RU2789503C1 - Способ количественного мультиплексного анализа альфа-2-макроглобулина, фетуина А и сывороточного амилоида А1 как факторов воспаления в сыворотке крови с использованием MALDI-TOF масс-спектрометрии - Google Patents
Способ количественного мультиплексного анализа альфа-2-макроглобулина, фетуина А и сывороточного амилоида А1 как факторов воспаления в сыворотке крови с использованием MALDI-TOF масс-спектрометрии Download PDFInfo
- Publication number
- RU2789503C1 RU2789503C1 RU2022112637A RU2022112637A RU2789503C1 RU 2789503 C1 RU2789503 C1 RU 2789503C1 RU 2022112637 A RU2022112637 A RU 2022112637A RU 2022112637 A RU2022112637 A RU 2022112637A RU 2789503 C1 RU2789503 C1 RU 2789503C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- fetuin
- macroglobulin
- serum
- alpha
- maldi
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 45
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 title claims abstract description 43
- 102100033312 Alpha-2-macroglobulin Human genes 0.000 title claims abstract description 29
- 108010015078 Pregnancy-Associated alpha 2-Macroglobulins Proteins 0.000 title claims abstract description 29
- 101000869480 Homo sapiens Serum amyloid A-1 protein Proteins 0.000 title claims abstract description 28
- 102100032277 Serum amyloid A-1 protein Human genes 0.000 title claims abstract description 26
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 title claims abstract description 16
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 title claims abstract description 10
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 title claims abstract description 9
- 102000013361 fetuin Human genes 0.000 title description 2
- 108060002885 fetuin Proteins 0.000 title description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 53
- 108010075843 alpha-2-HS-Glycoprotein Proteins 0.000 claims abstract description 33
- 102000012005 alpha-2-HS-Glycoprotein Human genes 0.000 claims abstract description 33
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 9
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 9
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims abstract description 9
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims description 25
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims description 25
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims description 25
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 claims description 23
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 18
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims description 15
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 claims description 10
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 10
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 5
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 4
- 230000005855 radiation Effects 0.000 claims description 4
- AFVLVVWMAFSXCK-UHFFFAOYSA-N α-cyano-4-hydroxycinnamic acid Chemical compound OC(=O)C(C#N)=CC1=CC=C(O)C=C1 AFVLVVWMAFSXCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 claims description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 3
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 claims description 3
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 claims description 3
- 206010051379 Systemic Inflammatory Response Syndrome Diseases 0.000 abstract description 9
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 6
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 abstract description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 abstract description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 22
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 21
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 21
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 17
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 13
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 11
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 10
- 102000054727 Serum Amyloid A Human genes 0.000 description 10
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 10
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 10
- 108700028909 Serum Amyloid A Proteins 0.000 description 9
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 8
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 8
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 5
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 4
- 238000000816 matrix-assisted laser desorption--ionisation Methods 0.000 description 4
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 4
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010074051 C-Reactive Protein Proteins 0.000 description 3
- 102100032752 C-reactive protein Human genes 0.000 description 3
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 3
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000001869 matrix assisted laser desorption--ionisation mass spectrum Methods 0.000 description 3
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N Methylamine Chemical compound NC BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 102000057429 human SAA1 Human genes 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 230000000155 isotopic effect Effects 0.000 description 2
- 238000001254 matrix assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrum Methods 0.000 description 2
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 102000011767 Acute-Phase Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010062271 Acute-Phase Proteins Proteins 0.000 description 1
- AAQGRPOPTAUUBM-ZLUOBGJFSA-N Ala-Ala-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O AAQGRPOPTAUUBM-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- MCKSLROAGSDNFC-ACZMJKKPSA-N Ala-Asp-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O MCKSLROAGSDNFC-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- GXIUDSXIUSTSLO-QXEWZRGKSA-N Asp-Val-Met Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N GXIUDSXIUSTSLO-QXEWZRGKSA-N 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000032928 Dyslipidaemia Diseases 0.000 description 1
- 206010017711 Gangrene Diseases 0.000 description 1
- JRCUFCXYZLPSDZ-ACZMJKKPSA-N Glu-Asp-Ser Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O JRCUFCXYZLPSDZ-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- ZTNHPMZHAILHRB-JSGCOSHPSA-N Glu-Trp-Gly Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)N)C(=O)NCC(O)=O)=CNC2=C1 ZTNHPMZHAILHRB-JSGCOSHPSA-N 0.000 description 1
- ABPRMMYHROQBLY-NKWVEPMBSA-N Gly-Ser-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CO)NC(=O)CN)C(=O)O ABPRMMYHROQBLY-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 1
- YADRBUZBKHHDAO-XPUUQOCRSA-N His-Gly-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O YADRBUZBKHHDAO-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 1
- ALPXXNRQBMRCPZ-MEYUZBJRSA-N His-Thr-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O ALPXXNRQBMRCPZ-MEYUZBJRSA-N 0.000 description 1
- 101001060288 Homo sapiens Alpha-2-HS-glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 206010022489 Insulin Resistance Diseases 0.000 description 1
- 208000017170 Lipid metabolism disease Diseases 0.000 description 1
- 102000001851 Low Density Lipoprotein Receptor-Related Protein-1 Human genes 0.000 description 1
- BMHIFARYXOJDLD-WPRPVWTQSA-N Met-Gly-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O BMHIFARYXOJDLD-WPRPVWTQSA-N 0.000 description 1
- SITLTJHOQZFJGG-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-valine Natural products CC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O SITLTJHOQZFJGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- IWZRODDWOSIXPZ-IRXDYDNUSA-N Phe-Phe-Gly Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)NCC(O)=O)C1=CC=CC=C1 IWZRODDWOSIXPZ-IRXDYDNUSA-N 0.000 description 1
