 현미경으로 관찰한 도이다(각 x100 확대). 1A is a suction is also observed under a microscope after the smear all cells isolated from adipose tissue to the plate, Fig. 1B is then to remove the suspended cells subculture only the cells attached to the plate is also observed under the microscope (each Enlarge x100).
도 2는 지방유래 줄기세포(ADSC)가 지방세포로 분화되었는지 Oil-Red O로 염색한 결과를 나타낸 도이다[지방유래 줄기세포의 분화유도 전(A), 분화유도 30일 후(B), 분화유도 30일 후 Oil-Red O로 염색한 결과(C)]. Figure 2 is a fat-derived stem cells (ADSC) is derived that the differentiation into fat cells, a diagram showing the results of staining with Oil-Red O [guided around the differentiation of adipose derived stem cells (A), differentiated in 30 days (B), differentiation induced 30 days after the result of staining with Oil-Red O (C)].
도 3은 ADSC-T 세포의 형태학적 변화를 현미경으로 관찰한 도이다[일차 지방유래 줄기세포(primary ADSC)(A), pEF321β-T 플라스미드의 도입에 의해 형성된 지방유래 줄기세포의 고밀도 세포 군집(high-density focus)(B, C), 고밀도 세포 군집에서 얻은 세포를 배양하여 확립한 ADSC-T 세포(D)](각 x100 확대). 3 is a block diagram observing morphological changes in ADSC-T cells with a microscope [primary adipose derived stem cells (primary ADSC) (A), pEF321β-T local high density cell cluster derived from the stem cells formed by the introduction of the plasmid ( high-density focus) (B, C), ADSC-T were established by culturing the cells obtained in the high-density cell cluster cells (D)] (each x100-up).
도 4는 ADSC-T 및 대조군으로 사용한 COS-1 세포 내에 발현된 SV40 T 항원을 형광항체 염색법으로 관찰한 도이다. 4 is a block diagram observing the SV40 T antigen expressed in COS-1 cells used as a control group, and T-ADSC fluorescent antibody staining.
도 5는 T 항원의 단일클론항체(monoclonal antibody)를 이용하여 ADSC-T 세포의 T 항원의 웨스턴 블로팅(western blotting) 분석 결과를 나타낸 도이다[일차 지방유래 줄기세포(A), ADSC-T(B, C, D), COS-1(E)]. 5 is a diagram showing a monoclonal antibody (monoclonal antibody) to T Western blotting (western blotting) of the antigen of the ADSC-T cells using the T antigen analysis [primary adipose derived stem cells (A), ADSC-T (B, C, D), COS-1 (E)].
도 6은 일차 지방유래 줄기세포(primary ADSC)와 ADSC-T 의 3개 세포(ADSC-T-1, ADSC-T-2, ADSC-T-3)의 증식 속도를 나타낸 도이다. 6 is a diagram showing the growth rate of the primary adipose derived stem cells (ADSC primary) and T 3-ADSC cells (ADSC-T-1, ADSC-T-2, ADSC-T-3) of the.
도 7은 콜라겐 젤에서의 3Y1 세포의 세포 형태(morphology)를 나타낸 도이다. 7 is a diagram illustrating a cell in the form of 3Y1 cells in collagen gel (morphology). 3Y1 세포를 콜라겐 젤 상에서 ADSC-T 또는 ADSC의 CM을 50% 함유하는 배지로, 각각 표시된 시간 동안 배양했다. The ADSC-T or ADSC CM of the 3Y1 cells on a collagen gel in a medium containing 50%, respectively, were incubated for indicated times.
도 8은 FPCL(Fibroblast-populated collagen lattice) 모델 상에서의 ADSC-T-CM의 수축 효과를 나타낸 도이다. 8 is a diagram illustrating a contraction effect of the T-ADSC-CM on FPCL (Fibroblast-populated collagen lattice) model. 3Y1 세포를 콜라겐 젤 상에서 ADSC-T 또는 ADSC의 50% 배양액(CM)을 이용하여 8일 동안 배양하여, 콜라겐 면적을 계산하였다. A 3Y1 cells by using a 50% culture medium (CM) in the ADSC-T or ADSC on collagen gel culture for 8 days, the collagen was calculated area.
도 9는 섬유아세포(fibroblast)의 이동성에 대한 ADSC-T 및 ADSC 배양액의 효과를 나타낸 도이다. 9 is a diagram showing the effect of T-ADSC and ADSC culture medium for the mobility of the fibroblasts (fibroblast). A는 각각의 배양액 처리후 48시간의 3Y1 세포의 이동성을 나타낸 것이고, B는 시간당 세포 이동 거리를 나타낸 그래프이다(수치 = 평균 ± 표준편차, n=0.3)[*p < 0.05] A will showing the mobility of the 48 hours of the culture process 3Y1 after each cell, B is a graph showing a moving distance per cell (value = mean ± SD, n = 0.3) [* p <0.05]
도 10은 배양액(CM; culture medium) 처리 후 3Y1 세포에 의한 콜라겐 생산을 나타낸 도이다. 10 is a culture medium; a diagram showing the collagen production by (CM culture medium) after treatment 3Y1 cells. 세포를 ADSC-T, ADSC 및 3Y1 세포 자체의 50% CM을 이용하여 5일 동안 배양하였다. The cells using the ADSC-T, ADSC and 50% CM in 3Y1 cells themselves were cultured for 5 days. 3Y1 세포의 세포 용해물(lysate) 및 배양 배지를 콜라겐 타입 I의 웨스턴 블로팅을 위해 이용하였다. The cell lysate (lysate), and the culture medium for the 3Y1 cells were used for Western blotting of collagen type I.
도 11은 ADSC-T 또는 ADSC의 CM으로 처리 후의 B16F10의 세포 펠렛을 나타낸 도이다. 11 is a diagram showing the cell pellet of B16F10 after treatment with T-ADSC ADSC or the CM. 세포를 각각 표시된 시간 동안 배양한 후 수득한 다음, 원심분리한 세포 펠렛을 디지털 카메라 사진으로 나타내었다. Obtained after incubation for the indicated times following each cell, showing a centrifuged cell pellet in a digital camera.
도 12는 B16F10 세포에서 멜라닌 함량에 대한 ADSC-T-CM 또는 ADSC CM의 효과를 나타낸 도이다. 12 is a diagram showing the effect of T-ADSC-CM or ADSC CM on melanin content in B16F10 cells. 세포(A) 및 배지(B)에서의 멜라닌 함랑을 분광광도계로 492nm에서 측정하였다( 수치 = 평균값 ± 표준편차, n = 3)[*P < 0.05 ] Hamrang melanin in the cells (A) and a medium (B) was measured with a spectrophotometer at 492nm (value = mean ± SD, n = 3) [* P <0.05]
도 13은 B16F10 세포에서의 ADSC-T-CM 및 ADSC CM의 타이로시네이즈 활성에 대한 효과를 나타낸 도이다. 13 is a diagram showing the effect on tyrosinase activity in the T-ADSC-CM and CM ADSC in B16F10 cells tie. B16F10 세포를 ADSC-T, ADSC의 50% CM을 포함하는 배지를 이용하여 배양하였고, 48 시간 후 세포 용해물로 타이로시네이즈 활성을 측정했다(수치 = 평균 ± 표준편차, n =3). Were cultured by using a medium for B16F10 cells include ADSC-T, 50% CM in the ADSC, measured the tyrosinase activity as a tie after 48 hours in cell lysates (value = mean ± SD, n = 3). [*P < 0.05] [* P <0.05]
도 14는 ADSC-T CM의 DPPH 자유 라디칼 소거능(free radical scavenging activity)을 나타낸 도이다. 14 is a diagram showing the DPPH free-radical scavenging activity of the ADSC-T CM (free radical scavenging activity). ADSC-T CM 및 0.13mM의 DPPH를 동량의 부피로 혼합하고 자유 라디칼 소거능을 각각 표시된 시간 동안 반응한 후 OD 515nm에서 측정하였다(수치 = 평균 ± 표준편차, n =3). ADSC-T CM and then a solution of the DPPH in the same amount of volume and 0.13mM to react for the time indicated by the free radical scavenging activity, respectively was determined at OD 515nm (value = mean ± SD, n = 3). [*P < 0.05] [* P <0.05]

본 발명은 시미안 바이러스(Simian virus; SV40)의 T 항원을 지방유래줄기세포에 주입하여 제작된 ADSC-T(adipose-derived stem cell) 세포주의 배양액을 유효성분으로 포함하는 피부재생용, 미백용, 항산화용 또는 상처 치료용 조성물에 관한 것이다. The invention simian virus; for skin regeneration, whitening containing culture medium of (Simian virus SV40) T The ADSC-T produced by injecting the antigen in the adipose derived stem cells (adipose-derived stem cell) of the cell line as an active ingredient relates to a composition for wound healing or for the antioxidant.

상기 조성물은 화장료 조성물, 식품 조성물 또는 약학적 조성물을 포함한다. The composition comprises a cosmetic composition, a food composition or a pharmaceutical composition.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다. Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명자들은 SV40의 T 항원의 발현이 여러 가지 세포의 수명을 연장시킨다는 것에 기초하여, 흡입지방으로부터 줄기세포(Adipose-Derived Stem Cells, ADSC)를 분리하고, 분리한 지방유래 줄기세포의 증식속도를 증가시키고 증식수명을 연장하기 위하여 SV40의 T 항원을 발현하는 벡터를 도입하면 지방유래 줄기세포의 수명이 연장될 것이라고 예상하였다. The present inventors have found that the growth rate on the basis of what sikindaneun expression of the T antigen of SV40 extending the life of a number of cells, separation of stem cells (Adipose-Derived Stem Cells, ADSC) from the suction fat, and a separate fat-derived stem cells an increase and prolong proliferation life introducing a vector expressing the SV40 T antigen were expected to extend the life of the fat-derived stem cells. 이를 확인하기 위하여 SV40의 T 항원을 발현하는 벡터인 pEF321β-T 플라스미드를 지방유래 줄기세포에 도입하였고 그 결과, SV40의 T 항원을 발현하는 지방유래 줄기세포의 수명이 연장되고, 증식속도가 향상되는 것을 확인할 수 있었다. In order to verify this, the vector of pEF321β-T plasmid expressing the T-antigen of SV40 was introduced into the adipose derived stem cells As a result, the extension of the fat-derived stem cells which express the T antigen of SV40 life, the growth rate is improved It was confirmed.

본 발명에 있어서 “시미안 바이러스(Simian Virus 40; SV40)”는 폴리오마 바이러스 과, 폴리오마 바이러스 속, 시미안 바이러스40 종에 속하는 바이러스로서, 5245개의 염기로 이루어지는 고리형 이중가닥 유전체를 가지며, 숙주범위가 넓어 여러 가지 세포의 형질전환 벡터로서 사용된다. "Simian virus (Simian Virus 40; SV40)" in the present invention has a polyoma virus, a polyoma virus, A simian as a virus belonging to the virus 40 species, the cyclic double-stranded genome consisting of 5245 bases, is used as a transformation vector of the number of cells is wider host range.

상기 SV40의 “T 항원”은 종양을 유발하는 바이러스인 SV40의 감염초기에 합성되는 초기 단백질로서, 감염세포의 종양화에 기여하는 단백질이다. The SV40 "T antigen" is a protein which is synthesized early in infection early SV40 virus to induce tumors, a protein that contributes to tumor Chemistry of infected cells. T 항원은 세포의 형질전환시, 세포측의 암억제 유전자산물(p53 등)과 결합하여 그 활성을 억제하는 작용이 있어 여러 가지 세포의 불멸화(immortalization)에 응용된다. T antigen during transformation of a cell, in combination with the cancer suppressing gene product of a cell side (p53, etc.) It is to inhibit its activity is applicable to many immortalized (immortalization) in different cells.

본 발명의 조성물에서 유효성분인 ADSC-T세포의 배양액은, Culture of the active ingredient, the ADSC-T cells in the composition of the present invention,

(a) 흡입지방조직에 콜라게나아제 효소를 처리한 후 원심분리하여 지방유래 줄기세포를 분리하여 배양하는 단계; (A) separating after processing the collagenase enzyme in adipose tissue suction centrifugal separating cultured adipose derived stem cells;

(b) 플라스미드 발현 벡터(pEF321β-T)를 상기 (a) 단계에서 배양한 지방유래 줄기세포에 형질 감염시켜 SV40 T 항원을 발현하는 지방유래 줄기세포(ADSC-T)를 제조하는 단계; (B) preparing a plasmid expression vector (pEF321β-T) to said (a) fat-derived stem cells (ADSC-T) which was transfected to the cultured adipose derived stem cells expressing SV40 T antigen on the stage; And

(c) 상기 제조된 ADSC-T세포를 배양하여 배양액을 수득하는 단계;를 포함하여 제조될 수 있다. (C) obtaining a culture medium by culturing the prepared ADSC-T cells; can be prepared, including.

본 발명의 ADSC-T 세포 배양액의 제조방법을 단계별로 상세히 설명하면 다음과 같다. If the step-by-step will be described in detail in a manufacturing method of T-ADSC cell culture medium of the present invention.

상기 (a)단계는 흡입지방조직으로부터 지방유래 줄기세포를 분리하여 배양하는 단계로, 먼저 흡입지방조직에 콜라게나아제 효소를 1:1의 중량비로 혼합한 후 30~40℃에서 40~50분 동안 처리한 다음, 원심분리하여 지방유래 줄기세포를 분리한다. The step (a) is sucked from the fat tissue in culturing to remove the adipose derived stem cells, first sucks the collagenase enzyme in adipose tissue 1 were mixed in a weight ratio of 1 in 30 ~ 40 ℃ 40 ~ 50 bun during treatment, then centrifuged to separate the adipose derived stem cells.

상기 “콜라게나아제 효소”는 콜라겐의 가수분해를 촉진하는 효소로서, 지방조직의 콜라겐을 분해하여 지방줄기세포를 각각 분리시키는 역할을 한다. The "collagenase enzyme" is an enzyme that promotes the hydrolysis of collagen, the degradation of collagen in fat tissue serves to remove the fat stem cells, respectively. 상기 원심분리는 2~5분간 500~1000G에서 수행될 수 있고, 바람직하게는 3분간 800G에서 수행되어, 상등액에 부유된 지질과 지방세포층을 제거한 후 여과기를 이용하여 세포성 잔사를 제거한다. The centrifugation may be performed at two or five minutes 500 ~ 1000G, it is preferably carried out in three minutes 800G, using a filter after removing the lipids and fats rich layer of cells in the supernatant and remove the cellular residue. 상기 여과기는 100㎛ 여과기가 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다. The filter is not intended to be a preferred 100㎛ filter, like.

