RU2786509C1 - Method for determination of mass concentrations of phenol and pyrocatechol in blood by high performance liquid chromatography - Google Patents
Method for determination of mass concentrations of phenol and pyrocatechol in blood by high performance liquid chromatography Download PDFInfo
- Publication number
- RU2786509C1 RU2786509C1 RU2022108555A RU2022108555A RU2786509C1 RU 2786509 C1 RU2786509 C1 RU 2786509C1 RU 2022108555 A RU2022108555 A RU 2022108555A RU 2022108555 A RU2022108555 A RU 2022108555A RU 2786509 C1 RU2786509 C1 RU 2786509C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- phenol
- blood
- extract
- sample
- pyrocatechol
- Prior art date
Links
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 139
- YCIMNLLNPGFGHC-UHFFFAOYSA-N Catechol Chemical compound OC1=CC=CC=C1O YCIMNLLNPGFGHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 94
- 210000004369 Blood Anatomy 0.000 title claims abstract description 51
- 239000008280 blood Substances 0.000 title claims abstract description 51
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 title claims abstract description 11
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 35
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 30
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims abstract description 16
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 15
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 12
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L mgso4 Chemical class [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims abstract description 12
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims abstract description 11
- 235000011007 phosphoric acid Nutrition 0.000 claims abstract description 8
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 claims abstract description 8
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 claims abstract description 6
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 claims abstract description 6
- 238000004164 analytical calibration Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims abstract description 5
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims abstract description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims abstract description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- IWDCLRJOBJJRNH-UHFFFAOYSA-N P-Cresol Chemical compound CC1=CC=C(O)C=C1 IWDCLRJOBJJRNH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 17
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 14
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 13
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N acetic acid ethyl ester Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 210000002381 Plasma Anatomy 0.000 description 7
- 210000002700 Urine Anatomy 0.000 description 7
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 7
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- QIGBRXMKCJKVMJ-UHFFFAOYSA-N benzohydroquinone Chemical compound OC1=CC=C(O)C=C1 QIGBRXMKCJKVMJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 6
- 229920001343 polytetrafluoroethylene Polymers 0.000 description 6
- LMWMTSCFTPQVCJ-UHFFFAOYSA-N 2-methylphenol;phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1.CC1=CC=CC=C1O LMWMTSCFTPQVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 210000002966 Serum Anatomy 0.000 description 5
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 5
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 5
- -1 aromatic amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 5
- 239000004810 polytetrafluoroethylene Substances 0.000 description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 5
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N HCl Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- INQOMBQAUSQDDS-UHFFFAOYSA-N Methyl iodide Chemical compound IC INQOMBQAUSQDDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 4
- 230000000996 additive Effects 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N methylene dichloride Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L sodium carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- QWVGKYWNOKOFNN-UHFFFAOYSA-N O-Cresol Chemical compound CC1=CC=CC=C1O QWVGKYWNOKOFNN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 150000001896 cresols Chemical class 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 3
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 3
- 230000002588 toxic Effects 0.000 description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 3
- WXNZTHHGJRFXKQ-UHFFFAOYSA-N 4-chlorophenol Chemical compound OC1=CC=C(Cl)C=C1 WXNZTHHGJRFXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000601 Blood Cells Anatomy 0.000 description 2
- 102000003425 EC 1.14.18.1 Human genes 0.000 description 2
- 108060008724 EC 1.14.18.1 Proteins 0.000 description 2
- 102200078400 GDPD5 C18S Human genes 0.000 description 2
- 230000036740 Metabolism Effects 0.000 description 2
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 2
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 2
- 230000002429 anti-coagulation Effects 0.000 description 2
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 2
- 239000012482 calibration solution Substances 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 238000002290 gas chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic Effects 0.000 description 2
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000035786 metabolism Effects 0.000 description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 description 2
- UFWIBTONFRDIAS-UHFFFAOYSA-N naphthalene Chemical compound C1=CC=CC2=CC=CC=C21 UFWIBTONFRDIAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 2
- 229930010796 primary metabolites Natural products 0.000 description 2
- 239000001187 sodium carbonate Substances 0.000 description 2
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000001256 steam distillation Methods 0.000 description 2
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 2
- HXDOZKJGKXYMEW-UHFFFAOYSA-N 4-Ethylphenol Chemical compound CCC1=CC=C(O)C=C1 HXDOZKJGKXYMEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RDOXTESZEPMUJZ-UHFFFAOYSA-N Anisole Chemical compound COC1=CC=CC=C1 RDOXTESZEPMUJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001736 Capillaries Anatomy 0.000 description 1