- MIJWOJAXARLEHA-WDSKDSINSA-N Ser-Gly-Glu Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O MIJWOJAXARLEHA-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- MLSQXWSRHURDMF-GARJFASQSA-N Ser-His-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)NC(=O)[C@H](CO)N)C(=O)O MLSQXWSRHURDMF-GARJFASQSA-N 0.000 description 1
- 101710190759 Serum amyloid A protein Proteins 0.000 description 1
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 1
- ZRPLVTZTKPPSBT-AVGNSLFASA-N Tyr-Glu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O ZRPLVTZTKPPSBT-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- MDYSKHBSPXUOPV-JSGCOSHPSA-N Val-Gly-Phe Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)N MDYSKHBSPXUOPV-JSGCOSHPSA-N 0.000 description 1
- VHIZXDZMTDVFGX-DCAQKATOSA-N Val-Ser-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](C(C)C)N VHIZXDZMTDVFGX-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- 208000005475 Vascular calcification Diseases 0.000 description 1
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 108010008685 alanyl-glutamyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 208000020832 chronic kidney disease Diseases 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 1
- 238000003748 differential diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 1
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 1
- 102000055634 human AHSG Human genes 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 1
- 101150084157 lrp-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 108010005942 methionylglycine Proteins 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 1
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 1
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 108010084525 phenylalanyl-phenylalanyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 108010004914 prolylarginine Proteins 0.000 description 1
- 238000007430 reference method Methods 0.000 description 1
- 238000000611 regression analysis Methods 0.000 description 1
- 230000007363 regulatory process Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
Images
Abstract
Изобретение относится к области молекулярной диагностики, а именно к разработке метода молекулярной диагностики синдрома системной воспалительной реакции (ССВР, systemic inflammatory response syndrome, SIRS), включая сепсис, с помощью количественного определения альфа-2-макроглобулина, фетуина А и сывороточного амилоида А1 в сыворотке крови человека с применением технологии MALDI-TOF масс-спектрометрии. По настоящему изобретению для альфа-2-макроглобулина в качестве изотопно-меченого стандарта используют пептид VGFYESDVMGR, для фетуина А - HTFMGVVSLGSPSGEVSHPR, а для сывороточного амилоида А1 - FFGHGAEDSLADQAANEWGR, в качестве изотопной метки используется стабильный изотоп кислорода 18О. Технический результат состоит в обеспечении возможности эффективного количественного мультиплексного анализа альфа-2-макроглобулина, фетуина А и сывороточного амилоида А1 как факторов воспаления в сыворотке крови с использованием MALDI-TOF масс-спектрометрии. 4 з.п. ф-лы, 2 ил., 1 табл., 5 пр.
Description
Область применения
Изобретение относится к области молекулярной диагностики, а именно к разработке метода молекулярной диагностики синдрома системной воспалительной реакции (ССВР, systemic inflammatory response syndrome, SIRS), включая сепсис, с помощью количественного определения альфа-2-макроглобулина, фетуина А и сывороточного амилоида А1 в сыворотке крови человека с применением технологии MALDI-TOF масс-спектрометрии.
Предшествующий уровень техники
Наиболее удобным объектом для изучения профиля белковых биомаркеров при возникновении каких-либо патологических состояний в организме человека является сыворотка крови человека. Среди известных маркеров воспаления для мультиплексного определения перспективными являются альфа-2-макроглобулин, сывороточный амилоид А и фетуин А [1].
Альфа-2-макроглобулин (α2-МГ) представляет собой белок сыворотки крови, выполняющий широкий спектр регуляторных процессов в организме человека, основным из которых является ингибирование активностей целого ряда протеаз. Сывороточная концентрация α2-МГ обладает прогностическим потенциалом при оценке тяжести течения различных заболеваний [2-6].
Белки сывороточного амилоида А (serum amyloid A, SAA) отвечают за множество разнообразных функций в организме. Их деятельность направлена на активацию защитной системы организма в ответ на развитие патологии, при этом, когда организм длительное время не способен справиться с заболеванием, присутствие SAA в избыточных количествах может приводить к новым нежелательным процессам и явлениям в организме. Основными циркулирующими формами SAA являются SAA1 и SAA2 (acute-phase serum amyloid A, A-SAA), представляющие собой белки острой фазы, уровень которых значительно возрастает в ответ на воспаления различного генеза подобно C-реактивному белку (C-reactive protein, CRP). При этом A-SAA считаются более удобным маркером системного воспаления, так как их уровни гораздо оперативнее и интенсивнее реагируют на патологические изменения в организме по сравнению с CRP. A-SAA являются неспецифическими маркерами воспаления, увеличение их концентрации в сыворотке крови напрямую связано с возрастанием тяжести течения заболевания, что делает их удобным диагностическим инструментом, позволяющим подбирать адекватные стратегии лечения [7].
Многообразие функций в организме, которыми обладает фетуин А, позволяет использовать его в качестве биомаркера большого круга заболеваний. Повышенные концентрации фетуина А способны провоцировать атеросклероз, резистентность к инсулину, дислипидемию и ожирение. Нормальный уровень фетуина А способствует укреплению костной ткани, а также препятствует избыточной кальцификации сосудов и появлению различных сердечно-сосудистых патологий. В свою очередь, снижение уровня фетуина А может также быть ассоциировано с развитием системного воспаления, сепсиса или хронической болезни почек.
Среди различных методов одновременного выявления вышеперечисленных маркеров наибольшим потенциалом обладает метод масс-спектрометрии, позволяющий, во-первых, достоверно идентифицировать изучаемый белок, во-вторых, при применении некоторых подходов определять концентрацию отдельных компонентов в сложной белковой смеси. Вместе с тем, для идентификации и количественного анализа с помощью масс-спектрометрии, как правило, возникает необходимость выделить интересующий нас белковый объект, что практически исключает использование подобного подхода для серийных методов контроля. В связи с этим в данной работе предложен альтернативный вышеописанному подходу количественный мультиплексный анализ ряда белковых биомаркеров непосредственно в сыворотке крови человека при помощи современных масс-спектрометрических методик с применением изотопно-меченых внутренних стандартов. В основе предлагаемого подхода лежат имеющиеся в литературе данные о функциональных особенностях интересующих нас белков, а также способности α2-МГ и фетуина А участвовать в реакциях ограниченного протеолиза. Именно ограниченный протеолиз лежит в основе образования множества активных форм белков, которые поступают в биологическую среду в виде предшественников [8,9]. Особенностью разрабатываемого метода является применение способности трипсина образовывать комплекс с α2-МГ, в результате чего последний переходит в активное состояние за счет процесса ограниченного протеолиза, что приводит к потере трипсином способности к гидролизу высокомолекулярных белков в сыворотке крови. Сформированный комплекс сохраняет активный центр фермента, ограничивая протеолитическую активность в отношении отдельных субстратов, зарегистрировать которую можно с помощью предлагаемого масс-спектрометрического подхода.