상기 세포성 잔사를 제거한 후, 생리식염수를 넣고 원심분리를 반복하여 세포를 세척한다. After removal of the cellular residues, to insert the saline repeated centrifugation and washing the cells. 상기 원심분리는 2~5분간 150~500G에서 수행될 수 있고, 바람직하게는 300G에서 3분 동안 수행될 수 있다. The centrifugation may be performed at two or five minutes 150 ~ 500G, may be preferable to perform at 300G for 3 minutes.

상기 분리된 지방유래 줄기세포(ADSC)를 10% FBS(Fetal Bovine Serum), 100units/ml 페니실린과 100㎍/ml 스트렙토마이신이 첨가된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Media) 배지에서 37℃, 5% CO 2 배양기에서 배양하며, 세포의 밀도(confluence)가 80-90%가 되면 계대 배양한다. The separated fat-derived stem cells (ADSC) to 10% FBS (Fetal Bovine Serum) , 100units / ml penicillin and 100㎍ / ml streptomycin the (Dulbecco's Modified Eagle Media) was added DMEM 37 ℃ in a culture medium, 5% CO 2 and cultured in a culture medium, and subcultured when density of cells (confluence) is a 80% to 90%. 상기 배양법은 당업계에 공지된 세포배양방법을 응용할 수 있다. The culture method is applicable to cell culture methods known in the art.

상기 (b)단계는 SV40 T 항원을 발현하는 지방유래 줄기세포(ADSC-T)를 제조하는 단계로, 플라스미드 발현 벡터(pEF321β-T)를 상기 (a) 단계에서 분리한 지방유래 줄기세포에 형질 감염시켜 SV40 T 항원을 발현하는 ADSC-T세포를 얻는다. The step (b) is a step for producing the SV40 T fat-derived stem cells (ADSC-T) expressing the antigen, transfected with a plasmid expression vector (pEF321β-T) to the fat-derived stem cells isolated from the step (a) It is obtained by infecting a T-ADSC cells expressing the SV40 T antigen.

상기 “벡터”는 DNA 재조합 실험에 있어서, 목적하는 DNA 단편을 숙주세포 등에 도입시킬 수 있는 DNA로서, 벡터 DNA는 제한효소 등으로 절단, 개환하여 여기에 목적으로 하는 DNA 단편을 삽입하여 연결하고 숙주세포에 도입시킬 수 있다. The "vector" is in the DNA recombination experiments, a DNA that can be introduced into the desired DNA fragment such host cell, the vector DNA is connected to cutting, a ring-opening by inserting a DNA fragment of interest here, a restriction enzyme, such as the host It can be introduced into the cells. 목적 DNA 단편을 연결한 벡터 DNA는 숙주세포의 염색체 DNA에 삽입되어 숙주의 분열과 더불어 각 세포로 분배되어 목적 DNA 단편을 대대로 유지하며 이어져 나간다. Vector DNA connecting the desired DNA fragment is inserted into the chromosomal DNA of the host cell with the division of the host is distributed to each cell, and leads out from generation to generation maintain the desired DNA fragment.

상기 플라스미드 발현 벡터 “pEF321β-T”는 SV40의 T 항원을 코딩하는 핵산서열을 포함하는 플라스미드를 의미한다. The plasmid expression vector "pEF321β-T" means a plasmid comprising a nucleic acid sequence coding for the T antigen of SV40.

상기 “형질 감염”은 유전자 DNA, 플라스미드 DNA, 바이러스 DNA·RNA 등을 세포의 배양액 또는 세포의 현탁액을 통해 세포에 주입하여 유전자 도입 및 감염을 유발시키는 것을 의미한다. The "transfected" it is meant that the gene DNA, plasmid DNA, viral DNA · RNA, such as injection of the cell through a suspension of cells or culture medium of the cell leads to gene introduction and infection. 구체적으로, 상기 발현 벡터의 형질 감염은 당업계에 공지되어 있는 인산화칼슘 (calcium phosphate) 형질 감염, 전기천공법(electroporation), 미세주입법 (microinjection) 그리고 리포솜 주입법(liposome injection)등을 포함한 이용가능한 모든 형질 감염 방법을 사용할 수 있다. Specifically, all available, including the transfection of an expression vector is phosphorylated calcium as is known in the art (calcium phosphate) transfection, electroporation (electroporation), microinjection (microinjection), and liposome injection (liposome injection), etc. traits can be used infection methods. 또한 바이러스나 박테리아를 운반자로 사용하여 진핵세포에 DNA를 도입할 수도 있다. It may also use viruses or bacteria as carriers for introducing DNA into eukaryotic cells.

예를 들어, 상기 pEF321β-T 플라스미드를 전기천공법으로 도입하는 방법은 지방유래 줄기세포를 무혈청 배지, 바람직하게는 무혈청 DMEM내에서 플라스미드와 혼합하고 전기충격을 주는 방법을 이용할 수 있으나, 이에 한정되지는 아니하며, 당업계에 알려진 전기천공 프로토콜을 사용하여 플라스미드를 도입할 수 있다. For example, the method of introducing a pEF321β-T plasmid by electroporation. However to use a method that an electric shock is mixed with the plasmid, and the adipose derived stem cells in serum-free medium, preferably serum-free DMEM, this nor it is not limited to, can be introduced into a plasmid using the electroporation protocol known in the art.

외래 유전자를 도입한 세포는 일정시간 배양을 통하여 도입된 유전자의 발현을 유도하고 발현 여부를 검증해보아야 한다. Cells incorporating the foreign gene is induced, and should try to verify whether the expression the expression of a gene introduced through a certain amount of time the culture. 도입 유전자의 발현을 위한 배양은 바람직하게는 37℃에서 5% CO 2 배양기에 배양하는 것이나 이에 한정되지 않는다. Culture for the expression of transgenes is preferably short of incubation in 5% CO 2 incubator at 37 ℃ not limited to this. 본 발명에 도입된 유전자는 SV40의 T 항원을 발현하는 유전자로서, T 항원의 발현여부는 상기 T 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 이용한 항원-항체 결합 반응을 통해 지방유래 줄기세포내 발현된 T 항원을 검출함으로서 검증할 수 있다. The gene introduced in the present invention is a gene expressing the T antigen of SV40, T antigen expression is checked antigen with antibodies that specifically bind to the T antigen of-the adipose derived stem cells expressed by the antibody-binding reaction T It can be verified by detecting the antigen. 구체적으로는, 통상의 효소면역분석법(ELISA), 방사능면역분석법(Radioimmunoassay, RIA), 샌드위치 측정법, 면역조직화학염색법, 항원-항체 응집법 등을 이용하여 검증할 수 있고, 웨스턴 블로팅 및 형광항체염색법으로 T 항원의 발현여부를 검증할 수 있다. Specifically, the conventional enzyme immunoassay (ELISA), radioactive immunoassay (Radioimmunoassay, RIA), sandwich assay, immunohistochemical staining, antigen-antibody can be verified by using a agglutination, Western blotting, and fluorescent antibody staining as can be verified whether the expression of the T antigen.

상기 (c)단계는 ADSC-T 세포를 배양하여 배양액을 수득하는 단계로, ADSC-T 세포를 각 1x10 5 cell/ml로 배양하는 단계; Wherein the step (c) culturing the step of obtaining a culture medium by culturing the ADSC-T cell, a T-ADSC cells in each 1x10 5 cell / ml; 세포의 밀도가 80%가 되고나서 계대 배양하는 단계; Then the density of cells, and the 80% step of sub-culturing; 및 세포의 밀도가 70~90%가 되고난 뒤 2일 후 배양액을 수거하는 단계에 의해 제조된다. And the density of the cells is produced by the step for collecting the culture medium after two days later, the I and 70 to 90%.

상기 방법에 의해 제조된 배양액을 원심분리하여 세포의 잔사를 제거하고 상등액만 수득한다. Centrifuging the culture solution prepared by the above method to remove the residue of the cells and the resulting supernatant only. 상기 원심분리는 500~1000G에서 2~5분간, 바람직하게는 800G에 3분간 원심 분리한다. The centrifuge is between 2 ~ 5 minutes at 500 ~ 1000G, preferably centrifuged 3 minutes at 800G.

상기 ADSC-T 세포 배양액을 위한 배지는 당업계에 알려진 기본 배지를 제한 없이 사용할 수 있다. Medium for the ADSC-T cell culture fluid may be used without limiting the basal medium known in the art. 기본 배지는 인위적으로 합성하여 제조할 수 있으며, 상업적으로 제조된 배지를 사용할 수도 있다. The basal medium may be prepared by artificially synthesizing with, it is also possible to use commercially produced in the medium. 상업적으로 제조되는 배지의 예를 들면, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal Essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, α-MEM (α-Minimal essential Medium), G-MEM (Glasgow's Minimal Essential Medium) 및 Isocove's Modified Dulbecco's Medium 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. Examples of the medium that is commercially produced by, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal Essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, α-MEM (α-Minimal essential Medium), G-MEM (Glasgow's Minimal Essential Medium), and Dulbecco's Modified Medium, etc. the's Isocove, but it is not limited to this. 또한, 상기 세포 배양 배지에는 필요에 따라 한 가지 이상의 보조성분을 첨가할 수 있는데, 이러한 보조성분으로는 태아 송아지, 말 또는 사람 등의 혈청을 비롯하여, 미생물의 오염을 막기 위한 페니실린 G (Penicillin G), 스트렙토마이신 설페이트 (streptomycin sulfate) 및 젠타마이신 (gentamycin) 등의 항생제, 암포테리신 B (amphotericin B) 및 니스타틴 (nystatin) 등의 항진균제 (antifungal agent) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 성분 중 하나 이상을 사용할 수 있다. In addition, the cells may be cultured, the addition of one or more accessory ingredients as needed, medium, with such auxiliary components, including the serum, such as fetal bovine, horse or human, penicillin G (Penicillin G) to prevent the contamination of microorganisms , of streptomycin sulfate (streptomycin sulfate), and gentamicin (gentamycin) antibiotics, amphotericin B (amphotericin B) and needle statin (nystatin) antifungal agents (antifungal agent) and a component selected from the group consisting of a mixture thereof such as You can use more than one.

상기 방법에 의해 제조된 본 발명의 ADSC-T 세포의 배양액은 콜라겐 배양에서 콜라겐의 탄력증가 및 창상수축효과를 가지고 있어 피부재생에 우수한 효과를 보이고, 또한 타이로시네이즈 활성 및 멜라닌 생산을 저해함으로써 피부 미백에 훌륭한 효과를 보이고, DPPH 라디칼 활성을 저해함으로써 항산화 효과에 탁월하며, 나아가 섬유아세포의 세포 이동성을 증가시킴으로써 상처 치료에 현저한 효과를 가지고 있으므로, 피부재생, 미백, 항산화 또는 상처치료에 유용하게 이용될 수 있다. Culture of ADSC-T cell of the invention prepared by the above method has got a resilience and wound contraction effect of collagen in the collagen culture showed an excellent effect on skin regeneration, and by inhibiting the tyrosinase activity and melanin production in Thailand show an excellent effect on skin whitening, since by inhibiting the DPPH radical activity has a marked effect on the wound healing, by, and superior to the antioxidant effect, and further increasing the cell mobility of the fibroblasts, useful for skin regeneration, whitening, anti-oxidation or wound healing It can be used.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있으며, 통상의 방법에 따라 액제, 현탁액, 에멀젼, 로션제, 연고제 등의 경피투여용 제형으로 제제화될 수 있다. The pharmaceutical composition of the present invention may include a pharmaceutically acceptable carrier, may be formulated into formulations for transdermal administration such as solutions, suspensions, emulsions, lotions, ointments by conventional methods. 상기 약학적으로 허용가능한 담체는 인산 완충 식염수(phosphate buffered saline), 정제수, 멸균수 등의 수성 희석제 혹은 용제를 포함하며, 프로필렌글리콜(propylene glycol), 올리브 오일 등의 비수성 희석제 혹은 용제를 포함한다. The pharmaceutically acceptable carrier comprises an aqueous diluent or solvent, such as phosphate buffered saline (phosphate buffered saline), purified water, sterilized water, a non-aqueous diluent or solvent such as propylene glycol (propylene glycol), olive oil . 또한, 필요에 따라 습윤제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다. In addition, it may include wetting agents, fragrances and preservatives, as needed. 상기 약학적 조성물에 함유되는 ADSC-T 세포 배양액은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. ADSC T-cell culture to be contained in the pharmaceutical composition varies depending on the condition and body weight, degree, drug form, route of administration, and duration of the disease of the patient, it may be suitably selected by those skilled in the art. 예를 들면, 상기 ADSC-T 세포 배양액의 일일 투여량은 1일 0.01~100mg/kg, 바람직하게는 0.1~10mg/kg으로 투여할 수 있으며, 상기 투여는 하루에 한번 또는 수회 나누어 투여할 수도 있다. For example, the daily dose of ADSC-T cell culture medium is 1 day 0.01 ~ 100mg / kg, and preferably may be administered as a 0.1 ~ 10mg / kg, the dose may be administered, divided once or several times a day .

상기 담체(들)은 수용자에게 유해하지 않고 제제의 다른 성분과 상용성 면에서 "허용되는" 것이어야 한다. The carrier (s) are to be not harmful to the recipient is "permitted to be" on another component and the compatible surface of the formulation. 이러한 관점에서, 약학적으로 허용되는 담체는 임의약학 투여에 적합한, 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항박테리아 및 항진균 활성제, 등장성 및 흡수 지연제 등을 포함하고자 한다. In this regard, pharmaceutically acceptable carriers intended to include the appropriate, any and all solvents, dispersion media, coatings, antibacterial and antifungal agent, isotonic and absorption delaying agents and the like in any pharmaceutical administration. 약학적으로 활성있는 물질을 위한 그러한 매질 및 활성제의 사용은 당분야에 공지이다. The use of such media and activating agent for the active substance in a pharmaceutical is known in the art. 임의의 통상적 매질 또는 활성제는 활성 화합물과 상용적이지 않은 것을 제외하고, 조성물에서의 그 용도가 고려된다. Any conventional medium or agent is except that the active compounds have not compatible with, and it is considered that use of the composition. 보조적인 활성 화합물(당분야에 공지 및/또는 본 발명에 따라 동정 또는 디자인됨)이 또한 조성물에 도입될 수 있다. Supplementary active compounds (known and / or identified or designed according to the invention to those skilled in the art) can also be incorporated into the composition. 제제는 편리하게 단위 제형으로 존재할 수 있고 제약/미생물학 분야에서 잘 알려진 임의의 방법으로 제조될 수 있다. Preparations can be presented in unit dosage form and may conveniently be prepared by any method well-known in the pharmaceutical / microbiology applications. 대체로, 일부 제제는 화합물을 액체 담체 또는 미분 고체 담체 또는 둘 모두와 혼합하고, 이후 필요하면 적합한 제제로 그 생성물을 성형시켜 제조된다. All in all, some formulations are mixing a compound with both the liquid carriers or finely divided solid carriers or both, and is prepared by molding the product with, if necessary after suitable formulation.

