RU2790193C1 - Способ прогнозирования энтеральной недостаточности при перитоните - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области медицины, ветеринарии и биологии и касается прогнозирования энтеральной недостаточности при перитоните. Осуществляют забор образца ткани кишечника и его иммуноморфологическое окрашивание, для этого образец фиксируют, заливают в парафин, изготавливают срезы, проводят их депарафинизацию и демаскирование антигенов. После чего срезы инкубируют с антителами к OxPhos Complex IV subunit I в разведении 1:200 во влажной камере при температуре 25°С и длительности инкубации 60 минут, затем обрабатывают проявляющим агентом Alexa fluor 568 goat anti-mouse IgG. При наличии окраски энтероцитов прогноз исхода энтеральной недостаточности считают благоприятным, а при ее отсутствии - неблагоприятным. Предлагаемый способ обеспечивает возможность прогнозирования исхода энтеральной недостаточности как в условиях эксперимента, так и в клинических условиях. 8 ил., 1 табл., 3 пр.

Description

Предлагаемое изобретение относится к области медицины, ветеринарии и биологии.

Известно, что перитонит до настоящего времени является одним из наиболее опасных осложнений острых хирургических заболеваний живота. Несмотря на интенсивную терапию, летальность среди больных остается недопустимо высокой и достигает 30-60% (Чепурных Е.Е., Шурыгина И.А., Шаульская Е.С., Шурыгин М.Г. Роль цитокинов в патогенезе развития распространенного гнойного перитонита // Бюллетень Восточно-Сибирского научного центра Сибирского отделения Российской академии медицинских наук. 2016. Т. 1. №4 (110). С. 177-182). Одной из основных причин, влияющих на течение заболевания и исход у больных с распространенным перитонитом, остается развивающийся в раннем послеоперационном периоде синдром энтеральной недостаточности (Топчиев М.А., Паршин Д.С., Кчибеков Э.А., Бирюков П.А., Мисриханов М.К. Дифференцированный подход к анти-гипоксической и эндопортальной терапии в лечении разлитого перитонита, осложненного синдромом энтеральной недостаточности // Медицинский вестник Северного Кавказа. 2018. Т. 13. №4. С. 619-623. DOI: 10.14300/mnnc.2018.13120).

В норме неповрежденная слизистая оболочка кишечника обеспечивает барьер для предотвращения перемещения внутрипросветных бактерий и токсинов в брюшную полость и системный кровоток. При перитоните воспалительные изменения в кишечной стенке и ишемия/гипоксия слизистой оболочки кишечника нарушают эту функцию (Кенарская М.В., Иванов С.А., Корымасов Е.А. Лечение энтеральной недостаточности у пациентов с распространенным перитонитом // Наука и инновации в медицине. 2018. Т. 3. №4. С. 31-35. DOI: 10.35693/2500-1388-2018-0-4-31-35). Нарушение целостности энтерогематического барьера приводит к повышенной проницаемости слизистой оболочки кишечника с развитием транслокации эндотоксинов и бактерий в систему гемо- и лимфоциркуляции (Дремина Н.Н., Чепурных Е.Е., Фадеева Т.В., Шурыгина И.А. Бактериальная транслокация при перитоните // Современные проблемы науки и образования. 2018. №6. С. 48.9), системному воспалительному ответу и, в конечном счете, синдрому полиорганной дисфункции (Косинец В.А. Синдром энтеральной недостаточности: патогенез, современные принципы диагностики и лечения // Новости хирургии. 2008. Т. 16. №2. С. 130-138).

К сожалению, на настоящий момент отсутствуют общепринятые методы, основанные на трактовке морфологических признаков, для прогнозирования течения энтеральной недостаточности.

Известен способ оценки степени повреждения стенки кишки при перитоните с помощью шкалы Chiu C.J. et al., разработанной авторами для оценки состояния кишечника в условиях гипоперфузии (Chiu C.J., McArdle А.Н., Brown R., Scott H.J., Gurd F.N. Intestinal mucosal lesion in low-flow states. I. A morphological, hemodynamic, and metabolic reappraisal. Arch. Surg. 1970. vol. 101. no 4. P. 478-483. DOI: 10.1001/archsurg.l970.01340280030009).