- 210000003743 Erythrocytes Anatomy 0.000 description 1
- ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N Heparin Chemical compound CC(O)=N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](COS(O)(=O)=O)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](C(O)=O)O[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OS(O)(=O)=O)[C@@H](O[C@@H]3[C@@H](OC(O)[C@H](OS(O)(=O)=O)[C@H]3O)C(O)=O)O[C@@H]2O)CS(O)(=O)=O)[C@H](O)[C@H]1O ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N 0.000 description 1
- 229960002897 Heparin Drugs 0.000 description 1
- 210000003491 Skin Anatomy 0.000 description 1
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 1
- ZMBHCYHQLYEYDV-UHFFFAOYSA-N Trioctylphosphine oxide Chemical compound CCCCCCCCP(=O)(CCCCCCCC)CCCCCCCC ZMBHCYHQLYEYDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- PAYRUJLWNCNPSJ-UHFFFAOYSA-N aniline Chemical compound NC1=CC=CC=C1 PAYRUJLWNCNPSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000711 cancerogenic Effects 0.000 description 1
- 231100000357 carcinogen Toxicity 0.000 description 1
- 239000003183 carcinogenic agent Substances 0.000 description 1
- 239000012159 carrier gas Substances 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 150000001793 charged compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000003544 deproteinization Effects 0.000 description 1
- DROMNWUQASBTFM-UHFFFAOYSA-N dinonyl benzene-1,2-dicarboxylate Chemical compound CCCCCCCCCOC(=O)C1=CC=CC=C1C(=O)OCCCCCCCCC DROMNWUQASBTFM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000010812 external standard method Methods 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 238000001030 gas--liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000001719 hemosorption Effects 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- UFFSXJKVKBQEHC-UHFFFAOYSA-N heptafluorobutyric anhydride Chemical compound FC(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(=O)OC(=O)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)F UFFSXJKVKBQEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008079 hexane Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- NHTMVDHEPJAVLT-UHFFFAOYSA-N isooctane Chemical compound CC(C)CC(C)(C)C NHTMVDHEPJAVLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009533 lab test Methods 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000000409 membrane extraction Methods 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic Effects 0.000 description 1
- GBMDVOWEEQVZKZ-UHFFFAOYSA-N methanol;hydrate Chemical compound O.OC GBMDVOWEEQVZKZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UZKWTJUDCOPSNM-UHFFFAOYSA-N methoxybenzene Substances CCCCOC=C UZKWTJUDCOPSNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L na2so4 Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000003533 narcotic Effects 0.000 description 1
- 239000005445 natural product Substances 0.000 description 1
- 229930014626 natural products Natural products 0.000 description 1
- 238000002414 normal-phase solid-phase extraction Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organs Anatomy 0.000 description 1
- 150000002931 p-cresols Chemical class 0.000 description 1
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000004014 plasticizer Substances 0.000 description 1
- 230000000607 poisoning Effects 0.000 description 1
- 231100000572 poisoning Toxicity 0.000 description 1
- 229920000435 poly(dimethylsiloxane) Polymers 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 230000000717 retained Effects 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000057 synthetic resin Substances 0.000 description 1
- 229920003002 synthetic resin Polymers 0.000 description 1
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 1
- 239000002966 varnish Substances 0.000 description 1
- 239000002351 wastewater Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 150000003739 xylenols Chemical class 0.000 description 1
Abstract
Description
Изобретение относится к области аналитической химии и может быть использовано в санитарно-гигиенических, экологических, лечебных и научных организациях, осуществляющих деятельность в области профпатологии и экологии человека.The invention relates to the field of analytical chemistry and can be used in sanitary, environmental, medical and scientific organizations operating in the field of occupational pathology and human ecology.
Актуальность определения фенола и его первичного метаболита пирокатехина в биологических средах связана с профессиональной деятельностью работников предприятий органического синтеза, производства бисфенолов, красителей, лака, синтетических смол, пластификаторов, стабилизаторов, пестицидов и других продуктов промышленного и бытового назначения, условия труда которых характеризуются воздействием фенола и пирокатехина на состояние здоровья.The relevance of the determination of phenol and its primary metabolite pyrocatechol in biological media is associated with the professional activities of employees of organic synthesis enterprises, the production of bisphenols, dyes, varnish, synthetic resins, plasticizers, stabilizers, pesticides and other industrial and household products, whose working conditions are characterized by exposure to phenol and pyrocatechin on health.
Фенол является промежуточным продуктом обмена белков и ароматических аминокислот в организме человека. Являясь естественным продуктом метаболизма фенол в микроколичествах циркулирует в крови и удаляется в виде конъюгатов с мочой.Phenol is an intermediate product of the metabolism of proteins and aromatic amino acids in the human body. As a natural product of metabolism, phenol circulates in trace amounts in the blood and is excreted in the form of conjugates in the urine.
Пирокатехин является первичным метаболитом фенола. Экзогенное поступление фенола в организм человека происходит через вдыхание загрязненного воздуха, при контакте с кожей.Pyrocatechin is the primary metabolite of phenol. Exogenous intake of phenol into the human body occurs through the inhalation of polluted air, upon contact with the skin.