본 발명의 약학 조성물은 그 목적 투여 경로에 적합하도록 제제화되어야 한다. The pharmaceutical compositions of the present invention should be formulated to be suitable for the purpose of the administration route. 투여 경로는 경구, 귀, 눈, 코, 또는 비경구, 예를 들면 정맥내, 피부내, 흡입, 경피(국소), 경점막, 및 직장 투여를 포함한다. The administration route is oral, ear, eye, nose, or parenterally, for example, include intravenous, within skin, by inhalation, transdermal (topical), transmucosal, and rectal administration. 비경구, 피부내, 또는 피하 적용을 위해 사용되는 용액 또는 현탁액은 다음의 성분들을 포함할 수 있다: 멸균 희석제, 예컨대 주사용 물, 염수 용액, 고정유, 폴리에틸렌글리콜, 글리세린, 프로필렌글리콜 또는 다른 합성 용매; Parenteral, solutions or suspensions used for skin application in, or subcutaneous may include the following components: a sterile diluent, such as injectable water, saline solution, fixed oils, polyethylene glycols, glycerine, propylene glycol or other synthetic menstruum; 항박테리아제 예컨대 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤; Antibacterial agent such as benzyl alcohol or methyl paraben; 항산화제 예컨대 아스코르브산 또는 중아황산나트륨; Antioxidants such as ascorbic acid or sodium bisulfite; 킬레이팅제 예컨대 에틸렌디아민테트라아세트산; Chelating agents such as ethylene diaminetetraacetic acid; 완충제 예컨대 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트 및 장력조절제 예컨대 염화나트륨 또는 덱스트로스, pH는 산이나 염기, 예컨대 염산 또는 수산화나트륨으로 조정될 수 있다. Buffering agents such as acetate, citrate or phosphate and tension adjusting agent, for example sodium chloride or dextrose deck, pH can be adjusted with acids or bases, such as hydrochloric acid or sodium hydroxide.

경구 또는 비경구 투여에 유용한 용액은 제약 분아에 공지된 임의의 방법을 통해 제조될 수 있으며, 예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, (Gennaro, A., ed.), Mack Pub., (1990)]에 기술된 것을 참조한다. Useful solutions for oral or parenteral administration can be prepared via any method known in the pharmaceutical bunah, see, e.g., [Remington's Pharmaceutical Sciences, (Gennaro, A., ed.), Mack Pub., (1990 )] to a reference to what described. 비경구 투여용 제제는 또한 구강 투여용 글리코콜레이트, 직장 투여용 메톡시살리실레이트, 또는 질 투여용 시트르산을 포함할 수 있다. Formulations for parenteral administration may also include a salicylate, or citric acid for vaginal administration methoxy salicylate for glycolate cholate, rectal administration for oral administration. 비경구 조제물은 앰플, 1회용 시린지 또는 유리나 플라스틱으로 제조된 복수 용량 바이알에 동봉될 수 있다. Parenteral preparations can be enclosed in multiple dose vials made of ampoules, disposable syringes or glass or plastic. 직장 투여용 좌제는 또한 약물을 비자극성 부형제 예컨대 코코아 버터, 다른 글리세리드, 또는 실온에서는 고체이고 체온에서는 액체인 다른 조성물과 혼합하여 제조될 수 있다. The suppositories for rectal administration of the drug, for example cocoa is also non-irritating excipient, butter, other glycerides, or solid at room temperature, and the temperature can be prepared by mixing with the other liquid composition. 제제는 또한 예를 들면 폴리알킬렌글리콜 예컨대 폴리에틸렌글리콜, 식물성 오일, 및 수소화 나프탈렌을 포함할 수 있다. Formulations may also comprise, for example, a polyalkylene glycol such as polyethylene glycol, vegetable oils, and the hydrogenated naphthalene. 직접 투여용 제제는 글리세롤 및 다른 고점도 조성물을 포함할 수 있다. Formulations for direct administration can include glycerol and other high-viscosity compositions. 이러한 약물에 유용할 수 있는 다른 비경구 담체에는 에틸렌비닐 아세테이트 공중합체 입자, 삼투압 펌프, 이식성 주입계, 및 리포좀이 포함된다. Other parenteral carrier that may be useful for these drugs include ethylene-vinyl acetate copolymer particles, osmotic pumps, portable infusion systems, and liposomes. 흡입 투여용 제제는 부형제로서, 예를 들면 락토오스를 함유할 수 있거나, 또는 예를 들면 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르, 글리코콜레이트 및 데옥시콜레이트를 함유하는 수용액, 또는 점비액 형태로 투여되는 유성액, 또는 코내에 적용되는 겔일 수 있다. Formulations for inhalation administration as an excipient, for example, or may contain lactose, or for example, polyoxyethylene-9-lauryl ether, an aqueous solution containing, glycolic cholate and deoxycholate, or that is administered in the form biaek oil-based liquid, or it can be applied in the nose gelil. 직장 전달을 위해 정체 관장이 또한 사용될 수 있다. Work can also be used to deliver the retention enemas.

경구 투여에 적합한 본 발명의 제제는 각각 사전결정된 약물의 양을 함유하는, 개별 단위 예컨대 캡슐, 젤라틴 캡슐, 샤세, 정제, 트로키, 또는 로젠지; If preparation of the present invention suitable for oral administration containing an amount of a predetermined substance, respectively, for example the individual units of capsules, gelatin capsules, Chasse, tablets, troches, or lozenges; 분말 또는 과립 조성물; Powder or granular composition; 수성액 또는 비수성액 중 용액 또는 현탁액; In aqueous solution or non-aqueous liquid solutions or suspensions; 또는 수중유 에멀션 또는 유중수 에멀션 형태일 수 있다. Or it may be an oil-in-water emulsion or a water-in-oil emulsion form. 약물은 또한 볼러스, 연약 또는 페이스트 형태로 투여될 수 있다. Drugs may also be administered as a bolus, or soft paste form. 정제는 경우에 따라 1 이상의 보조 성분과 함께 약물을 압착 또는 몰딩시켜 제조될 수 있다. The drug with one or more accessory ingredients In some cases, tablets may be prepared by compression or molding. 압착 정제는 적절한 기계에서, 경우에 따라 결합제, 윤활제, 불활성 희석제, 표면 활성 또는 분산제와 혼합된, 자유 유동 형태, 예컨대 분말 또는 과립 형태의 약물을 압착시켜 제조될 수 있다. Compressed tablets can be produced by pressing a binder, lubricant, inert diluent, surface active or dispersing agents and mixed, free-flowing form such as powder or granule form of the drug in some cases, in a suitable machine. 몰딩된 정제는 적절한 기계에서, 불활성 액체 희석제로 습윤시킨 적절한 담체 및 분말화 약물의 혼합물을 몰딩시켜 제조될 수 있다. Molded tablets can be made in a suitable machine, by molding a mixture of a suitable carrier and the powdered medicament that wetting with an inert liquid diluent.

경구 조성물은 대체로 불활성 희석제 또는 식용 담체를 포함한다. Oral compositions will generally include an inert diluent or an edible carrier. 경구 치료 투여 목적을 위해, 활성 화합물은 부형제와 함께 도입될 수 있다. For oral therapeutic administration purposes, the active compounds may be incorporated with excipients. 구강청결제로서 사용하기 위한 유체 담체를 이용해 제조된 경구 조성물은 유체 담체 중 화합물을 포함하고 경구에 적용되어 휙소리를 내고 뱉어내거나 또는 삼켜지게 된다. The oral compositions prepared using a fluid carrier for use as an oral cleaner becomes including a fluid carrier compound and swallowed naegeona spit out the swish sound is applied to the oral or. 약학적으로 적합한 결합제, 및/또는 보강제 물질이 조성물의 일부로서 포함될 수 있다. There is a pharmaceutically suitable binding agents, and / or adjuvant materials can be included as part of the composition. 정제, 알약, 캡슐, 트로키 등은 임의의 이하 성분, 또는 유사한 성질의 화합물을 함유할 수 있다: 결합제, 예컨대 미세결정 셀룰로스, 검 트라가칸트 또는 젤라틴; Tablets, pills, capsules, troches and the like may contain any of the following ingredients, or compounds of a similar nature: a binder such as microcrystalline cellulose, gum tragacanth or gelatin; 부형제 예컨대 전분 또는 락토스; An excipient such as starch or lactose; 붕해제 예컨대 알긴산, 프리모겔, 또는 옥수수전분; Disintegrating agents, for example alginic acid, Primo gel, or corn starch; 윤활제 예컨대 스테아르산마그네슘 또는 스테로테스; Test with a lubricant such as magnesium stearate or stearyl; 유동화제 예컨대 콜로이드성 이산화규소; Glidants, for example colloidal silicon dioxide; 감미제, 예컨대 수크로스 또는 사카린; A sweetening agent such as sucrose or saccharin; 또는 풍미제 예컨대 페퍼민트, 메틸 살리실레이트, 또는 유기 풍미제. Or flavoring agents, for example peppermint, methyl salicylate salicylate, or organic flavor.

주사용으로 적합한 약학 조성물은 멸균 수용액(수용성인 경우) 또는 분산액 및 멸균 주사 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. Pharmaceutical compositions suitable for injectable use include sterile powders for the sterilizing solution (if water soluble) or dispersions and sterile injectable solutions or extemporaneous preparation of the dispersion. 정맥내 투여를 위해, 적절한 담체는 생리적 염수, 정세균성 물, Cremophor ELTM(BASF, Parsippany, NJ) 또는 인산 완충 염수(PBS)를 포함한다. For intravenous administration, suitable carriers include physiological saline, St. jeongsegyun water, Cremophor ELTM (BASF, Parsippany, NJ) or phosphate buffered saline (PBS). 제조 및 보관 조건 하에서 안정해야 하고 미생물 예컨대 박테리아 및 진균의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. It must be stable under the conditions of manufacture and storage and must be preserved against the contaminating action of microorganisms, for example bacteria and fungi. 담체는 예를 들면, 물, 에탄올, 폴리올(예컨대, 글리세롤, 프로필렌글리콜, 및 액상 폴리에틸렌글리콜), 및 이의 적절한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. Carriers are, for example, water, ethanol, polyol may be a (for example, glycerol, propylene glycol, and liquid polyethylene glycol), and suitable mixtures contain a solvent or dispersion medium thereof. 적절한 유동성은 예를 들면, 코팅 예컨대 레시틴을 사용하는 것에 의해, 분산물의 경우에는 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지된다. Proper fluidity, for example, coatings for example, when by using a lecithin, by the maintenance of the dispersion has the required particle size, and is maintained by the use of surfactants. 많은 경우, 등장화제, 예컨대 당, 다가알콜 예컨대 만니톨, 솔비톨 또는 염화나트륨이 조성물에 포함되는 것이 바람직하다. In many cases, it is preferred that the isotonic agent, a polyhydric alcohol for example mannitol, sorbitol, or sodium chloride, for example, sugar contained in the composition. 주사용 조성물의 장기간 흡수는 조성물에 흡수를 지연시키는 활성제, 예를 들면 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 첨가시킴으로서 이루어질 수 있다. Long-term absorption of the injectable compositions may be, for active agents, such that delay absorption in the composition may be composed of aluminum monostearate and gelatin sikimeuroseo added.

멸균 주사용액은 상기 열거된 성분 중 1 또는 그 조합과 적절한 용매 중 필요량의 활성 화합물을 도입하고, 필요한 경우 여과 멸균을 후속하여 제조될 수 있다. Sterile injectable solutions, and introducing the active compound in the appropriate solvent with one or a combination of ingredients enumerated above requirements, and can be subsequently produced by the sterilizing filtration, if necessary. 대체로, 분산액은 활성 화합물을 염기성 분산 매질 및 상기 열거된 성분 중에서 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클에 활성 화합물을 도입하여 제조된다. In general, the dispersions are prepared by introducing the active compound into a sterile vehicle containing the other ingredients necessary in component a basic dispersion medium and the enumeration of the active compound. 멸균 주사용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 제조 방법은 이전에 멸균여과된 그 용액으로부터 임의 추가적인 목적 성분이 더해진 활성 성분의 분말이 생성되는 진공 건조법 및 냉동 건조법을 포함한다. In the case of sterile powders for the preparation of sterile injectable solutions, the manufacturing method includes a vacuum-drying and freeze-drying is a powder of the active ingredient plus any additional object components from the solution before the sterile filtration to produce.

관절내 투여에 적합한 제제는 미세결정형, 예를 들면 수성 미세결정 현탁액 형태일 수 있는 약물의 멸균 수성 조제물 형태일 수 있다. Formulations suitable for administration joint may be a micro-crystalline form, for example, an aqueous microcrystalline sterile aqueous preparation in the form of the drug, which may be a suspension form. 리포좀 제제 또는 생분해성 중합체 시스템이 또한 관절 내 및 눈 투여 둘 모두를 위한 약물을 준비하는데 사용될 수 있다. The liposome formulations or biodegradable polymer systems may also be used to prepare the drug for both intra-articular and eye treatment.

눈 치료를 포함하여, 국소 투여에 적합한 제제는 액체 또는 반액체 조제물 예컨대 도찰제, 로션, 겔, 도포제, 수중유 또는 유중수 에멀션 예컨대 크림, 연고 또는 페이스트; Including eye treatment, formulations suitable for topical administration include liquid or semi-liquid preparations for example, liniment, lotion, gel, liniment, oil-in-water or water-in-oil emulsions, for example creams, ointments or pastes; 또는 용액 또는 현탁액 예컨대 점적액을 포함한다. Or comprises a liquid solution or suspension, for example dropwise. 피부 표면에 국소 투여를 위한 제제는 약물을 피부학적으로 허용되는 담체 예컨대 로션, 크림, 연고 또는 비누로 분산시켜 제조된다. Formulations for topical administration to the skin surface, are prepared by dispersing the drug in a dermatologically acceptable carrier for example, lotion, cream, ointment or soap. 국소 도포하고 제거를 억제하기 위해 피부 상에 막이나 층을 형성할 수 있는 담체가 특히 유용하다. A carrier capable of forming a film or layer on the skin for topical application and inhibit removal is particularly useful. 내부 조직 표면에 국소 도포를 위해, 활성제는 액체 조직 접착제 또는 조직 표면에 접착을 강화시키는 것으로 알려진 다른 물질에 분산될 수 있다. For topical application to internal tissue surfaces, the active agent may be dispersed in the other substance known to enhance adhesion to a liquid tissue adhesive or the tissue surface. 예를 들면, 히드록시프로필셀룰로스 또는 피브리노겐/트롬빈 용액을 사용하는 것이 유리하다. For example, hydroxypropyl cellulose, or it is advantageous to use the fibrinogen / thrombin solution. 대안적으로, 조직 코팅 용액, 예컨대 펙틴-함유 제제가 사용될 수 있다. Alternatively, the tissue coated with the solution, such as pectin-containing formulations may be used.

