RU2788097C2 - Therapeutic and neuroprotective peptides - Google Patents
Therapeutic and neuroprotective peptides Download PDFInfo
- Publication number
- RU2788097C2 RU2788097C2 RU2019126014A RU2019126014A RU2788097C2 RU 2788097 C2 RU2788097 C2 RU 2788097C2 RU 2019126014 A RU2019126014 A RU 2019126014A RU 2019126014 A RU2019126014 A RU 2019126014A RU 2788097 C2 RU2788097 C2 RU 2788097C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- retinal
- cells
- luminate
- field
- glycinyl
- Prior art date
Links
- 230000000324 neuroprotective Effects 0.000 title description 12
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title description 6
- 230000001225 therapeutic Effects 0.000 title description 3
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 claims abstract description 43
- 230000002207 retinal Effects 0.000 claims abstract description 18
- 229930002945 all-trans-retinaldehyde Natural products 0.000 claims abstract description 16
- 235000020945 retinal Nutrition 0.000 claims abstract description 16
- 239000011604 retinal Substances 0.000 claims abstract description 16
- 210000001116 Retinal Neurons Anatomy 0.000 claims abstract description 10
- 206010064930 Age-related macular degeneration Diseases 0.000 claims abstract description 8
- 208000002780 Macular Degeneration Diseases 0.000 claims abstract description 5
- 230000001965 increased Effects 0.000 claims abstract description 5
- 230000004410 intraocular pressure Effects 0.000 claims abstract description 5
- 230000004304 visual acuity Effects 0.000 claims abstract description 4
- 210000003583 Retinal Pigment Epithelium Anatomy 0.000 claims abstract description 3
- 230000003412 degenerative Effects 0.000 claims abstract 2
- 201000011056 retinal disease Diseases 0.000 claims abstract 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 7
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 4
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 claims description 4
- 206010038848 Retinal detachment Diseases 0.000 claims description 3
- 210000002301 Subretinal Fluid Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000001328 Optic Nerve Anatomy 0.000 abstract description 9
- 230000004380 optic nerve Effects 0.000 abstract description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- VLSMHEGGTFMBBZ-OOZYFLPDSA-N Kainic acid Chemical compound CC(=C)[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)[C@H]1CC(O)=O VLSMHEGGTFMBBZ-OOZYFLPDSA-N 0.000 description 24
- 229950006874 kainic acid Drugs 0.000 description 24
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 206010022114 Injury Diseases 0.000 description 16
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 13
- 210000001525 Retina Anatomy 0.000 description 12
- 239000003855 balanced salt solution Substances 0.000 description 12
- 210000000327 Mueller cell Anatomy 0.000 description 9
- 208000010412 Glaucoma Diseases 0.000 description 8
- 239000002609 media Substances 0.000 description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 210000003169 Central Nervous System Anatomy 0.000 description 6
- 208000003098 Ganglion Cysts Diseases 0.000 description 6
- 208000005400 Synovial Cyst Diseases 0.000 description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 6
- 210000004556 Brain Anatomy 0.000 description 5
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 5
- 230000001537 neural Effects 0.000 description 5
- 210000002569 neurons Anatomy 0.000 description 5
- 201000007737 retinal degeneration Diseases 0.000 description 5
- 230000004258 retinal degeneration Effects 0.000 description 5
- 238000007492 two-way ANOVA Methods 0.000 description 5
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 4
- 206010056677 Nerve degeneration Diseases 0.000 description 4
- 206010052639 Nerve injury Diseases 0.000 description 4
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 4
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 4
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 4
- 230000001146 hypoxic Effects 0.000 description 4
- 239000004090 neuroprotective agent Substances 0.000 description 4
- 230000001603 reducing Effects 0.000 description 4
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 4
- 238000000585 Mann–Whitney U test Methods 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 210000000278 Spinal Cord Anatomy 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal Effects 0.000 description 3
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 239000000306 component Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 description 3
- 230000000626 neurodegenerative Effects 0.000 description 3
- 230000002981 neuropathic Effects 0.000 description 3
- 230000004112 neuroprotection Effects 0.000 description 3
- 230000002887 neurotoxic Effects 0.000 description 3
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 1-[(1S,2R,3R,4S,5R,6R)-3-carbamimidamido-6-{[(2R,3R,4R,5S)-3-{[(2S,3S,4S,5R,6S)-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-3-(methylamino)oxan-2-yl]oxy}-4-formyl-4-hydroxy-5-methyloxolan-2-yl]oxy}-2,4,5-trihydroxycyclohexyl]guanidine Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 206010007515 Cardiac arrest Diseases 0.000 description 2
- 208000008069 Geographic Atrophy Diseases 0.000 description 2
- 208000010496 Heart Arrest Diseases 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L MgCl2 Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 206010053643 Neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 2
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 2
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 2
- 210000003994 Retinal Ganglion Cells Anatomy 0.000 description 2
- 208000007014 Retinitis Pigmentosa Diseases 0.000 description 2
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 2
- 238000010306 acid treatment Methods 0.000 description 2
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 230000000295 complement Effects 0.000 description 2
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 230000004406 elevated intraocular pressure Effects 0.000 description 2
- 230000002708 enhancing Effects 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000000302 ischemic Effects 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000926 neurological Effects 0.000 description 2
- 230000016273 neuron death Effects 0.000 description 2
- 239000002581 neurotoxin Substances 0.000 description 2
- 150000002978 peroxides Chemical group 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 2
- 230000002588 toxic Effects 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 229930006677 A03BA01 - Atropine Natural products 0.000 description 1
- 229940064005 Antibiotic throat preparations Drugs 0.000 description 1
- 229940083879 Antibiotics FOR TREATMENT OF HEMORRHOIDS AND ANAL FISSURES FOR TOPICAL USE Drugs 0.000 description 1
- 229940042052 Antibiotics for systemic use Drugs 0.000 description 1
- 229940042786 Antitubercular Antibiotics Drugs 0.000 description 1
- 210000000702 Aorta, Abdominal Anatomy 0.000 description 1
- 206010059512 Apoptosis Diseases 0.000 description 1
- RKUNBYITZUJHSG-SPUOUPEWSA-N Atropine Chemical compound O([C@H]1C[C@H]2CC[C@@H](C1)N2C)C(=O)C(CO)C1=CC=CC=C1 RKUNBYITZUJHSG-SPUOUPEWSA-N 0.000 description 1
- 229960000396 Atropine Drugs 0.000 description 1
- 229940098773 Bovine Serum Albumin Drugs 0.000 description 1
- 108091003117 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000020504 Collagenase family Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase family Proteins 0.000 description 1
- 210000000795 Conjunctiva Anatomy 0.000 description 1
- XVOYSCVBGLVSOL-UHFFFAOYSA-N Cysteic acid Chemical compound OC(=O)C(N)CS(O)(=O)=O XVOYSCVBGLVSOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010012601 Diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 206010012689 Diabetic retinopathy Diseases 0.000 description 1
- AAOVKJBEBIDNHE-UHFFFAOYSA-N Diazepam Chemical compound N=1CC(=O)N(C)C2=CC=C(Cl)C=C2C=1C1=CC=CC=C1 AAOVKJBEBIDNHE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000981 Epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 210000003722 Extracellular Fluid Anatomy 0.000 description 1
- JLXVRFDTDUGQEE-YFKPBYRVSA-N Gly-Arg Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N JLXVRFDTDUGQEE-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 229940093922 Gynecological Antibiotics Drugs 0.000 description 1
- WZUVPPKBWHMQCE-VYIIXAMBSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2C[C@@]2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-VYIIXAMBSA-N 0.000 description 1
