RU2788359C1 - Штамм гибридных культивируемых клеток Homo sapiens/Mus musculus Hu-C6D7-RBD - продуцент человеческих моноклональных антител, специфичных к RBD домену S белка вируса SARS-CoV-2 - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и медицины, в частности к штамму гибридных культивируемых клеток Homo sapiens/Mus musculus Hu-C6D7-RBD, продуценту человеческих моноклональных антител, специфичных к RBD домену S белка вируса SARS-CoV-2. Изобретение позволяет расширить арсенал средств пролуцентов человеческих моноклональных антител, специфичных к RBD домену S белка вируса SARS-CoV-2, обладающих вируснейтрализующей активностью, которые могут использоваться для накопления моноклонального иммуноглобулинового сырья с целью последующего изготовления терапевтического препарата. 8 ил., 9 пр.

Description

Изобретение относится к области биотехнологии, биоинженерии, биофармакологии, может быть использовано в качестве источника (продуцента) субстанции для производства иммунобиологического препарата для лечения или профилактики новой коронавирусной инфекции COVID-19. Заявлен штамм гибридной клеточной линии с авторским названием Hu-C6D7-RBD, продуцирующей человеческие моноклональные антитела, специфические к RBD домену S белка вируса SARS-CoV-2.

Коронавирусная инфекция это острое вирусное заболевание, поражающее преимущественно верхние дыхательные пути этиологическим агентом которого является РНК-содержащий вирус семейства Coronaviridae, рода Betacoronavirus, подроду Sarbecovirus. На 2019 год семейство Coronaviridae включало в себя 40 видов РНК-содержащих вирусов, поражающих человека и животных [Dai L. // Cell. – 2020. – V. 182. - N. 3. – P. 722-733.].

В конце 2002 года был зарегистрирован коронавирус SARS-CoV (Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus) который являлся возбудителем пневмонии у людей и вызывал тяжелый острый респираторный синдром (ТОРС). В период эпидемии в 37 странах мира всего было зарегистрировано 8 тысяч случаев заболевания, из них было зарегистрировано 774 летальных случая. В 2004 году новых случаев заболевания не было обнаружено [Wu L.P. // Emerging infectious diseases. – 2007. – V. 13. - N. 10. – P. 1562.].

В 2012 году на Аравийском полуострове был зарегистрирован коронавирус ближневосточного респираторного синдрома MERS-CoV (Middle East respiratory syndrome). Было выявлено 2519 случаев заболевания, из них 866 закончились летальным исходом. Все случаи заболевания географически ассоциированы с Аравийским полуостровом. На данный момент вирус MERS-CoV продолжает циркулировать и вызывать новые случаи заболевания [Yan Y. // Reviews in medical virology. – 2020. – V. 30. - N. 3. – P. e2106.].

В конце 2019 г. в Китайской Народной Республике (КНР) произошла вспышка новой коронавирусной инфекции с эпицентром в городе Ухань (провинция Хубэй). Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) 11 февраля 2020 г. определила официальное название инфекции, вызванной новым коронавирусом, – COVID-19 («Coronavirus disease 2019»). Международный комитет по таксономии вирусов 11 февраля 2020 г. присвоил официальное название возбудителю инфекции – SARS-CoV-2 [Tillett R.L. // The Lancet Infectious Diseases. – 2021. – Vl. 21. - N. 1. – P. 52-58.]. В настоящее время новая коронавирусная инфекция зарегистрирована на территории 210 государств. На май 2022 года количество случаев заражения достигло около 525 миллионов человек, а смертность превысила 6,2 миллионов случаев. SARS-CoV-2 продолжает инфицировать людей во всем мире, а значит необходимо разрабатывать эффективные препараты для лечения и профилактики новой коронавирусной инфекции.

В современном мире большую роль в здравоохранении занимает разработка инновационных лекарственных препаратов, которые в свою очередь должны обладать большой клинической эффективностью и безопасностью. К таким средствам относятся препараты на основе моноклональных антител. Моноклональные антитела являются классом препаратов, которые способны точно связываться с антигеном (молекулярной мишенью) благодаря наличию специальных антигенсвязывающих участков в своей структуре. В качестве потенциальных лекарств для лечения или профилактики новой коронавирусной инфекции COVID-19 рассматриваются препараты на основе моноклональных антител, которые могут быть нацелены на молекулярную мишень в S-белке (S1-NTD, RBD, S2). Анализ доступной информации по уже полученным препаратам показал, что большей эффективностью в нейтрализации вируса обладают препараты на основе RBD-специфических антител.

На территории РФ запатентовано одно человеческое моноклональное антитело, обладающее нейтрализующей активностью, селективно взаимодействующее с RBD фрагментом в составе S белка вируса SARS-CoV-2 [Патент RU. № 2744274].

В настоящее время только три препарата моноклональных антитела против SARS-CoV-2 имеют разрешения FDA (Food and Drug Administration, Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США) на экстренное использование для лечения COVID-19 легкой и средней степени тяжести с лабораторно подтвержденным SARS-CoV-2 у госпитализированных пациентов с высоким риском развития тяжелого заболевания.