В этом способе выделяют следующие степени повреждения слизистой тонкой кишки, являющиеся морфологическим эквивалентом энтеральной недостаточности:

Степень 0 - нормальные ворсинки.

Степень 1 - развитие субэпителиального пространства Грюнхагена, обычно на вершине ворсинки; часто со скоплением капилляров.

Степень 2 - расширение субэпителиального пространства с умеренным подъемом эпителиального слоя на собственной пластинке.

Степень 3 - массивный эпителиальный подъем по бокам ворсин. Несколько участков могут быть оголены.

Степень 4 - оголенные ворсинки с собственной пластинкой и раскрытыми расширенными капиллярами. Можно отметить увеличение клеточности собственной пластинки.

Степень 5 - аутолиз и распад собственной пластинки; кровоизлияние и изъязвление.

Недостатком этого способа оценки степени повреждения стенки кишки при перитоните является то, что использование его на практике проблематично в связи с тем, что невозможно однозначно определить одну степень повреждения при неоднородности морфологических изменений в разных отделах кишечной стенки (Шурыгина И.А., Чепурных Е.Е., Дремина Н.Н., Шурыгин М.Г. Разработка шкалы оценки выраженности энтеральной недостаточности// Современные проблемы науки и образования. 2021. №5. С. 95).

Кроме этого к недостаткам шкалы Chiu С.J. et al. следует отнести и то, что в оценке отсутствуют критерии, указывающие на дальнейшее течение патологического процесса и его исход.

Наиболее близким к предлагаемому является способ прогнозирования энтеральной недостаточности при остром перитоните в эксперименте, включающий взятие образца из зоны повреждения и его исследование.

Известный способ осуществляют следующим образом. Ежедневно, начиная с первых суток после оперативного лечения в объеме санации брюшной полости, определяют содержание молекул средней массы и малонового диальдегида в локальном и организменном кровотоках. Определение проводят на фоне проводимой антибактериальной и инфузионной терапии. На основе показателей молекул в динамике, а также коэффициента перистальтики кишечника рассчитывают прогностический индекс энтеральной недостаточности по определенной формуле. Значения прогностического индекса энтеральной недостаточности менее 2,01 свидетельствуют о регрессе энтеральной недостаточности. Значения индекса от 2,02 до 3,21 определяют низкую степень вероятности прогрессирования энтеральной недостаточности. Значения индекса от 3,22 и более определяют высокую степень вероятности прогрессирования энтеральной недостаточности (Пат. 2580664, Российская Федерация, МПК А61В 10/00, G01N 33/52. Способ прогнозирования энтеральной недостаточности при остром перитоните в эксперименте, авторы / Власов А.П., Шибитов В.А., Трофимов В.А. и др., заявитель и патентообладатель: Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарева" - №2015108272/14; заявл. 10.03.2015; опубл. 10.04.2016; Бюл. №10).

Недостатком известного способа является то, что он не может быть осуществим в клинической практике в связи с необходимостью неоднократного забора крови из локального кровотока - брыжеечные вены.

Кроме этого известный способ достаточно сложен и трудоемок из-за неоднократного определения содержания молекул средней массы и малонового диальдегида в сыворотке крови, вследствие чего и не используется в рутинной клинической практике.

Задачей заявляемого изобретения является разработка способа прогнозирования энтеральной недостаточности при перитоните и при лечении острых хирургических заболеваний живота.

Техническим результатом предлагаемого способа является повышение его специфичности за счет выявления наличия окрашенных энтероцитов - ключевых функциональных компонентов кишечной стенки, а также упрощение и снижение его трудоемкости.

Технический результат достигается тем, что способ прогнозирования энтеральной недостаточности включает взятие образца из зоны повреждения и его исследование.

Отличительные приемы заявляемого способа заключаются в том, что берут образец ткани кишечника и проводят его иммуноморфологическое окрашивание. Для этого образец фиксируют, заливают в парафин, изготавливают срезы, проводят их депарафинизацию и демаскирование антигенов.

Отличительные приемы заявляемого способа заключаются и в том, что после демаскирования антигенов срезы инкубируют с антителами к OxPhos Complex IV subunit I в разведении 1:200 во влажной камере при температуре 25°С и длительности инкубации 60 минут.