- 229960004184 Ketamine Hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 206010025421 Macule Diseases 0.000 description 1
- 206010025425 Maculopathy Diseases 0.000 description 1
- 210000003205 Muscles Anatomy 0.000 description 1
- 102100002496 NOS2 Human genes 0.000 description 1
- 101700049309 NOS2 Proteins 0.000 description 1
- 206010029350 Neurotoxicity Diseases 0.000 description 1
- 208000008760 Optic Nerve Disease Diseases 0.000 description 1
- 206010061323 Optic neuropathy Diseases 0.000 description 1
- 108009000578 Oxidative Stress Proteins 0.000 description 1
- 229940055729 Papain Drugs 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 229940049954 Penicillin Drugs 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 210000001428 Peripheral Nervous System Anatomy 0.000 description 1
- 208000001293 Peripheral Nervous System Disease Diseases 0.000 description 1
- 206010034606 Peripheral neuropathy Diseases 0.000 description 1
- 231100000614 Poison Toxicity 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 208000008513 Spinal Cord Injury Diseases 0.000 description 1
- 229960005322 Streptomycin Drugs 0.000 description 1
- QOLYAJSZHIJCTO-VQVTYTSYSA-N Thr-Pro Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O QOLYAJSZHIJCTO-VQVTYTSYSA-N 0.000 description 1
- 229940024982 Topical Antifungal Antibiotics Drugs 0.000 description 1
- 206010044221 Toxic encephalopathy Diseases 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 210000001631 Vena Cava, Inferior Anatomy 0.000 description 1
- 206010047571 Visual impairment Diseases 0.000 description 1
- 208000000208 Wet Macular Degeneration Diseases 0.000 description 1
- 230000003213 activating Effects 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- HAMNKKUPIHEESI-UHFFFAOYSA-N aminoguanidine Chemical compound NNC(N)=N HAMNKKUPIHEESI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003484 anatomy Anatomy 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000009412 basement excavation Methods 0.000 description 1
- 229960000626 benzylpenicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000002146 bilateral Effects 0.000 description 1
- 201000004569 blindness Diseases 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001684 chronic Effects 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 229960003529 diazepam Drugs 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- LCGLNKUTAGEVQW-UHFFFAOYSA-N dimethyl ether Chemical compound COC LCGLNKUTAGEVQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cells Anatomy 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000007489 histopathology method Methods 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory Effects 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001771 impaired Effects 0.000 description 1
- 238000010874 in vitro model Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 1
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 1
- 229940079866 intestinal antibiotics Drugs 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- VCMGMSHEPQENPE-UHFFFAOYSA-N ketamine hydrochloride Chemical compound [Cl-].C=1C=CC=C(Cl)C=1C1([NH2+]C)CCCCC1=O VCMGMSHEPQENPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003902 lesions Effects 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 231100000189 neurotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 231100000228 neurotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 229940005935 ophthalmologic Antibiotics Drugs 0.000 description 1
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral Effects 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 201000007914 proliferative diabetic retinopathy Diseases 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating Effects 0.000 description 1
- 239000000790 retinal pigment Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 230000000472 traumatic Effects 0.000 description 1
- 229960001322 trypsin Drugs 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 230000004393 visual impairment Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Abstract
Description
Родственные заявкиRelated Applications
По настоящей заявке испрашивается приоритет в соответствии с предварительными заявками на патент США № 62/448300, озаглавленной «Нейропротекторные пептиды», поданной 19 января 2017 г., и 62/500998, озаглавленной «Терапевтические пептиды и их механизмы действия», поданной 3 мая 2017 г., полное раскрытие обоих этих заявок включено в настоящий документ посредством ссылки.This application claims priority under U.S. Provisional Applications No. 62/448,300 entitled "Neuroprotective Peptides" filed January 19, 2017 and 62/500998 entitled "Therapeutic Peptides and Their Mechanisms of Action" filed May 3, 2017 the full disclosure of both of these applications is incorporated herein by reference.
Перечень последовательностейSequence listing
Настоящая заявка содержит Перечень последовательностей, который был представлен в электронном виде в формате ASCII и настоящим полностью включен посредством ссылки. Указанная копия ASCII, созданная 31 мая 2018 г., называется ALLEG-008PC_SL.txt и имеет размер 591 байт. This application contains a Sequence Listing which has been submitted electronically in ASCII format and is hereby incorporated by reference in its entirety. The specified ASCII copy, created on May 31, 2018, is named ALLEG-008PC_SL.txt and is 591 bytes in size.
Область техники, к которой относится настоящее изобретениеThe field of technology to which the present invention relates
Настоящее изобретение в целом относится к областям биологии и медицины и, в частности, к нейропротекторным пептидам, используемым для лечения повреждений нервов, возникающих в результате нейродегенеративных или нейропатических заболеваний (например, глаукомы, пигментного ретинита, наследственных или приобретенных дегенераций сетчатки, периферической нейропатии, нейродегенеративной центральной нервной системы (ЦНС) или периферических нарушений), гипоксических поражений (например, остановки сердца или инсульта) или механических повреждений (например, травмы, повреждений спинного мозга), а также применимы для усиления восстановления сетчатки и неврологических тканей и регенерационной терапии сетчатки и неврологических заболеваний посредством улучшения иммуномодулирующей функции.The present invention generally relates to the fields of biology and medicine and, in particular, to neuroprotective peptides used to treat nerve damage resulting from neurodegenerative or neuropathic diseases (for example, glaucoma, retinitis pigmentosa, hereditary or acquired retinal degenerations, peripheral neuropathy, neurodegenerative central nervous system (CNS) or peripheral disorders), hypoxic injury (e.g., cardiac arrest or stroke) or mechanical injury (e.g., trauma, spinal cord injury), and are also applicable to enhance retinal and neurological tissue repair and regeneration therapy of the retina and neurological diseases by improving immunomodulatory function.
Предшествующий уровень техники настоящего изобретенияBackground of the Invention
В соответствии с 37 CFR 1.71(e) настоящий патентный документ содержит материал, который подлежит защите авторских прав, и владелец настоящего патентного документа сохраняет за собой все авторские права.Pursuant to 37 CFR 1.71(e), this patent document contains material that is subject to copyright protection, and the owner of this patent document retains all copyright.
Известно, что помимо травматических повреждений нервов и гипоксических поражений различные заболевания вызывают нейродегенеративные или нейропатические эффекты. Например, глаукома представляет собой нейропатию зрительного нерва, которая вызывает экскавацию или «купирование» диска зрительного нерва, дегенерацию ганглиозных клеток сетчатки и, как следствие, потерю поля зрения. Поскольку повышенное внутриглазное давление (IOP) является основным фактором риска развития глаукомы, многие стратегии лечения были направлены на снижение внутриглазного давления.In addition to traumatic nerve injuries and hypoxic lesions, various diseases are known to cause neurodegenerative or neuropathic effects. For example, glaucoma is an optic neuropathy that causes excavation or “cupping” of the optic disc, degeneration of retinal ganglion cells, and consequent loss of the visual field. Because elevated intraocular pressure (IOP) is a major risk factor for the development of glaucoma, many treatment strategies have focused on lowering intraocular pressure.