Для оценки риска воздействия производственных факторов среды на состояние здоровья работников актуальным является разработка и совершенствование методического обеспечения по определению массовых концентраций фенола и пирокатехина в крови на уровне фоновых значений и выше с использованием высокочувствительного и селективного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии.To assess the risk of the impact of production environmental factors on the health of workers, it is relevant to develop and improve methodological support for determining the mass concentrations of phenol and pyrocatechol in the blood at the level of background values and above using a highly sensitive and selective method of high performance liquid chromatography.
Из уровня техники известен ряд способов количественного определения фенола в крови методом газовой хроматографии:A number of methods for the quantitative determination of phenol in the blood by gas chromatography are known from the prior art:
- (Метод 1) в плазме крови с использованием химической дериватизации и анализе методом газовой хроматографии на капиллярных колонках в сочетании с масс-спектрометрией. Пробу крови центрифугировали для отделения плазмы. К аликвоте плазмы объемом 500 мкл добавляли 500 мкл дистиллированной воды, содержащей 50 мкл бензола и 5 мкл п-крезола в качестве внутреннего стандарта. В смесь добавляли 3 мл изооктана и диэтилового эфира (80/20 по объему) и перемешивали содержимое в течение 1 ч в орбитальном шейкере. Отбирали 2 мл экстракта и проводили дериватизацию фенола с целью повышения летучести производного фенола. К экстракту добавляли 100 мкл триэтиламина в бензоле с концентрацией 1 моль/л в качестве катализатора процедуры дериватизации, 20 мкл гептафтормасляного ангидрида (дериватизирующий агент), перемешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. Смесь промывали 2 мл 1М раствора фосфатного буфера (рН 6,0) и удаляли остаток воды безводным сульфатом натрия. После проведения реакции дериватизации 500 мкл экстракта переносили в виалы для анализа. Температура инжектора и термостата колонок 250°С, детектора 300°С. Анализировали 2 мкл экстракта трижды, после каждого анализа промывали колонку ацетонитрилом. Идентификацию фенола проводили по фрагменту гептафтормасляного производного с массовым зарядом 69 m/z. Количественное определение проводили по молекулярному иону дериватизированного фенола с массовым зарядом 290 m/z. Чувствительность определения 0,4 мг/дм3 (Harrison L., Morrison J., Fennessey P. Microtechnique for quantifying phenol in plasma by gas chromatography-mass spectrometry // Clin. Chem. - 1991. - Vol. 37. - P. 1739-1742.).- (Method 1) in blood plasma using chemical derivatization and analysis by gas chromatography on capillary columns combined with mass spectrometry. The blood sample was centrifuged to separate the plasma. To a 500 µl plasma aliquot was added 500 µl of distilled water containing 50 µl of benzene and 5 µl of p-cresol as an internal standard. 3 ml of isooctane and diethyl ether (80/20 by volume) were added to the mixture and the contents were stirred for 1 hour in an orbital shaker. 2 ml of the extract was taken and phenol was derivatized in order to increase the volatility of the phenol derivative. To the extract was added 100 µl of triethylamine in benzene with a concentration of 1 mol/l as a catalyst for the derivatization procedure, 20 µl of heptafluorobutyric anhydride (derivatizing agent), mixed and incubated at room temperature for 30 min. The mixture was washed with 2 ml of 1M phosphate buffer solution (pH 6.0) and the residual water was removed with anhydrous sodium sulfate. After the derivatization reaction, 500 µl of the extract was transferred into vials for analysis. The temperature of the injector and column thermostat was 250°С, and that of the detector was 300°С. Analyzed 2 μl of the extract three times, after each analysis, the column was washed with acetonitrile. Phenol was identified by a fragment of a heptafluorobutyric derivative with a mass charge of 69 m/z. The quantitative determination was carried out by the molecular ion of derivatized phenol with a mass charge of 290 m/z. The sensitivity of the determination is 0.4 mg / dm 3 (Harrison L., Morrison J., Fennessey P. Microtechnique for quantifying phenol in plasma by gas chromatography-mass spectrometry // Clin. Chem. - 1991. - Vol. 37. - P. 1739-1742.).