Основное отличие предлагаемого способа заключается в том, что после инкубации срезы обрабатывают проявляющим агентом Alexa fluor 568 goat anti-mouse IgG и при наличии окраски энтероцитов прогноз исхода энтеральной недостаточности считают благоприятным, а при ее отсутствии - неблагоприятным.

Сопоставительный анализ заявляемого технического решения с прототипом позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию изобретения «новизна».

Заявляемый способ обеспечивает достижение усматриваемого заявителем технического результата, а именно по выявлению наличия или отсутствия окрашивания энтероцитов при исследовании гистологических препаратов осуществить специфически точный прогноз энтеральной недостаточности при перитоните и при лечении острых хирургических заболеваний живота.

Применение при иммуноморфологическом окрашивании гистологических препаратов в качестве первичных антител антител к OxPhos Complex IV subunit I позволило повысить специфичность заявляемого способа, оценить течение энтеральной недостаточности. Так авторами установлено, что наличие окраски в энтероцитах свидетельствует о благоприятном прогнозе исхода энтеральной недостаточности, а при отсутствии окраски - прогноз неблагоприятный.

Изучение единственного объекта - гистологических препаратов кишечника и отсутствие необходимости проведения многократных инвазивных процедур (забора крови из брыжеечных вен) в послеоперационном периоде позволило упростить предлагаемый способ прогнозирования и снизить его трудоемкость.

Преимуществом предлагаемого способа является также и то, что он позволяет прогнозировать энтеральную недостаточность, как в условиях эксперимента, так и в клинических условиях.

Изложенное позволяет сделать вывод о соответствии технического решения критерию «изобретательский уровень».

Способ, составляющий заявляемое изобретение, предназначен для использования в медицине и биологии. Возможность его осуществления подтверждена описанными в заявке приемами и средствами.

Вышеизложенное дает основание считать, что заявляемое техническое решение соответствует критерию изобретения «промышленная применимость».

Заявляемый способ прогнозирования энтеральной недостаточности при перитоните поясняется фигурами 1-8, на которых показаны гистологические срезы обработанных образцов ткани кишечника, свидетельствующие о возможности оценки тяжести повреждения энтероцитов при перитоните по изменению окраски энтероцитов.

На фигуре 1, позиция А показана яркая окраска (красный цвет) энтероцитов на Oxphos энтероцитов (увеличение 400х) у животного на 7 сутки эксперимента; повреждение энтероцитов 4 балла.

На фигуре 2, позиция В показано отсутствие окраски на Oxphos энтероцитов слизистой оболочки у животного на 14 сутки после моделирования перитонита при выраженности энтеральной недостаточности 4 балла, увеличение 400х.

На фигуре 3, показана гистологическая картина стенки кишки у больного А. на 19 сутки послеоперационного периода, рутинная окраска гематоксилином и эозином, ув. 40х, степень повреждения оценена в 4 балла.

На фигуре 4, позиция А показана яркая окраска (красный цвет) на Oxphos энтероцитов на 19 сутки послеоперационного периода у больного А., увеличение 100х.

На фигуре 5 показана гистологическая картина стенки кишки у больного А. на 24 сутки послеоперационного периода, рутинная окраска гематоксилином и эозином, увеличение 40х; степень повреждения оценена в 3 балла.

На фигуре 6 позиция В показано отсутствие окраски на Oxphos энтероцитов слизистой оболочки на 24 сутки у больного А., увеличение 100х.

На фигуре 7, позиция А показана яркая окраска (красный цвет) на Oxphos энтероцитов на 18 сутки послеоперационного периода у больного Б. (увеличение 100х).

На фигуре 8, позиция А показана яркая окраска (красный цвет) на Oxphos энтероцитов на 24 сутки послеоперационного периода у больного Б., увеличение 100х.

Заявляемый способ осуществляют следующим образом:

Образцы ткани кишечника фиксируют в растворе FineFIX (Milestone, Италия), после чего заливают в парафиновые блоки по общепринятой методике (Меркулов Г.А Курс патогистологической техники.- Л.: Медицина, 1969 - С. 13-15, 52-59). Затем готовят гистологические срезы толщиной 5 мкм и монтируют их на стекла, покрытые поли-L-лизином. Далее препараты депарафинируют в толуоле - 2 раза по 10 минут, затем последовательно в спиртах 100°, 96°, 90°, 70° по 3 минуты.