Недавние исследования показывают, что дегенерация нерва, возникающая при глаукоме, может быть результатом процесса, подобного тому, который происходит после травматического повреждения нейронов центральной нервной системы (ЦНС). Например, после повреждения ЦНС уровни некоторых нейротоксичных веществ увеличиваются во внеклеточной жидкости. Считается, что эти токсичные вещества затем вызывают вторичное повреждение нейронов в дополнение к механическому повреждению, которое произошло в результате первичной травмы. Лекарственные средства, способные предотвращать или уменьшать действие этих нейротоксических веществ, могут быть кандидатами для разработки не только в качестве нейропротекторов для глаз, но также и в качестве нейропротекторов, применимых для уменьшения гибели или нарушений нейронов после повреждения или травмы других нейрональных тканей, включая в себя головной и спинной мозг. Смотрите Yoles, E., et al.; a2-Adrenoreceptor Agonists Are Neuroprotective in a Rat Model of Optic Nerve Degeneration; Investigative Ophthalmology & Visual Science, Vol. 40, No. 1, pp. 65-73 (January 1999) и Neufeld, A.H., et al.; Inhibition of Nitric-Oxide Synthase 2 by Aminoguanidine Provides Neuroprotection of Retinal Ganglion Cells in a Rat Model of Chronic Glaucoma; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (1999).Recent studies suggest that the nerve degeneration that occurs in glaucoma may be the result of a process similar to that which occurs after traumatic injury to central nervous system (CNS) neurons. For example, after CNS injury, the levels of certain neurotoxic substances increase in the extracellular fluid. It is believed that these toxic substances then cause secondary neuronal damage in addition to the mechanical damage that occurred as a result of the primary injury. Drugs capable of preventing or reducing the effects of these neurotoxic agents may be candidates for development not only as neuroprotective agents for the eye, but also as neuroprotective agents useful in reducing neuronal death or damage following damage or injury to other neuronal tissues, including brain and spinal cord. See Yoles, E., et al.; a2-Adrenoreceptor Agonists Are Neuroprotective in a Rat Model of Optic Nerve Degeneration; Investigative Ophthalmology & Visual Science, Vol. 40, no. 1, pp. 65-73 (January 1999) and Neufeld, A.H., et al.; Inhibition of Nitric-
Заявитель в настоящее время разрабатывает синтетический олигопептид (Luminate®, Allegro Ophthalmics, LLC), который ингибирует ряд интегринов и при введении в глаз может вызывать витреолиз, заднюю витреоретинальную отслойку (PVD) и может использоваться для лечения нарушений зрения, таких как влажная форма макулодистрофии (WMD), диабетическая ретинопатия (PDR), диабетическая макулопатия (DME) и витреомакулярная тракция (VMT). Как описано в настоящем документе, заявитель обнаружил, что этот синтетический олигопептид также демонстрирует нейропротекторные эффекты в крысиной модели дегенерации зрительного нерва и, как указано выше, также может быть эффективным для предотвращения или восстановления других типов повреждения или дегенерации нерва, таких как вторичное повреждение нейронов, связанное с травматическими повреждениями.Applicant is currently developing a synthetic oligopeptide (Luminate®, Allegro Ophthalmics, LLC) that inhibits a number of integrins and when injected into the eye can cause vitreolysis, posterior vitreoretinal detachment (PVD) and can be used to treat visual impairments such as wet macular degeneration ( WMD), diabetic retinopathy (PDR), diabetic maculopathy (DME), and vitreomacular traction (VMT). As described herein, Applicant has found that this synthetic oligopeptide also exhibits neuroprotective effects in a rat model of optic nerve degeneration and, as stated above, may also be effective in preventing or repairing other types of nerve injury or degeneration such as secondary neuronal injury, associated with traumatic injuries.
Краткое раскрытие настоящего изобретенияBrief summary of the present invention
В соответствии с настоящим изобретением предложен способ индукции у человека или отличного от человека животного эффекта, выбранного из следующих: нейропротекция, защита от патологии или повреждения нервов или их уменьшение, лечение глаукомы, лечение возрастной макулярной дегенерации или других унаследованных или приобретенных дегенераций сетчатки, усиление восстановления ткани сетчатки, усиление регенеративной терапии сетчатки посредством активации врожденных иммунных клеток или лечение наследственной или приобретенной дегенерации сетчатки. Такой способ предусматривает введение субъекту неприродного пептида, который вызывает такой эффект, в количестве, которое эффективно для того, чтобы вызвать такой эффект.The present invention provides a method for inducing in a human or non-human animal an effect selected from the following: neuroprotection, protection against or reduction of nerve pathology or damage, treatment of glaucoma, treatment of age-related macular degeneration or other inherited or acquired retinal degenerations, enhancement of recovery retinal tissue, enhancing retinal regenerative therapy by activating innate immune cells, or treating hereditary or acquired retinal degeneration. Such a method involves administering to the subject a non-natural peptide that causes such an effect, in an amount that is effective to cause such an effect.
В соответствии с настоящим изобретением, пептид может содержать глицинил-аргинил-глицинил-цистеиновую кислоту-треонил-пролин (SEQ ID NO: 1), включая в себя любой фрагмент, аналог, производное, фармацевтически приемлемую соль, гидрат, изомер, мультимер, циклическую форму, линейную форму, конъюгат, производное или другую модифицированную форму, которая вызывает указанный эффект. Другие неприродные пептиды, которые могут быть использованы в способах по настоящему изобретению, могут включать в себя некоторые из соединений, описанных в рассматриваемой предварительной заявке на патент США № 62/521984, поданной 19 июня 2017 г., полное описание которой прямо включено в настоящий документ посредством ссылки.In accordance with the present invention, the peptide may contain glycinyl-arginyl-glycinyl-cysteinic acid-threonyl-proline (SEQ ID NO: 1), including any fragment, analogue, derivative, pharmaceutically acceptable salt, hydrate, isomer, multimer, cyclic form, linear form, conjugate, derivative or other modified form that causes the specified effect. Other non-natural peptides that may be used in the methods of the present invention may include some of the compounds described in pending US Provisional Application No. 62/521,984, filed June 19, 2017, the full disclosure of which is expressly incorporated herein. through a link.
Кроме того, в соответствии с настоящим изобретением, способ может быть осуществлен для защиты от повреждения, уменьшения повреждения или восстановления функции после повреждения зрительного нерва и/или сетчатки у субъекта, страдающего от глаукомы, возрастной макулярной дегенерации, сухой макулярной дегенерации или других наследственных или приобретенных дегенераций сетчатки, таких как пигментный ретинит.In addition, in accordance with the present invention, the method can be carried out to protect against damage, reduce damage, or restore function after damage to the optic nerve and/or retina in a subject suffering from glaucoma, age-related macular degeneration, dry macular degeneration, or other hereditary or acquired retinal degenerations such as retinitis pigmentosa.
Кроме того, в соответствии с настоящим изобретением способ может быть осуществлен для лечения субъекта, который перенес травму, механическое повреждение или поражение (например, гипоксическое или ишемическое поражение) головного мозга, спинного мозга, ЦНС или периферической нервной системы.In addition, in accordance with the present invention, the method can be carried out for the treatment of a subject who has suffered trauma, mechanical damage or damage (for example, hypoxic or ischemic damage) to the brain, spinal cord, CNS or peripheral nervous system.
Кроме того, в соответствии с настоящим изобретением способ может быть осуществлен для лечения или восстановления ослабленной функции головного мозга или другой части нервной системы субъекта после события, повреждающего нерв или головной мозг, такого как заболевание, травма или поражение, включая в себя, без ограничения, остановку сердца, инсульт, гипоксическое или ишемическое поражение, заболевание, нарушение или травму.In addition, in accordance with the present invention, the method can be carried out to treat or restore impaired function of the brain or other part of the nervous system of a subject after a nerve or brain damaging event, such as a disease, injury, or injury, including, without limitation, cardiac arrest, stroke, hypoxic or ischemic injury, disease, disorder or injury.
Кроме того, в соответствии с настоящим изобретением способ может быть осуществлен для защиты или уменьшения повреждения нерва из-за нейропатического или нейродегенеративного заболевания или нарушения, будь то глазное или системное.In addition, according to the present invention, the method can be carried out to protect or reduce nerve damage due to a neuropathic or neurodegenerative disease or disorder, whether ocular or systemic.
Другие аспекты и детали настоящего изобретения будут понятны после прочтения подробного описания и примеров, изложенных ниже.Other aspects and details of the present invention will become apparent upon reading the detailed description and examples set forth below.
Краткое описание графических материаловBrief description of graphic materials
Следующее подробное описание и примеры предоставлены с целью неисчерпывающего описания некоторых, но не обязательно всех, примеров или вариантов осуществления настоящего изобретения и никоим образом не должны ограничивать объем настоящего изобретения.The following detailed description and examples are provided for the purpose of non-exhaustive description of some, but not necessarily all, examples or embodiments of the present invention and should in no way limit the scope of the present invention.
Фиг. 1 представляет собой гистограмму сравнения количества ганглиозных клеток в каждом поле с количеством исследованных полей, как описано в примере 1 ниже, при обработке люминатом по сравнению с контролем.Fig. 1 is a bar graph comparing the number of ganglion cells in each field with the number of fields examined, as described in Example 1 below, when treated with luminate compared to control.
Фиг. 2 представляет собой гистограмму сравнения общего количества клеток во всех полях с количеством всех клеток при обработке люминатом и контроле, как описано в примере 1 ниже, при обработке люминатом и контроле.Fig. 2 is a bar graph comparing the total number of cells in all fields with the number of all cells in the luminate treatment and control, as described in Example 1 below, in the luminate treatment and control.