- (Метод 2) известен способ определения в сыворотке крови свободного фенола и о,м,п - крезола методом газовой хроматографии с детектированием на пламенно-ионизационном детекторе. Согласно способу извлечение фенола и крезолов из сыворотки крови проводили перегонкой с водяным паром и последующей экстракцией хлороформом. Разделение аналитов проводилось на стеклянной набивной колонке (2 м х 4 мм), заполненной сорбентом Chromaton-N-AW- DMCS (0,20-0,25) мм с нанесенной на него неподвижной жидкой фазой динонилфталатом (10%) и Chromaton-N-AW-DMCS (0,16-0,20) мм с нанесенным на него OV-17 (фенил (50%) метил силиконовое масло). В качестве газа-носителя использовали особо чистый азот со скоростью потока 50 мл/мин. Температура колонки 140°С, температура испарителя 180°С. Анализ проб проводили в изотермическом режиме. Объем вводимой пробы составлял от 2 до 5 мкл. Идентификацию фенола проводили по относительному времени удерживания. Количественное определение фенола проводили методом внутреннего стандарта, в качестве которого использовали о-крезол. Чувствительность определения 2,0 мг/дм3 (Кочетова М.М., Лурье Б.Л. Определение свободного фенола в сыворотке крови методом газожидкостной хроматографии при гемосорбции // Вопросы медицинской химию. - 1985. - Т. 31, №1. - С. 72-74).- (Method 2) there is a method for determining free phenol and o, m, p - cresol in blood serum by gas chromatography with detection on a flame ionization detector. According to the method, the extraction of phenol and cresols from blood serum was carried out by steam distillation and subsequent extraction with chloroform. Separation of analytes was carried out on a glass packed column (2 m x 4 mm) filled with a Chromaton-N-AW-DMCS sorbent (0.20-0.25) mm coated with a stationary liquid phase of dinonyl phthalate (10%) and Chromaton-N -AW-DMCS (0.16-0.20) mm coated with OV-17 (phenyl (50%) methyl silicone oil). Highly pure nitrogen was used as a carrier gas with a flow rate of 50 ml/min. Column temperature 140°C, evaporator temperature 180°C. Samples were analyzed in isothermal mode. The volume of the injected sample was from 2 to 5 μl. Phenol was identified by relative retention time. Quantitative determination of phenol was carried out by the method of internal standard, which was used as o-cresol. The sensitivity of the determination is 2.0 mg / dm 3 (Kochetova M.M., Lurie B.L. Determination of free phenol in blood serum by gas-liquid chromatography during hemosorption // Questions of Medical Chemistry. - 1985. - T. 31, No. 1. - pp. 72-74).
- (Метод 3) известен способ определения фенола и крезола в крови методом газовой хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием. Извлечение фенола и крезола проводили с предварительной депротеинизацией путем добавления к 1 мл крови 2 мл ацетонитрила, полученную суспензию перемешивали и центрифугировали при 1000 об./мин 10 минут. Органическую фазу выпаривали под струей азота при температуре 40°С. К остатку добавляли внутренний стандарт (анилин) и растворяли в 1 мл дихлорметана. Пробу объемом 1 мкл анализировали на газовом хроматографе. Нижний предел количественного определения составил 0,069 мг/дм3 для о-крезола и 0,26 мг/дм3 для фенола (Boatto G., Nieddu М., Carta A., A. Pau A., Lorenzoni S., Manconi P., Serra D. Determination of phenol and o-cresol by GC/MS in a fatal poisoning case // J. Forensic Science International. - 2004. - Vol. 139. - P. 191-194.).- (Method 3) known method for the determination of phenol and cresol in the blood by gas chromatography with mass spectrometric detection. The extraction of phenol and cresol was carried out with preliminary deproteinization by adding 2 ml of acetonitrile to 1 ml of blood, the resulting suspension was stirred and centrifuged at 1000 rpm for 10 minutes. The organic phase was evaporated under a stream of nitrogen at a temperature of 40°C. An internal standard (aniline) was added to the residue and dissolved in 1 ml of dichloromethane. A sample with a volume of 1 µl was analyzed on a gas chromatograph. The lower limit of quantitative determination was 0.069 mg/dm 3 for o-cresol and 0.26 mg/dm 3 for phenol (Boatto G., Nieddu M., Carta A., A. Pau A., Lorenzoni S., Manconi P. , Serra D. Determination of phenol and o-cresol by GC/MS in a fatal poisoning case // J. Forensic Science International - 2004. - Vol. 139. - P. 191-194.).
- (Метод 4) Известен способ определения в крови свободного фенола методом газовой хроматографии с пламенно-ионизационным детектором. Определение основано на предварительном переводе фенола в метилфениловый эфир при взаимодействии с йодистым метилом в щелочной среде, извлечении продукта дериватизации из крови экстракцией диэтиловым эфиром и последующем газохроматографическом анализе экстракта. Градуировочную характеристику устанавливают методом внутреннего стандарта (нафталина) на градуировочных смесях фенола на основе цельной крови. Определению не мешают ксиленолы и о-,м-,п-крезолы. Чувствительность определения массовой концентрации фенола в крови 0,04 мг/дм3 с погрешностью не более 25% (Определение вредных веществ в биологических средах: Сборник методических указаний. / МУК 4.1.2108-06 «Определение массовой концентрации фенола в биосредах (кровь) газохроматографическим методом». - М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2008. - 183 с.).- (Method 4) A known method for the determination of free phenol in the blood by gas chromatography with a flame ionization detector. The determination is based on the preliminary conversion of phenol to methylphenyl ether upon interaction with methyl iodide in an alkaline medium, the extraction of the derivatization product from the blood by extraction with diethyl ether, and subsequent gas chromatographic analysis of the extract. The calibration characteristic is established by the method of internal standard (naphthalene) on phenol calibration mixtures based on whole blood. Xylenols and o-, m-, p-cresols do not interfere with the determination. The sensitivity of determining the mass concentration of phenol in the blood is 0.04 mg / dm 3 with an error of not more than 25% (Determination of harmful substances in biological media: Collection of guidelines. / MUK 4.1.2108-06 “Determination of the mass concentration of phenol in biological media (blood) by gas chromatography method". - M.: Federal Center for Hygiene and Epidemiology of Rospotrebnadzor, 2008. - 183 p.).