После чего препараты выдерживают 10 минут в дистиллированной воде, затем помещают в цитратный буфер (рН=6.0) и проводят обработку в микроволновой печи мощностью 800 W, которую нагревают при 100% мощности 8 минут, затем при 60% мощности 10 минут. Потом препараты охлаждают до 25°С в цитратном буфере и промывают в трис буфере (рН=7,6) 2 раза по 5 минут. Для фиксации месторасположения образца на стекле его обводят гидрофобным карандашом (Dako Pen (Dako, Code S2002). Далее на образец наносят Image-iT FX signal enhancer (Invitrogen. Cat. № I 36933, Lot 681688) и инкубируют его во влажной камере при температуре 25°С 30 минут. Промывают в трис буфере (рН=7,6) 2 раза по 5 минут. Затем наносят первые первичные антитела anti-OxPhos Complex IV subunit I monoclonal antibody (Invitrogen, Cat. № D 0589, Lot 459600), рабочее разведение 1:200 и инкубируют во влажной камере при температуре 25°С 60 минут, после чего промывают в трис буфере (рН=7,6) 2 раза по 5 минут. Далее наносят вторичные антитела Alexa fluor 568 goat anti-mouse IgG (H+L) (Invitrogen, Cat. № A-11031, Lot 822389), рабочее разведение 1:300 и инкубируют во влажной камере при температуре 25°С 30 минут, после чего промывают в трис буфере (рН=7,6) 2 раза по 5 минут и затем наносят Hoechst (Invitrogen, Cat. NH-3570), рабочее разведение 1:300, инкубируют 10 минут, промывают в трис буфере (рН=7,6) 2 раза по 5 минут, после чего заключают в Fluoromount (Diagnostic Biosystems, REF K024, Lot P 939-B). Готовый препарат оценивают при помощи микроскопа с флюоресцентным модулем и при наличии окраски энтероцитов прогноз исхода энтеральной недостаточности считают благоприятным, а при ее отсутствии - неблагоприятный прогноз.

Осуществление заявляемого способа поясняется примерами конкретного выполнения. Приведенные ниже примеры служат для иллюстрации, но не ограничивают данное изобретение.

Пример 1.

Лабораторным животным - крысам линии Wistar весом 220-250 г в возрасте 6 мес. проводили моделирование перитонита. Для этого выполняли лапаротомию, в рану выводили слепую кишку и в бессосудистой зоне области купола слепой кишки проводили разрез серозно-мышечной оболочки длиной до 1 см. Затем рану кишки ушивали непрерывным обвивным швом, после чего в брюшную полость вводили взвесь, содержащую по 0,5 мл 10⁹ микробных тел Е. coli и В. fragilis, после чего лапаротомную рану ушивали (Пат. 2716482, Российская Федерация, МПК G09B 23/28, А61В 17/00 Способ моделирования перитонита. Чепурных Е.Е., Шурыгина И.А., Фадеева Т.В., Григорьев Е.Г.; №2019109595, заявл. 01.04.2019, опубл. 11.03.2020. Бюл. №8).

В исследовании было использовано 18 животных.

На 3, 7 и 14 сутки после моделирования перитонита животных подвергали аутопсии. Кишечник фиксировали в растворе FineFIX (Milestone, Италия), заливали в парафин, срезы окрашивали гематоксилин-эозином. Степень энтеральной недостаточности оценивали по специальной шкале Chiu C.J. et al., 1970 (Chiu C.J., McArdle A.H., Brown R., Scott H.J., Gurd F.N. Intestinal mucosal lesion in low-flow states. I. A morphological, hemodynamic, and metabolic reappraisal// Arch Surg. 1970. V. 101, N 4. P. 478-483. DOI: 10.1001 /archsurg. 1970.01340280030009).

Исследования выполняли с соблюдением принципов, изложенных в Конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других целей (Страсбург, Франция, 1986), а также в соответствии с правилами гуманного обращения с животными, которые регламентированы «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г. №755).

Установлено, что у животных выраженность повреждения слизистой оболочки, являющаяся морфологическим эквивалентом энтеральной недостаточности, нарастала с достижением максимума к 14 суткам, когда средняя величина индекса повреждения составила 4.17 балла.