Фиг. 3 представляет собой гистограмму сравнения количества клеток пигментного эпителия сетчатки (RPE) в контрольных и обработанных планшетах, как описано в примере 2 ниже (условные обозначения: Cont = контрольная (BSS) обработка; Lu = обработка люминатом (только); H2O2, 100 мкМ = обработка пероксидом (только); Lu, H2O2, 100 мкМ = люминат с последующей обработкой пероксидом).Fig. 3 is a bar graph comparing the number of retinal pigment epithelial (RPE) cells in control and treated plates as described in Example 2 below (symbols: Cont = control (BSS) treatment; Lu = luminate treatment (only); H2O2, 100 μM = peroxide treatment (only); Lu, H2O2, 100 μM = luminate followed by peroxide treatment).
Фиг. 4 представляет собой гистограмму сравнения количества клеток Мюллера сетчатки в контрольных и обработанных планшетах, как описано в примере 3 ниже (условные обозначения: Cont = контрольная (BSS) обработка; Lu = обработка люминатом (только); KA = обработка каиновой кислотой (только) и KA-Lu, 500 мкМ = люминат с последующей обработкой каиновой кислотой).Fig. 4 is a bar graph comparing the number of retinal Müller cells in control and treated plates as described in Example 3 below (symbols: Cont = control (BSS) treatment; Lu = luminate treatment (only); KA = kainic acid treatment (only) and KA-Lu, 500 μM = luminate followed by treatment with kainic acid).
На фиг. 5 показаны гистологические микрофотографии ткани сетчатки, взятые у крыс, обработанных контрольными или увеличивающимися дозами нейротоксического средства каиновой кислотой, как описано в примере 4 ниже.In FIG. 5 shows histological micrographs of retinal tissue taken from rats treated with control or increasing doses of the neurotoxic agent kainic acid as described in Example 4 below.
Фиг. 6 представляет собой гистограмму сравнения количества нейронов сетчатки в контрольных и обработанных планшетах, как описано в примере 5 ниже (условные обозначения: Cont = контрольная (BSS) обработка; Lu = обработка люминатом (только); KA, 100 мкМ = обработка каиновой кислотой (только) и Lu-KA, 100 мкМ = люминат с последующей обработкой каиновой кислотой).Fig. 6 is a bar graph comparing the number of retinal neurons in control and treated plates as described in Example 5 below (label: Cont = control (BSS) treatment; Lu = luminate treatment (only); KA, 100 μM = kainic acid treatment (only ) and Lu-KA, 100 μM = luminate followed by treatment with kainic acid).
Подробное описание настоящего изобретенияDetailed description of the present invention
Следующее подробное описание и сопровождающие графические материалы, на которые оно ссылается, предназначены для описания некоторых, но не обязательно всех, примеров или вариантов осуществления настоящего изобретения. Описанные варианты осуществления следует рассматривать во всех отношениях только как иллюстративные, а не ограничивающие. Содержание этого подробного описания и прилагаемых графических материалов никоим образом не ограничивают объем настоящего изобретения.The following detailed description and the accompanying drawings to which it refers are intended to describe some, but not necessarily all, examples or embodiments of the present invention. The described embodiments are to be considered in all respects only as illustrative and not restrictive. The contents of this detailed description and the accompanying drawings do not limit the scope of the present invention in any way.
Заявитель изучил безопасность и нейропротектекторные эффекты соединения, содержащего неприродный пептид глицинил-аргинил-глицинил-цистеиновая кислота-треонил-пролин (SEQ ID NO: 1), имеющего структурную формулу соединения 1 ниже (также упоминаемого как ALG-1001 или Luminate®, Allegro Ophthalmics, LLC):Applicant studied the safety and neuroprotective effects of a compound containing a non-natural peptide glycinyl-arginyl-glycinyl-cysteic acid-threonyl-proline (SEQ ID NO: 1) having the structural formula of
Циклическая форма неприродного пептида глицинил-аргинил-глицинил-цистеиновая кислота-треонил-пролин (SEQ ID NO: 1) показана ниже как соединение 2:The cyclic form of the unnatural peptide glycinyl-arginyl-glycinyl-cysteinic acid-threonyl-proline (SEQ ID NO: 1) is shown below as Compound 2:
Соединения 1 и 2, а также другие родственные соединения описаны в рассматриваемых патентных заявках США с серийными номерами 13/467995 и 14/696250, причем полное раскрытие каждой такой заявки специально включено в настоящий документ посредством ссылки.
Пример 1Example 1
Глазная нейропротекция in vivo на крысиной моделе повышенного внутриглазного давленияOcular neuroprotection in vivo in a rat model of elevated intraocular pressure
Здоровых крыс Wister (n=8) в возрасте десяти (10) недель содержали в виварии, в котором поддерживалась постоянная температура 26°C и постоянный цикл свет-темнота (14 часов и 10 часов, соответственно) с доступной по желанию пищей. Крыс случайным образом делили на группу лечения люминатом из пяти (5) животных (группа А) и группу лечения основным солевым раствором (контроль BSS) из трех (3) животных (группа В).Healthy Wister rats (n=8) at ten (10) weeks of age were housed in a vivarium maintained at a constant temperature of 26°C and a constant light-dark cycle (14 hours and 10 hours, respectively) with food available at will. Rats were randomly divided into a luminate treatment group of five (5) animals (Group A) and a basic saline treatment (BSS control) group of three (3) animals (Group B).
Каждое животное группы А получало одну интравитреальную инъекцию в дозе 1,28 мг/20 мкл люмината в правый глаз. Каждое животное группы В получало по одной интравитреальной инъекции в дозе 20 мкл сбалансированного солевого раствора (BSS). Левые глаза всех животных в группах A и B не подвергали инъекции и использовали в качестве необработанных контролей. Интравитреальные инъекции вводили на расстоянии 2 мм за каймой в супроназальном квадранте с использованием иглы 30-го калибра, прикрепленной к шприцу объемом 1,0 куб. Были приняты меры, чтобы избежать повреждения линзы или сетчатки.Each animal in group A received one intravitreal injection of 1.28 mg/20 μl of luminate into the right eye. Each animal in group B received one intravitreal injection of 20 μl of balanced salt solution (BSS). The left eyes of all animals in groups A and B were not injected and were used as untreated controls. Intravitreal injections were administered 2 mm behind the border in the supronasal quadrant using a 30-gauge needle attached to a 1.0 cc syringe. Care was taken to avoid damage to the lens or retina.
Через двадцать четыре (24) часа после введения инъекций крыс анестезировали путем внутрибрюшинной инъекции в дозе 3,0 мл/кг смеси гидрохлорида кетамина (2,5 мг/мл), диазепама (2,0 мг/мл) и атропина (0,1 мг/мл). Затем глаза подвергали перитонеальной отслойке конъюнктивы боковой прямой мышцы, чтобы обнажить зрительный нерв. Затем зрительный нерв лигировали шелковым швом в течение 60 минут, в течение которых отсутствие кровотока в сетчатке каждого лигированного глаза проверяли с помощью контактной линзы Plano. Лигатуры удаляли через 60 минут, и восстановление кровотока в сетчатке проверяли в каждом ранее лигированном глазу с использованием контактной линзы Plano.Twenty-four (24) hours after injection, rats were anesthetized by intraperitoneal injection of 3.0 ml/kg of a mixture of ketamine hydrochloride (2.5 mg/ml), diazepam (2.0 mg/ml) and atropine (0.1 mg/ml). The eyes were then subjected to a peritoneal detachment of the conjunctiva of the lateral rectus muscle to expose the optic nerve. The optic nerve was then ligated with a silk suture for 60 minutes, during which time the absence of retinal blood flow in each ligated eye was checked with a Plano contact lens. The ligatures were removed after 60 minutes and restoration of retinal blood flow was checked in each previously ligated eye using a Plano contact lens.
После удаления лигатур и проверки восстановления кровотока в сетчатке крыс содержали живыми в течение 48 часов, а затем умерщвляли посредством направления в брюшную аорту и нижнюю полую вену и перфузии 200 мл 10% формальдегида.After removing the ligatures and checking for restoration of blood flow in the retina, the rats were kept alive for 48 hours and then sacrificed by directing to the abdominal aorta and inferior vena cava and perfusion with 200 ml of 10% formaldehyde.