В первом квартале 2021 г. FDA одобрило экстренное применение препарата для лечения COVID-19 Sotrovimab (VIR-7831), также известный как GSK4182136. Его создателем является британская фармацевтическая компания GSK (GlaxoSmithKline) и ее американский партнер Vir Biotechnology [Tuccori M. // MAbs. – 2020. – V. 12. - N. 1. – P. 1854149.]. VIR-7831 является моноклональным антителом двойного действия, нацеленным на S-белок коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома (SARS-CoV-2). Первоначально моноклональное антитело было получено в 2003 г. из родительского антитела (S309), выделенного из В-клеток памяти выжившего в 2003 г. человека с тяжелым острым респираторным синдромом, вызванным коронавирусом (SARS-CoV). Моноклональное антитело нацелено на блокирование гликансодержащего эпитопа (гликан в положении N343) в RBD, который оказался высококонсервативен для подрода Sarbecovirus. Также данный эпитоп не конкурирует за связывание с ангиотензинпревращающим ферментом 2 (ACE2) [Cathcart A.L. // bioRxiv. – 2021.].

Еще два препарата, которые получили разрешение на использование FDA -LY-CoV555/бамланивимаб и LY-CoV016/этесевимаб, - представляют собой рекомбинантные, полностью человеческие моноклональные антитела [Патент U.S. 17/116588], разработанные компанией AbCellera совместно с Исследовательским центром вакцин США в Национальном институте аллергии и инфекционных заболеваний (NIAID). Моноклональные антитела были получены из клинического материала Эли Лилли, которая переболела коронавирусной инфекцией. Препараты на основе комбинаций двух и более моноклональных антител являются предпочтительными, нежели однокомпонентные препараты, поскольку они обеспечивают повышение противовирусной эффективности [Jones B.E. // Science translational medicine. – 2021. – V. 13. - N. 593. - С. eabf1906.]. Моноклональное антитело LY-CoV555 является специфичным к RBD и связывается в верхнем (активном) или нижнем (покоящемся) положениях белка. Так же было показано, что LY-CoV555 связывается с эпитопом, перекрывающим сайт связывания ACE2 [Jones B.E. // BioRxiv. – 2020.]. Моноклональное антитело LY-CoV016 способно связываться с другим эпитоп на S белке. Разная специфичность моноклональных антител позволяет предположить, что два антитела, используемые для терапии в комбинации, будут работать синергично, что еще больше расширит их клиническое применение по сравнению с монотерапией. Было высказано предположение, что такие комбинированные препараты способны нейтрализовать вирус с новыми мутациями [Starr T. N. //Science. – 2021. – V. 371. - N. 6531. – P. 850-854.].

Экспериментальный препарат Казиривимаб/имдевимаб (REGN-COV2, ронапрев), разработанный американской биотехнологической компанией Regeneron Pharmaceuticals [Патент U.S. 10787501(B1)],состоит из двух моноклональных антител REGN10933 и REGN10987 [Hansen J. // Science. – 2020. – V. 369. - N. 6506. – P. 1010-1014.]. Оба моноклональных антитела REGN10933 и REGN10987 связываются с неперекрывающимися сайтами на RBD. REGN10933 связывается в верхней части RBD, блокируя взаимодействие с ACE2, в то время как REGN10987 связывается сбоку от RBD и не перекрывает сайт связывания ACE2. Таким образом, два антитела в этом коктейле могут одновременно связываться с различными областями RBD [Starr T.N. // Science. – 2021. – V. 371. - N. 6531. – P. 850-854.]. В результате множественных исследований было показано, что данный препарат из коктейля моноклональных антител позволяет нейтрализовать вирус SARS-CoV-2, а также штаммы с новыми мутациями из Соединенного Королевства (B.1.1.7), Южной Африки (B.1.351) и Бразилии (P.1) [Baum A. // Science. – 2020. – V. 370. - N. 6520. – P. 1110-1115.].

Техническим результатом предлагаемого изобретения является перевиваемая линия гетерогибридных клеток Homo sapiens/Mus musculus Hu-C6D7-RBD, производящая человеческие моноклональные антитела (чМКА) C6D7-RBD, специфичные к RBD домену S белка вируса SARS-CoV-2, обладающие вируснейтрализующей активностью, которые могут использоваться для накопления моноклонального иммуноглобулинового сырья с целью последующего изготовления терапевтического препарата.

Технический результат достигается тем, что предложен штамм гибридных культивируемых клеток H. sapiens/Mus. musculus Hu-C6D7-RBD - продуцент чМКА, специфичных к RBD домену S белка вируса SARS-CoV-2. Штамм депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск», коллекционный номер H-98.

Характеристика штамма гетерогибридной клеточной линии Hu-C6D7-RBD.

Видовая принадлежность: тригибридома мышь-человек-человек. Материал, используемый для получения гибридомы: плазмобластная фракция из цельной венозной крови донора, переболевшего новой коронавирусной инфекцией COVID-19, а через 6 месяцев после выздоровления иммунизированного вакциной «Спутник Лайт» (пр-во ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, Россия). Партнеры для гибридизации: клетки гетерогибридомы K6H6/B5 (ATCC® CRL-1823™), полученные слиянием клеток мышиной миеломы P3/NSI/1-Ag4-1 с малигнизированными клетками человека, больного нодулярной лимфомой.