Применение MALDI масс-спектрометрии для осуществления количественных расчетов как новое направление в количественной протеомике возникло сравнительно недавно. В 2004 году была предложена методика количественного определения пептидов с использованием синтетических аналогов аминокислот, содержащих изотопы (метод внутренних стандартов). Отличительной особенностью этого подхода являлась возможность применять его при MALDI-TOF масс-спектрометрии, что существенно расширяло возможности этого метода [10].
При этом метод получения стабильных изотопомеров пептидов и белков в дальнейшем был усовершенствован. Метод основан на обмене кислорода 16О на 18О в карбоксильных группах этих соединений в воде H2 18O в присутствии трифторуксусной кислоты (ТФУ) [11]. При этом показано, что изотопную метку можно вводить на любой стадии пробоподготовки - как до триптического гидролиза, так и после. Данный способ получения изотопомеров является универсальным решением для любых пептидов и белков. Аминокислотные остатки, которые подвергаются обмену (Asp и Glu), присутствуют практически во всех белках, к тому же в любых пептидах есть как минимум одна С-концевая карбоксильная группа. Чем больше атомов 18О вводится в молекулу, тем существеннее расходятся в спектре пики внутреннего стандарта и анализируемого образца. При этом число атомов 18О, вошедших в молекулу, не влияет на результат количественного определения, которое можно проводить как по спектрам MALDI исследуемых белков, так и по спектрам их триптических пептидов [12,13].
В настоящее время существует необходимость разработки подходов дифференциальной диагностики генерализованного воспаления инфекционного и неинфекционного происхождения. Применяемая в настоящее время стандартная микробиологическая диагностика SIRS требует не менее 48 часов для выявления этиологического агента, причем во многих случаях время проведения анализа может оказаться значительно больше [14]. Кроме того, на ее результаты может влиять предшествующая антибактериальная терапия и несоблюдение надлежащих требований при заборе биологического материала. Тем не менее, молекулярная диагностика SIRS, сепсиса и их возможных осложнений - трудновыполнимая задача вследствие высокой вариабельности и отсутствия специфических маркеров, характеризующих патогенез заболевания. В современной литературе описано свыше 178 различных биомаркеров SIRS, однако ни один из них не обладает необходимой надежностью, чтобы использовать его в качестве единственного диагностического критерия.
Очевидно, что для диагностики воспалительных процессов, а также характеристики патогенеза заболевания, наиболее целесообразным является одновременное измерение нескольких маркеров в одном эксперименте. Однако в настоящее время нет однозначного ответа на то, какой набор маркеров может быть использован для прогноза развития SIRS разной инфекционной этиологии и какими методами он может быть определен. В связи с этим разработанная методика для одновременной количественной оценки в сыворотке крови сразу нескольких маркеров воспаления с использованием метода масс-спектрометрии представляется крайне актуальной.
На сегодняшний день не известны способы количественного измерения сывороточных альфа-2-макроглобулина, фетуина А и сывороточного амилоида А1 человека с помощью MALDI-TOF масс-спектрометрии с применением изотопно-меченых аналогов пептидов, содержащих атомы стабильного изотопа кислорода 18О, входящих в состав измеряемых соединений. Таким образом, ни один из известных способов не может рассматриваться в качестве прототипа заявляемого изобретения.
Технической проблемой является необходимость разработки эффективного способа количественного мультиплексного анализа альфа-2-макроглобулина, фетуина А и сывороточного амилоида А1 как факторов воспаления в сыворотке крови с использованием MALDI-TOF масс-спектрометрии.
Раскрытие сущности изобретения
Технический результат состоит в обеспечении возможности эффективного количественного мультиплексного анализа альфа-2-макроглобулина, фетуина А и сывороточного амилоида А1 как факторов воспаления в сыворотке крови с использованием MALDI-TOF масс-спектрометрии.
Технический результат достигается за счет способа количественного мультиплексного анализа альфа-2-макроглобулина, фетуина А и сывороточного амилоида А1 как факторов воспаления в сыворотке крови с использованием MALDI-TOF масс-спектрометрии, в ходе которого сыворотку крови разбавляют дистиллированной водой в соотношении 1/25, а трипсин разводят до концентрации 50 мкг/мл в 50 мМ NH4HCO3, после чего полученные растворы смешивают в равном соотношении и инкубируют при 37°С в течение 15 минут для измерения уровней альфа-2-макроглобулина и в течение 120-180 минут для измерения уровней фетуина А и SAA1, далее реакцию трипсинолиза останавливают внесением равного объема 2% трифторуксусной кислоты до объемной концентрации 1%, затем в образцы вносят соответствующие изотопно-меченые стандарты в известной концентрации, после чего полученные смеси наносят на мишень MALDI-TOF масс-спектрометра с использованием α-циано-4-гидроксикоричной кислоты в качестве матрицы, после чего получают масс-спектры в режиме регистрации положительных ионов при установке мощности лазерного излучения на уровне минимального порогового значения, достаточного для десорбции-ионизации образца, причем масс-спектры получают путем суммирования пяти серий по 1000 импульсов лазера для каждой серии, при этом для альфа-2-макроглобулина в качестве изотопно-меченого стандарта используют пептид VGFYESDVMGR, для фетуина А - HTFMGVVSLGSPSGEVSHPR, а для сывороточного амилоида А1 - FFGHGAEDSLADQAANEWGR, в качестве изотопной метки используется стабильный изотоп кислорода 18О.