На фигуре 1 позиция А показано повреждение слизистой оболочки у животного на 14 сутки после моделирования перитонита, оцененное в 5 баллов, окраска гематоксилином и эозином, увеличение 40х. Выраженность повреждения слизистой оболочки показана в нижеприведенной таблице (среднее ± ошибка среднего).

Таблица

Образцы ткани кишечника фиксировали в растворе FineFIX (Milestone, Италия), и заливали в парафиновые блоки по общепринятой методике [Меркулов Г.А Курс патогистологической техники.- Л.: Медицина, 1969 - С. 13-15, 52-59). Готовили гистологические срезы толщиной 5 мкм и монтировали на стекла, покрытые поли-L-лизином. Препараты депарафинировали в толуоле - 2 раза по 10 минут, затем последовательно в спиртах 100°, 96°, 90°, 70° по 3 минуты. После чего препараты выдерживали в дистиллированной воде 10 минут, затем помещали в цитратный буфер (pH=6.0) и проводили обработку в микроволновой печи мощностью 800 W, которую нагревали при 100% мощности 8 минут, затем при 60% мощности 10 минут. Потом препараты охлаждали до 25°С в цитратном буфере и промывали в трис буфере (рН=7,6) 2 раза по 5 минут. Обводили гидрофобным карандашом Dako Pen (Dako, Code S2002). Наносили Image-iT FX signal enhancer (Invitrogen. Cat. №I 36933, Lot 681688), инкубировали во влажной камере при температуре 25°С 30 минут. Промывали в трис буфере (рН=7,6) 2 раза по 5 минут.Наносили первые первичные антитела anti-OxPhos Complex IV subunit I monoclonal antibody (Invitrogen, Cat. №D 0589, Lot 459600), рабочее разведение 1:200, инкубировали во влажной камере при температуре 25°С 60 минут. Промывали в трис буфере (рН=7,6) 2 раза по 5 минут. Наносили вторичные антитела Alexa fluor 568 goat anti-mouse IgG (H+L) (Invitrogen, Cat. № A-11031, Lot 822389), рабочее разведение 1:300, инкубировали во влажной камере при температуре 25°С 30 минут. Промывали в трис буфере (рН=7,6) 2 раза по 5 минут. Наносили Hoechst (Invitrogen, Cat. NH-3570), рабочее разведение 1:300, инкубировали 10 минут. Промывали в трис буфере (рН=7,6) 2 раза по 5 минут. Заключали в Fluoromount (Diagnostic Biosystems, REF K024, Lot P 939-B).

Было установлено, что на 3 и 7 сутки сохранялась окраска энтероцитов на Oxphos. На фигуре 1, позиция А показана яркая окраска (красный цвет) энтероцитов на Oxphos энтероцитов (увеличение 400х) у животного на 7 сутки эксперимента, повреждение энтероцитов 4 балла.

При нарастании энтеральной недостаточности (14 сутки) окраска на Oxphos в энтероцитах не выявлялась, что свидетельствовало об истощении репаративных способностей стенки кишки и неблагоприятном исходе (фиг. 3, позиция С). На фигуре 2, позиция В показано отсутствие окраски на Oxphos энтероцитов слизистой оболочки у животного на 14 сутки после моделирования перитонита при выраженности энтеральной недостаточности 4 балла, увеличение 400х.

Пример 2.

Больной А., поступил в хирургическое отделение с диагнозом: Огнестрельное слепое дробовое ранение живота, проникающее в брюшную полость. Множественные сквозные ранения тонкой и слепой кишки, брыжейки тонкой кишки и мезоколон. Выполнено оперативное лечение: сегментарное иссечение поврежденной тонкой кишки, учитывая тяжесть повреждений назначена программированная релапаротомия через 24 часа. На программированной релапаротомии произведено ушивание ран правой почки, сквозного ранения ДПК, абдоминизация поджелудочной железы, резекция ободочной кишки, наложение илеотрансверзоанастомоза, санация, дренирование брюшной полости. Состояние пациента крайне тяжелое, обусловлено объемом перенесенной операции, эндотоксикозом на фоне развившегося в послеоперационном периоде перитонита, синдромом системного воспалительного ответа, метаболическими нарушениями, гипопротеинемией, воспалением передней брюшной стенки, сопутствующей патологией.