흡입 치료를 위해, 스프레이로 분배되는 분말 흡입(자가추진 또는 스프레이 제제)은 네뷸라이저이거나 또는 오토마이저가 사용될 수 있다. For inhalation treatments, inhalation powder (self-propulsion or spray formulations) dispensed with a spray that can be used in a nebulizer or auto or optimizer. 이러한 제제는 분말 흡입 장치 또는 자가 추진 분말-분배 제제로부터 폐 투여를 위한 미분 형태일 수 있다. Such formulations powder inhalation device or self-propelled powder may be in the form of fine powder for pulmonary administration from a distributing agent. 자가 추진 용액 및 스프레이 제제의 경우, 원하는 스프레이 특징(즉, 원하는 입자 크기를 갖는 스프레이를 생성할 수 있는 특징)을 갖는 밸브의 선택에 의해 또는 제어된 입자 크기의 현탁 분말로서 활성 성분을 유입시켜서 그 효과를 달성할 수 있다. In the case of self-propelled solution and spray formulations, by entering the desired spray characteristics active ingredient as a suspended powder of or controlled by the selection of the valve a particle size having a (that is, the desired particle size of the features that can generate a spray having) the It can achieve the effect. 흡입 투여를 위해, 화합물은 또한 적절한 추진제, 예를 들면 가스 예컨애 이산화탄소를 함유하는 가압 용기 또는 분배기, 또는 네뷸라이저로부터의 에어로졸 스프레이 형태로 전달될 수 있다. For inhalation administration, the compounds may also, for an appropriate propellant, for example, can be delivered in aerosol spray form from a pressurized container or dispenser, or nebyul containing carbon dioxide gas For keonae riser.

전신 투여는 또한 경점막 또는 경피 수단에 의해 이루어질 수 있다. Systemic administration can also be by transmucosal or transdermal means. 경점막 또는 경피 투여를 위해, 투과하려는 장벽에 적합한 침투제가 제제에 사용된다. The penetrant suitable for the transmucosal or a barrier to transdermal permeation is used in the formulation. 그러한 침투제는 대체로 당분야에 공지이며, 예를 들면, 경점막 투여를 위해, 세제 및 담즙산염이 포함된다. Such penetrants are generally known in the art, for example, for transmucosal administration, detergents and bile salts are included. 경점막 투여는 코 스프레이 또는 좌제의 사용을 통해 수행될 수 있다. Transmucosal administration may be accomplished through the use of nasal sprays or suppositories. 경피 투여를 위해, 활성 화합물은 대체로 당분야에서 공지된 바와 같이 연고, 셀브, 젤 또는 크림으로 제제화된다. For transdermal administration, the active compounds are formulated into ointments, Selb, gels or creams as generally known in the art.

본 발명의 식품 조성물에 포함되는 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. The type of food contained in the food composition of the present invention is not limited. 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸컬릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함하는 낙농제품, 각종 수프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다. Examples of foods are meat, sausage, if the bread, chyokeolrit, candies, snacks, cookies, pizza, and other noodles, gums, dairy products including ice cream, various soups, beverages, teas, drinks, alcoholic drinks and vitamin complex, etc this and include all kinds of health food in general meaning.

상기 식품 조성물은 건강 음료 조성물을 포함할 수 있고, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. The food composition may include a composition for health beverages, may contain as a further component such as various flavors or natural carbohydrates, as conventional beverages. 상기 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스, 슈크로오스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. The natural carbohydrate is a sugar alcohol of the polysaccharide, xylitol, sorbitol, and pentaerythritol, such as monosaccharides, maltose, disaccharides, and dextrin, cyclodextrin, such as sucrose, such as glucose and fructose. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. Sweetening agents may be used as the synthetic sweeteners such as thaumatin, natural sweeteners or saccharin, aspartame, such as stevia extract. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 상기 지방유래줄기세포에 T항원을 도입한 ADSC-T 세포(adipose-derived stem cell-T cell)의 배양액 100g당 일반적으로 0.01 내지 0.04 g, 바람직하게는 약 0.02 내지 0.03 g이다. The content of the natural carbohydrate is generally 0.01 to 0.04 g, preferably from about 0.02 per culture 100g of ADSC-T cells (adipose-derived stem cell-T cell) incorporating the T antigen in the adipose derived stem cells of the invention It is to about 0.03 g.

상기 화장료 조성물은 본 발명의 ADSC-T 세포 배양액을 사용하여 통상의 화장료 제조방법에 따라, 다양한 형태로 제조될 수 있다. The cosmetic composition according to a conventional method for producing cosmetics using the ADSC-T cell culture medium of the present invention can be prepared in various forms. 예를 들어, 상기 화장료 조성물은 상기 배양액을 함유하는 향장 제품, 샴푸, 헤어로션, 헤어크림, 헤어 젤 등의 형태로 제조될 수 있으며, 이는 통상의 클렌징액, 수렴액 및 보습액으로 희석되어 사용될 수 있다. For example, the cosmetic composition can be prepared in the form of a cosmetic product, shampoo, hair lotion, hair cream, hair gel containing the culture medium, which can be used is diluted in a conventional cleansing liquid, astringent solution and boseupaek have. 또한, 상기 화장료 조성물은 화장료 조성물 분야에서 통상적으로 사용되는 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료, 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다. In addition, the cosmetic composition may comprise conventional adjuvants, such as stabilizers, solubilizers, vitamins, pigments, and fragrances commonly used in the field of cosmetic compositions. 상기 화장료 조성물에 있어서, 상기 배양액의 함량은 피부재생, 미백 및 항산화의 효과를 달성하기에 유효한 양, 예를 들면, 조성물 총 중량에 대하여 0.001~10 중량%로 함유될 수 있고, 바람직하게는 약 0.01~1 중량%로 함유될 수 있다. In the cosmetic composition, the amount of the culture solution may be contained in an amount effective to achieve the effect of skin regeneration, whitening and antioxidants, for example, 0.001 to 10 weight% based on the composition total weight, preferably from about 0.01 to 1% by weight may be contained.

본 발명의 실시예에서 실험 데이터의 통계처리를 위해, SPSS 20 프로그램을 사용하여 실험군과 대조군의 평균의 차이를 mann-whitney u test를 수행하여 P < 0.05일 때 유의하다고 하였다. For the statistical processing of the experimental data in the embodiment of the present invention, the average difference between the test and control groups using the SPSS program 20 performs the mann-whitney u test was considered statistically significant P <0.05 days.

이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. Or less, on the basis of the present invention in embodiments will be described in detail. 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다. Embodiments will be apparent to those of ordinary skill in that only for illustrating the present invention more specifically, it is according to the subject matter of the present invention is not limited by the scope of the invention to the examples in the art.

[제조예 1] 지방유래줄기세포에 T항원을 도입한 ADSC-T 세포(adipose-derived stem cell-T cell) 배양액의 제조 [Preparation Example 1] the introduction of T antigen to the adipose derived stem cells, T-ADSC cells (adipose-derived stem cell-T cell) Preparation of culture medium

1. 지방조직으로부터 지방유래 줄기세포(Adipose-Derived Stem Cell)의 분리 및 배양 1. Isolation and culture of adipose derived stem cells from fat tissue (Adipose-Derived Stem Cell)

지방유래 줄기세포(ADSC)의 분리는 성형외과에서 지방흡입술을 시행한 환자에게 동의를 구한 후, 채취한 지방조직에서 지방유래 줄기세포(ADSC)를 추출하였다. Separation of fat-derived stem cells (ADSC) is extracted the fat-derived stem cells (ADSC) in patients after obtaining the consent collected by local organizations underwent liposuction in Plastic Surgery. 구체적으로는, 분리된 지방조직을 PBS(phosphate buffered saline)로 세척한 후 0.075% 콜라게나아제(sigma)와 1:1의 중량비로 혼합하여 37℃에서 45분 동안 처리하였다. Specifically, washing the separated fat tissue as (phosphate buffered saline) PBS and then 0.075% collagenase (sigma) and 1: 1 were mixed in a weight ratio of treatment at 37 ℃ for 45 minutes. 효소 처리 후, 800G에서 5분 동안 원심 분리하여, 상등액에 부유된 지질과 지방세포 층을 제거한 후 100㎛ 여과기로 여과하여 세포성 잔사를 제거하였다. After the enzyme treatment, was centrifuged at 800G for 5 minutes, to remove the lipid and adipocyte layer suspended in the supernatant was filtered with a filter 100㎛ to remove cellular debris. 여과액에 생리식염수를 가한 후 300G에서 3분 동안 원심 분리하여 2-3번 정도 세포를 세척하여 지방유래 줄기세포(ADSC)를 얻었다. After adding saline to the filtrate was centrifuged at 300G for 3 minutes and washed two to three times a cell to obtain a fat-derived stem cells (ADSC).

수득한 지방유래 줄기세포(ADSC)를 10% FBS(Fetal bovine Serum), 100units/ml 페니실린과 100㎍/ml 스트렙토마이신이 첨가된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Media)배지에서 37℃, 5% CO 2 배양기에서 배양하였다. The resulting fat-derived stem cells (ADSC) 10% FBS (Fetal bovine Serum), 100units / ml penicillin and 100㎍ / ml streptomycin was added the DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Media) 37 ℃ in a culture medium, 5% CO 2 incubator It was incubated at. 분리된 지방유래 줄기세포(ADSC)는 적혈구와 혼합되어 있으며, 이 적혈구를 제거하기 위하여 적혈구 용해 완충용액을 사용하기도 하나 적혈구 용해 완충용액 사용시 지방유래 줄기세포(ADSC)의 수가 감소되는 경향이 있다. Discrete fat-derived stem cells (ADSC) is mixed with red blood cells, in order to remove the red blood cells one may use the red blood cells lysis buffer tends to decrease in the number of red blood cell lysis buffer using adipose derived stem cells (ADSC). 따라서 초기배양시 분리된 지방유래 줄기세포(ADSC) 원상태와 적혈구를 함께 배양하였다. Thus were cultured adipose derived separated during the initial culturing stem cells (ADSC) and red blood cells with intact. 이러한 이유로 초기배양시 지방유래 줄기세포(ADSC)가 적혈구와 혼합되어 배양되었다(도 1A). For this reason, were cultured fat-derived stem cells (ADSC) during the initial culture is mixed with the red blood cells (Fig. 1A). 초기 배양 1일 후 지방유래 줄기세포(ADSC)가 플레이트에 다 부착되었을 거라고 판단하고 PBS로 2회 세척하여 부유세포 및 적혈구를 제거하였다. After 1 day the initial culture was determined would the adipose derived stem cells (ADSC) is attached to the plate to remove the suspended cells and red blood cells were washed twice with PBS. 완전히 제거되지 않은 적혈구는 계대배양 시 트립신 화(trypsinization)에 의해 제거하였다. Red blood cells are not completely removed during sub-culturing were removed by trypsin Chemistry (trypsinization). 세포의 밀도(confluence)가 배양기의 80-90%가 되면 계대 배양하였다. When the density of cells (confluence) that is 80-90% of the culture medium and cultured, passaged.

초기 배양 약 2-3일 후 섬유아세포 형태(fibroblast morphology)를 가진 지방유래 줄기세포(ADSC)가 나타남을 확인할 수 있었다. About 2-3 days after initial culturing fibroblasts had a form of fat-derived stem cells (ADSC) with (fibroblast morphology) you can see a vision. 이후 10cm 플레이트로 계대 배양 후 지방유래 줄기세포(ADSC)의 모양을 관찰하였다. Since then sub-cultured in 10cm plate it was observed the appearance of the adipose derived stem cells (ADSC). 그 결과 지방유래 줄기세포(ADSC)는 다른 성체줄기세포처럼 섬유아세포와 같은 형태를 나타냄을 알 수 있었다(도 1B). As a result, fat-derived stem cells (ADSC) have been found to represent a form, such as fibroblasts, as other adult stem cells (Fig. 1B).

2. 지방유래 줄기세포(ADSC)의 지방세포(adipocyte)로의 분화 능력 확인 2. Check the capacity to differentiate adipose derived stem cells (ADSC) of fat cells (adipocyte)

상기 지방유래줄기세포의 분리 및 배양 실험에서 수득한 지방유래줄기세포(ADSC)가 지방세포로 분화되는지 확인하기 위해 지방유래 줄기세포(ADSC)를 지방세포 분화 유도 배지를 사용하여 4주간 분화를 유도시킨 후, 지방세포로 분화되었는지를 확인하였다. The fat-derived stem cells isolated and is a fat-derived stem cells (ADSC) obtained in cultivation trials to ensure that differentiated into adipocytes using the induction medium for adipose derived stem cells (ADSC) adipocytes differentiation inducing differentiation 4 weeks It was confirmed that after that, to differentiate into adipocytes. 지방세포 분화유도 배지는 PromoCell사에서 판매중인 Preadipocyte Differentiation Medium을 사용하였고, 분화된 지방세포의 지방세포 유지배지는 PromoCell사에서 판매중인 Adipocyte Nutrition Medium을 사용하였다. Adipocyte differentiation-inducing culture medium was used Preadipocyte Differentiation Medium for sale PromoCell four fat cells maintain the medium of adipocytes differentiation was used Adipocyte Nutrition Medium sale PromoCell four. 구체적으로는, 지방유래 줄기세포(ADSC)를 지방세포 분화유도 배지에서, 3일 간격으로 배지를 교환하면서 10일간 배양하여 분화를 유도하였고, 이후 지방세포 유지 배지로 바꾸어서 20일간 추가로 더 배양하였다. Specifically, the fat-derived stem cells (ADSC) from the induction medium differentiated adipocytes were induced to differentiate by culturing 10 days while exchanging the culture medium to 3 days, changing after keeping adipocyte medium was further incubated in 20 days more . 배양된 세포는 10% 포르말린에 고정시키고 60% Oil-Red O 용액으로 염색하여 세포내 지방소적(lipid droplet)을 시각화하였다. The cultured cells were visualized by intracellular fat droplets (droplet lipid) and fixed in 10% formalin and stained with 60% Oil-Red O solution. 결과는 도 2에 나타내었다.[지방유래 줄기세포 분화유도 전(A), 분화유도 30일 후(B), 분화유도 30일 후 Oil-Red O 염색 결과(C)]. The results are shown in Figure 2. [differentiation-induced adipose derived stem cells before (A), 30 days after differentiation induction (B), 30 days after differentiation induction Oil-Red O staining (C)].