В наиболее предпочтительном варианте реализации изобретения используют масс-спектрометр, оснащенный твердотельным лазером 337 нм. Также в наиболее предпочтительном варианте реализации изобретения для внутренней калибровки масс в спектрах используют ионы, соответствующие продуктам автопротеолиза трипсина. Также в наиболее предпочтительном варианте реализации изобретения измерения масс устанавливают не более 50 ppm. Также в наиболее предпочтительном варианте реализации изобретения в качестве вариабельной модификации указывают окисление остатков метионина.
Описание фигур
Фиг.1. MALDI-TOF масс-спектр сыворотки крови, обработанной трипсином, А - через 15 минут инкубации, Б - через 120 минут инкубации. Пептиды, обозначенные величинами MH+на спектре, относятся к различным маркерам воспаления. Значения MH+отобранных пептидов-кандидатов обозначены «*».
Фиг.2. Фрагменты MALDI масс-спектров характеристического пептида VGFYESDVMGR (MH+=1259,6) (а), стандарта (б) и их смеси.
Осуществление изобретения
Предложен метод мультиплексного определения концентраций альфа-2-макроглобулина, фетуина А и сывороточного амилоида А1, основанного на взаимодействии трипсина с альфа-2-макроглобулином в сыворотке крови человека, а также проведена оценка его применимости для диагностики синдрома системной воспалительной реакции различной инфекционной этиологии. Показано, что в основе метода лежит способность трипсина, добавленного в сыворотку крови, к связыванию с α2-МГ, что приводит к существенному изменению и ограничению протеолитической активности трипсина в пользу белков с более низкой молекулярной массой. В результате этого взаимодействия в сыворотке крови появляются фрагменты (пептиды) некоторых белков, концентрацию которых можно измерить масс-спектрометрически. В результате масс-спектрометрического анализа подвергнутых гидролизу трипсином сывороток крови были идентифицированы пептиды, относящиеся к α2-МГ, фетуину А и SAA1. Определение концентрации указанных белков по их фрагментам проведены при добавлении в сыворотку крови изотопно-меченых синтетических аналогов пептидов известной концентрации (стандартов), причем мечение коммерческих пептидов изотопами кислорода 18О проводилось непосредственно в лабораторных условиях без необходимости синтеза дорогостоящих изотопно-меченых аналогов.
Для каждого изучаемого пептида были получены изотопно-меченые стандарты путем прямого введения изотопов 18O в состав аналогичных синтезированных пептидов. В ходе экспериментов были установлены особенности протекания реакции взаимодействия трипсина с основными ингибиторами протеаз в сыворотке крови и оценена возможность дальнейшей разработки подходов количественного анализа. Для каждого из исследуемых маркеров было установлено оптимальное время гидролиза трипсином. Мультиплексность метода достигается путем измерения всех заявленных маркеров воспаления в одном образце с добавлением смеси стандартов в известной концентрации, однако реакцию гидролиза с помощью ТФУ необходимо останавливать через 15 минут для измерения уровней α2-МГ и через 120-180 минут для измерения уровней фетуина А и SAA1.
Также технический результат достигается за счет того, что разработанная методика масс-спектрометрической количественной оценки уровней концентрации фетуина А и сывороточного амилоида А была сопоставлена со стандартным иммунологическим методом с помощью коммерческих наборов для иммуноферментного анализа (ИФА). С помощью регрессионного анализа были получены соотношения связи между результатами измерений, полученных двумя указанными методами, в результате чего была установлена четкая корреляционная зависимость между разработанным и референсным методом (ИФА).
Разработанная методика может быть представлена и в мультиплексном варианте. При этом в качестве стандарта в таком случае используется не один синтетический аналог пептида, а их смесь. В общем случае количество белков, концентрация которых одномоментно измеряется в одном образце, ограничено уникальностью производимых ими фрагментов (по массе и по аминокислотной последовательности) и возможностью детектировать их масс-спектрометрически. Количество образцов сыворотки крови, анализ которых может осуществляться одновременно, составляет порядка двух десятков, однако, оно может быть увеличено с помощью автоматической раскапывающей станции дозирования и робота для пробоподготовки. Общее время анализа в настоящий момент составляет около 3-4 часов от момента получения образца сыворотки крови пациента до определения концентрации изучаемых биомаркеров.
Заявляемый способ осуществляют следующим образом.
Сыворотку крови разбавляют дистиллированной водой в соотношении 1/25. Затем разводят трипсин до концентрации 50 мкг/мл в 50 мМ NH4HCO3. Полученные растворы смешивают в равном соотношении и инкубируют при 37°С в течение 15 минут для измерения уровней α2-МГ и через 120-180 минут для измерения уровней фетуина А и SAA1. Далее реакцию трипсинолиза останавливают внесением равного объема 2% трифторуксусной кислоты до объемной концентрации 1%. Затем полученный образец наносят на мишень масс-спектрометра с использованием α-циано-4-гидроксикоричной кислоты в качестве матрицы. Затем получают масс-спектры путем суммирования шести серий по 1000 импульсов лазера для каждой серии в режиме регистрации положительных ионов при установке мощности лазерного излучения на уровне минимального порогового значения, достаточного для десорбции-ионизации образца. В рамках заявляемого способа для альфа-2-макроглобулина в качестве изотопно-меченого стандарта используют пептид VGFYESDVMGR (SEQ ID NO:1), для фетуина А - HTFMGVVSLGSPSGEVSHPR (SEQ ID NO:2), а для сывороточного амилоида А1 - FFGHGAEDSLADQAANEWGR (SEQ ID NO:3), в состав которых вводят изотопы кислорода 18О. Метод введения изотопов основан на обмене кислорода 16О на 18О в карбоксильных группах этих соединений в воде H2 18O в присутствии трифторуксусной кислоты (ТФУ) [11]. Предпочтительно для реализации заявляемого способа используют MALDI-TOF масс-спектрометр, оснащенный твердотельным лазером 337 нм. При этом для внутренней калибровки масс в спектрах использовали ионы, соответствующие продуктам автопротеолиза трипсина. Измерения масс устанавливают не более 50 ppm.