На 5-е сутки послеоперационного периода у пациента А. картина распространенного перитонита. Выполнена релапаротомия, при ревизии органов брюшной полости выявлен тонкокишечный свищ до 0,5 см, дистальнее 2 см энтероэнтероанастомоза. Кишечный свищ иссечен, выполнено ушивание тонкой кишки (материал направлен на гистологическое исследование). Илеотрансверзоанастомоз, швы на двенадцатиперстной кишки состоятельны.

На 11 сутки, в связи с поступлением кишечного содержимого по дренажам из брюшной полости, выполнена релапаротомия. В брюшной полости признаки перитонита, мутный выпот с кишечным отделяемым, рыхлый фибрин. Петли тонкой кишки умеренно дилатированы. При ревизии выявлена несостоятельность энтероэнтероанастомоза до 1,0 см. Дополнительно выявлено 3 кишечных свища: дистальнее энтероэнтероанастомоза на 12 см тонкокишечный свищ до 0,5 см; в 2 см от связки Трейца тонкокишечный свищ до 0,5 см; при ревизии илеотрансверзоанастомоза - точечная несостоятельность на брыжеечном крае. Учитывая энтеральную недостаточность, выполнена резекция илеотрансверзоанастомоза (концы заглушены аппаратным швом), резекция тонкой кишки с анастомозом и свищом (протяженностью до 15 см), иссечение и ушивание свища тонкой кишки (материал направлен на гистологическое исследование), наложение энтероэнтероанастомоза однорядными, внеслизистыми швами. Для оценки течения перитонита и состояния кишечной стенки назначена программированная релапаротомия через 24 часа. Выполнено 2 санационных релапаротомии, при ревизии брюшной полости наблюдалась положительная динамика - в брюшной полости содержимого нет, тонкая кишка не эктазирована, не гиперемирована. Сохраняется умеренная отечность кишечной стенки. Швы на тонкой и тонкой кишке состоятельны. Но через 2 дня повторное поступление кишечного отделяемого по дренажам из брюшной полости, что потребовало повторной релапаротомии, на которой выявлено минимальное количество кишечного отделяемого между петлями тонкой кишки. При ревизии брюшной полости выявлена несостоятельность энтероэнтероанастомоза на брыжеечном крае кишки до 1,0 см. Края свища иссечены, дефект кишки ушит однорядным швом. Выполнена санация брюшной полости.

Состояние пациента оставалось крайне тяжелым. Тяжесть состояния обусловлена: абдоминальной патологией, энтеральной недостаточностью, эндотоксикозом, синдромом системного воспалительного ответа, метаболическими нарушениями, сопутствующей патологией. Несмотря на проводимую комплексную терапию состояние пациента без динамики, наблюдалось прогрессирование полиорганной недостаточности. Кишечная недостаточность привела к формированию множественных кишечных свищей, которые стали причиной еще 2 релапаротомий.

На 19 сутки, в связи с поступлением кишечного отделяемого из брюшной полости, выполнена релапаротомия, при ревизии брюшной полости в области энтероэнтероанастомоза выявлена полная несостоятельность ранее наложенных швов, выполнена резекция анастомоза с наложением энтероэнтероанастомоза конец в конец (материал направлен на гистологического исследование). Также выполнено ушивание свищей двенадцатиперстной кишки и тонкой кишки. Брюшная полость санирована растворами антисептиков. На 24 сутки выполнена 8 релапаротомия, при выполнении которой ушит точечный свищ тонкой кишки однорядным швом, взят образец ткани на исследование.

Образцы ткани кишечника, полученные при проведении оперативных вмешательств при поступлении, на 5, 11, 19 и 24 сутки, подвергали гистологическому исследованию по заявляемому способу.

Установлено, что при исследовании тканей кишечника при поступлении, на 5, 11, 19 сутки сохранялась окраска на OxPhos энтероцитов, что свидетельствовало о наличии резервов для репарации стенки кишки.

Так, на фигуре 3, позиция С показана гистологическая картина стенки кишки у больного А. на 19 сутки, рутинная окраска гематоксилином и эозином, увеличение 40х, степень повреждения оценена в 4 балла.

На фигуре 4, позиция А показана яркая окраска (красный цвет) на Oxphos энтероцитов на 19 сутки (увеличение 100х).

При исследовании, проведенном в срок 24 сутки, установлено отсутствие окраски на Oxphos в энтероцитах (фиг. 6).

