RU2799054C1 - Способ определения противовоспалительной активности биомедицинского клеточного продукта на основе мезенхимальных клеток - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии. Представлен способ оценки противовоспалительной активности биомедицинского клеточного продукта на основе мезенхимальных стромальных клеток костного мозга путем исследования содержания в крови цитокинов, а именно фактора некроза опухоли-альфа (TNF-α). Способ включает в себя определение концентрации TNF-α в сыворотке периферической крови до и после введения МСК костного мозга на фоне асептического воспаления. Изобретение обеспечивает быструю и точную диагностику снижения интенсивности асептического воспалительного процесса после использования БМКП, отражая эффективность применения конкретного клеточного продукта и достаточность введенной дозы. 1 табл., 1 пр.

Description

Изобретение относится к области медицины, конкретно к способу оценки противовоспалительной активности биомедицинского клеточного продукта (БМКП) на основе мезенхимальных стромальных клеток (МСК) костного мозга путем исследования содержания в крови цитокинов, а именно фактора некроза опухоли-альфа (англ. tumor necrosis factor alpha, TNF-α). Способ включает в себя определение концентрации TNF-α в крови до и после введения БМКП на фоне асептического воспаления. Он обеспечивает быструю и точную диагностику подавления асептического воспалительного процесса в результате терапии и является примером оценки эффективности применения конкретного клеточного продукта.

Изобретение относится к области медицины, а именно к лабораторной диагностике, основанной на определении содержания в крови провоспалительного цитокина (TNF-α) методом иммуноферментного анализа (ИФА).

Цель изобретения - разработать способ определения противовоспалительной активности БМКП на основе МСК костного мозга.

Биомедицинские клеточные продукты - новая группа препаратов, представляющих собой клеточные линии различного происхождения, используемые для профилактики и лечения широкого спектра заболеваний, в том числе для подавления иммунного конфликта при аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток и тяжелых аутоиммунных процессах [1, 2].

Одной из таких клеточных линий являются МСК. Клетки данной группы получают из различных органов и тканей, но наиболее перспективными источниками считаются костный мозг и жировая ткань. Используемые в качестве БМКП клетки должны быть жизнеспособны и функционально активны. Известно, что МСК способны влиять на функции иммунокомпетентных клеток, используя ряд механизмов, позволяющих ускользать от иммунного ответа реципиента при введении в организм. Они модифицируют функции элементов системы врожденного иммунитета таким образом, что обеспечивают свою защиту от повреждающего действия этих факторов. МСК подавляют пролиферацию, экспрессию рецепторов и эффекторные функции натуральных киллеров, ингибируют окислительный взрыв нейтрофилов, изменяют характер продукции цитокинов и иных медиаторов воспаления [3, 4]. Установлено, что МСК участвуют в регуляции иммунного ответа, негативно влияя на созревание дендритных клеток и дифференцировку Т-лимфоцитов [5]. Таким образом, для оценки эффекта от применения БМКП, содержащего МСК, необходим показатель, отражающий характер ответа со стороны иммунной системы. Учитывая, что TNF-α играет важнейшую роль в развитии воспалительного процесса, возможна оценка динамики его содержания при использовании в качестве маркера ответа на лечение препаратами МСК.

Известен способ оценки воспалительного процесса по тесту прямого повреждения нейтрофилов и определению концентрации циркулирующих иммунных комплексов после создания экспериментального асептического воспаления у лабораторных животных с использованием скипидара и вазелинового масла [6]. Однако эти методики дают возможность анализировать только отдельные звенья иммунного ответа, не демонстрируя полной картины.

Другой способ позволяет оценить течение воспалительного процесса по уровню лейкоцитов крови в разные временные периоды. Его реализация включает моделирование асептического воспаления путем введения подопытным животным скипидара и вазелинового масла с последующим визуальным наблюдением места инъекции (отек тканей с очагами некроза).

Опубликованные данные свидетельствуют об изменении числа лейкоцитов крови на разных этапах воспалительного процесса [7].

Наиболее близким к изобретению является способ оценки эффективности лечения воспалительных заболеваний кишечника с применением МСК. Он заключается в исследовании динамики численного состава субпопуляций Т- и В-лимфоцитов до и после введения БМКП. При содержании в периферической крови аутореактивного клона В1 лимфоцитов (0,013-0,027)×10⁹/л, CD3+CD4+CD38+(0,12-0,22)×10⁹/л, CD3+CD8+CD38+(0,057-0,073)×10⁹/л, значении иммунорегуляторного индекса 1,35-1,43, эффективность терапии воспалительных заболеваний кишечника с применением МСК оценивают как удовлетворительную [8]. Однако данный способ позволяет охарактеризовать только клеточное звено иммунитета и технически сложен, т.к. требует наличия проточного цитофлуориметра и навыков его использования.