도 2에 나타난 바와 같이, 배양 30일 후 지방유래 줄기세포(ADSC)에서 지방세포 특유의 지방소적이 관찰되어 지방세포로 분화됨을 확인할 수 있었다. 2, the 30 days of the culture adipocytes unique fat droplets in the fat-derived stem cells (ADSC) is observed it was confirmed that the differentiation into fat cells. 또한, 배양 30일 후 Oil-Red O 염색 결과 지방소적이 붉게 염색되어 지방세포로 분화되었음을 확인할 수 있었으며(C), 분화를 유도하지 않은 세포의 경우 염색이 되지 않은 것을 확인할 수 있었다(A). In addition, it was confirmed that the culture after 30 days Oil-Red O staining fat droplets had to check red that is stained to differentiate into fat cells (C), that is not the case of non-induced cells stained differentiation (A). 따라서, 지방유래 줄기세포(ADSC)가 정상적인 지방세포로 분화할 수 있는 능력을 보유함을 알 수 있다. Therefore, it is fat-derived stem cells (ADSC) is seen that retain the ability to differentiate into normal fat cells.

3. SV40 T 항원의 발현에 의한 ADSC-T 세포주의 확립 및 특징 3. T antigen of SV40 T-ADSC cells by the expression of the establishment and characteristics

(1) 형질 감염(transfection) (1) transfection (transfection)

SV40 T 항원을 지방유래 줄기세포(ADSC)에서 안정적으로 발현시키기 위해 SV40의 T 항원 유전자를 발현시키는 pEF321β-T 플라스미드 DNA를 지방유래 줄기세포(ADSC)에 전기천공 방법으로 도입하였다. SV40 T antigen was introduced into the electroporation method pEF321β the T-DNA plasmid expressing the T-antigen gene of SV40 in order to stably expressed in the adipose derived stem cells (ADSC) to the fat-derived stem cells (ADSC). 구체적으로는, 20㎍의 상기 플라스미드 벡터 pEF321β-T 와 1x10개의 지방유래 줄기세포를 800㎕의 무혈청 DMEM내에서 혼합하고 0.4㎠의 큐벳에 담아 전기충격을 주었다. Specifically, the mixture of the plasmid vector pEF321β-T and 1x10 of adipose derived stem cells in serum-free DMEM 20㎍ of 800㎕ and put in cuvettes of 0.4㎠ given an electric shock. 전기충격은 Gene Pluser X cell Electroporation System(BIO-RAD)을 이용하여 160V, 15m/초의 조건으로 실시하였다. Electric shock using a Gene Pluser X cell Electroporation System (BIO-RAD) was carried out with 160V, 15m / sec condition. 플라스미드 벡터 pEF321β-T가 도입되어 고밀도 세포군집(High density focus)을 형성한 지방유래 줄기세포는 페니실린 캡(penicillin cap)을 씌워 트립신화한 다음 세포를 클로닝한 뒤 24 웰 플레이트에 배양하고 세포가 배양기의 80-90%가 되었을 때 계대 배양하였으며, 이 세포주를 ADSC-T 로 명명하였다. Plasmid vector pEF321β-T is introduced high density cell clusters (High density focus) to form a fat-derived stem cells are penicillin cap (penicillin cap) to cover trip myth and then after cloning a cell culture in a 24 well plate and the cells are incubator when a is a 80 - 90% was sub-cultured, the cell line was named as the ADSC-T. 상기 ADSC-T 세포의 형태학적 변화를 도 3에 나타내었다. The morphological changes in the T-ADSC cells is shown in Fig.

도 3A에 나타낸 바와 같이, 일차 지방유래 줄기세포(primary ADSC)의 경우 세포의 크기가 크고 긴 섬유아세포(fibroblast)의 형태로 접촉제어(contact inhibition)에 의해 증식이 정지되어 세포 단층(monolayer)을 형성하는 것을 확인할 수 있었다. As shown in Figure 3A, the primary adipose derived stem cells, the cells are large, long fibroblast contact control in the form of (fibroblast) is growth is stopped by the (contact inhibition) cell monolayers (monolayer) size in the case of the (primary ADSC) It was confirmed to form. 또한, 도 3B 및 3C에 나타난 바와 같이, 일차 지방유래 줄기세포에 pEF321β-T 플라스미드가 도입되어 SV40 T 항원이 발현된 지방유래 줄기세포(ADSC-T)가 접촉제어 받지 않고 세포 단층 위에 세포들이 겹쳐 자라는 현상이 나타나 세포 밀도가 높은 고밀도 세포 군집(high-density focus)을 형성하는 것을 확인할 수 있었다. Further, as shown in Figures 3B and 3C, the primary adipose derived is a pEF321β-T plasmid introduced into the stem cells are cells overlaid on without SV40 T antigen is expressed adipose derived stem cells (ADSC-T) is in contact control cell monolayers this phenomenon appears to grow cell density was found to form a high-density cell clusters (high-density focus). 또한, 도 3D에 나타난 바와 같이, ADSC-T 는 세포의 크기가 작아지면서 방추형으로 변화되었음을 알 수 있었다. Further, it was found that as shown in FIG 3D, is the size of the T-ADSC cells As small change spindle. 이러한 ADSC-T 의 세포 형태 변화는 SV40 T 항원의 발현에 의한 것이라고 추정해 볼 수 있다. This morphological change of cell is T-ADSC can be estimated to be due to the expression of the SV40 T antigen.

(2) ADSC-T 세포의 T 항원 발현 여부-형광항체염색법 (2) whether or not T-ADSC cells The expression of T antigen-fluorescent antibody staining

ADSC-T 세포 내의 T 항원의 발현을 확인하기 위하여, SV40 T 항원에 대한 단일클론항체(monoclonal antibody)와 FITC(Fluorescein isothiocyanate)로 표식된 항-마우스 IgG를 사용하여 형광항체염색을 시행하여 UV 하에서 T 항원의 발현을 관찰하였다. In order to determine the T-antigen expression in the ADSC-T cell, anti-labeled monoclonal antibody (monoclonal antibody) and FITC (Fluorescein isothiocyanate) for the SV40 T antigen using the mouse IgG under the UV underwent fluorescent antibody staining We observed the expression of T antigen. 이때 대조군으로 COS-1 세포를 사용하였으며, COS-1 세포의 경우 SV40 T 항원을 이용하여 만들어진 세포로서 ADSC-T 세포의 SV40 T 항원 발현 유무를 비교 확인할 수 있다. At this point we used the COS-1 cells as a control, in the case of COS-1 cells can be identified as a cell made by using the SV40 T antigen compared to the SV40 T antigen expressing the presence or absence of T-ADSC cells.

구체적으로는, ADSC-T 세포 및 COS-1 세포를 에탄올과 아세톤을 1:1로 혼합한 용액으로 18분간 고정하였다. Specifically, the ADSC-T cells and COS-1 cells, one of ethanol and acetone and fixed 18 minutes in a solution mixed in a 1. 고정된 세포를 PBS로 세척한 후, SV40 T 항원에 특이적으로 결합하는 마우스의 단일클론항체와 함께 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. After washing with PBS, the fixed cells were then incubated for 1 hour at 37 ℃ with a mouse monoclonal antibody of specifically binding to SV40 T antigen. 배양된 세포를 PBS로 세척한 후 FITC로 표식된 토끼의 항-마우스 IgG와 함께 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. It was incubated for 1 hour at 37 ℃ with mouse IgG - washing the cultured cells with PBS and then the anti-rabbit labeled with FITC. 상기 배양된 세포를 형광 현미경으로 관찰하였다. It was observed for the culture of cells under a fluorescence microscope. 상기 실험에 대한 결과를 도 4에 나타내었다. The results for the experiments in Fig.

도 4에 나타난 바와 같이, 고밀도 세포 군집(high-density focus)에서 분리된 ADSC-T 세포가 SV40 T 항원에 대한 단일클론항체(monoclonal antibody)로 염색되어 COS-1 세포와 마찬가지로 T 항원이 발현되는 것을 확인할 수 있었다. As shown in Figure 4, the ADSC-T cells isolated from the high density cell clusters (high-density focus) is stained with monoclonal antibody (monoclonal antibody) for the SV40 T antigen which the T antigen expression as in the COS-1 cells It was confirmed.

3. ADSC-T 세포의 웨스턴 블로팅(western blotting)을 이용한 T 항원 발현 확인 3. Check the T antigen expression using Western blotting (western blotting) of ADSC-T cells

3개의 ADSC-T 세포로부터 각각 총 세포추출물(Total cell extract)을 제조하여 웨스턴 블로팅(western blotting)으로 세포 내에 존재하는 SV40 T 항원을 검출하였다. 3 and from the ADSC-producing T cells to the total cell extracts (Total cell extract) respectively detect the SV40 T antigen were present in the Western blotting (western blotting) to the cell. 구체적으로는, 동량의 단백질을 포함하는 각 세포의 추출물을 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔로 전기영동한 후, 니트로 셀룰로오스막에 옮겼다. Specifically, the extract of each cell comprising the same amount of protein was 10% SDS- polyacrylamide gel electrophoresis, transferred to a nitrocellulose membrane. SV40 T 항원에 특이적으로 결합하는 마우스의 단일클론항체(IgG)를 결합시킨 후 퍼옥시다제가 접합된 항-마우스 IgG를 사용하여 발색시켰다. Color development was by using the mouse IgG - After coupling the monoclonal antibody (IgG) of mice specifically binding to SV40 T antigen peroxidase-conjugated anti-I. 상기 결과를 도 5에 나타내었다. The results are shown in Fig.

도 5에 나타난 바와 같이, 웨스턴 블로팅 결과 ADSC-T 의 3개의 세포(B, C, D)에서 양성 대조군인 COS-1(E) 세포처럼 T 항원이 발현됨을 확인할 수 있었으며, 음성 대조군인 일차 지방유래 줄기세포(primary ADSC)는 T 항원이 발현되지 않음을 확인하였다(A). As shown in Figure 5, the Western blot results were to determine that the T antigen is expressed as a three cells (B, C, D) COS-1 (E) cells of the positive control in the ADSC-T, a negative control the primary fat-derived stem cells (ADSC primary) is (a) was confirmed to T N antigen is not expressed. 상기 결과로부터, 분리된 ADSC-T 세포주는 T 항원을 안정적으로 발현하고 있었으며, T 항원에 의해 세포증식이 증가되었고, 세포의 형태가 변화되었음을 알 수 있었다. From the above results, ADSC T-cell line was separated and is stably express the T antigen, it can be seen that the cell proliferation, a change in morphology of the cells was increased by T antigen.

4. SV40 T 항원에 의해 수립된 ADSC-T 세포의 증식속도 4. SV40 T proliferation rate of the T-ADSC cells established by the antigen

시미안 바이러스 40(SV40) T 항원에 의해 확립된 ADSC-T 와 제 1차 지방유래 줄기세포(primary ADSC)의 세포 증식 속도를 측정하여 비교하였다. The simian virus 40 (SV40) The ADSC-T and the primary adipose derived stem cells (ADSC primary) established by the T cell antigen were compared to measure the proliferation rate. 세포배양 시 세포의 밀도가 80%가 되었을 경우 계대배양을 시행하였고, 매 계대마다 세포를 계수하여 세포증식곡선(cell growth curve)을 작성하여 비교하였다. If the density of the cell culture when cells became 80% were treated with sub-culturing, the cells counted every passage was compared by creating a cell growth curve (cell growth curve). 상기 결과를 도 6에 나타내었다. The results are shown in Fig.

도 6에 나타난 바와 같이, 일차 지방유래 줄기세포(primary ADSC)는 약 6-7일 간격으로 한 번씩 세포분열을 하는 반면, 3개의 ADSC-T 의 세포는 모두 약 2일에 한 번씩 세포분열을 하는 것으로 나타났다. As shown in Figure 6, the primary adipose derived stem cells (ADSC primary), while once the cell division to approximately 6-7 day intervals, three of the T-ADSC cells, all of the times of cell division to about 2 days It showed that. 또한 일차 지방유래 줄기세포(primary ADSC)의 경우 증식 속도가 점점 떨어져 사멸하는 현상을 나타내었지만, ADSC-T 의 경우에는 3개의 세포주간에 약간의 차이는 있었으나 전체적으로 세포의 수명이 길어지고 빠른 증식속도를 나타내었다. In addition, the primary fat-derived stem cells if the (primary ADSC) was shown to a phenomenon in which the growth rate apoptosis getting away, ADSC-T case, the three little difference in the cells weekly is but is overall longer in the cell life faster growth rate the indicated. 이러한 증식속도 향상은 약 6개월(50 패시지)까지 계속되었고, 이후에는 세포의 증식속도가 떨어지는 양상을 나타내었다. This growth rate has continued to improve until approximately 6 months (50 passages), since there showed a proliferation rate of cells falling pattern.

5. ADSC-T 세포 배양액의 제조 5. ADSC-T Preparation of cell culture media

본 발명의 세포 배양액을 제조하기 위해, DMEM에 FBS가 10% 함유된 배지로 ADSC-T 및 ADSC 세포를 배양액(Cultrued Medium : CM) 배지로 3일간 배양하였다. To prepare the culture medium of the present invention, the culture medium ADSC T-ADSC cells and in the medium containing 10% FBS is in DMEM: was set to (Cultrued CM Medium) culture medium for 3 days. 실험에 이용한 배양액의 패시지(passage) 숫자는 ADSC-T 는 22 패시지, 제 1차 ADSC 세포는 6 패시지에서 수득한 배양액을 이용하였다. Passage (passage) number of culture media used in the experiment is ADSC-T is 22 passages, the first ADSC cells was used as a culture medium obtained in six passages.

[실시예 1] ADSC-T 세포 배양액의 피부재생(skin regeneration) 및 상처치료(wound healing) 효과 검증 [Example 1] ADSC-T cells play skin (skin regeneration) and wound healing (wound healing) verify the effect of the culture

1. 섬유아세포-파퓰레이티드 콜라겐(fibroblast-populated collagen) 격자 수축 어세이(lattice contraction assay) 1. fibroblast-populated collagen federated (fibroblast-populated collagen) lattice contraction assay (lattice contraction assay)

콜라겐 용액을 만들기 위하여, 5x DMEM(-NaHCO3)과 멸균 재형성 완충액(Sterile reconstitution Buffer)(2.2gNaHCO 3 , 0.05N NaOH, 200mM HEPES in 100ml)를 준비하였다. To make a collagen solution, and prepare 5x DMEM (-NaHCO3) and antiseptics forming buffer (Sterile reconstitution Buffer) (2.2gNaHCO 3 , 0.05N NaOH, 200mM HEPES in 100ml). 콜라겐 타입(Collagen type)(Nitta Gelatin,Japan) 7 부피(volume), 5X DMEM 2 부피, Buffer 1 을 얼음 상에서 섞어주었다. It gave a mixture of collagen type (Collagen type) (Nitta Gelatin, Japan) 7 vol (volume), 5X DMEM 2 by volume, Buffer 1 on ice. 세포를 웰(well)당 1 x 10 5 으로 되게 세포수를 맞춘 후 콜라겐 용액에 첨가해 기포가 최대한 적게 나게 섞는다. After the cells to be 1 x 10 5 per well (well) to align the cells and mix remind was added to the collagen solution as little as possible air bubbles. 6 웰(well)에 웰당 1.5ml씩 분주하여 37℃, 5% CO 2 조건에서 30분 동안 배양하였다. The Pipette 1.5ml per well in 6 well (well) were cultured in 37 ℃, 5% CO 2 condition for 30 minutes. 굳어진 콜라겐은 가장자리를 멸균된 주사기로 떼어 주고, 처리할 샘플 배지를 50% 농도로 하여 첨가하였으며, 8일간 배양하여 Image J 프로그램을 이용하여 콜라겐 면적을 구하였다. Hardened collagen is giving off by a sterile syringe to the edges, it was added to the sample medium to be processed as a 50% concentration, the area of ​​collagen was determined using the Image J program and cultured for 8 days.