На фигуре 5 позиция D показана гистологическая картина стенки кишки у больного А. на 24 сутки, рутинная окраска гематоксилином и эозином, ув. 40х, степень повреждения оценена в 3 балла.

На фигуре 6, позиция В показано отсутствие окраски на Oxphos энтероцитов слизистой оболочки на 24 сутки, увеличение 100х.

На 30 сутки у больного А. наступил летальный исход.

Пример 3.

Больной Б., 67 лет поступил в клинику с диагнозом: Послеоперационный перитонит. Спаечная болезнь брюшной полости, тяжелое течение. Тонкокишечные свищи. Флегмона передней брюшной стенки.

В анамнезе пациент перенес левостороннюю гемиколэктомию по поводу рака ободочной кишки. Считает себя больным с 30.05.19 г., когда появились жалобы на вздутие живота и приступообразные схваткообразные боли в животе. Развитие данного состояния связывает с погрешностью в диете, был госпитализирован в хирургическое отделение с диагнозом: Спаечная болезнь брюшной полости. Острая кишечная непроходимость. В этот же день произведена операция лапаротомия, энтеролиз, резекция тонкой кишки, наложение энтероэнтероанастомоза, санация и дренирование брюшной полости. В раннем послеоперационном периоде у пациента развилась клиника перитонита, которая потребовала выполнение релапаротомии, резекции энтероэнтероанастомоза в связи с его несостоятельностью, санации и дренирования брюшной полости. Энтеральная недостаточность, развившаяся на фоне перитонита, явилась причиной несостоятельности кишечной стенки, что и привело к многократным ушиваниям свищенесущих участков тонкой кишки и санационным релапаротомиям (11 санационных релапаротомий). При оценке степени выраженности энтеральной недостаточности состояние оценивалось как тяжелое.

Образцы ткани кишечника, полученные при проведении релапаротомии на 18 и 24 сутки послеоперационного периода были исследованы по за-являемому способу.

Установлено, что при всех исследованиях сохраняется окраска на OxPhos в энтероцитах, что свидетельствовало о сохранении резервов для репарации стенки кишки.

На фигуре 7, позиция А показана яркая окраска (красный цвет) на Oxphos энтероцитов на 18 сутки (увеличение 100х). На фигуре 8, позиция А показана яркая окраска (красный цвет) на Oxphos энтероцитов на 24 сутки (увеличение 100х). Прогноз - исход благоприятный.

Больной Б. был выписан с выздоровлением.

В течение сентября 2020 г. по апрель 2022 г. в лаборатории клеточных технологий и регенеративной медицины ИНЦХТ были проведено исследование 118 гистологических образцов тканей кишечника, из которых 100 были получены от лабораторных животных и 18 от больных перитонитом.

Наличие окраски энтероцитов в 100% образцах полностью соответствовало благоприятному прогнозу исхода энтеральной недостаточности. Отсутствие окраски энтероцитов в 100% образцах также полностью соответствовало неблагоприятному прогнозу. Точность прогноза составила 100%.

Полученные данные свидетельствуют о том, что предлагаемый способ позволяет прогнозировать течение энтеральной недостаточности по выявления наличия окрашенных или неокрашенных энтероцитов - ключевых функциональных компонентов кишечной стенки.

Таким образом, заявляемый способ позволяет осуществить прогнозирование исхода энтеральной недостаточности при перитоните и при лечении острых хирургических заболеваний живота. Предлагаемый способ не сложен в выполнении и может быть использован в медицине, ветеринарии и биологии.

Claims (1)

1. Способ прогнозирования энтеральной недостаточности при перитоните, включающий взятие образца из зоны повреждения и его исследование, отличающийся тем, что берут образец ткани кишечника и проводят его иммуноморфологическое окрашивание, для этого образец фиксируют, заливают в парафин, изготавливают срезы, проводят их депарафинизацию и демаскирование антигенов, после чего срезы инкубируют с антителами к OxPhos Complex IV subunit I в разведении 1:200 во влажной камере при температуре 25°С и длительности инкубации 60 минут, после чего обрабатывают проявляющим агентом Alexa fluor 568 goat anti-mouse IgG и при наличии окраски энтероцитов прогноз исхода энтеральной недостаточности считают благоприятным, а при ее отсутствии - неблагоприятным.

Images