Затем глаза энуклеировали и фиксировали для гистопатологического анализа. Образцы сетчатки и зрительного нерва от каждого глаза обезвоживали и погружали в парафин. Горизонтальные срезы толщиной 4 микрона разрезали и окрашивали гематоксилином и эозином. Посредством световой микроскопии подсчитывали количество ганглиозных клеток в осевых срезах сетчатки каждого глаза от границы между зрительно и слепой частями сетчатки до зрительного нерва. Кроме того, в каждом сечении число ганглиозных клеток на миллиметр по всей длине сетчатки рассчитывали в цифровом виде с использованием калибровочного предметного стекла, откалиброванного для этой цели.The eyes were then enucleated and fixed for histopathological analysis. Retinal and optic nerve samples from each eye were dehydrated and embedded in paraffin.
Измерение внутреннего сетчатого слоя проводили путем наблюдения срезов при увеличении в 40 раз не более 1 мм от зрительного нерва.Measurement of the inner reticular layer was performed by observing sections at a magnification of 40 times no more than 1 mm from the optic nerve.
Результаты подвергали статистическому анализу. Результаты для каждой группы выражали как среднее ± стандартное отклонение, и статистическую значимость между результатами групп оценивали с помощью двухфакторного дисперсионного анализа, а также U-критерия Манна-Уитни. Вероятности <0,05 считались значимыми.The results were subjected to statistical analysis. Results for each group were expressed as mean ± standard deviation, and statistical significance between group results was assessed using a two-way analysis of variance as well as the Mann-Whitney U-test. Probabilities <0.05 were considered significant.
В таблице 1 ниже показано количество ганглиозных клеток на поле для пяти (5) глаз, обработанных LUMINATE®, и трех глаз, обработанных BSS (контроль):Table 1 below shows the number of ganglion cells per field for five (5) LUMINATE® treated eyes and three BSS treated eyes (control):
Таблица 1Table 1
В таблице 2 ниже представлен двухфакторный дисперсионный анализ данных, представленных в таблице 1. Группа A включает в себя глаза, обработанные ALG1001, а группа B включает в себя глаза, обработанные BSS (контроль):Table 2 below presents a two-way analysis of variance on the data presented in Table 1. Group A includes eyes treated with ALG1001 and group B includes eyes treated with BSS (control):
Таблица 2table 2
В таблице 3 приведены результаты дисперсионного анализа в виде таблицы, представленные в таблице 2, с указанием статистически значимой разницы (р<0,0001) между глазами, обработанными люминатом (группа A), и глазами, обработанными BSS (контроль) (группа B).Table 3 summarizes the results of the analysis of variance in the form of a table presented in Table 2, indicating a statistically significant difference (p<0.0001) between eyes treated with luminate (group A) and eyes treated with BSS (control) (group B) .
Таблица 3Table 3
Табличные результаты двухфакторного дисперсионного анализаTabular results of two-way analysis of variance
Фиг. 1 представляет собой столбчатую диаграмму количества ганглиозных клеток в каждом поле относительно количества полей, исследованных в отношении обработки люминатом и контроля, иллюстрирующую различия между средним.Fig. 1 is a bar graph of the number of ganglion cells in each field versus the number of fields examined for luminate treatment and control, illustrating the differences between the mean.
В таблице 4 показаны результаты в табличном виде U-критерия Манна-Уитни, которые также указывают на статистически значимое различие (р<0,0001) между глазами, обработанными люминатом (группа A), и глазами, обработанными BSS (контроль) (группа B).Table 4 shows the results in tabular form of the Mann-Whitney U-test, which also indicate a statistically significant difference (p<0.0001) between Luminate treated eyes (group A) and BSS treated eyes (control) (group B ).
Таблица 4Table 4
Табличные результаты Манна-УитниMann-Whitney tabular results
Фиг. 2 представляет собой гистограмму сравнения среднего количества ганглиозных клеток на поле между глазами, обработанными люминатом (группа A), и глазами, обработанными BSS (контроль) (группа B), с использованием U-критерия Манна-Уитни.Fig. 2 is a bar graph comparing the mean number of ganglion cells per field between luminate-treated eyes (Group A) and BSS-treated (control) eyes (Group B) using the Mann-Whitney U-test.
На основании этих данных примера 1 сделан вывод, что интравитреальное введение препарата, содержащего эффективное количество пептида глицинил-аргинил-глицинил-цистеиновая кислота-треонил-пролин (SEQ ID NO: 1) (люминат), характеризовалось значительными нейропротективными эффектами у этой крысиной модели повышенного IOP. Как отмечалось выше, положительные результаты на этой животной модели индуцированного глаукомой повреждения нейронов в глазу не только свидетельствуют о его полезности в качестве нейропротекторного средства для глаз, но также и в качестве нейропротекторного средства, применимого для снижения гибели или нарушения нейрональной функции после повреждения или травмы других нейрональных тканей, в том числе головного и спинного мозга.Based on these data from Example 1, it was concluded that intravitreal administration of a preparation containing an effective amount of the peptide glycinyl-arginyl-glycinyl-cysteic acid-threonyl-proline (SEQ ID NO: 1) (luminate) was characterized by significant neuroprotective effects in this rat model of increased IOP. As noted above, the positive results in this animal model of glaucoma-induced neuronal injury in the eye not only suggest its usefulness as a neuroprotective agent for the eye, but also as a neuroprotective agent useful in reducing neuronal death or impairment following damage or injury to others. neuronal tissues, including the brain and spinal cord.
Пример 2Example 2
InVitro нейропротекторное действие люмината на пигментный эпителий сетчатки (RPE)InVitro Neuroprotective Effect of Luminate on Retinal Pigment Epithelium (RPE)
Известно, что пероксид водорода (H2O2), физиологический медиатор окислительного стресса, вызывает апоптоз в эпителиальных клетках сетчатки (RPE).Hydrogen peroxide (H2O2), a physiological mediator of oxidative stress, is known to induce apoptosis in retinal epithelial cells (RPE).
Клетки ARPE-19 инкубировали в среде DMEM/F12 с добавлением фетальной бычьей сыворотки (FBS) в концентрации 10% и стрептомицина в концентрации 50 мкг/мл и пенициллина в концентрации 50 мкг/мл при температуре 37°C в атмосфере 5% CO2. Для индукции дифференцировки клетки ARP-19 культивировали в трансвелах с покрытием ламинином в течение 2 недель в той же среде, дополненной 1% FBS и антибиотиками. Затем клетки RPE выделяли и аликвоты приблизительно 150-200 мкл клеточной суспензии распределяли в чашки Петри, содержащие контрольную среду. Затем клетки инкубировали при температуре 37°С в течение 24 часов перед использованием.ARPE-19 cells were incubated in DMEM/F12 medium supplemented with fetal bovine serum (FBS) at a concentration of 10% and streptomycin at a concentration of 50 μg/ml and penicillin at a concentration of 50 μg/ml at a temperature of 37°C in an atmosphere of 5% CO 2 . To induce differentiation, ARP-19 cells were cultured in laminin-coated transveils for 2 weeks in the same medium supplemented with 1% FBS and antibiotics. The RPE cells were then isolated and approximately 150-200 μl aliquots of the cell suspension were dispensed into petri dishes containing control medium. The cells were then incubated at 37° C. for 24 hours before use.
После этого готовили следующие четыре (4) отдельные чашки нейронов, как показано ниже:After that, the following four (4) individual dishes of neurons were prepared, as shown below:
А) Контрольные клетки сетчатки RPE;A) Control cells of the retina RPE;
B) Клетки сетчатки RPE, инкубированные с ALG-1001 (люминат) в концентрации 1,0 мг/мл;B) RPE retinal cells incubated with ALG-1001 (luminate) at a concentration of 1.0 mg/ml;
C) Клетки сетчатки RPE, инкубированные с пероксидом водорода в концентрации 100 мкМ; а такжеC) Retinal RPE cells incubated with 100 μM hydrogen peroxide; as well as
D) Клетки RPE сетчатки, инкубированные с ALG-1001 (люминат) в концентрации 1,0 мг/мл в течение 24 часов перед воздействием пероксидом водорода в концентрации 100 мкМ.D) Retinal RPE cells incubated with ALG-1001 (luminate) at a concentration of 1.0 mg/ml for 24 hours prior to exposure to hydrogen peroxide at a concentration of 100 μM.