Недостатками указанных известных методов являются:The disadvantages of these known methods are:
- использование в пробоподготовке высокотоксичных органических растворителей бензола, диэтилового эфира, хлороформа, дихлорметана. (методы 1-4),- use in sample preparation of highly toxic organic solvents of benzene, diethyl ether, chloroform, dichloromethane. (methods 1-4),
- низкая чувствительность определения (методы 1-4),- low detection sensitivity (methods 1-4),
- невозможность применения известного способа для анализа именно смеси фенола и пирокатехина в пробах крови при их совместном присутствии (методы 1-4),- the impossibility of using the known method for the analysis of a mixture of phenol and catechol in blood samples in their joint presence (methods 1-4),
- сложная пробоподготовка (дериватизация, перегонка с водяным паром) (методы 1, 2, 4).- complex sample preparation (derivatization, steam distillation) (methods 1, 2, 4).
Из патента РФ №2188416 известен способ количественного определения фенола в крови, согласно которому в пробу крови добавляют последовательно карбонат натрия и йодистый метил, далее производят экстракцию диэтиловым эфиром при соотношении экстрагент: йодистый метил: карбонат натрия как (2,0-10,0) об.ч. : (0,25-0,3) об.ч. : (1,5-2,0) мас.ч. соответственно, затем полученный экстракт нагревают до температуры 35-40°С, выдерживают при этой температуре 9-12 с, центрифугируют и осуществляют определение фенола газохроматографическим методом.From the patent of the Russian Federation No. 2188416, a method for the quantitative determination of phenol in the blood is known, according to which sodium carbonate and methyl iodide are added successively to the blood sample, then extraction is performed with diethyl ether at a ratio of extractant: methyl iodide: sodium carbonate as (2.0-10.0) vol.h. : (0.25-0.3) vol. : (1.5-2.0) wt.h. accordingly, then the resulting extract is heated to a temperature of 35-40°C, maintained at this temperature for 9-12 s, centrifuged and phenol is determined by the gas chromatographic method.
Однако, этот известный способ характеризуется сложной пробоподготовкой, включающей проведение реакции дериватизации, использованием высокотоксичных йодистого метила в реакции дериватизации (2 класс опасности, канцероген) и высоколетучего диэтилового эфира для экстракции, недостаточной чувствительностью определения фенола (0,008 мг/л), невозможностью определения в крови пирокатехина при совместном присутствии с фенолом.However, this well-known method is characterized by complex sample preparation, including a derivatization reaction, the use of highly toxic methyl iodide in the derivatization reaction (hazard class 2, carcinogen) and highly volatile diethyl ether for extraction, insufficient sensitivity for the determination of phenol (0.008 mg / l), the impossibility of determining in the blood pyrocatechin in the joint presence with phenol.
Из патента РФ №2205398 известен способ определения гидрохинона или пирокатехина в водных растворах физико-химическим методом с предварительной стадией экстракционного концентрирования при рН 2-3 гидрофобными растворителями в присутствии органических оксидов. При этом в качестве гидрофобного растворителя применяют гексановый раствор триоктилфосфиноксида с концентрацией 0,5 моль/дм3 и раздельное определение гидрохинона и пирокатехина проводят в выделившейся органической фазе методом микроколоночной высокоэффективной жидкостной хроматографии.From RF patent No. 2205398, a method is known for determining hydroquinone or pyrocatechol in aqueous solutions by a physicochemical method with a preliminary stage of extraction concentration at pH 2-3 with hydrophobic solvents in the presence of organic oxides. At the same time, a hexane solution of trioctylphosphine oxide with a concentration of 0.5 mol/dm 3 is used as a hydrophobic solvent, and separate determination of hydroquinone and pyrocatechol is carried out in the separated organic phase by the method of microcolumn high-performance liquid chromatography.
Недостатком этого способа является то, что способ предназначен для определения гидрохинона и пирокатехина в сточной воде и не может быть использован для анализа фенола и пирокатехина в биологической матрице (крови).The disadvantage of this method is that the method is intended for the determination of hydroquinone and pyrocatechol in wastewater and cannot be used for the analysis of phenol and pyrocatechol in the biological matrix (blood).