Далее способ количественного определения альфа-2-макроглобулина, фетуина А и сывороточного амилоида А1 в сыворотке крови человека с применением технологии MALDI-TOF масс-спектрометрии будет описан в виде примеров, которые предназначены для иллюстрации изобретения и никоим образом не ограничивают его.
Заявляемое изобретение поясняется примерами.
Пример 1
Получение изотопно-меченых пептидов, входящих в состав сывороточных альфа-2-макроглобулина, фетуина А и сывороточного амилоида А1 человека
Для возможности количественного измерения альфа-2-макроглобулина, фетуина А и сывороточного амилоида А1 в сыворотке крови человека необходимо было синтезировать пептидные фрагменты этих белковых соединений, ионы которых были зарегистрированы на MALDI-TOF масс-спектрометре в результате триптического гидролиза через 15 и 120 минут после начала реакции. На Фиг.1А приведен пример MALDI-TOF масс-спектра сыворотки крови пациента с гангреной нижних конечностей, обработанной трипсином, через 15 минут инкубации, на Фиг.1Б - через 120 минут инкубации.
Для ионов с MH+=1259,6 (альфа-2-макроглобулин) и MH+=2081,0 (фетуин А) предполагаемая последовательность была подтверждена масс-спектрометрически по спектрам фрагментации, а также дополнительно установлены их принадлежности к α2-МГ с величиной Score=114 (пороговое значение 24) и к фетуину А с величиной Score=135 (пороговое значение 29), соответственно. Для иона с MH+=2178,0 (сывороточный амилоид А1) принадлежность к белку сывороточного амилоида А была установлена в результате обращения к компьютерной библиотеке белкового поиска MASCOT при идентификации всех триптических пептидов, представленных на спектре сывороточных продуктов ферментативного гидролиза, после двух часов гидролиза. Совпадения семи значений MH+ионов экспериментального с теоретическим спектром позволили достоверно идентифицировать в исследуемом образце сывороточный амилоид А1 с величиной Score=105 (пороговое значение 56), с величиной покрытия исходной последовательности в 68%. В случае, если Score больше порогового значения, то идентификация соединения является достоверной (P<0,05).
Пептиды VGFYESDVMGR (MH+=1259,6), HTFMGVVSLGSPSGEVSHPR (MH+=2081,0) и FFGHGAEDSLADQAANEWGR (MH+=2178,0) были синтезированы в ООО «НПФ Верта» (г. Санкт-Петербург, Россия).
Опираясь на ранее известные методики прямого введения изотопов 18О для количественного анализа методом масс-спектрометрии, были подобраны следующие условия получения изотопно-меченых пептидов: стандарты были получены путем инкубации 1 мМ водных растворов пептидов в присутствии двукратного объема H2 18O (95-98% 18O, "Cambridge Isotope Laboratories Andover", США), 25% ацетонитрила и 10% трифторуксусной кислоты (ТФУ) в течение 1 часа при 50°С в твердотельном термостате «Гном» («ДНК-технология», Россия). Затем аликвоты полученных стандартов высушивали в вакуумном концентраторе SpeedVac (Concentrator Plus, Eppendorf 5305, Германия) для дальнейшего растворения в необходимом объеме воды (LiChrosolv, Merck, Германия) непосредственно перед использованием.
Концентрацию стандартов и степень включения изотопа кислорода 18O характеризовали масс-спектрометрически.
Таким образом, для каждого из трех исследуемых маркеров воспаления был получен изотопно-меченый стандарт, концентрация которого была определена по спектрам смеси пептида и стандарта с учетом известного изотопного распределения, полученного из спектров пептида и стандарта по отдельности. Соотношение суммарной площади под пиками пептида и суммарной площади под пиками стандарта в смеси равно отношению концентраций данных соединений. На Фиг.2 приведен пример фрагмента MALDI масс-спектров характеристического пептида VGFYESDVMGR (MH+=1259,6) (Фиг.2а), стандарта (Фиг.2б) и их смеси (Фиг.2в).
Пример 2
Регистрация и обработка масс-спектров
Для анализа как синтетических, так и полученных в результате ферментативного гидролиза трипсином пептидов использовали MALDI масс-спектрометрию с времяпролетным анализатором, реализованную в приборе ultrafleXtreme™ (Bruker, Германия), оснащенным твердотельным лазером 337 нм.
Образцы наносили на мишень (MTP 384 target plate ground steel TF, Bruker, Германия) с использованием матрицы HCCA (α-циано-4-гидроксикоричная кислота, Bruker). Масс-спектры получали в режиме регистрации положительных ионов при помощи программы Bruker Daltonics flex Control (Bruker, Германия). Для накопления масс-спектров мощность лазерного излучения устанавливали на уровне минимального порогового значения, достаточного для десорбции-ионизации образца. Спектры получали в результате суммирования пяти серий по 1000 импульсов лазера для каждой серии. Обработку полученных результатов проводили с помощью программы Bruker Daltonics flex Analysis (Bruker, Германия). Идентификацию соединений осуществляли посредством программы Bruker Daltonics BioTools (Bruker, Германия), взаимодействующей с базами данных NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov) и SwissProt (www.uniprot.org) с использованием MASCOT (www.matrixscience.com). Для внутренней калибровки масс в спектрах использовали ионы, соответствующие продуктам автопротеолиза трипсина (842,51 и 2211,01 Да). Точность измерения масс устанавливали не более 50 ppm. В качестве вариабельной модификации указывали окисление остатков метионина.