Через восемь (8) часов после воздействия количество клеток измеряли с использованием способа вытеснения трипанового синего в камере Нейбауэра. Фиг. 3 представляет собой гистограмму сравнения количества клеток RPE на планшетах A, B, C и D. Эти данные примера 2 показывают, что пероксид водорода был токсичен для клеток RPE, о чем свидетельствует тот факт, что количество клеток RPE в планшете, обработанном только пероксидом водорода (планшет C), составляло только 78% от количества контрольных клеток (планшет A). Однако количество клеток RPE в планшете, предварительно обработанном ALG-1001 (люминатом) до воздействия пероксида водорода (пластина D), составляло 90% от количества контрольных клеток (пластина A), что указывает на то, что предварительная обработка ALG-1001 (люминатом), характеризовалась нейропротекторным эффектом в этой модели in vitro.Eight (8) hours after exposure, cell counts were measured using the trypan blue displacement method in a Neubauer chamber. Fig. 3 is a bar graph comparing the number of RPE cells on plates A, B, C, and D. This data from Example 2 shows that hydrogen peroxide was toxic to RPE cells, as evidenced by the fact that the number of RPE cells in a plate treated with hydrogen peroxide alone (plate C) was only 78% of the control cells (plate A). However, the number of RPE cells in the plate pretreated with ALG-1001 (luminate) before exposure to hydrogen peroxide (plate D) was 90% of the control cells (plate A), indicating that pretreatment with ALG-1001 (luminate) , was characterized by a neuroprotective effect in this in vitro model.
Пример 3Example 3
InVitro нейропротекторные эффекты люмината на клетки Мюллера сетчаткиInVitro Neuroprotective Effects of Luminate on Retinal Müller Cells
Мышей CD1 умерщвляли путем декапитации, глаза быстро энуклеировали в комплемент DMEM с раствором антибиотика и хранили в течение ночи при комнатной температуре. Затем интактные глазные яблоки инкубировали в DMEM, содержащей 0,1% трипсина и 70 Ед/мл коллагеназы, при температуре 37°С в течение 60 минут.CD1 mice were sacrificed by decapitation, the eyes were rapidly enucleated in DMEM complement with antibiotic solution and stored overnight at room temperature. The intact eyeballs were then incubated in DMEM containing 0.1% trypsin and 70 U/ml collagenase at 37° C. for 60 minutes.
Инкубированные материалы помещали в чашку Петри, содержащую DMEM, дополненную 10% фетальной бычьей сывороткой, и сетчатки удаляли без клеток RPE в небольшие агрегаты и высевали в чашки 35 мм для культивирования. Среду не меняли в течение 6 дней, а затем пополняли каждые 3 - 4 дня. Культуры выдерживали при температуре 37°С в 55% СО2/95% О2 в увлажненном инкубаторе.The incubated materials were placed in a petri dish containing DMEM supplemented with 10% fetal bovine serum and the retinas were removed without RPE cells in small aggregates and plated in 35 mm culture dishes. The medium was not changed for 6 days and then replenished every 3 to 4 days. Cultures were maintained at 37° C. in 55% CO 2 /95% O 2 in a humidified incubator.
Когда разрастание клеток достигало полуконфлюентности, (80%) агрегатов сетчатки удаляли путем пипетирования среды в чашку. Эту операцию повторяли три (3) раза до получения очищенной плоской клеточной популяции. Через 24 часа клетки подвергали экспериментальным условиям.When cell outgrowth reached semi-confluency, (80%) retinal aggregates were removed by pipetting the medium into a dish. This operation was repeated three (3) times until a purified squamous cell population was obtained. After 24 hours, the cells were subjected to experimental conditions.
Готовили четыре (4) отдельные чашки для клеток Мюллера следующим образом: А) контрольные клетки Мюллера; B) клетки Мюллера, инкубированные с ALG-1001 (люминат) в концентрации 1,0 мг/мл; C) клетки Мюллера, инкубированные с каиновой кислотой в концентрации 500 мкМ и D) клетки Мюллера, инкубированные с люминатом в концентрации 1,0 мг/мл в течение 24 часов перед воздействием каиновой кислотой в концентрации 500 мкМ. Через сорок восемь (48) часов после воздействия количество клеток измеряли с использованием способа вытеснения трипанового синего в камере Нейбауэра.Four (4) separate dishes for Mueller cells were prepared as follows: A) control Mueller cells; B) Mueller cells incubated with ALG-1001 (luminate) at a concentration of 1.0 mg/ml; C) Muller cells incubated with kainic acid at a concentration of 500 μM; and D) Muller cells incubated with luminate at a concentration of 1.0 mg/ml for 24 hours prior to exposure to kainic acid at a concentration of 500 μM. Forty-eight (48) hours after exposure, cell numbers were measured using the trypan blue displacement method in a Neubauer chamber.
Фиг. 4 представляет собой гистограмму сравнения количества клеток Мюллера на планшетах A, B, C и D. Эти данные показывают, что планшет, инкубированный с люминатом в концентрации 1,0 мг/мл в течение 24 часов перед воздействием каиновой кислотой в концентрации 500 мкМ (планшет D), характеризовался более высоким количеством клеток Мюллера, чем любой из других планшетов (A, B или C), и значительно большим количеством клеток Мюллера, чем планшет (планшет C), который подвергался воздействию каиновой кислотой без предварительной обработки люминатом.Fig. 4 is a histogram comparing the number of Mueller cells on plates A, B, C and D. These data show that the plate incubated with 1.0 mg/mL luminate for 24 hours prior to exposure to 500 μM kainic acid (plate D) had a higher Mueller cell count than any of the other plates (A, B, or C) and a significantly higher Mueller cell count than the plate (plate C) that was exposed to kainic acid without luminate pretreatment.
Через сорок восемь (48) часов после воздействия количество клеток измеряли с использованием способа вытеснения трипанового синего в камере Нойбауэра. Фиг. 4 представляет собой гистограмму сравнения количества клеток Мюллера на планшетах A, B, C и D. Эти данные указывают на то, что планшет, инкубированный с люминатом в концентрации 1,0 мг/мл в течение 24 часов до воздействия каиновой кислотой в концентрации 500 мкМ (планшет D), характеризовался более высоким числом клеток Мюллера, чем любой из других планшетов (A, B или C), и значительно более высоким числом клеток Мюллера, чем планшет (планшет C), который подвергался воздействию каиновой кислотой без предварительной обработки люминатом.Forty-eight (48) hours after exposure, cell numbers were measured using the trypan blue displacement method in a Neubauer chamber. Fig. 4 is a histogram comparing the number of Mueller cells in plates A, B, C and D. These data indicate that the plate incubated with luminate at a concentration of 1.0 mg/ml for 24 hours prior to exposure to kainic acid at a concentration of 500 μM (plate D) had a higher Mueller cell count than any of the other plates (A, B, or C) and a significantly higher Mueller cell count than the plate (plate C) that was exposed to kainic acid without luminate pretreatment.
Пример 4Example 4
Дозозависимое нейротоксическое действие каиновой кислоты in vivo Dose-dependent neurotoxic effects of kainic acid in vivo
В правые глаза 4 крысам Wister вводили интравитреально 20 мкл четырех различных растворов, как указано ниже: A) раствор BSS в качестве контроля, B) каиновую кислоту в концентрации 0,5 мМ, C) каиновую кислоту в концентрации 5,0 мМ и D) каиновую кислоту в концентрации 50,0 мМ.The right eyes of 4 Wister rats were injected intravitreally with 20 μl of four different solutions as follows: A) BSS solution as a control, B) 0.5 mM kainic acid, C) 5.0 mM kainic acid, and D) kainic acid at a concentration of 50.0 mm.
Крыс умерщвляли через 24 часа после обработки, и глаза готовили к гистопатологическому исследованию. На фиг. 5 показаны репрезентативные гистологические срезы для каждого из четырех (4) обработанных глаз.Rats were sacrificed 24 hours after treatment, and the eyes were prepared for histopathological examination. In FIG. 5 shows representative histological sections for each of the four (4) treated eyes.