Также известны способы определения содержания фенола и его производных в биологических средах (кровь, моча) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ):Also known are methods for determining the content of phenol and its derivatives in biological media (blood, urine) by high performance liquid chromatography (HPLC):
- (Метод 5) определение фенола, п-крезола и 4-хлорфенола в плазме крови с использованием жидкостной мембранной экстракции и колоночной жидкостной хроматографии с амперометрическим биосенсором модифицированным ферментом тирозиназой в качестве блока селективного детектирования. Фенолы селективно экстрагируются в пористую мембрану из ПТФЭ (политетрафторэтилена), пропитанную органическим растворителем, не смешивающимся с водой, и далее в щелочную акцепторную фазу. Через ионообменный интерфейс аналиты переносятся в колонку жидкостного хроматографа с обращенной фазой, где они разделяются и обнаруживаются с помощью биосенсора. Никакой предварительной обработки образца перед экстракцией, за исключением центрифугирования, не производится. Разделение аналитов осуществляется методом обращенно-фазовой жидкостной хроматографии с использованием подвижной фазы, состоящей из метанола (градиент 0-10%) и 10 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 6,0) в 0,9% растворе хлорида натрия при скорости потока 0,1 мл/мин на колонке длиной 20 мм и внутренним диаметром 1 мм. Нижний предел определения фенола, п-крезола и 4-хлорфенола в плазме крови составил 0,05 м/дм3 (Norberg J., Emnrus J., Jonsson J.A., Mathiasson L., Burestedt E., Knutsson M., Marko-Varga G. On-line supported liquid membrane-liquid chromatography with a phenol oxidase-based biosensor as a selective detection unit for the determination of phenols in blood plasma // Journal of Chromatography B. - 1997. - Vol. 701. - P. 39-46.).- (Method 5) determination of phenol, p-cresol and 4-chlorophenol in blood plasma using liquid membrane extraction and column liquid chromatography with an amperometric biosensor modified with tyrosinase enzyme as a selective detection unit. Phenols are selectively extracted into a porous PTFE (polytetrafluoroethylene) membrane impregnated with a water-immiscible organic solvent and then into an alkaline acceptor phase. Through the ion exchange interface, the analytes are transferred to the reverse phase liquid chromatograph column, where they are separated and detected by the biosensor. No pre-treatment of the sample prior to extraction, except for centrifugation, is performed. Separation of analytes is carried out by reverse-phase liquid chromatography using a mobile phase consisting of methanol (gradient 0-10%) and 10 mM sodium phosphate buffer (pH 6.0) in 0.9% sodium chloride solution at a flow rate of 0, 1 ml/min on a column with a length of 20 mm and an internal diameter of 1 mm. The lower limit for the determination of phenol, p-cresol and 4-chlorophenol in blood plasma was 0.05 m / dm 3 (Norberg J., Emnrus J., Jonsson JA, Mathiasson L., Burestedt E., Knutsson M., Marko-Varga G. On-line supported liquid membrane-liquid chromatography with a phenol oxidase-based biosensor as a selective detection unit for the determination of phenols in blood plasma // Journal of Chromatography B. - 1997. - Vol. 701. - P. 39 -46.).
- (Метод 6) известен способ определение фенола и п-крезола в моче методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с флуориметрическим детектированием. Образцы мочи центрифугировали в течение 15 мин при 1000 g, чтобы обеспечить осаждение эритроцитов или других клеток крови, если они присутствовали в моче. Анализировали супернатант в количестве 20 мкл на жидкостном хроматографе с флуориметрическим детектором при длине волны возбуждения 284 нм и длине волны излучения 310 нм. Градуировка детектора проводилась на стандартных растворах фенолов в моче методом внешнего стандарта в диапазоне 0,002-0,040 и 0,00075-0,045 мг/дм3 для фенола и п-крезола соответственно. Разделение аналитов проводили на колонке длиной 250 мм и внутренним диаметром 4,6 мм с обращенной фазой С18 GL Sciences (Япония), размер частиц 5 мкм, с использованием подвижной фазы метанол-вода (65:35) со скоростью потока 1,4 мл/мин при температуре термостата колонки 35°С. Нижний предел определения 0,0005 мг/дм3 для фенола и 0,00025 мг/дм3 для п-крезола (Tekkeli S.E., Kiziltas M.V., Dincel D., Erkoc R., Topcu G. Simultaneous Determination of Phenol and p-Cresol in Human Urine by an HPLC Method // Acta Chromatographica, 2016. - 28(2): p. 255-262).- (Method 6) known method for the determination of phenol and p-cresol in urine by high performance liquid chromatography with fluorimetric detection. Urine samples were centrifuged for 15 min at 1000 g to ensure the sedimentation of erythrocytes or other blood cells if they were present in the urine. The supernatant was analyzed in an amount of 20 μl on a liquid chromatograph with a fluorimetric detector at an excitation wavelength of 284 nm and an emission wavelength of 310 nm. The detector was calibrated on standard solutions of phenols in urine using the external standard method in the range of 0.002-0.040 and 0.00075-0.045 mg/dm 3 for phenol and p-cresol, respectively. Separation of analytes was carried out on a column with a length of 250 mm and an internal diameter of 4.6 mm with a reversed phase C18 GL Sciences (Japan), particle size 5 μm, using a mobile phase of methanol-water (65:35) with a flow rate of 1.4 ml/ min at a column thermostat temperature of 35°C. The lower limit of determination is 0.0005 mg / dm 3 for phenol and 0.00025 mg / dm 3 for p-cresol (Tekkeli SE, Kiziltas MV, Dincel D., Erkoc R., Topcu G. Simultaneous Determination of Phenol and p-Cresol in Human Urine by an HPLC Method // Acta Chromatographica, 2016. - 28(2): pp. 255-262).