Для подтверждения аминокислотной последовательности пептидов выбранные ионы были фрагментированы в тандемном режиме регистрации положительных ионов (с помощью метода LIFT). По обработанным спектрам были установлены аминокислотные последовательности пептидов при обращении к базе данных NCBI с использованием MASCOT. Точность определения m/z родительского иона была ограничена 50 ppm, его фрагментов - 0,2 Да.
Пример 3
Расчет концентрации полученного изотопно-меченого стандарта методом MALDI масс-спектрометрии по известной концентрации синтетического пептида
На первом этапе получали масс-спектры немеченого синтетического пептида известной концентрации, его изотопно-меченого стандарта и их смеси в соотношении 1:1 (v/v). Смесь готовили таким образом, чтобы максимальные интенсивности пиков в изотопных распределениях пептида и его стандарта были сопоставимы.
Пример полученных масс-спектров пептида VGFYESDVMGR (MH+=1259,6) и соответствующего стандарта представлен на Фиг.2.
В общем случае соотношение сумм площадей изотопных распределений пептида и его стандарта соответствует соотношению их концентраций. Зная соотношение сумм площадей и концентрацию одного из компонентов, можно вычислить другой компонент.Спектр синтетического пептида, а также спектр изотопно-меченого стандарта нужны для уточнения характера распределения и установления вероятного перекрытия пиков от этих соединений в случае их смеси. В случае перекрытия пиков - изотопное распределение стандарта остается неизменным от спектра к спектру, а значит вклад каждого из перекрывающихся пиков можно вычислить. Удобнее всего найти отношение площади каждого из нескольких первых перекрывающихся пиков стандарта к суммарной площади всех пиков стандарта и в дальнейшем использовать его для определения вклада стандарта в суммарный спектр.
В случае с пептидом VGFYESDVMGR (MH+=1259,6) по спектру можно судить об однозначном расхождении распределений синтетического пептида и его изотопно-меченого аналога, что позволяет сравнивать суммарные площади этих соединений в смеси без каких-либо поправок.
В Таблице 1 представлены выходные данные для спектра стандарта (Фиг.2б), предоставляемые программным обеспечением масс-спектрометра (программа flexAnalysis, Bruker, Германия).
| Таблица 1 - | |||
| Результаты измерений площади, соответствующей регистрируемому сигналу изотопного распределения смеси целевых соединений | |||
| Отношение массы к заряду, m/z |  |
Отношение массы к заряду, m/z |  |
| 1259,6 | 6151,080 | 1265,6 | 55,861 |
| 1260,6 | 4287,920 | 1266,6 | 70,349 |
| 1261,6 | 1981,599 | 1267,6 | 290,087 |
| 1262,6 | 587,148 | 1268,6 | 231,806 |
| 1263,6 | 192,488 | 1269,6 | 1491,132 |
| 1270,6 | 1124,902 | ||
| 1271,6 | 3154,776 | ||
| 1272,6 | 1984,967 | ||
| 1273,6 | 781,578 | ||
| 1274,6 | 229,300 | ||
| 1275,6 | 132,342 | ||
Для полученных результатов справедливо соотношение 
, где 
- суммарная площадь под пиками стандарта, 
- суммарная площадь под пиками синтетического пептида, 
- концентрация стандарта, 
- концентрация синтетического пептида. Для расчета концентрации стандарта необходимо располагать точной концентрацией синтетического пептида, что позволяет рассчитать концентрацию стандарта по формуле: 
. То есть отношение "
" суммарной площади пиков стандарта к суммарной площади первых пиков синтетического пептида составляет:
Коэффициент является ключевым параметром, получаемым из спектров и зависящим от уровня шума на спектре и общем уровне сигнала от целевых соединений, что накладывает определенные ограничения на точность измерений, соотношение концентрации стандарта и измеряемого пептида, которое необходимо подбирать таким образом, чтобы коэффициент был близок к единице для обеспечения наименьшей погрешности. В дальнейшем для расчета концентрации пептида, входящего в состав измеряемых сывороточных маркеров, используется обратный коэффициент:
В текущем примере 
При смешивании стандарта с синтетическим пептидом в соотношении 1:1, с добавлением матрицы в конечную смесь для нанесения полученного образца на мишень, концентрация полученного стандарта составляет:
Пример 4
Обработка трипсином сывороток крови человека
Сыворотки крови разбавляли дистиллированной водой в 25 раз и смешивали в равном соотношении по объему с трипсином (Sequencing Grade Modified Trypsin, Frozen, Promega, США), разведенным до концентрации 50 мкг/мл в 50 мМ NH4HCO3. Полученную смесь помещали в твердотельный термостат «Гном» («ДНК-технология», Россия) для дальнейшей инкубации при 37°С в течение требуемого промежутка времени. Реакцию трипсинолиза останавливали внесением равного объема 2% трифторуксусной кислоты (ТФУ) до объемной концентрации 1%.
В ходе экспериментов также были установлены особенности протекания реакции взаимодействия трипсина с основными ингибиторами протеаз в сыворотке крови. Для каждого из исследуемых маркеров было установлено оптимальное время гидролиза трипсином. Мультиплексность метода достигалась путем измерения всех заявленных маркеров воспаления в одном образце с добавлением смеси стандартов в известной концентрации, однако реакцию гидролиза необходимо было останавливать через 15 минут для измерения уровней α2-МГ и через 120-180 минут для измерения уровней фетуина А и SAA1.
Пример 5
Расчет концентрации сывороточных маркеров воспаления методом MALDI масс-спектрометрии по известной концентрации изотопно-меченого стандарта
С учетом всех разведений сыворотки в ходе триптического гидролиза и остановки реакции образец сыворотки разведен в 100 раз, что необходимо учитывать при пересчете концентраций. Полученный образец смешивают с изотопно-меченым стандартом соответствующего пептида, входящего в состав измеряемого сывороточного маркера или со смесью из всех трех стандартов измеряемых маркеров в известной концентрации. В случае, если суммарная площадь под пиками для измеряемого стандарта сопоставима с суммарной площадью под пиками для измеряемого пептида сывороточного маркера, молярная концентрация в результате триптического гидролиза должна в полной мере отражать молярную концентрацию соответствующего сывороточного маркера.