2. 섬유아세포-파퓰레이티드 콜라겐 격자(Fibroblast-populated collagen lattice; FPCL) 배양 실험에서 ADSC-T 배양액의 피부수축 효과 2. fibroblast-populated collagen lattice federated (Fibroblast-populated collagen lattice; FPCL ) in cultured ADSC-T experimental skin contraction effect of culture

콜라겐 은 진피층의 90%를 차지하고 있으며 피부 내 콜라겐 함량은 보습, 탄력과 관련이 있다. Collagen accounts for 90% of the dermis and collagen content in the skin is associated with moisture, elasticity. 또한 피부에 상처가 났을 때 치유과정은 지혈, 염증, 증식, 창상수축 단계로 이루어지며 창상수축 단계에서 콜라겐의 수축정도는 매우 중요하다. When the wound healing process also woke the skin is made of hemostasis, inflammation, proliferation, wound contraction step is very important contraction of the collagen in the wound contraction step. 이러한 과정은 항노화와 창상에 따른 피부조직 복원 과정에서 유사하게 나타난다. This process was quite similar in tissue restoration process according to the anti-aging and wound. 이러한 항노화(탄력증가) 및 창상수축효과in vitro 에서 FPCL(Fibroblast-populated collagen lattice)모델을 이용한 배양액으로 확인이 가능하고 본실험에서는 FPCL을 이용하여 줄기세포 배양액을 처리하였을때 콜라겐 수축 정도를 확인하였다. These anti-aging (resilience), and wound contraction effect of the collagen contraction when the FPCL (Fibroblast-populated collagen lattice) experiment this and make is possible to culture using models in vitro, using the FPCL was treated with stem cell culture confirmed. 콜라겐 속에 섬유아세포(3Y1)를 혼합하여 콜라겐을 형성한 후 50% 농도의 줄기세포배양액이 함유한 배지를 이용하여 배양하였다. After a mixture of fibroblasts (3Y1) in the collagen to form a collagen and cultured using a medium containing the stem cell culture medium and 50% concentration. 먼저 콜라겐속의 세포를 2일, 5일 및 8일 동안 배양 후 각각 현미경으로 관찰하였다. First two days of collagen in the cells for 5 days and 8 days of culture was observed with a microscope, respectively. 상기 결과를 도 7 및 도 8에 나타내었다. The results are shown in Figs.

도 7에 나타낸 바와 같이, 2일 동안의 경우에는 큰 차이점이 없었으나, 2일 후부터는 ADSC-T CM을 처리한 콜라겐 속의 세포가 네트워크를 형성하여 자라는 것을 볼 수 있다. In the case of Fig. For 2 days, as shown in FIG. 7, there are in the one there was no big difference, processing the ADSC-T CM hubuteoneun 2 days collagen cell can see that grow to form a network. 상기 결과를 도 7에 나타내었다. The results are shown in Fig.

또한 도 8에 나타낸 바와 같이, 배양 후 8일째 콜라겐의 면적을 측정한 결과 대조군(control) 9.6㎠, ADSC-T 4.3 ㎠, ADSC 10.1㎠으로 나타났으며, 이는 처음 면적 10.4㎠에 비교해 ASDC-T가 2.4배 면적이 감소하였다. In addition, compared to the, day 8 control result of measuring the area of ​​the collagen (control) 9.6㎠, ADSC-T 4.3 ㎠ After incubation, ADSC showed a 10.1㎠, which first area 10.4㎠ As shown in Figure 8 ASDC-T the decreased surface area is 2.4 times.

ADSC-T의 배양액은 상처부위 수축작용이 우수함을 알 수 있었고, 피부재생 및 항노화 기능성화장품과 상처치료의약품의 원료로 사용가능함을 알 수 있었다. Culture of ADSC-T has been able to know the wound contraction is excellent, it was found possible to use as an ingredient in skin rejuvenation and anti-aging functional cosmetics, pharmaceuticals and wound healing. 제 1차 ADSC(6 계대)의 배양액은 대조군과 비교하여 효과를 거의 보이지 않았다. Culture medium of the first ADSC (passage 6) was almost no effect compared to the control.

3. 세포 이동거리 확인을 통한 ADSC-T 배양액의 상처치료 효과 분석 3. Analysis of wound healing ADSC-T cell culture through a travel distance check

(1) 상처치유과정을 확인하기 위하여 섬유아세포 3Y1의 이동거리를 확인하였다. (1) the moving distance of the 3Y1 fibroblasts was confirmed in order to confirm the wound healing process. 3Y1을 100% 밀집도(confluence)가 되게 배양한 후 멸균된 팁(tip)으로 세포를 그었으며 그 폭은 1600㎛(±100㎛)으로 맞추었다. A 3Y1 were those for 100% density (confluence) the cells with a sterile tip (tip) and incubated so that the width was set to 1600㎛ (± 100㎛). 그 후 줄기세포 배양액을 첨가하고, 대조군으로는 혈청(serum) 보정을 위해서 줄기세포배양액과 마찬가지로 3Y1 배양액을 만든 후 이를 대조군으로 사용하였다. That after the addition of stem cell culture medium, and the control is made after the culture 3Y1 like stem cell culture medium for serum (serum) correction was used as a control. 24시간, 48시간 간격으로 세포이동거리를 사진으로 촬영 후 Image J 프로그램을 이용하여 그 이동거리를 측정하였다. 24 hours, then taken to a photo cell migration distance of 48 intervals using Image J program measure the moving distance.

(2) 피부의 탄력, 주름, 상처치유에서 섬유아세포는 가장 중요한 역할을 한다. (2) in elasticity, wrinkles, wound healing, fibroblasts of the skin is the most important role. 이 세포의 이동성은 피부의 탄력증가, 빠른 상처회복 기능을 한다. The mobility of these cells is to increase the elasticity of skin, rapid wound healing capabilities. 줄기세포 배양액의 상처치유효과를 확인하기 위해서 래트(rat) 섬유아세포 3Y1 세포의 이동성을 확인하였다. In order to determine the wound healing effect of stem cell cultures was confirmed that the rat (rat) mobility of fibroblast 3Y1 cells. 3Y1을 100mm 플레이트(plate0에 컨플루언트(confluent)로 배양하고 멸균된 팁으로 그은 후, ADSC-T, 제 1차 ADSC 배양액을 50% 농도로 세포에 처리하였으며, 무처리 3Y1을 대조군으로 하였다. 세포의 이동거리는 24시간, 48시간으로 시간대별로 측정하였으며, 48시간의 시점에서 세포의 모습을 촬영하였다. 상기 결과를 도 9에 나타내었다. A 3Y1 100mm plate (after drawn to confluent (confluent) in a culture and a sterile tip on plate0, ADSC-T, the was treated with primary ADSC culture medium to the cells at 50% concentration, and the non-treatment 3Y1 as a control. moving distance of cells 24 hours, 48 ​​hours was measured over time, at a time point of 48 hours, to take the state of cells are shown the results in Fig.

도 9A에 나타낸 바와 같이, 48시간 시점에서 ADSC-T 배양액을 처리한 세포가 활발히 이동하고 있는 것을 확인하였다. As shown in Figure 9A, it was confirmed that the processing time of 1-48 hours the ADSC-T cells in the culture medium, and actively moving.

도 9B에 나타낸 바와 같이, 이동거리를 측정한 결과 ADSC-T는 24시간에서 730 ㎛m, 48시간에서 1123 ㎛를 이동하였으며, ADSC는 513 ㎛, 857 ㎛를 이동하였다. As shown in Fig. 9B, T-ADSC results of measuring the movement distance was moved in the 1123 ㎛ 730 ㎛m, 48 sigan in 24 sigan, ADSC was moved to 513 ㎛, 857 ㎛. ADSC-T 세포의 배양액의 상처치료 효과는 제 1차 ADSC의 6 패시지 배양액보다 높게 나타났다. Wound-healing effect of the culture of the T-ADSC cells was higher than 6. Passage of the culture medium first ADSC.

따라서, 본 발명의 ADSC-T 세포의 배양액은 상처치료 효과가 현저하다는 것을 확있했다. Thus, the ADSC-culture of T cells of the present invention was hwakit that the wound healing significantly.

4. ADSC-T 배양액의 콜라겐 생산 촉진 효과 확인 4. Check ADSC-T collagen production promoting effect of culture

(1) 세포내 콜라겐 함량과 유리된 콜라겐을 측정하기 위해서, 3Y1 세포에 50%농도의 줄기세포배양액을 처리한 후 5일 동안 배양하였다. (1) then to measure the intracellular collagen content and the glass collagen, processing the stem cell culture medium and 50% concentrations on 3Y1 cells were cultured for 5 days. 줄기세포 배양액을 PBS로 2회 세척한 후 수거하여 1,100rpm 조건에서 3분간 원심분리하여 상등액을 제거하여 총 용해 완충액(total lysis buffer)(20mM 7.0 Hepes, 25% Glycerol, 450mM NaCl, 0.4mM EDTA, 0.5mM DTT, 프로티에이즈 억제제(protease inhibitor, 1% NP-40)로 현탁(suspension)하였다. 얼음 상에서 1시간 동안 반응시킨 후 12,000rpm, 4℃ 조건에서 15분간 원심분리하여 상등액을 수득하였다. 분리한 상등액은 브래드포드(bradford)법을 이용해 단백질을 정량 후 웨스턴 블로팅(western blotting)을 수행하였다. After washing twice with PBS, the stem cell culture fluid collected and the total dissolution to remove the supernatant to 3 minutes and centrifuged at 1,100rpm condition buffer (total lysis buffer) (20mM 7.0 Hepes, 25% Glycerol, 450mM NaCl, 0.4mM EDTA, 0.5mM DTT, Protea HIV inhibitors were suspended (suspension) in (protease inhibitor, 1% NP-40). to give the 1 after reaction for a time for 15 minutes was centrifuged at 12,000rpm, 4 ℃ condition supernatant on ice. after the determination of the protein was separated supernatant using Bradford (bradford) method was performed by Western blotting (western blotting).

시료 단백질을 8% SDS 폴리아크릴아마이드젤(polyacrylamide gel)에서 전기영동(75V, 2시간)을 수행한 후 Hybond ECl(Amersham) 멤브레인(membrane)에 전기이동(electrotransfer)(90V, 3시간)을 수행한 뒤, 멤브레인을 5% 스킨밀크(skin-milk)로 블로킹(blocking)하였다. The sample protein 8% SDS polyacrylamide gel (polyacrylamide gel) electrophoresis (75V, 2 hour) after electrophoresis (electrotransfer) (90V, 3 hours) to Hybond ECl (Amersham), the membrane (membrane) perform in performing a back, the membrane is blocked (blocking) in 5% milk skin (skin-milk). 멤브레인을 COL1A2(SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY) 1차 항체를 이용하여 2시간 동안 상온에서 반응시키고 TBS-T(tris-buffered saline-tween: pH 7.6 Tris-HCl, 137mM NaCl, 0.1% Tween-20)용액으로 3회 세척한 후 퍼옥시데이즈-컨쥬게이트 안티-고트(peroxidase-conjugated anti-Goat) IgG 2차 항체로 1시간 동안 상온에서 반응시켰다. Reacting the membrane for 2 hours at room temperature with a primary antibody (SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY) COL1A2 and TBS-T (tris-buffered saline-tween: pH 7.6 Tris-HCl, 137mM NaCl, 0.1% Tween-20) with 3 solution after washing once peroxidase-conjugated anti-goat (peroxidase-conjugated anti-Goat) was reacted at room temperature for 1 hour with secondary antibody IgG 2. TBS-T용액으로 3회 세척한 후 화학형광반응(ECL, Enhanced chemiluminescence)으로 발광시킨 후 엑스레이(X-ray) 필름에 감광시킨 후 이를 분석하였다. After washing three times with TBS-T solution, then it emits light of a fluorescent chemical reaction (ECL, Enhanced chemiluminescence) was sensitive to X-rays (X-ray) film was analyzed.

(2) 피부상처회복과정 에서 섬유아세포의 증식 및 이에 의한 콜라겐 생성 증가는 상처회복과정 중에서 중요한 요소이다. (2) The proliferation and collagen production of fibroblasts in the process by increasing the skin wound healing is an important factor in wound healing process. 이에 줄기세포배양액을 3Y1세포에 처리하여 무처리군과 비교하여 세포내 콜라겐 단백질 생산 및 세포외 유리된 콜라겐 단백질양을 웨스턴 블로팅(western blotting)으로 확인하였다. In comparing the stem cell culture medium and non-treatment group was treated on 3Y1 cells to the collagen protein levels glass extracellular collagen protein production and cells was confirmed by Western blotting (western blotting). 상기 결과를 도 10에 나타내었다. The results are shown in Fig.

도 10에 나타낸 바와 같이, ADSC-T 배양액을 처리하였을 때 세포내 콜라겐 단백질이 증가한 것을 확인할 수 있다(도 10A). As it is shown in Figure 10, when processing the ADSC-T cell culture medium can be confirmed that collagen protein is increased (Fig. 10A). 배지 속에 유리된 콜라겐 또한 무처리군과 비교하여 증가하였음을 알 수 있었다(도 10B). The collagen in the glass medium was also seen that they have increased in comparison with the untreated group (Fig. 10B). 상기 결과로부터 본 발명의 ADSC-T의 배양액은 섬유아세포의 콜라겐 수축작용 뿐만 아니라 콜라겐 생산도 촉진함으로써 상처치료 및 피부재생을 유도함을 알 수 있었다. Culture of ADSC-T of the present invention from the above results was found to induce a skin wound healing and reproduction, as well as collagen contraction of the fibroblasts also promote collagen production.

따라서, 본 발명의 ADSC-T 배양액은 상처치료제 및 피부재생, 항노화, 주름개선의 기능성 화장품 원료로서의 효과의 현저성을 입증하였다. Accordingly, T-ADSC culture medium of this invention demonstrated remarkable effect as of the wound healing and skin regeneration, anti-aging, and functional cosmetics for anti-wrinkle.