Недостатками указанных известных методов являются:The disadvantages of these known methods are:
- низкая чувствительность (метод 5),- low sensitivity (method 5),
- применение токсичного растворителя метанола для приготовления подвижной фазы (метод 5),- the use of toxic solvent methanol for the preparation of the mobile phase (method 5),
- невозможность применения описанного способа пробоподготовки для анализа смеси фенола и пирокатехина в крови из-за загрязнения аналитической колонки компонентами матрицы (метод 6).- the impossibility of using the described method of sample preparation for the analysis of a mixture of phenol and catechol in the blood due to contamination of the analytical column with matrix components (method 6).
Также известен способ, описанный в работе Niwa Т. Phenol and p-cresol accumulated in uremic serum measured by HPLC with fluorescence detection // Clin. Chem. - 1993. - Vol. 39, No. 1. - P. 108-111. Согласно известному способу отбирают пробу венозной крови объемом не менее 1 см3 в чистую пробирку. Далее производят ее пробопод готовку путем переноса 1 см3 крови в центрифужную пробирку и центрифугирования со скоростью 1500 об/мин в течение 5 мин. Отбирают 0,1 мл сыворотки, 1 мкг добавляют внутреннего стандарта п-этилфенола и 10 мл дистиллированной воды. Пробу подкисляют 1 М раствором соляной кислоты до рН 1, добавляют 0,1 г NaCl и экстрагируют 0,3 мл этилацетата встряхиванием в течение 10 мин. Центрифугируют пробу со скоростью 1500 об/мин в течение 5 мин, отбирают экстракт (верхний слой этилацетата) для анализа методом ВЭЖХ. Далее производят введение подготовленной пробы в пробоотборное устройство жидкостного хроматографа, проводят анализ экстракта в количестве 10 мм3 на обращено-фазной колонке Finepak Sil C18S длиной 150 мм и внутренним диаметром 4,6 мм. Подвижная фаза: смесь дистиллированной воды и ацетонитрила в объемном соотношении 70:30, скорость движения подвижной фазы 1 мл/мин, длина волны возбуждения флуориметрического детектора 260 нм, длина волны эмиссии 305 нм, температура термостата колонки соответствовала температуре окружающей среды (воздух лаборатории), время удерживания фенола 6,2 мин. Определяют содержание фенола с использованием ранее построенного градуировочного графика. Диапазон измеряемых концентраций фенола в крови 0,1-10 мг/дм3, погрешность определения 10%.Also known is the method described in Niwa T. Phenol and p-cresol accumulated in uremic serum measured by HPLC with fluorescence detection // Clin. Chem. - 1993. - Vol. 39, no. 1. - P. 108-111. According to the known method, a sample of venous blood with a volume of at least 1 cm 3 is taken into a clean test tube. Further, its sample preparation is carried out by transferring 1 cm3 of blood into a centrifuge tube and centrifugation at a speed of 1500 rpm for 5 min. 0.1 ml of serum is taken, 1 μg of p-ethylphenol internal standard and 10 ml of distilled water are added. The sample is acidified with 1 M hydrochloric acid to pH 1, 0.1 g of NaCl is added and extracted with 0.3 ml of ethyl acetate by shaking for 10 minutes. Centrifuge the sample at 1500 rpm for 5 minutes and remove the extract (top layer of ethyl acetate) for HPLC analysis. Next, the prepared sample is introduced into the sampling device of the liquid chromatograph, the extract is analyzed in an amount of 10 mm 3 on a reverse-phase Finepak Sil C18S column 150 mm long and 4.6 mm in inner diameter. Mobile phase: a mixture of distilled water and acetonitrile in a volume ratio of 70:30, the flow rate of the mobile phase is 1 ml/min, the excitation wavelength of the fluorimetric detector is 260 nm, the emission wavelength is 305 nm, the column oven temperature corresponded to ambient temperature (laboratory air), phenol retention time 6.2 min. Determine the content of phenol using a previously built calibration graph. The range of measured concentrations of phenol in the blood is 0.1-10 mg/dm 3 , the error of determination is 10%.
Недостатки известного способа: невозможность совместного определения фенола и пирокатехина при использовании в качестве подвижной фазы смеси ацетонитрила и дистиллированной воды в соотношении 70:30 без подкисления дистиллированной воды уксусной кислотой до получения концентрации 0,1% раствора, т.к. в данных условиях пирокатехин не удерживается на обращено-фазной колонке Finepak Sil C18S, что затрудняет проведение количественного анализа пирокатехина.The disadvantages of the known method: the impossibility of joint determination of phenol and catechol when using as a mobile phase a mixture of acetonitrile and distilled water in a ratio of 70:30 without acidifying distilled water with acetic acid to obtain a concentration of 0.1% solution, t.to. under these conditions, pyrocatechol is not retained on the reverse-phase Finepak Sil C18S column, which makes it difficult to quantify pyrocatechol.