Результаты ясно демонстрируют дегенерацию сетчатки крыс Wister при увеличении концентрации каиновой кислоты от 0,5 мМ до 5,0 мМ. Это подтверждает, что каиновая кислота действительно вызывает дозозависимую нейротоксичность сетчатки in vitro, и подтверждает актуальность исследований с использованием обработанных каиновой кислотой клеток сетчатки in vitro, таких как примеры 2, 3 и 5 настоящей патентной заявки.The results clearly demonstrate retinal degeneration in Wister rats when the concentration of kainic acid is increased from 0.5 mM to 5.0 mM. This confirms that kainic acid does induce dose-dependent retinal neurotoxicity in vitro and confirms the relevance of studies using kainic acid-treated retinal cells in vitro such as examples 2, 3 and 5 of this patent application.
Пример 5Example 5
InVitro нейропротекторные эффекты люмината на нейроны сетчаткиInVitro Neuroprotective Effects of Luminate on Retinal Neurons
Мышей CD1 умерщвляли путем декапитации, глаза быстро энуклеировали в комплемент DMEM с раствором антибиотика и сетчатку выделяли из пигментного эпителия.CD1 mice were sacrificed by decapitation, the eyes were rapidly enucleated in DMEM complement with antibiotic solution, and the retina was isolated from the pigment epithelium.
Выделенную сетчатку инкубировали в среде Хэнка, содержащей папаин в концентрации 2,5 мг/мл и цистеин в концентрации 0,1 мг/мл, в течение 15 минут при температуре 30°С. После промывания средой Хэнка с добавлением CaCl2 в концентрации 1,9 мМ, MgCl2 в концентрации 0,6 мМ и бычьего сывороточного альбумина в концентрации 0,1 мг/мл.The isolated retina was incubated in Hank's medium containing papain at a concentration of 2.5 mg/ml and cysteine at a concentration of 0.1 mg/ml for 15 minutes at 30°C. After washing with Hank's medium with the addition of CaCl2 in concentration 1.9 mM, MgCl2 at a concentration of 0.6 mm and bovine serum albumin at a concentration of 0.1 mg / ml.
Сетчатку механически отделяли, приблизительно 150-200 мкл клеточной суспензии вносили в чашку Петри, содержащую контрольную среду. Биполярные клетки идентифицировали под микроскопом по морфологии клеток. Клетки инкубировали в течение 6 часов перед использованием.The retina was mechanically separated, approximately 150-200 μl of the cell suspension was added to a Petri dish containing control medium. Bipolar cells were identified under a microscope by cell morphology. Cells were incubated for 6 hours before use.
Четыре (4) отдельные чашки нейронов готовили следующим образом: A) контрольные нейроны сетчатки, B) нейроны сетчатки, инкубированные с ALG-1001 (люминат) в концентрации 1,0 мг/мл, C) нейроны сетчатки, инкубированные с каиновой кислотой в концентрации 100 мкМ, D) нейроны сетчатки, инкубированные с люминатом в концентрации 1,0 мг/мл в течение 24 часов перед воздействием каиновой кислоты в концентрации 500 мкМ.Four (4) individual dishes of neurons were prepared as follows: A) control retinal neurons, B) retinal neurons incubated with ALG-1001 (luminate) at a concentration of 1.0 mg/ml, C) retinal neurons incubated with kainic acid at a concentration of 100 μM, D) retinal neurons incubated with luminate at a concentration of 1.0 mg/ml for 24 hours before exposure to kainic acid at a concentration of 500 μm.
Через восемь (8) часов после воздействия количество клеток измеряли с использованием способа вытеснения трипанового синего в камере Нейбауэра.Eight (8) hours after exposure, cell counts were measured using the trypan blue displacement method in a Neubauer chamber.
Фиг. 6 представляет собой гистограмму сравнения количества нейронов сетчатки на планшетах A, B, C и D. Эти данные показывают, что каиновая кислота была токсичной для нейронов сетчатки, и предварительная обработка люминатом существенно снижала эту токсичность. В частности, количество нейронов в планшете, обработанном только каиновой кислотой в концентрации 100 мкМ (планшет C), составляло 58% по сравнению с контролем, в то время как количество нейронов в планшете, инкубированном с люминатом в концентрации 1,0 мг/мл в течение 24 часов перед воздействием каиновой кислотой в концентрации 500 мкМ (планшет D), составляло 80% от контроля. Эти результаты заслуживают особого внимания, учитывая, что планшет D получил в пять (5) раз больше каиновой кислоты, чем планшет C.Fig. 6 is a bar graph comparing the number of retinal neurons in plates A, B, C, and D. These data show that kainic acid was toxic to retinal neurons, and pre-treatment with luminate significantly reduced this toxicity. In particular, the number of neurons in the plate treated with only kainic acid at a concentration of 100 μM (plate C) was 58% compared to the control, while the number of neurons in the plate incubated with luminate at a concentration of 1.0 mg/ml in within 24 hours before exposure to kainic acid at a concentration of 500 μm (plate D), was 80% of the control. These results are noteworthy given that Tablet D received five (5) times more kainic acid than Tablet C.
Пример 6Example 6
Проспективное открытое исследование на людях люмината при лечении сухой AMDA prospective open label human study of luminate in the treatment of dry AMD
Чтобы определить, оказывает ли единичная интравитреальная инъекция люмината в концентрации 1,0 мг/50 мкл какое-либо влияние на улучшение наибольшей остроты зрения с коррекцией (BCVA) у субъектов с сухой AMD, с умеренной или умеренно выраженной сухой AMD.To determine whether a single intravitreal injection of Luminate at a concentration of 1.0 mg/50 µl has any effect on improving maximal corrected visual acuity (BCVA) in subjects with dry AMD, with moderate to moderate dry AMD.
Это проспективное интервенционное, открытое, одобренное IRB клиническое подтверждение на людях концепции исследования проводили на 7 людях с умеренной и умеренно тяжелой сухой AMD.This prospective, interventional, open-label, IRB-approved clinical proof-of-concept study was performed in 7 people with moderate to moderately severe dry AMD.
Основные критерии включения включали в себя пациентов с сухой макулярной дегенерацией с относительно интактными фоторецепторными слоями и слоями RPE в центральном 1 мм макулы по OCT.The main inclusion criteria included patients with dry macular degeneration with relatively intact photoreceptor layers and RPE layers in the central 1 mm of the macula on OCT.
Исходный уровень BCVA у субъектов находился между 20/30 и 20/400 без каких-либо признаков субретинальной жидкости или CNV и отсутствии лечения анти-VEGF в анамнезе.Baseline BCVA levels in subjects were between 20/30 and 20/400 with no evidence of subretinal fluid or CNV and no history of anti-VEGF treatment.
Все включенные пациенты проходили базовую однократную интравитреальную инъекцию люмината в концентрации 1,0 мг/50 мкл и подвергались мониторингу ежемесячно, кроме того, получали толщину центральной макулы, OCT, цифровые цветные фотографии и BCVA до и после лечения.All included patients received a basic single intravitreal injection of Luminate at a concentration of 1.0 mg/50 μl and were monitored monthly, in addition, they received central macular thickness, OCT, digital color photographs and BCVA before and after treatment.
Результаты этого открытого подтверждающего концепцию исследования люмината при лечении сухого AMD у пациентов-людей, обобщены в таблице 5 ниже:The results of this open-label proof-of-concept study of Luminate in the treatment of dry AMD in human patients are summarized in Table 5 below:
Таблица 5Table 5
Добавилось 10 букв0.3 log Mar (20/40)
Added 10
Добавилось 20 букв0.6 log Mar (20/80)
Added 20
Добавилось 15 букв1.0 log Mar (20/200)
Added 15 letters
Добавилось 15 букв1.0 log Mar (20/200)
Added 15 letters
Не добавилось букв1.3 log Mar (20/400)
No letters added
Добавилось 10 букв0.20 log Mar (20/32)
Added 10 letters
* У пациента 5 наблюдались худшие исходные фовеальные анатомические особенности в группе и не было обнаружено заметного улучшения BCVA.*
Эти результаты указывают на то, что в этом исследовании BCVA субъектов, получавших люминат, улучшилось до 20 букв.These results indicate that in this study, the BCVA of Luminate-treated subjects improved to 20 letters.