Система селекции гибридных клеток – гипоксантин-аминоптерин-тимидин (HAT). Кратность клонирования – однократно.

Морфологическая характеристика. Культура тригибридных клеток Hu-C6D7-RBD представлена слабо прикрепленными к подложке округлыми клетками размером с исходную миеломную.

Характер роста на питательных средах: рост суспензионный, культивирование стационарное и динамическое в шейкере-инкубаторе с орбитальным движением платформы.

Культуральные свойства. Культивирование в питательной среде Hybridoma-SFM (Gibco, UK) при температуре 37 °С, 5% СО₂ и влажности 80%. Кратность рассева 1:2 – 1:3, время субкультивирования от 3 до 4 суток, посевная доза 50-100 тыс. кл./мл. Культивирование штамма производится при температуре 37 °C в атмосфере 5% углекислого газа.

Продуктивность гибридной клеточной линии in vitro. Титр иммуноглобулинов в культуральной жидкости после культивации в инкубаторе в колбах 1.6L Optimum Growth™ Flasks (Thomson, США), анализированный с использованием непрямого твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) – не менее 1:100 тыс. Концентрация иммуноглобулинов составляет в среднем 6 – 8 мг/л.

Контаминация штамма гибридных клеток. Проведено исследование методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени на выявление микоплазмы - не обнаружено; бактериологический посев на выявление бактерий и грибов - не обнаружены; проверка на вирусы - не проводилась.

Способ, условия и состав сред для криоконсервации:

А) среда для криоконсервации - 90% фетальной сыворотки (ФБС), 10% диметилсульфоксида;

Б) режим замораживания - пластиковые флаконы (виалы) с культурой клеток, по 2×10⁸ клеток/мл среды для криоконсервации в каждом флаконе. Замораживают в заданном режиме:

1) со скоростью 1 °С/мин до -70 °С.

2) через сутки виалы перемещают в хранилище с жидким азотом.

В) режим размораживания – выполняют на водяной бане при 37 °С в течение 2-3 минут. Виалы асептически вскрывают, содержимое переносят в центрифужную пробирку с 7-8 мл бессывороточной среды, центрифугируют 5 минут при 200×g, супернатант отбрасывают, клетки ресуспендируют в среде культивирования и переносят в лунки 6-луночного планшета или культуральный флакон с суточным фидерным слоем клеток. Жизнеспособность восстанавливаемых гибридом после криоконсервации составляет 75-85 %.

Характеристика полезного продукта. Полученный штамм гетерогибридных клеток Hu-C6D7- RBD производит высокоспецифичные человеческие моноклональные антитела подкласса IgG1, специфичные к RBD S-белка вируса SARS-CoV-2, проявляющие активность в непрямом твердофазном ИФА не менее 1:100 тыс. Человеческие моноклональные антитела из культуральной жидкости выделяют с помощью аффинной хроматографии на колонке с Protein G-сефарозой (HiTrapTM Protein G, Швеция), с последующей гель-фильтрацией на колонке Superdex 200 10/300 GL (GE Healthcare Bio-Sciences, Швеция). Чистоту полученных иммуноглобулиновых фракций оценивают методом электрофореза в денатурирующих условиях. Концентрацию иммуноглобулинов определяют при помощи планшетного спектрофотометра Smart Spec Plus (Bio-Rad, США) при длине волны 280 нм, а также с использованием инфракрасного спектрометра Direct Detect (Merck, Германия).

Изобретение осуществляют следующим образом:

Из периферической крови донора, переболевшего COVID-19 и иммунизированного через 6 месяцев вакциной «Спутник Лайт» (Россия), осуществляют забор сыворотки крови, которую проверяют в непрямом твердофазном ИФА в отношении специфичности к RBD домену вируса SARS-CoV-2. На 7 сутки после вакцинации осуществляют забор крови в вакуумные пробирки Vacuette (Greiner-Bio-One, Австрия) с лития гепарином для выделения субпопуляции плазмобластов и гибридизации с миеломной линией клеток.

Для увеличения выхода плазмобластов из периферической крови доноров поводят предварительное обогащение В-клеток с помощью коммерческого набора RosetteSep^TM Human B Cell Enrichment Cocktail (Stemcell Technologies, Канада). Фенотипирование плазмобластов и их сортинг осуществляют с использованием панели коммерческих МКА, конъюгированных с флуорохромами, против CD-антигенов (BD Biosciences, США). С помощью настольной системы для клеточного сортинга FACSAria III (Becton Dickinson, США) и с использованием программного обеспечения BD FACSDiva (версия 8.0) методом многократного гейтирования выделяют субпопуляцию плазмобластов с фенотипом CD19⁺CD20^loCD27^hiCD38^hi. Далее по заданному гейту осуществляют сортинг данной субпопуляции в стерильные полипропиленовые пробирки, содержащие 500 мкл фетальной сыворотки, для последующего элекстрослияния с клетками-партнерами.