Исследование содержания TNF-α в сыворотке крови методом ИФА позволяет в полной мере оценить эффективность применяемого БМКП на основе МСК, достаточность введенной дозы клеток и необходимость повторного назначения препарата для купирования воспалительного процесса.

Техническим результатом заявляемого изобретения является создание способа оценки противовоспалительной активности БМКП на основе МСК костного мозга, который включает в себя определение концентрации цитокина TNF-α в сыворотке периферической крови методом ИФА до и после введения МСК на фоне асептического воспаления. Его прикладное значение заключается в возможности определения функциональной активности, эффективности введенного клеточного продукта и достаточности применяемой дозы. В соответствии с прототипом, успешное применение МСК при асептическом воспалении (например, при возникновении реакции «трансплантат против хозяина») должно снижать уровень провоспалительного цитокина TNF-α в крови не менее 50% от значения до введения БМКП.

Способ доступен для выполнения в большинстве лабораторий, оснащенных стандартным оборудованием для ИФА, не требует использования технически сложных методик, обеспечивает быстрое получение результата и точную оценку эффективности применения конкретного клеточного продукта.

В процессе проведения патентно-информационного поиска не выявлено источников, порочащих новизну предлагаемого изобретения.

Заявляемое изобретение разработано в лаборатории клеточных технологий, лаборатории клеточной и молекулярной иммунологии, отделе обеспечения качества ФГБУН КНИИГиПК ФМБА России в соответствии с планом научно-исследовательской работы.

ПРИМЕР ИСПОЛЬЗОВАНИЯ СРЕДСТВА

Способ реализован следующим образом. Объектом исследования служили МСК костного мозга белых мышей, полученные в результате культивирования. Для проведения эксперимента использовали самцов лабораторных нелинейных мышей (n=41) в возрасте 6 мес.массой 19-21 г. Испытания выполнены на базе лаборатории клеточных технологий, лаборатории клеточной и молекулярной иммунологии, отдела обеспечения качества ФГБУН КНИИГиПК ФМБА России в соответствии с международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных. Для исследования отобраны здоровые особи надлежащего вида, имевшие свободный доступ к свежей воде и пище. [9].

С целью выделения МСК после умерщвления животного извлекали обе бедренные кости, удаляли эпифизы и вымывали костный мозг во флакон с полной питательной средой, содержащей следующие компоненты: среду αМЕМ (StemCells), эмбриональную телячью сыворотку (20%), гепарин (Sigma, 2 Ед/мл), L-глутамин 2 мМ (StemCells). Дальнейшее культивирование осуществляли в CO₂-инкубаторе Sanyo-5AC в стандартных условиях (5% углекислого газа, температура 37°С). Полную замену среды производили каждые 4-5 сут. После формирования конфлюэнтного монослоя клетки открепляли 0,25% раствором «Трипсин-ЭДТА», затем ингибировали действие фермента, добавляя избыток полной питательной среды. Количество жизнеспособных МСК подсчитывали в камере Горяева с использованием красителя трипанового синего, после чего "выполняли пересев в культуральные флаконы из расчета 1500 мезенхимальных клеток/см². Оставшиеся клетки замораживали с раствором диметилсульфоксида в конечной концентрации 10% для дальнейшего использования.

В эксперименте лабораторных мышей разделили на 4 группы. Первая группа мышей - контрольная, включала интактных животных (6 мышей). Остальные группы были экспериментальными. Подопытным особям второй (5 мышей), третьей (20 мышей) и четвертой (10 мышей) индуцировали асептическое воспаление путем подкожного введения смеси из 0,1 мл скипидара и 0,1 мл вазелинового масла. Третья и четвертая группы мышей на фоне воспалительного процесса получили соответственно однократное (на 6 сутки после индукции воспаления) либо двукратное (на 5,6 сутки) введение БМКП, содержащего МСК, в хвостовую вену в дозе 0,06×10⁶ клеток на 1 мышь. В течение эксперимента проводили ежедневный визуальный контроль состояния подопытных особей. На 7 сутки животных умерщвляли, собирали кровь в пробирки типа Эппендорф и отделяли сыворотку путем центрифугирования при комнатной температуре +22°С на скорости 3000 об/мин в течение 20 минут с использованием центрифуги MultiSpin MSC-3000.