При добавлении стандарта с концентрацией 4⋅10-8 М в гидролизованный образец сыворотки в соотношении 1:1 (v/v) концентрацию сывороточного маркера (например, альфа-2-макроглобулина) можно получить, рассчитав . Для одного из измерений 
.
Для α2-МГ, в отличие от сывороточного амилоида А1 и фетуина А, необходимо учитывать дополнительный коэффициент 2, так как от одной молекулы α2-МГ в результате ограниченного протеолиза трипсином через 15 минут отщепляется две молекулы характеристического пептида VGFYESDVMGR (MH+=1259,6), то есть количество моль/л измеряемого пептида в 2 раза превышает молярную концентрацию исходного α2-МГ, что с учетом всех разведений дает следующую формулу для расчета молярной концентрации α2-МГ:
или в других единицах, с учетом молярной массы 
Список источников
1. Mancini N. Sepsis diagnostic Methods and Protocols: Method & Molecular Microbiology // Springer New York. 2015. 17-31 p.
2. Christensen U., Sottrup-Jensen L. Mechanism of α2-Macroglobulin-Proteinase Interactions. Studies with Trypsin and Plasmin // Biochemistry. American Chemical Society, 1984. Vol.23, №26. P. 6619-6626.
3. Larsson L.J. et al. The conformational changes of α2-macroglobulin induced by methylamine or trypsin. Characterization by extrinsic and intrinsic spectroscopic probes // Biochemical Journal. Biochem J, 1987. Vol.243, №1. P. 47-54.
4. Atkinson H.M. et al. Determination of alpha-2-macroglobulin complexes by a new immuno-activity assay // Thrombosis Research. Thromb Res, 2012. Vol.129, №5. P. 635-640.
5. Justus C.W.E. et al. Quantification of free α2-macroglobulin and α2-macroglobulin-protease complexes by a novel ELISA system based in streptococcal α2-macroglobulin receptors // Journal of Immunological Methods. J Immunol Methods, 1990. Vol.126, №1. P. 103-108.
6. Abbink J.J. et al. Quantification of functional and inactivated α2-macroglobulin in sepsis // Thrombosis and Haemostasis. Thromb Haemost, 1991. Vol.65, №1. P. 32-39.
7. Buck M. et al. Structure and Expression of Different Serum Amyloid A (SAA) Variants and their Concentration-Dependent Functions During Host Insults // Current Medicinal Chemistry. 2016. Vol.23, №17. P. 1725-1755.
8. Christensen U., Sottrup-Jensen L. Mechanism of α2-Macroglobulin-Proteinase Interactions. Studies with Trypsin and Plasmin // Biochemistry. 1984. Vol.23, №26. P. 6619-6626.
9. Nawratil P. et al. Limited Proteolysis of Human α 2 -HS Glycoprotein/Fetuin // Journal of Biological Chemistry. 1996. Vol.271, №49. P. 31735-31741.
10. Mirgorodskaya O.A. et al. Absolute quantitation of proteins by a combination of acid hydrolysis and matrix-assisted laser desorption/ionization mass, spectrometry // Analytical Chemistry. Anal Chem, 2004. Vol.76, №13. P. 3569-3575.
11. RU2399627C2 - СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИЗОТОПНО-МОДИФИЦИРОВАННЫХ ПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ - Яндекс.Патенты [Электронный ресурс]. URL: https://yandex.ru/patents/doc/RU2399627C2_20100920 (дата обращения: 26.04.2022).
12. Козьмин Ю.П. et al. Прямое введение изотопов 18 в пептиды и белки для количественного анализа методом масс-спектрометрии // Биоорганическая химия. Федеральное государственное унитарное предприятие Академический научно …, 2011. Vol.37, №6. P. 793-806.
13. Лебедев А.Т., Артеменко К.А., Самгина Т.Ю. Основы масс-спектрометрии белков и пептидов // М., Техносфера. 2012.
14. D’Onofrio V. et al. The Clinical Impact of Rapid Molecular Microbiological Diagnostics for Pathogen and Resistance Gene Identification in Patients With Sepsis: A Systematic Review // Open Forum Infectious Diseases. Oxford Academic, 2020. Vol.7, №10.
Способ количественного мультиплексного анализа альфа-2-макроглобулина, фетуина А и сывороточного амилоида А1 как факторов воспаления в сыворотке крови с использованием MALDI-TOF масс-спектрометрии
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<120>Способ количественного мультиплексного анализа альфа-2-макроглобулина,
фетуина А и сывороточного амилоида А1 как факторов воспаления в сыворотке
крови с использованием MALDI-TOF масс-спектрометрии
<160>3
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>11
<212>PRT
<213>Synthetic
<400>1
Val Gly Phe Tyr Glu Ser Asp Val Met Gly Arg
1 5 10
<210>2
<211>20
<212>PRT
<213>Synthetic
<400>2
His Thr Phe Met Gly Val Val Ser Leu Gly Ser Pro Ser Gly Glu Val
1 5 10 15
Ser His Pro Arg
20
<210>3
<211>20
<212>PRT
<213>Synthetic
<400>3
Phe Phe Gly His Gly Ala Glu Asp Ser Leu Ala Asp Gln Ala Ala Asn
1 5 10 15
Glu Trp Gly Arg
20
<---
Claims (5)
1. Способ количественного мультиплексного анализа альфа-2-макроглобулина, фетуина А и сывороточного амилоида А1 как факторов воспаления в сыворотке крови с использованием MALDI-TOF масс-спектрометрии, в ходе которого сыворотку крови разбавляют дистиллированной водой в соотношении 1/25, а трипсин разводят до концентрации 50 мкг/мл в 50 мМ NH4HCO3, после чего полученные растворы смешивают в равном соотношении и инкубируют при 37°С в течение 15 минут для измерения уровней альфа-2-макроглобулина; для измерения уровней фетуина А и сывороточного амилоида А1 полученные растворы инкубируют при 37°С в течение 120–180 минут; далее для остановки каждой из реакций трипсинолиза через необходимый интервал времени в образцы вносят равный объем 2% трифторуксусной кислоты до объемной концентрации 1%, затем в образцы вносят соответствующие изотопно-меченые стандарты в известной концентрации, после чего полученные смеси наносят на мишень MALDI-TOF масс-спектрометра с использованием α-циано-4-гидроксикоричной кислоты в качестве матрицы, после чего получают масс-спектры в режиме регистрации положительных ионов при установке мощности лазерного излучения на уровне минимального порогового значения, достаточного для десорбции-ионизации образца, причем масс-спектры получают путем суммирования пяти серий по 1000 импульсов лазера для каждой серии, при этом для альфа-2-макроглобулина в качестве изотопно-меченого стандарта используют пептид VGFYESDVMGR, для фетуина А - HTFMGVVSLGSPSGEVSHPR, а для сывороточного амилоида А1 - FFGHGAEDSLADQAANEWGR, в качестве изотопной метки используют стабильный изотоп кислорода 18О.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что используют масс-спектрометр, оснащенный твердотельным лазером 337 нм
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для внутренней калибровки масс в спектрах используют ионы, соответствующие продуктам автопротеолиза трипсина.