В качестве партнера для гибридизации используют линейную гибридную культуру миеломных клеток K6H6/B5 (ATCC® CRL-1823™). Плазмобласты с фенотипом CD19⁺CD20^loCD27^hiCD38^hi и клетки K6H6/B5 смешивают в соотношении 1:2, отмывают чистой культуральной средой RPMI-1640, затем буфером для электрослияния BTXpress Cytofusion Medium C (BTX, Harvard Bioscience, США), в котором впоследствии ресуспендируют клетки. Электрослияние проводят в мультипораторе ECM2001 (BTX, США) с использованием микрослайда для слияния Model 453 (BTX, Harvard Bioscience, США) в режиме, включающем три стадии: выравнивание, импульс, пост-выравнивание.

По окончании процедуры слияния суспензию клеток выдерживают 30 минут в микрослайде при комнатной температуре, далее переносят в питательную среду Hybri-Care (ATCC® 46-X™) с 20% ФБС, однократным раствором HAT (Gibco 21060-017, Thermo Fisher, США) и вносят по 100 мкл полученной суспензии в лунки 96-луночных культуральных планшетов. Инкубируют клетки с заменой селективной культуральной среды раз в трое суток до появления видимого роста гибридных клеток в лунках, а затем и монослоя гибридных клеток.

Культуральную жидкость из лунок, в которых наблюдается рост гибридных клеток, тестируют в ИФА в отношении специфического взаимодействия с рекомбинантным RBD (his-sars2-rbd, Invivogen). Клетки из лунок, показавших наилучшую активность в отношении антигена, подвергают клонированию. Единичные клоны гетерогибридом наращивают в увеличивающихся объемах среды в культуральных флаконах, перманентно тестируя культуральную жидкость на наличие антител, специфически взаимодействующих с рекомбинантным RBD.

Для последующего масштабирования и очистки стабильные гетерогибридомы синтезирующие чМКА переводят со среды Hybri-Care (ATCC® 46-X™) с 20% ФБС на бессывороточную среду Hybridoma-SFM (Gibco, UK), с постепенным замещением среды в процентном соотношении 30:70%, 50:50%, 70:30%, 100%. После адаптирования клоны гетерогибридом наращивают с масштабированием: в культуральных флаконах Corning® T-25 и T-75, затем в качалочных колбах 1.6L Optimum Growth™ Flasks (Thomson, США), после чего выделяют из культуральной жидкости фракцию человеческих иммуноглобулинов G (IgG), применяя аффинную хроматографию на сорбенте с Protein G-сефарозой (HiTrapTM Protein G, Швеция), с последующей гель-фильтрацией на колонке Superdex™ 200 10/300 GL (GE Healthcare Bio-Sciences, Швеция).

Выделенные IgG (чМКА) тестируют на предмет специфической активности в отношении рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2.

Выбранные чМКА проверяют на вируснейтрализующую активность в тесте, демонстрирующем ингибирующее взаимодействие белка АСЕ2 с рекомбинантным белком RBD.

Изобретение иллюстрируют следующие графические материалы:

Фиг. 1. Результаты тестирования специфической активности сыворотки донора после перенесенного заболевания COVID-19 и после иммунизации вакциной «Спутник Лайт» в отношении рекомбинантного RBD методом ИФА.

Фиг. 2. Результаты отбора наиболее перспективных клонов гибридом-продуцентов чМКА, специфичных к рекомбинантных к RBD домену вируса SARS-CoV-2.

Фиг. 3. Результаты электрофореза в 10%-ом полиакриламидном геле (ПААГ) в денатурирующих и не денатурирующих условиях образца чМКА C6D7-RBD, выделенного из культуральной жидкости одноименной гетерогибридомы-продуцента Hu-C6D7-RBD.

Дорожка 1. Маркер молекулярных масс PageRuler™ Prestained Protein Ladder SM1811 (Fermentas, США). Дорожка 2 – образец чМКА С6D7-RBD в денатурирующих (с 2-меркаптоэтанолом) условиях. Дорожка 3 – образец чМКА С6D7-RBD в неденатурирующих (без 2-меркаптоэтанола) условиях.

Фиг. 4. Результаты электрофореза в 12%-ом полиакриламидном геле (ПААГ) в денатурирующих и не денатурирующих условиях образца рекомбинантного RBD домена вируса SARS-CoV-2.

Дорожка 1. Маркер молекулярных масс PageRuler™ Prestained Protein Ladder SM1811 (Fermentas, США). Дорожка 2 – рекомбинантный RBD в денатурирующих (с 2-меркаптоэтанолом) условиях. Дорожка 2 – рекомбинантный RBD в неденатурирующих (без 2-меркаптоэтанола) условиях.

Фиг.5. Результаты вестерн-блот анализа чМКА C6D7-RBD в отношении рекомбинантного белка RBD.

Дорожка 1. Маркер молекулярных масс PageRuler™ Prestained Protein Ladder SM1811 (Fermentas, США). Дорожка 2 – рекомбинантный RBD, детектированный чМКА C6D7-RBD.

Фиг. 6. Результат определения подкласса и изотипа очищенного чМКА C6D7-RBD с помощью иммунохроматографического экспресс-теста.

Фиг. 7. Результаты определения аффинного взаимодействия чМКА C6D7-RBD с белком-мишенью RBD.

Фиг. 8. Определение способности исследуемого чМКА C6D7-RBD оказывать вируснейтрализующую активность в тесте, демонстрирующем ингибирующее взаимодействие белка АСЕ2 с белком RBD.