[실시예 2] ADSC-T 세포 배양액의 미백(skin whitenig) 효과 검증 [Example 2] T-ADSC cells whitening verification (skin whitenig) the effect of culture medium

1. ADSC-T 배양액의 멜라닌(melanin) 생성 저해 효과 확인 1. The check-ADSC T broth melanin (melanin) production-inhibiting effect of the

(1) 멜라닌 측정을 위해서 멜라노마(melanoma) 16F10세포를 100mm 플레이트에 배양하고 50% 농도로 줄기세포배양액을 처리한 후 24시간, 48시간, 72시간의 시간대 별로 배양하였다. (1) After measurement for melanin cultured melanoma (melanoma) 16F10 cells in 100mm plates and processed the stem cell culture medium with 50% concentration 24 hours, 48 ​​hours, and the cells were cultured over time of 72 hours. 각 시간대 별로 3.5 x 10 6 으로 세포수를 맞춘 후 수거하여 PBS로 세척(washing)한 후 1100 rpm의 조건으로 3분동안 원심분리하여 세포 침전물을 수득하였다. Each cell precipitate was centrifuged for 3 min with the washing (washing) conditions of 1100 rpm and then with 3.5 x 10 6 PBS collected in Align the number of cells over time was obtained. 세포 펠렛(pellet)과 배지는 1N NaOH·DMSO 용액을 첨가 후 볼텍싱(vortexing)을 한 후 이들을 80℃에서 1시간 동안 처리하였다. The cell pellet (pellet) and the medium was treated for them for 1 hour at 80 ℃ After vortexing (vortexing) seen after the addition of 1N NaOH · DMSO solution. 그 후 492nm 흡광도에서 측정하였으며 멜라닌 함량은 무처리군에 대한 함량으로 나타내었다. Then the absorbance was measured at 492nm melanin content was characterized by a content of the non-treatment group.

(2) 마우스 멜라노마(Mouse Melanoma) B16F10 세포에 줄기세포배양액을 처리하여 멜라닌 생성 저해 여부를 확인하였다. (2) treating a stem cell culture in a mouse melanoma (Melanoma Mouse) B16F10 cells was confirmed whether melanogenesis inhibition. B16F10세포를 ADSC-T, ADSC의 배양액이 50% 함유된 배지를 이용하여 배양하였으며, 배양액이 함유되지 않은 DMEM으로 배양한 세포를 무처리 대조군으로 하여 무처리세포에서 생성되는 멜라닌양과 배양액 처리시 생산된 멜라닌양을 비교하였다. During production of melanin amount and the culture process B16F10 cells were cultured using the ADSC-T, a medium containing 50% of culture solution of ADSC, to a cell culture in DMEM that the culture medium is not contained in the untreated control group produced by the untreated cells compared to the amount of melanin. 세포와 배지속의 멜라닌양을 24시간, 48시간, 72시간의 시간대별로 측정하였으며 세포를 PBS로 세척한 후 세포를 침전시킨 다음 디지털 카메라로 세포 펠렛(pellet)의 색깔을 확인하였다. Was 24 hours, the amount of melanin in the cells and culture medium for 48 hours, were determined over time for 72 hours to precipitate the cells were washed with PBS and then cells was confirmed that the color of a digital camera, the cell pellet (pellet). 상기 결과를 도 11에 나타내었다. The results are shown in Fig.

도 11에 나타낸 바와 같이, 48시간에서부터 눈으로 확인이 될 정도로 ADSC-T의 배양액을 처리한 B16F10의 세포침전물에서 멜라닌 생성이 저해되어 세포의 펠렛색이 차이 나는 것을 확인할 수 있었다. 11, from 48 hours to such an extent that the Visual inspection is a melanogenesis inhibition at the cellular precipitate in B16F10 treated with culture solution of ADSC-T was confirmed that I the pellet color difference of the cell. 또한 72시간 동안 배양한 세포는 멜라닌 생산의 차이가 더욱 현저하였다. In addition, cells were cultured for 72 hours, the difference in melanin production was more pronounced.

또한, 3 x 10 5 의 B16F10 세포 펠렛을 1N NaOH DMSO를 처리하여 80℃에서 세포를 녹여 그 속의 멜라닌 함량을 492nm에서 측정하였다. In addition, 3 x 10 5 B16F10 the cell pellet was treated in a 1N NaOH DMSO dissolve the cells at 80 ℃ to measure the melanin content in the at 492nm. 상기 결과를 도 12에 나타내었다. It is shown in Figure 12 for the results.

도 12에 나타낸 바와 같이, ADSC-T 배양액을 처리한 후 72시간째의 멜라닌 함량이 무처리군과 비교하여 73%로 감소한 것을 확인하였다(도 12A). As it is shown in Figure 12, after processing the ADSC-T culture medium the melanin content of the second 72 hours to make sure that as compared with the non-treatment group decreased by 73% (Figure 12A). B16F10이 세포 밖으로 방출한 멜라닌을 측정하기 위해서, 각각의 시간대별 수거한 배지를 위와 같은 방법으로 측정한 결과 제 1차 ADSC 배양액을 처리한 배지속의 멜라닌 함량은 차이가 없었으며, ADSC-T 배양액을 처리한 배지속의 멜라닌과 비교하였을 때 각각 83.9%, 76.1% 50.5%로 시간이 지날수록 감소함을 확인하였다(도 12B). B16F10 is to measure the melanin released out of the cell, was measured in each time slot, such as the collection medium as above how the primary melanin content in the treated ADSC culture medium was not different, the ADSC-T broth as compared to the melanin in the treated medium it was found that this decreased over time to 83.9%, 76.1% 50.5%, respectively (Figure 12B).

2. ADSC-T 배양액의 타이로시네이즈(Tyrosinase) 활성 저해 효과 검증 2. Verification tyrosinase (Tyrosinase) inhibitory effect of the tie T-ADSC culture

(1) B16F10을 배양한 후 50% 줄기세포 배양액을 첨가한 후 48시간과 72시간 동안 배양하였다. (1) it was cultured and incubated for B16F10 48 hours after the addition of 50% of stem cell culture medium and 72 hours. 그 후 세포를 PBS 2회 세척하고 1100 rpm에서 8분간 원심분리하여 세포를 수득하였다. Then cells were washed with PBS 2 times to give a cell separated eight minutes centrifugation at 1100 rpm. 용해 완충액(Lysis buffer)(20mM sodium phosphate, pH 6.8, 1% Trion x-100, 1mM protein inhibiton)을 800㎕ 첨가하여 10초간 5회 볼텍싱을 반복하였다. Adding a lysis buffer (Lysis buffer) (20mM sodium phosphate, pH 6.8, 1% Trion x-100, 1mM protein inhibiton) 800㎕ was repeated by five times vortexing for 10 seconds. 12,000 rpm, 4℃ 조건에서 15분동안 원심분리하여 얻어진 배양 상등액을 타이로시네이즈 효소액으로서 사용하였다. The culture supernatant obtained by centrifugation for 15 minutes at 12,000 rpm, 4 ℃ condition was used as a tyrosinase enzyme solution during the tie. 싱기 효소액은 브래드포드(bradford)법을 이용하여 단백질 정량하여 동량을 사용하였다. Singgi enzyme solution is the same amount as was used to quantify protein using the Bradford (bradford) method. 타이로시네이즈 활성을 확인하기 위하여 2.5mM L-DOPA(3,4-Dihydroxy-L-phenylalanine, Sigma-Aldrich), 50mM 인산염 완충액(phosphate buffer)(pH 6.8) 및 효소액을 첨가하여 37℃에서 20분간 반응시킨 후 475nm에서 흡광도를 측정하였으며 타이로시네이즈 활성은 무처리군에 대한 활성정도로 나타내었다. In order to confirm the tyrosinase activity as a tie 2.5mM L-DOPA (3,4-Dihydroxy-L-phenylalanine, Sigma-Aldrich), 50mM phosphate buffer (phosphate buffer) in a (pH 6.8) and 37 ℃ by the addition of 20 enzyme solution minutes after which the reaction was measured at 475nm recombinase activity when the tie exhibited enough activity to the untreated group.

(2) 앞서 멜라닌 생산량이 ADSC-T 배양액을 처리하였을 때 저해되는 효과를 확인하였다. (2) to determine the effect of inhibition as previously obtain specific melanin production process the ADSC-T medium. 타이로시네이즈는 멜라닌 생성과정 중에서 가장 중요한 핵심 효소로 멜라닌 형성 첫 번째 과정에서부터 참여하는 효소이다. When the tie tyrosinase is an enzyme that forms melanin participation from the first process to be the most important key enzyme from the melanin production process. 그러므로 ADSC-T 배양액의 멜라닌 생성억제작용을 한번 더 확인하기 위하여 ADSC-T배양액에 의한 타이로시네이즈의 활성억제를 검토하였다. Therefore, to determine T-ADSC culture of melanogenesis inhibitory again to the action of inhibiting the activity of tyrosinase as a tie according to the ADSC-T to culture were examined.

타이로시네이즈 효소활성을 측정하기 위해서 B16F10세포에 50% 농도의 배양액을 처리한 후 48시간 후에 세포를 수거하여 용해 완충액을 넣어 세포 속 단백질을 수득하였다. And then to measure the tyrosinase activity in the medium of the handle tie 50% concentration in B16F10 cells were collected 48 hours later the cells into the lysis buffer to give a protein in the cell. 상기 용액을 타이로시네이즈 활성측정에 사용하였다. The solution was used in tyrosinase activity was measured when the tie. 브래드포드(bradford)법을 이용해 타이로시네이즈 단백질을 정량하였고, 같은 양의 단백질을 취해 L-dopa가 도파크롬(dopachrome)이 되는 정도를 흡광도 475nm에서 측정하였다. Bradford was quantified tyrosinase protein using the tie (bradford) method to measure the degree of protein taken on the same amount of L-dopa is that waveguide chromium (dopachrome) at 475nm absorbance. 상기 결과를 도 13에 나타내었다. It is shown in Figure 13 for the results.

상기 도 13에서 나타낸 바와 같이, 무처리 대조군의 타이로시네이즈 활성에 비해 ADSC-T의 배양액은 26.5%, 제 1차 ADSC 배양액은 84.9%로 나타나 ADSC-T 및 ADSC의 배양액은 타이로시네이즈를 저해함을 알 수 있었고 저해효과는 ADSC보다 ADSC-T의 배양액에서 크게 나타났다. As shown in the Figure 13, the culture medium was 26.5%, the first ADSC culture of ADSC-T than the tyrosinase activity when as a tie of the untreated control group was shown in 84.9% culture of ADSC-T and the ADSC is when the tie tyrosinase the inhibition was found to be inhibitory effect was significant in cultures of ADSC-T than the ADSC.

따라서, 본 발명의 ADSC-T의 배양액은 타이로시네이즈 활성을 억제하여 멜라닌 합성을 감소시키므로, 미백 효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다. Thus, the culture medium of the ADSC-T of the present invention to inhibit tyrosinase activity when as a tie because it reduces the synthesis of melanin, it was confirmed that the whitening effect can be represented.

[실시예 3] ADSC-T 세포 배양액의 DPPH 에세이를 이용한 항산화 효과 검증 Example 3 Antioxidative effect verification using the DPPH assay of ADSC-T cell culture

(1) 줄기세포 배양액의 항산화효과는 DPPH(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl) 라디칼 소거능으로 확인하였으며 에탄올에 0.13mM DPPH(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl,sigma-Aldrich)용액을 제조하여 0.13mM DPPH와 시료를 1:1의 중량비로 혼합시켜 암실에서 10분, 20분간 반응시킨 후 515nm에서 흡광도 감소를 확인하였다. (1) Antioxidant effects of stem cell culture is DPPH (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl) radical scavenging activity was confirmed by preparing a 0.13mM DPPH (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl, sigma-Aldrich) solution in ethanol 0.13mM by the DPPH with the sample 1 were mixed in a weight ratio of 1 was confirmed for 10 minutes for 20 minutes after which the reaction decreases absorbance at 515nm in a dark room.

DPPH radical scavenging activity(%)= = DPPH radical scavenging activity (%)

Figure 112013034458079-pat00001
X 100 X 100

Figure 112013034458079-pat00002
: 무처리군 : Untreated group

Figure 112013034458079-pat00003
: 처리군 : Treatment group

(2) 줄기세포배양액의 항산화 효과를 확인하기 위해서 DPPH 어세이(DPPH assay)를 사용하여 알아보았다. (2) examined using the DPPH assay (DPPH assay) to determine the antioxidant activity of a stem cell culture. DPPH는 그 자체가 매우 안정한 자유 라디칼로서 515nm에서 광흡수를 나타내는 보라색 화합물이다. DPPH is a purple compound showing an optical absorption at 515nm as a very stable free radicals itself. 양성자 라디칼 스캐빈저(Proton-radical scavenger)에 의해 탈색되어 노란색으로 변하여 육안으로 관찰이 가능하다. Are discolored by the proton-radical scavengers (Proton-radical scavenger) changed to yellow can be observed with the naked eye. 0.13mM DPPH용액을 제조한 후 ADSC-T 세포배양액을 처리하였을 때 흡광도 감소를 알아보았다. After preparing a solution 0.13mM DPPH when handling the ADSC-T cell cultures were examined in a decrease absorbance. ADSC-T배양액은 0.13mM DPPH 용액과 1:1 중량비로 섞어주어 10분, 20분간 암실에서 반응시켜 515nm에서 흡광도 감소를 확인하였다. ADSC-T culture medium is 0.13mM DPPH solution in a 1: 1 were reacted and mixed in a weight ratio of from 10 minutes to 20 minutes and a dark room was found to reduce the absorbance at 515nm. 줄기세포배양액은 DMEM배지에서 생산하는데 DMEM 배지속에는 항산화 작용을 하는 비타민 E가 첨가되어있어 DPPH 라디칼을 소거할 것이라 예상되어 이와 비교하여 실험을 하였다. Stem cell culture medium is DMEM medium to produce ln in DMEM medium has become a vitamin E is added to the antioxidant action is expected to clear the DPPH radical was experiments compared this way. 상기 결과를 도 14에 나타내었다. It is shown in Figure 14 for the results.

도 14에 나타낸 바와 같이, DMEM 배지자체에 의해서도 DPPH 라디칼을 소거하나 배지첨가 후 20분후에는 소거활성이 감소하였다. 14, 20 minutes after the addition of a medium to the DPPH radical scavenging by the DMEM medium itself is decreased by the scavenging. 이는 배지속의 DPPH 라디칼 소거물질의 양이 미미하다고 볼 수 있다. It can be seen that the minimal amount of DPPH radical scavenging material in the medium. ADSC-T 배양액의 경우에는 10분 경과 후의 반응부터 DMEM배지보다 소거능이 크며, 20분 동안 반응시켰을 때에는 소거능이 더욱 증가하였으며 DMEM과 비교하여 약 2배 정도 DPPH 라디칼을 저해하였다. For T-ADSC culture is large and the scavenging effect than the DMEM culture medium from the reaction after 10 minutes, when reacted for 20 minutes, this was further increased scavenging DPPH radical was inhibited by about twice as compared with DMEM.