Измерение уровня TNF-α проводили методом ИФА с использованием набора реагентов TNF alpha Mouse ELISA Kit (Thermo Fisher Scientific, США).

Полученные результаты представлены в таблице в виде медианы (Me) и интерквартального интервала 25-75 процентилей (Q_0,25-Q_0,75). Для определения различий использовали критерий Манна-Уитни. Различия считали достоверными при р<0,05.

Обнаружено, что на фоне индукции асептического воспаления содержание TNF-α в сыворотке крови мышей значительно превышало границы референсных значений. После введения БМКП, содержащего МСК, выявлено снижение концентрации указанного провоспалительного цитокина. Следует отметить, что в группе с однократным введением МСК только у 20% мышей уровень TNF-α был сопоставим с показателями контрольной интактной группы, тогда как при двукратной инъекции - у 40%.

Обнаруженные различия между показателями в исследуемых группах лабораторных животных свидетельствуют о целесообразности использования уровня TNF-α в качестве маркера противовоспалительной активности БМКП на основе МСК. Таким образом, предлагаемый способ удобен для клинического использования и может быть применен в практике для определения противовоспалительной активности МСК с целью оценки эффективности введенного клеточного продукта.

Список литературы

1. Рачинская О.А., Меркулов В.А. Применение методов цитогенетического анализа при оценке качества клеточных линий в составе биомедицинских клеточных продуктов // БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. - 2018. - Т. 18. - №. 1. - С. 25-32.

2. Владимирская Е.Б. Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) в клеточной терапии // Онкогематология. - 2007. - №. 1. - С. 4-16.

3. Климович В.Б. Иммуномодулирующая активность мезенхимальных стромальных (стволовых) клеток // Медицинская иммунология. - 2014. - Т. 16, №.2. - С. 107-126.

4. Human mesenchymal stem cells inhibit neutrophil apoptosis: a model for neutrophil preservation in the bone marrow niche / Raffaghello L., Bianchi G., Bertolotto M. [et al.]. // Stem Cells. - 2008. - Vol. 26. - P. 151-162.

5. Mesenchymal stem cells inhibit the differentiation of dendritic cells through an interleukin-6-dependent mechanism / Djouad F., Charbonnier L.M., Bouffi C. [et al.]. // Stem Cells. - 2007. - Vol. 25. - P. 2025-2032.

6. Балабекова M.К. Состояние иммунного статуса интактных крыс с асептическим воспалением (экспериментальное исследование) // Вестник Казахского Национального медицинского университета. - 2010. - №. 5 (часть 3). - С. 278-281.

7. Динамика течения воспаления, вызванного на фоне металлиндуцированной иммунодепрессии / Балабекова М.К., Рыспекова Н.Н., Жукешева М.К. [и др.]. // Современные проблемы науки и образования. - 2015. - №6. (URL: https://science-education.ru/ru/article/view?id=23780).

8. Способ оценки эффективности лечения мезенхимальными стромальными клетками воспалительных заболеваний кишечника: пат. 2463596 Рос. Федерация: МПК G01N 33/49 / Князев О.В.; заявитель и патентообладатель Князев О.В., Лазебник Л.Б., Коноплянников А.Г. и др. - №2011116520/15; заявл. 26.04.2011; опубл. 10.10.2012. - 8 с.

9. Гоглова, О.О. Этика работы с экспериментальными животными / Гоглова О.О., Богомолов А.Ф. // Медицинское право и этика. - 2003 - №4. - С. 4-6.

10. Европейская Конвенция о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (Страсбург, 18 марта 1986 г.)

Claims (1)

1. Способ определения противовоспалительной активности биомедицинского клеточного продукта на основе мезенхимальных клеток костного мозга путем оценки уровня фактора некроза опухоли альфа (TNF-α) в сыворотке крови, включающий в себя определение TNF-α методом иммуноферментного анализа до и после введения продукта, отличающийся тем, что анализируется динамика содержания указанного провоспалительного цитокина как комплексный показатель ослабления интенсивности воспалительного процесса, в качестве показателя эффективности лечения принято снижение уровня TNF-α не менее чем на 50% от исходного.