Примеры получения и использования чМКА, синтезируемых штаммом гетерогибридной клеточной линии Hu-C6D7-RBD.

Пример 1. Получение сыворотки крови донора, переболевшего новой коронавирусной инфекцией COVID-19 и получение сыворотки крови того же донора после иммунизации вакциной «Спутник Лайт».

Образец объемом 20 мл собирают в центрифужные пробирки и отстаивают при комнатной температуре в течение 30 мин до полного образования тромба. Пробирки центрифугируют при 1200×g в течение 10 минут, по окончания центрифугирования отбирают сыворотку крови в чистые пробирки. При необходимости повторяют центрифугирование.

Пример 2. Тестирование специфической активности сыворотки донора, в отношении рекомбинантного белка RBD методом непрямого твердофазного ИФА.

В лунки 96-луночного полистиролового планшета вносят по 100 мкл раствора с рекомбинантным белком RBD в концентрации 1 мкг/мл на лунку в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) (137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na₂HPO₄, 1,76 мМ KH₂PO₄, рН 7.4) и инкубируют при температуре 37 °С в течение 2 часов на планшетном орбитальном шейкере (Elmi, Латвия) при скорости вращения платформы 370 об./мин. После инкубации каждую лунку планшета отмывают трехкратно ФСБ с добавлением 0,05% Tween-20 (ФСБ-Тw), каждый раз внося в лунки планшета по 200 мкл отмывающего раствора. Затем свободные валентности пластика блокируют молоком с массовой долей жира не более 0,5%, внося по 200 мкл на лунку, и инкубируют при температуре 37 °C в течение 1 часа при тех же условиях. После инкубации лунки планшета трехкратно отмывают ФСБ-Тw. Сыворотки донора после болезни и после иммунизации разводят в ФСБ в соотношениях от 1:25 до 1:1800 с двукратным шагом разведения и инкубируют в течение 1 ч на шейкере при температуре 37 °C, затем трехкратно промывают ФСБ-Тw. В качестве отрицательного контроля используется лунка с чистым ФСБ, в качестве положительного контроля используется ранее проверенная сыворотка крови донора с высоким титром антител к RBD белку в разведении 1:25. После инкубации лунки планшета трижды отмывают ФСБ-Тw. Далее в лунки добавляют кроличьи антитела против цельной молекулы IgG человека, конъюгированные с пероксидазой хрена (Sigma, США) в разведении 1:20 тыс (Sigma, США). Планшет инкубируют при температуре 37 °C в течение 40 минут на шейкере, затем 6 раз отмывают буфером ФСБ-Тw. После этого в лунки вносят по 100 мкл субстрат-индикаторного раствора (10 мкл 30% Н₂O₂ и 8 мг ортофенилендиамина на 10 мл фосфатно-цитратного буфера рН 5.0) (Sigma P4809, США). Положительную реакцию оценивают по появлению желто-коричневого окрашивания раствора. Реакцию останавливают добавлением в лунки по 50 мкл 4N серной кислоты. Детекцию результата цветной реакции проводят на планшетном спектрофотометре (Bio-Rad xMark, США) при длине волны 492 нм. Положительным считают результат, превышающий показатели оптической плотности отрицательного контроля не менее, чем в 2 раза. Результаты представлены на Фиг. 1.

Пример. 3. Выделение плазмобластов из цельной венозной крови донора.

Для выделения плазмобластов из цельной венозной крови донора, на 7 день после иммунизации вакциной «Спутник Лайт» проводят забор периферической крови в вакуумные пробирки Vacuette (Greiner-Bio-One, Австрия) с лития гепарином. Для увеличения выхода плазмобластов из периферической крови донора предварительно проводят преобогащение В-клеток с помощью коммерческого набора RosetteSep^TM Human B Cell Enrichment Cocktail (Stemcell Technologies, Канада). Гепаринизированную кровь инкубируют в пробирках в течение 20 мин с RosetteSep^TM Human B Cell Enrichment Cocktail из расчета 50 мкл реактива на 1 мл цельной крови. Затем кровь разводят в 2 раза ФСБ с 2% ФБС, наслаивают на градиент плотности RosetteSep^TM DM-L Density (Stemcell Technologies, Канада) в соотношении 1:1, и центрифугируют в течение 30 мин при 1200×g с выключенным тормозом при комнатной температуре. Полученное опалесцирующее кольцо на границе раздела двух сред отбирают и дважды отмывают в среде RPMI 1640 при 300×g в течение 10 мин, а затем ресуспендируют в полной питательной среде RPMI 1640, содержащей 2 мМ глутамина («ПанЭко»,Россия), 10 мМ HEPES (Sigma, США), 25 мкМ 2-меркаптоэтанола (Sigma, США) и 2% ФБС (TermoFisher Scientific, США). Жизнеспособность клеток оценивают на автоматическом счетчике ТС-20 (Bio-Rad, США) после окрашивания клеток трипановым синим (Invitrogen, США) по инструкции производителя.