따라서, 본 발명의 ADSC-T의 배양액은 현저한 항산화 효과 를 보인다는 것을 확인하였다. Thus, the culture medium of the ADSC-T of the present invention, it was confirmed that shows a significant antioxidant effect.

이하 본 발명의 약학적 조성물, 식품 조성물 및 화장품 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명을 한정하고자함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다 . Hereinafter pharmaceutical composition of the present invention, one example describes the preparation of a food composition and a cosmetic composition, is only intended to describe in detail, not intended to limit the invention.

제제예 1. 약학적 제제의 제조 Formulation Example 1: Preparation of pharmaceutical preparations

1-1. 1-1. 산제의 제조 Preparation of powder

ADSC-T 세포의 배양액 20 mg Culture of T-ADSC cells 20 mg

유당 100 mg Lactose 100 mg

탈크 10 mg Talc 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에충진하여산제를 제조한다. By mixing the above components and filled in airtight to prepare a powder.

1-2. 1-2. 정제의 제조 Preparation of tablets

ADSC-T 세포의 배양액 10 mg Culture of T-ADSC cells 10 mg

옥수수전분 100 mg 100 mg Corn starch

유당 100 mg Lactose 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg 2 mg of magnesium stearate

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다. After mixing the ingredients of the tablets prepared according to the method of manufacturing the appointed other conventional purification.

1-3. 1-3. 캡슐제의 제조 Preparation of capsules

ADSC-T 세포의 배양액 10 mg Culture of T-ADSC cells 10 mg

결정성 셀룰로오스 3 mg Crystalline cellulose 3 mg

락토오스 14.8 mg Lactose 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 0.2 mg Magnesium stearate 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다. According to a conventional capsule production method of mixing the components above and filled in a gelatin capsule to prepare a capsule.

1-4. 1-4. 주사제의 제조 Preparation of injection

ADSC-T 세포의 배양액 10 mg Culture of T-ADSC cells 10 mg

만니톨 180 mg Mannitol 180 mg

주사용 멸균 증류수 2974 mg Injectable sterile distilled water 2974 mg

Na 2 HPO 4? Na 2 HPO 4? 2H 2 O 26 mg 2H 2 O 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당 (2 ml) 상기의 성분 함량으로 제조한다. 1 per ampoule (2 ml) according to the conventional method for preparing injections are prepared as components the amount of the.

1-5. 1-5. 액제의 제조 Preparation of the solution

ADSC-T 세포의 배양액 20 mg Culture of T-ADSC cells 20 mg

이성화당 10 g 10 g per isomerization

만니톨 5 g Mannitol 5 g

정제수 적량 Purified water q.s.

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ml로 조절한 후 갈색병에충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다. One according to the conventional method for preparing liquid preparation dissolved was added to the respective components in purified water was added an appropriate amount of lemon flavor, and then mix the above components is added and then purified water to adjust the total added to purified water to total 100 ml and then to fill in a brown bottle sterilization was to prepare a solution.

제제예 2. 식품 제제의 제조 Preparation Example 2. Preparation of food preparations

2-1. 2-1. 건강식품의 제조 Manufacturing of Health Food

ADSC-T 세포의 배양액 100 mg Culture of T-ADSC cells 100 mg

비타민 혼합물 적량 Vitamin mixture proper quantity

비타민 A 아세테이트 70 μg Vitamin A acetate 70 μg

비타민 E 1.0 mg Vitamin E 1.0 mg

비타민 B1 0.13 mg Vitamin B1 0.13 mg

비타민 B2 0.15 mg Vitamin B2 0.15 mg

비타민 B6 0.5 mg Vitamin B6 0.5 mg

비타민 B12 0.2 μg Vitamin B12 0.2 μg

비타민 C 10 mg Vitamin C 10 mg

비오틴 10 μg Biotin 10 μg

니코틴산아미드 1.7 mg 1.7 mg nicotinamide

엽산 50 μg 50 μg of folic acid

판토텐산 칼슘 0.5 mg Calcium pantothenate 0.5 mg

무기질 혼합물 적량 Mineral mixture suitable amount

황산제1철 1.75 mg Ferrous sulfate 1.75 mg

산화아연 0.82 mg 0.82 mg zinc oxide

탄산마그네슘 25.3 mg 25.3 mg Magnesium carbonate

제1인산칼륨 15 mg No. 1 15 mg potassium phosphate

제2인산칼슘 55 mg No. 2 55 mg Calcium Phosphate

구연산칼륨 90 mg Potassium citrate 90 mg

탄산칼슘 100 mg 100 mg calcium carbonate

염화마그네슘 24.8 mg 24.8 mg Magnesium chloride

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다. The composition ratio of the vitamin and mineral mixtures are however the composition mixed in embodiments preferred for the appropriate component to the relatively healthy foods example, and Fig. Mubang carried transform the mixing ratio optionally, a mixture of the above components according to a conventional method of health food producing and then , to prepare a granule, and may be used in the production of health food composition according to a conventional method.

2-2. 2-2. 건강음료의 제조 Preparation of health drink

ADSC-T 세포의 배양액 100 mg Culture of T-ADSC cells 100 mg

비타민 C 15 g Vitamin C 15 g

비타민 E(분말) 100 g Vitamin E (powdered) 100 g

젖산철 19.75 g Iron lactate 19.75 g

산화아연 3.5 g Zinc oxide 3.5 g

니코틴산아미드 3.5 g Nicotinamide 3.5 g

비타민 A 0.2 g Vitamin A 0.2 g

비타민 B1 0.25 g Vitamin B1 0.25 g

비타민 B2 0.3g Vitamin B2 0.3g

물 정량 Water Determination

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85 ℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 l 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다. A mixture of components of the in accordance with a conventional health beverage preparation method, and then, approximately one was heated and stirred at 85 ℃ for a time, after sterilization and sealed obtained in 2 l vessel and filtered to sterilize the created solution is stored in a refrigerator, and then the use in the manufacture composition for health beverages of the invention.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다. The composition ratio but may also be relatively Although the suitable components for beverages to a preferred embodiment variant the mixing ratio optionally mixed composition according to regional and national symbols including Layer demand or demand country, use purpose embodiment.

제제예 3 : 화장료 제제의 제조 Formulation Example 3: Preparation of cosmetic formulations

1. 유연 화장수 1. Flexible lotion

ADSC-T 세포의 배양액 0.5 중량% ADSC-culture of T cells of 0.5% by weight

글리세린 5.0 중량% Glycerol 5.0% by weight

1,3-부틸렌글리콜 3.0 중량% 1,3-butylene glycol 3.0% by weight

에탄올 5.0 중량% Ethanol 5.0% by weight

폴리옥시에틸렌노닐페닐에테르 0.5 중량% 0.5% by weight Polyoxyethylene nonyl phenyl ether

향료 적량 Perfume q.s.

방부제 적량 Antiseptic proper

정제수 잔량 Purified water balance

2. 수렴 화장수 2. Convergence lotion

ADSC-T 세포의 배양액 0.5 중량% ADSC-culture of T cells of 0.5% by weight

글리세린 3.0 중량% Glycerin 3.0%

구연산 0.1 중량% Citric acid 0.1% by weight

에탄올 10.0 중량% Ethanol 10.0% by weight

폴리옥시에틸렌올레일에테르 1.0 중량% 1.0% by weight of polyoxyethylene oleyl ether

소르비톨 2.0 중량% Sorbitol 2.0% by weight

향료 적량 Perfume q.s.

방부제 적량 Antiseptic proper

정제수 잔량 Purified water balance

3. 로션(에멀젼) 3. lotion (emulsion)

ADSC-T 세포의 배양액 0.5 중량% ADSC-culture of T cells of 0.5% by weight

글리세린 3.0 중량% Glycerin 3.0%

1,3-부틸렌글리콜 8.0 중량% 1,3-butylene glycol 8.0% by weight

스쿠알란 10.0 중량% Squalane 10.0% by weight

모노올레인산폴리옥시에틸렌소르비탄 2.0 중량% Mono oleic acid polyoxyethylene sorbitan 2.0% by weight

트리에탄올아민 1.5 중량% Triethanolamine 1.5% by weight

글리세릴스테아레이트 0.5 중량% 0.5% by weight of glyceryl stearate

스테아릴글리시레티네이트 0.2 중량% Stearyl glycidyl retina carbonate 0.2% by weight

카르복시비닐폴리머 0.1 중량% Carboxyvinyl polymer 0.1% by weight

아르기닌 0.1 중량% Arginine, 0.1% by weight

향료 적량 Perfume q.s.

방부제 적량 Antiseptic proper

정제수 잔량 Purified water balance

4. 크림 4. Cream

ADSC-T 세포의 배양액 0.5 중량% ADSC-culture of T cells of 0.5% by weight

글리세린 3.0 중량% Glycerin 3.0%

스테아린산 8.0 중량% Stearic acid 8.0% by weight

스쿠알란 5.0 중량% Squalane 5.0% by weight

자기유화형 모노스테아린산 글리세린 2.5 중량% A self-emulsifiable glycerin monostearate 2.5% by weight

모노스테아린산 폴리옥시에틸렌 소르비탄 1.5 중량% Monostearate 1.5% by weight of polyoxyethylene sorbitan

프로필렌 글리콜 4.0 중량% Propylene glycol 4.0% by weight

스테아릴글리시레티네이트 0.2 중량% Stearyl glycidyl retina carbonate 0.2% by weight

바셀린 2.0 중량% Vaseline 2.0% by weight

산화방지제 적량 Antioxidant q.s.

향료 적량 Perfume q.s.

방부제 적량 Antiseptic proper

정제수 잔량 Purified water balance

Claims (10)

  1. 지방유래줄기세포에 T항원을 도입한 ADSC-T 세포(adipose-derived stem cell-T cell)의 배양액을 유효성분으로 포함하는, 피부재생 개선용 화장료 조성물. The introduction of the T antigen in the adipose derived stem cells, T-ADSC cells (adipose-derived stem cell-T cell) culture of, a cosmetic composition for improving skin regeneration comprising, as an active ingredient.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 T항원은 시미안 바이러스40(SV40)으로부터 유래한 것을 특징으로 하는, 피부재생 개선용 화장료 조성물. The method of claim 1, wherein the T antigen is a simian virus 40 (SV40), improved cosmetic composition for skin regeneration, characterized in that derived from.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 ADSC-T세포의 배양액은 The method of claim 1, wherein the ADSC-culture of T cells,
    (a) 흡입지방조직에 콜라게나아제 효소를 처리한 후 원심분리하여 지방유래 줄기세포를 분리하여 배양하는 단계; (A) separating after processing the collagenase enzyme in adipose tissue suction centrifugal separating cultured adipose derived stem cells;
    (b) 플라스미드 발현 벡터(pEF321β-T)를 상기 (a) 단계에서 배양한 지방유래 줄기세포에 형질 감염시켜 SV40 T 항원을 발현하는 ADSC-T세포를 제조하는 단계; (B) preparing an ADSC-T cells expressing the SV40 T antigen by transfection of plasmid expression vectors (pEF321β-T) in the (a) a fat-derived stem cells cultured in the step; And
    (c) 상기 제조된 ADSC-T를 배양하여 배양액을 수득하는 단계;를 포함하여 제조되는 것을 특징으로 하는, 피부재생 개선용 화장료 조성물. (C) the production of a T-ADSC cultured to obtain a culture fluid; cosmetic composition, characterized in, that improve skin regeneration is made, including.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 (b) 단계의 형질감염은 인산화칼슘 형질감염, 전기천공법, 미세주입법 및 리포솜 주입법으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 방법으로 수행하는 것을 특징으로 하는, 피부재생 개선용 화장료 조성물. 4. The method of claim 3, for the transfection in step (b) is characterized in that for performing the first method at least one selected from the group consisting of phosphorylation, calcium transfection, electroporation, microinjection and liposome injection, improved skin regeneration A cosmetic composition.
  5. 지방유래줄기세포에 T항원을 도입한 ADSC-T 세포(adipose-derived stem cell-T cell)의 배양액을 유효성분으로 포함하는, 피부재생 개선용 식품 조성물. Fat derived from the introduction of the T antigen to the T cell-ADSC stem cells (adipose-derived stem cell-T cell) culture of, a food composition for improving skin regeneration comprising, as an active ingredient.
  6. 지방유래줄기세포에 T항원을 도입한 ADSC-T 세포(adipose-derived stem cell-T cell)의 배양액을 유효성분으로 포함하는, 미백용 화장료 조성물. The introduction of the T antigen in the adipose derived stem cells, T-ADSC cells (adipose-derived stem cell-T cell), whitening cosmetic composition comprising a culture medium as an active ingredient.
  7. 지방유래줄기세포에 T항원을 도입한 ADSC-T 세포(adipose-derived stem cell-T cell)의 배양액을 유효성분으로 포함하는, 미백용 식품 조성물. The introduction of the T antigen in the adipose derived stem cells, T-ADSC cells (adipose-derived stem cell-T cell) culture of, a food composition for whitening which contains as an active ingredient.
  8. 지방유래줄기세포에 T항원을 도입한 ADSC-T 세포(adipose-derived stem cell-T cell)의 배양액을 유효성분으로 포함하는, 항노화용 화장료 조성물. The fat-derived stem cells, comprising the culture of T-ADSC cells (adipose-derived stem cell-T cell) incorporating the T antigen as an active ingredient, wherein nohwayong cosmetic composition.
  9. 지방유래줄기세포에 T항원을 도입한 ADSC-T 세포(adipose-derived stem cell-T cell)의 배양액을 유효성분으로 포함하는, 항노화용 식품 조성물. The fat-derived stem cells, comprising the culture of T-ADSC cells (adipose-derived stem cell-T cell) incorporating the T antigen as an active ingredient, wherein nohwayong food composition.
  10. 지방유래줄기세포에 T항원을 도입한 ADSC-T 세포(adipose-derived stem cell-T cell)의 배양액을 유효성분으로 포함하는, 상처치료용 약학적 조성물. Containing a culture of T-ADSC cells (adipose-derived stem cell-T cell) incorporating the T antigen in fat-derived stem cells as an active ingredient, wound healing pharmaceutical composition.






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KR20130021793A (en) * 2011-08-24 2013-03-06 인타글리오주식회사 Cosmetic composition comprising nano capsule or nanofiber containing cultured medium of adipose-derived adult stem cells and manufacturing method thereof

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Title
서미정, Hair growth promoting effect of culture medium of primary and immortalized Adipose-Derived Stem Cells, 이학석사학위논문, 창원대학교, 2011년 6월 *
서미정, Hair growth promoting effect of culture medium of primary and immortalized Adipose-Derived Stem Cells, 이학석사학위논문, 창원대학교, 2011년 6월*

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