Следует принимать во внимание, что, хотя настоящее изобретение было описано выше со ссылкой на определенные примеры или варианты осуществления настоящего изобретения, в описанные примеры и варианты осуществления могут быть внесены различные дополнения, исключения, изменения и модификации, не отступая от предполагаемой сущности и объема настоящего изобретения. Например, любые элементы, стадии, представители, компоненты, композиции, реагенты или части одного варианта осуществления или примера могут быть включены или использованы с другим вариантом осуществления или примером, если не указано иное или если это не сделает этот вариант осуществления или пример неподходящим для его предполагаемого использования. Кроме того, если стадии способа или процесса были описаны или перечислены в определенном порядке, порядок таких стадий может быть изменен, если не указано иное, или если это не сделает способ или процесс непригодным для его предполагаемой цели. Кроме того, элементы, стадии, представители, компоненты, композиции, реагенты или части любого изобретения или примера, описанного в настоящем документе, могут необязательно существовать или использоваться при отсутствии или существенном отсутствии любого другого элемента, стадии, представителя, компонента, композиции, реагента или части, если не указано иное. Все разумные добавления, исключения, модификации и изменения должны рассматриваться как эквиваленты описанных примеров и вариантов осуществления и должны быть включены в объем следующей формулы изобретения.It should be appreciated that while the present invention has been described above with reference to certain examples or embodiments of the present invention, various additions, deletions, changes and modifications may be made to the described examples and embodiments without departing from the intended spirit and scope of the present invention. inventions. For example, any elements, steps, representatives, components, compositions, reagents, or parts of one embodiment or example may be included or used with another embodiment or example unless otherwise noted or unless this would make that embodiment or example unsuitable for its use. intended use. In addition, if the steps of a method or process have been described or listed in a particular order, the order of such steps may be changed, unless otherwise indicated, or unless this renders the method or process unsuitable for its intended purpose. In addition, elements, steps, representatives, components, compositions, reagents, or parts of any invention or example described herein may optionally exist or be used in the absence or substantial absence of any other element, step, representative, component, composition, reagent, or parts unless otherwise noted. All reasonable additions, deletions, modifications and alterations are to be considered equivalent to the examples and embodiments described and are to be included within the scope of the following claims.
--->--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ SEQUENCE LIST
<110> АЛЛЕГРО ФАРМАСЬЮТИКАЛС, ИНК.<110> ALLEGRO PHARMACEUTICALS, INC.
<120> ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЕ И НЕЙРОПРОТЕКТОРНЫЕ ПЕПТИДЫ<120> THERAPEUTIC AND NEUROPROTECTIVE PEPTIDES
<130> ALLEG-008PC<130> ALLEG-008PC
<140> PCT/US2018/014287<140> PCT/US2018/014287
<141> 2018-01-18<141> 2018-01-18
<150> 62/500998<150> 62/500998
<151> 2017-05-03<151> 2017-05-03
<150> 62/448,300<150> 62/448,300
<151> 2017-01-19<151> 2017-01-19
<160> 1 <160> 1
<170> PatentIn версия 3.5<170> PatentIn version 3.5
<210> 1<210> 1
<211> 6<211> 6
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический<223> Artificial sequence description: synthetic
пептид peptide
<220><220>
<221> MOD_RES<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)<222> (4)..(4)
<223> Цистеиновая кислота<223> Cysteic acid
<400> 1<400> 1
Gly Arg Gly Xaa Thr Pro Gly Arg Gly Xaa Thr Pro
1 5 15
<---<---
Claims (7)
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201762448300P | 2017-01-19 | 2017-01-19 | |
| US62/448,300 | 2017-01-19 | ||
| US201762500998P | 2017-05-03 | 2017-05-03 | |
| US62/500,998 | 2017-05-03 | ||
| PCT/US2018/014287 WO2018136669A2 (en) | 2017-01-19 | 2018-01-18 | Therapeutic and neuroprotective peptides |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2019126014A RU2019126014A (en) | 2021-02-19 |
| RU2019126014A3 RU2019126014A3 (en) | 2021-02-19 |
| RU2788097C2 true RU2788097C2 (en) | 2023-01-16 |
Family
ID=
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2012118503A (en) * | 2009-11-10 | 2013-12-20 | Аллегро Фармасьютикалс, Инк. | COMPOSITIONS AND METHODS FOR INHIBITING CELL ADHESION OR DIRECTION OF DIAGNOSTIC OR THERAPEUTIC AGENTS TO RGD LINKING SITES |
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2012118503A (en) * | 2009-11-10 | 2013-12-20 | Аллегро Фармасьютикалс, Инк. | COMPOSITIONS AND METHODS FOR INHIBITING CELL ADHESION OR DIRECTION OF DIAGNOSTIC OR THERAPEUTIC AGENTS TO RGD LINKING SITES |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| KUPPERMANN B. D. "A Dual-Mechanism Drug for Vitreoretinal Diseases." Retina Today, July/August 2015; p. 85-87. * |
| SCHMIDT et al. "Neurodegenerative Diseases of the Retina and Potential for Protection and Recovery". Curr. Neuropharmacol. 2008; 6(2): p.164-178. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20210085749A1 (en) | Therapeutic and Neuroprotective Peptides | |
| DE69713032T2 (en) | Use of SCF for corneal treatment | |
| EP3643723B1 (en) | Novel peptide and pharmaceutical composition for treatment of eye diseases comprising same novel peptide as active ingredient | |
| JP5643237B2 (en) | Method for inhibiting apoptosis of photoreceptor cells | |
| TWI400080B (en) | The use of substances for the treatment of loss of eyesight in humans with glaucoma and other degenerative eye diseases | |
| WO2022194109A1 (en) | Complex for treating optic nerve disease, and preparation method therefor and use thereof | |
| SK65998A3 (en) | Methods for treating photoreceptors using glial cell line-derived neurotrophic factor (gdnf) protein product | |
| HU195523B (en) | Process for producing fractions of hyaluronic acid and pharmaceutical compositions containing them | |
| Glybina et al. | Photoreceptor neuroprotection in RCS rats via low-dose intravitreal sustained-delivery of fluocinolone acetonide | |
| CN102639141A (en) | Composition and methods for the prevention and treatment of macular degeneration, diabetic retinopathy, and diabetic macular edema | |
| WO2006096011A1 (en) | PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR TREATING AVELLINO CORNEA DYSTROPHY COMPRISING AN ANTIBODY AGAINST TGF-β | |
| EP3448388B1 (en) | Dipeptidyl peptidase-4 inhibitors for topical eye treatment of retinal neurodegenerative diseases | |
| RU2788097C2 (en) | Therapeutic and neuroprotective peptides | |
| WO1995029194A1 (en) | Peptides as therapeutic agents for the treatment of auto-immune diseases | |
| KR20170123502A (en) | Pharmaceutical composition for preventing or treating angiogenic diseases comprising collagen and pigemented epithelium derived factor | |
| KR20120096555A (en) | Method for screening drug efficacious in treating dry eye and/or keratoconjunctival disorders and pharmaceutical composition obtained thereby | |
| JP2020518678A (en) | Gap junction intercellular communication modulators and their use for the treatment of diabetic eye disease | |
| EP4082559A1 (en) | Application of fusion protein in treating age-related macular degeneration | |
| Duan et al. | Preliminary study of a controllable device for subtenon drug infusion in a rabbit model | |
| EP4159225A1 (en) | Novel pharmaceutical composition for treating dry eye syndrome | |
| RU2733392C1 (en) | Combined ophthalmic agent | |
| CN105017406B (en) | Novel polypeptide with neuroprotective function | |
| Navarro-Partida et al. | Safety and Tolerability of Topical Ophthalmic Triamcinolone Acetonide-Loaded Liposomes Formulation and Evaluation of Its Biologic Activity in Patients with Diabetic Macular Edema. Pharmaceutics 2021, 13, 322 | |
| US20230077811A1 (en) | Activation of neuropeptide receptors on plasmacytoid dendritic cells to treat or prevent ocular diseases associated with neovascularization and inflammation | |
| US20230263860A1 (en) | Methods And Compositions For Treating Stroke |