Для выделения популяции плазмобластов преобогащенные В-лимфоциты окрашивают МКА, конъюгированными с флуорохромами: anti-CD19 APC (клон HIB19), anti-CD20 BV421 (клон 2H7), anti-CD38 PE-cy7 (клон HIT2), anti-CD27 BB515 (клон M-T271). В-лимфоциты (5×10⁶ клеток/мл) инкубируют с МКА в темноте в течение 20 мин при температуре 20 °С в соответствии с инструкцией производителя. Затем клетки дважды отмывают избытком ФСБ с 2% ФБС и осаждают центрифугированием 10 мин при 200×g.

С помощью системы для клеточного сортинга FACSAria III (Becton Dickinson, США), оснащенной тремя лазерами с длинами волн излучения 405, 488 и 633 нм, и с использованием программного обеспечения BD FACSDiva (версия 8.0) методом многократного гейтирования выделяют фракцию плазмобластов с фенотипом CD19⁺CD20^loCD27^hiCD38^hi. Далее по заданному гейту осуществляют сортинг данной субпопуляции в пробирку с 500 мкл ФБС.

Выделенные плазмобласты отмывают ФСБ с 2% ФБС двукратно в течение 10 мин при 300×g. Отмытый клеточный осадок ресуспендируют в 1 мл среды RPMI-1640, проводят подсчет концентрации клеток с применением автоматического счетчика клеток TC-20 (Bio-Rad, США), доводят концентрацию чистой культуральной средой до 1×10⁶ кл/мл.

Пример. 4. Получение гетерогибридом-продуцентов чМКА, специфичных к RBD домену вируса SARS-CoV-2.

В качестве клеток-партнеров для электрослияния с выделенными плазмобластами используют клеточную линию K6H6/B5 (ATCC® CRL1823™). Клетки K6H6/B5 предварительно культивируют в среде RPMI-1640 с содержанием 2 мМ L-глутамина и ФБС 10%. Культивирование клеточной линии K6H6/B5 проводят в культуральных флаконах Corning® T-150 при температуре 37 °С во влажной атмосфере с 5% СО2.

Гибридизацию проводят с помощью системы для электрослияния клеток, состоящей из генератора электрических импульсов BTX ECM 2001 и микрослайда Model 453 (BTX, Harvard Bioscience, США). Плазмобласты и клетки-партнеры берут в соотношении 1:2. Полученную клеточную взвесь дважды отмывают центрифугированием при 400×g в течение 5 мин в буфере для электрослияния BTXpress Cytofusion Medium C (BTX, Harvard Bioscience). Далее клетки ресуспендируют в 500 мкл буфера BTXpress Cytofusion Medium C и вносят в кювету для электрослияния. Электропорацию проводят по следующим параметрам: напряженность электрического поля 1560 V, длительность диэлектрофореза клеток 30 с. Показатели постоянного тока: амплитуда элекрического импульса 500 V, длительность импульса — 30 мкс, число приложенных импульсов 2. После электрослияния содержимое микрослайда оставляют на 30 мин при комнатной температуре, а затем переносят в 60 мл среды Hybri-Care (ATCC® 46-X™), содержащей 20% ФБС, однократным раствором HAT (Gibco, ThermoFisher, США) и вносят по 100 мкл полученной суспензии в лунки 96 луночных культуральных планшетов, избегая краевых лунок, в которые вносят раствор 1% CuSO₄ (Acros Organics, Бельгия).

В результате гибридизации получают семь 96-луночных планшетов, содержащих по 60 лунок с клетками.

Пример 5. Культивирование гетерогибридных клеток и получение клонов гетерогибридом, продуцирующих чМКА, специфичных к RBD домену вируса SARS-CoV-2.

96-луночные планшеты с клетками культивируют при 37 °C в 5% CO₂. Через 3-4 дня в каждой лунке заменяют питательную среду. Рост клеток контролируют с помощью светового микроскопа. Селекцию гетерогибридных колоний проводят с помощью селективных добавок HAT и HT (Thermo Fisher, США). На 14 день среду с содержанием HAT заменяют на среду, содержащую селективную добавку HT, а на 20 день меняют на питательную среду без селективных добавок.

По образованию монослоя гибридных клеток в лунке, питательную среду отбирают по 100 мкл на анализ специфической активности к RBD домену вируса SARS-CoV-2, методом иммуноферментного анализа. Для выполнения ИФА используют 96-луночный полистироловый планшет с иммобилизованным на нем рекомбинантным белком RBD (методика подготовки планшета соответствует описанной выше, в примере 2). В качестве отрицательного контроля используют лунку, в которую вносят чистый ФСБ. В качестве положительного контроля используется ранее проверенная сыворотка крови донора с высоким титром антител к RBD белку в разведении 1:25. Методика проведения ИФА описана в примере 2.

Для дальнейшей работы отбирают лунки, в которых показатели оптической плотности в ИФА превышают значения отрицательного контроля не менее чем в 2 раза.

Клонирование гетерогибридных клеток-продуцентов специфических чМКА к RBD белку проводят методом предельных разведений. Клетки в лунке ресуспендируют и подсчитывают их концентрацию на счетчике клеток TC-20, затем делают разведения суспензии в среде Hybri-Care из расчета 2 кл. на лунку (в 100 мкл), 1 кл. на лунку и 0,5 кл. на лунку. Каждым вариантом разведенной суспензии заполняют 60 лунок 96 луночного планшета. По мере нарастания гетерогибридных клеток в лунке, культуральную жидкость из лунок, содержащих визуализирующиеся клональные группы клеток, исследуют на специфическую активность в отношении RBD методом ИФА (аналогично описанному выше).