4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что измерения масс устанавливают не более 50 ppm.
5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве вариабельной модификации указывают окисление остатков метионина.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2789503C1 true RU2789503C1 (ru) | 2023-02-03 |
Family
ID=
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2016160511A1 (en) * | 2015-03-30 | 2016-10-06 | Virgin Instruments Corporation | Maldi-tof ms method and apparatus for assaying an analyte in a bodily fluid from a subject |
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2016160511A1 (en) * | 2015-03-30 | 2016-10-06 | Virgin Instruments Corporation | Maldi-tof ms method and apparatus for assaying an analyte in a bodily fluid from a subject |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| GAO J. et al. Multiplex Immuno-MALDI-TOF MS for Targeted Quantification of Protein Biomarkers and Their Proteoforms Related to Inflammation and Renal Dysfunction, Anal Chem., 2018, vol. 90, N. 5, pp. 3366-3373. ТАРАСКИН А. С. и др. Мультиплексный анализ факторов воспаления в сыворотке крови с применением метода MALDI-TOF-масс-спектрометрии, Материалы XXI Зимней молодежной школы ПИЯФ по биофизике и молекулярной биологии: Тезисы докладов Молодежной конференции, 2020, сс. 205-206. ТЮЛИН А. А. и др. Разработка метода количественной оценки изоформ А1 и А2 острофазного сывороточного амилоида, НЕДЕЛЯ НАУКИ ИФНиТ : сборник материалов Всероссийской конференции, 2020, сс. 293-295. ТАРАСКИН А. С. Мультиплексный анализ альфа-2-макроглобулина, фетуина А и сывороточного амилоида А1 как факторов воспаления в сыворотке крови с использованием новых масс-спектрометрических подходов, диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук, 2021, 135 с. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP1616181B1 (en) | Polypeptides related to natriuretic peptides and methods of their identification and use | |
| US20170248608A1 (en) | Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) Protein SRM Assay | |
| US20120302650A1 (en) | Insulin-Like Growth Factor 1 Receptor (IGF1R) Protein SRM/MRM Assay | |
| Popp et al. | An automated assay for the clinical measurement of plasma renin activity by immuno-MALDI (iMALDI) | |
| Zhang et al. | Evaluation of sample preparation methods for label-free quantitative profiling of salivary proteome | |
| CA3042585A1 (en) | Mass spectrometry-based methods for the detection of circulating histones h3 and h2b in plasma from sepsis or septic shock (ss) patients | |
| US9417246B2 (en) | Insulin receptor substrate 1 (IRS1) protein SRM/MRM assay | |
| RU2789503C1 (ru) | Способ количественного мультиплексного анализа альфа-2-макроглобулина, фетуина А и сывороточного амилоида А1 как факторов воспаления в сыворотке крови с использованием MALDI-TOF масс-спектрометрии | |
| AU2012318590B2 (en) | SRM/MRM assay for the ephrin type-A receptor 2 protein | |
| US20160209412A1 (en) | Msia-srm assay for biomarker analysis | |
| WO2024133743A1 (en) | Method for diagnosing and/or classifying the severity of a neurodegenerative disease | |
| US20210246085A1 (en) | Methods and Systems for Measuring Plasma Renin Activity | |
| US9733253B2 (en) | Secreted protein acidic and rich in cysteine (SPARC) protein SRM assay | |
| CN113533547A (zh) | 一种补体蛋白c1r表达量的测量方法 | |
| US20160216268A1 (en) | SRM/MRM Assay for the Fatty Acid Synthase Protein | |
| AU2012318567B2 (en) | SRM/MRM assay for the receptor tyrosine-protein kinase erbB-4 protein (HER4) | |
| WO2013166343A2 (en) | Mrm-ms signature assay | |
| Sogawa et al. | The measurement of a fibrinogen α C-chain 5.9 ákDa fragment (FIC 5.9) using MALDI-TOF MS and a stable isotope-labeled peptide standard dilution | |
| Yıldız | Behavior of Alpha-2-Macroglobulin Unique Peptides in Biological Samples | |
| EP2491402A2 (en) | Blood coagulation status measurement in saliva | |
| JP2024117521A (ja) | 膵臓がんの検出方法 | |
| CN120847406A (zh) | 检测aldoa s39磷酸化的试剂用于诊断三阴性乳腺癌的用途 | |
| KR20080091234A (ko) | 신장 질환의 진단 방법 및 이를 위한 마커 | |
| Suckau et al. | An automated assay for the clinical measurement of plasma renin activity by immuno-MALDI (iMALDI)☆ | |
| HK40012761A (en) | Methods and systems for determining plasma angiotensin i levels |