Колонии, показывающие хороший рост и стабильные высокие показатели в ИФА, при наработке монослоя подвергают переводу со среды Hybri-Care (ATCC® 46-X™) с 20% ФБС на бессывороточную среду Hybridoma-SFM (Gibco, UK), с постепенным замещением среды в процентном соотношении 30:70%, 50:50%, 70:30%, 100%. После адаптирования клоны гетерогибридом наращивают с масштабированием: в культуральных флаконах Corning® T-25 и T-75. Далле адаптированные гетерогибридомы к среде без ссыворотки подвергают культивированию в колбах 1.6L Optimum Growth™ Flasks (Thomson Instrument Company, США) при температуре 37 °C в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа. Результаты представлены на Фиг. 2. Количество клеток при субкультивировании в культуральных флаконах поддерживают в диапазоне между 1×10⁵ и 1×10⁶ кл/мл культуральной среды. Замену культуральной среды производят каждые 2-3 дня.

Для получения чМКА, культуральную жидкость, в которой культивировались гетерогибридомы, подвергают очистке методом аффинной хроматографии на колонке с Protein G-сефарозой (HiTrapTM Protein G, Швеция). Для очисти чМКА используют хроматографическую систему ÄKTA Start (GE Healthcare, Швеция). Колонку с полезной емкостью 3 мл, заполненную Protein G сефарозой, уравновешивают буфером нанесения (50 мМ Трис-HCl, 100 мМ NaCl, pH 7.4). Образец до нанесения на колонку подготавливают. Для этого фильтруют культуральную жидкость при помощи шприцевых фильтров Corning Incorporated (Германия), затем к профильтрованному раствору добавляют 1/10 объема буфера состава 500 мМ Трис-HCl, 1000 мМ NaCl, pH 7.4. Далее производят нанесение образца со скоростью 2 мл/мин на льду. После нанесения колонку отмывают от не связавшихся компонентов буфером нанесения (50 мМ Трис-HCl, 100 мМ NaCl pH 7.4) до достижения равновесия. Элюируют целевые чМКА с сорбента при помощи буфера 50 мМ Трис-HCl, 100 мМ NaCl, 50 мМ глицина, рН 2.4. Элюат собирают после начала экспоненциального роста величины абсорбции при 280 нм (А280) и заканчивают, когда А280 начинает снижаться по логарифмическому закону (выходить на плато). Уровень pH элюата доводят до 7,5 – 8,0 добавлением 1 М раствора Tris основания pH 11.0.

Выделенные IgG переводят в ФСБ и доочищают методом гель-фильтрации на сорбенте Superdex 200 10/300 GL (GE Healthcare, Великобритания). Хранят раствор иммуноглобулинов в ФСБ с добавлением 0,1 % NaN₃ при температуре 4-8 °С.

Для измерения концентрации чМКА проводят спектрофотометрию на приборе (Smart Spec Plus, Bio-Rad, США) при длине волны А₂₈₀, затем для расчета концентрации [мг/мл] полученное значение разделяют на коэффициент массовой экстинкции для IgG, равный 1,37. Чистоту полученной иммуноглобулиновой фракции оценивают методом SDS-электрофореза по Лэммли в 10%-ом полиакриламидном геле (ПААГ) в денатурирующих и неденатурирующих условиях. Гель подвергают окраске кумасси бриллиантовым синим R-250. Фиг. 3.

Пример 6. Тестирование иммунологической специфичности очищенного чМКА С6D7-RBD в отношении рекомбинантного белка RBD.

Фракцию целевого коммерчески доступного белка RBD (his-sars2-rbd, Invivogen) анализируют методом электрофореза в денатурирующих и не денатурирующих условиях в 12 % ПААГ. Результаты представлены на Фиг. 4.

Рекомбинантный RBD в количестве 1 мкг на дорожку подвергают ПААГ электрофорезу в денатурирующих условиях, после чего осуществляют горизонтальный перенос белка из геля на нитроцеллюлозную мембрану Hybond-C Extra (GE Healthcare, Великобритания) стандартным методом. Мембрану по окончании переноса погружают в обезжиренное (не более 0,5% жирности) молоко для блокировки свободных валентностей нитроцеллюлозы, инкубируют в течение часа при покачивании и температуре 37 °С. Мембрану промывают ФСБ- Тw трижды, после чего погружают в раствор с чМКА C6D7-RBD с концентрацией 10 мкг/мл в ФСБ. Инкубируют час при 37 °С с орбитальным перемешиванием, затем отмывают трижды ФСБ- Тw . Детектируют антитела на мембране козьими антителами против IgG человека, конъюгированными с пероксидазой хрена (Sigma, США). Для этого конъюгат с пероксидазой хрена разводят в ФСБ 1:10000, погружают в него нитроцеллюлозную мембрану и инкубируют 40 мин при покачивании и температуре 37 °С. Мембрану отмывают ФСБ-Тw не менее шести раз и проявляют 1% раствором диаминобензидина в ФСБ с добавлением хлоридов никеля и кобальта, а также 33% перекиси водорода в количестве 1 мкл на 1 мл красящего раствора. После развития окраски реакцию останавливают, ополаскивая мембрану водой и высушивая. Результаты представлены на Фиг. 5.

Пример 7. Определение подкласса и изотипа очищенного чМКА C6D7-RBD.

Для определения подкласса и изотипа очищенного чМКА C6D7-RBD используют иммунохроматографический экспресс-тест (Iso-Gold^™ Rapid Human Antibody Isotyping Kit, Канада). Согласно инструкции производителя, перед использованием экспресс-теста все компоненты доводят до комнатной температуры. Образец чМКА C6D7-RBD берут в разведении 1:100 и добавляют в культуральную пробирку с 200 мкл буфера для разбавления образца (Part Number SDB-004). Затем в культуральную пробирку с исследуемым образцом вставляют тест-полоску и ждут 10 минут, пока поток раствора пройдет по всей длине тест-полоски. Результат оценивают по проявлению красной индикаторной линии. Результаты представлены на Фиг. 6.

Пример 8. Определение аффинного взаимодействия чМКА C6D7-RBD с белком-мишенью RBD.

Сродство чМКА C6D7-RBD определяют методом поверхностного плазмонного резонанса (SPR) на приборе BIAcore X-100 (Biacore, Швеция). Анализ проводят при температуре 25 °С на сенсорном чипе CM5 в буфере HBS-EP (10 мМ Hepes, 150 мМ NaCl, 3 мМ EDTA и 0,005% поверхностно-активного вещества P20, pH 7.4). Антитела к гистидину конъюгируют с сенсорным чипом с использованием наборов His Capture Kit type 2 и Amine Coupling Kit (Cytiva, Швеция) в соответствии с инструкцией производителя. Эксперименты проводятся в предположении существования высокоаффинного комплекса антиген/антитело. Для всех нейтрализующих антител кинетические анализы проводят путем непрямого связывания с иммобилизованными на чипе CM5 анти-гистидиновыми антителами.

Рекомбинантный RBD (10 мкг/мл) наносят на чип со скоростью 30 мкл/мин в течение 3 минут. После 10-минутной стабилизации антитело (концентрации в диапазоне от 6,25 нМ до 100 нМ) вводили в течение 3 мин при постоянной скорости потока 40 мкл/мин. Диссоциацию контролируют в течение 90 мин, после чего чип регенерируют 10 мМ глицином pH 1,7 в течение 30 с при скорости потока 50 мкл/мин. Сенсорограммы нормализуют путем вычитания базовых значений RU из эталонной проточной кюветы (без захвата чМКА) и анализируют путем подгонки данных к модели связывания Ленгмюра 1:1 с помощью программного обеспечения Biacore T200 Evaluation Software.

Измерение равновесной константы диссоциации (K_D) для чМКА C6D7-RBD составило: K_D = 5,525×10^-9 М. Результаты представлены на Фиг. 7.

Пример 9. Определение способности исследуемого чМКА C6D7-RBD оказывать вируснейтрализующую активность в тесте, демонстрирующем ингибирующее взаимодействие белка АСЕ2 с белком RBD.

Для определения нейтрализующей активности проводят ИФА. В лунки 96-луночный полистиролового планшета иммобилизуют рекомбинантный белок RBD в концентрации 1 мкг/мл по описанной выше в прим. 2 методике. Затем в лунки планшета вносят очищенное чМКА C6D7-RBD с концентрацией от 10 мкг/мл до 0,078125 мкг/мл с двухратным серийным шагом разведения и инкубируют при тех же условиях. Следующим этапам в лунки вносят рекомбинантный белок человеческого ACE2 (fc-hace2, Invivogen) (внеклеточный домен, аминокислоты 18-740), конъюгированный с пероксидазой хрена с использованием набора LYNX Rapid HRP Antibody Conjugation Kit (Bio-Rad) и инкубируют 1 час при тех же условиях. После трехкратной отмывки в лунки планшета вносят по 100 мкл проявочного раствора на основе 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (TMB). Реакцию оценивают по появлению синего окрашивания раствора. Интенсивность окрашивания измеряют на планшетном спектрофотометре (Bio-Rad xMark) при длине волны 655 нм. За 100%-ю нейтрализующую активность принимают среднее значение оптической плотности фона (контрольные лунки без иммобилизации RBD, что равносильно случаю, когда он полностью заблокирован антителами), а за отсутствие нейтрализующей активности (0%) принимают среднее значение оптической плотности контрольных лунок, где ACE2-HRP взаимодействует с RBD без внесения антитела. По контрольным значениям получают линейную функцию, с помощью которой значения оптической плотности в опытных лунках с различным количеством антитела переводят в процентное значение нейтрализующей активности. Результаты представлены на Фиг. 8.

Claims (1)

1. Штамм гибридных культивируемых клеток Homo sapiens/Mus musculus C6D7-RBD - продуцент человеческих моноклональных антител, специфичных к рецептор-связывающему домену (RBD) S белка вируса SARS-CoV-2, депонирован в государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск», коллекционный номер H-98.

Images