Кроме того, данный метод не позволяет определять содержание фенола и пирокатехина в крови на уровне концентраций ниже 0,1 мг/дм3, реально присутствующих в крови.In addition, this method does not allow to determine the content of phenol and catechol in the blood at concentrations below 0.1 mg/dm 3 actually present in the blood.
При этом из уровня техники не были выявлены известные способы количественного определения фенола и пирокатехина в цельной крови, поэтому сделать выбор ближайшего аналога к заявляемому изобретению не представляется возможным.At the same time, known methods for the quantitative determination of phenol and catechol in whole blood have not been identified from the prior art, so it is not possible to make a choice of the closest analogue to the claimed invention.
Технический результат, достигаемый предлагаемым способом, заключается в возможности определения фенола и пирокатехина из одной пробы крови при их совместном присутствии, при одновременном обеспечении высокой чувствительности за счет увеличения степени экстракции фенола и пирокатехина до 87-100% и достижения селективности определения содержания фенола и пирокатехина в крови на уровне от 0,004 мг/дм3.The technical result achieved by the proposed method consists in the possibility of determining phenol and catechol from one blood sample in their joint presence, while ensuring high sensitivity by increasing the degree of extraction of phenol and catechol to 87-100% and achieving selectivity in determining the content of phenol and catechol in blood at a level of 0.004 mg / dm 3 .
Кроме того применение предлагаемого способа упрощает процедуру построения градуировочной кривой и расчета концентраций аналитов в крови.In addition, the application of the proposed method simplifies the procedure for constructing a calibration curve and calculating the concentrations of analytes in the blood.
Указанный технический результат достигается предлагаемым способом определения массовых концентраций фенола и пирокатехина в крови методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, согласно которому осуществляют отбор пробы крови, проводят ее подкисление 0,1%-ным раствором ортофосфорной кислотой в объемном соотношении проба : раствор кислоты как 20:1, выполняют извлечения аналитов жидкостной экстракцией, для чего добавляют к подкисленной пробе ацетонитрил в объемном соотношении проба: ацетонитрил как 1:1 соответственно, смесь центрифугируют 10 мин со скоростью 5000 об/мин, производят отбор верхнего слоя экстракта, добавляют в него 0,1 г смеси сорбента марки С18 и соли сульфата магния в массовом соотношении 1:6 соответственно, для очистки экстракта, перемешивают 1 мин и вновь центрифугируют 10 мин со скоростью 5000 об/мин, очищенный экстракт фильтруют и вводят в хроматограф 10 мм3 отфильтрованного экстракта, проводят измерение и определяют концентрацию фенола и пирокатехина с использованием градуировочного графика.The specified technical result is achieved by the proposed method for determining the mass concentrations of phenol and catechol in the blood by high performance liquid chromatography, according to which blood samples are taken, it is acidified with a 0.1% solution of orthophosphoric acid in a volume ratio of sample : acid solution as 20: 1, analytes are extracted by liquid extraction, for which acetonitrile is added to the acidified sample in a volume ratio of sample: acetonitrile as 1:1, respectively, the mixture is centrifuged for 10 minutes at a speed of 5000 rpm, the upper layer of the extract is taken, 0.1 g of the mixture is added to it sorbent brand C18 and salts of magnesium sulfate in a mass ratio of 1:6, respectively, to purify the extract, mix for 1 min and centrifuge again for 10 min at a speed of 5000 rpm, the purified extract is filtered and injected into the chromatograph 10 mm 3 of the filtered extract, measurement and determine the concentration of phenol and catechol using calibration curve.
Достижение указанного технического результата обеспечивается за счет следующего.The achievement of the specified technical result is provided by the following.
Благодаря тому, что пробу крови подкисляют ортофосфорной кислотой, обеспечивается повышение эффективности извлечения фенола и пирокатехина из крови, например, по сравнению с применением для подкисления раствора соляной кислоты.Due to the fact that the blood sample is acidified with phosphoric acid, an increase in the efficiency of the extraction of phenol and pyrocatechol from the blood is ensured, for example, in comparison with the use of a hydrochloric acid solution for acidification.
Применение при экстракции в качестве экстрагента ацетонитрила, позволяет получить чистый экстракт, в то время как при использовании, например, этилацетата наблюдается разрушение клеток крови, выделенный экстракт мутный и окрашен в красный цвет. И даже при последующей очистке экстракта сорбентом он остается мутным и слабоокрашенным, что отрицательно влияет на точность измерения.The use of acetonitrile as an extractant during extraction makes it possible to obtain a pure extract, while when using, for example, ethyl acetate, destruction of blood cells is observed, the isolated extract is cloudy and colored red. And even with the subsequent purification of the extract with a sorbent, it remains cloudy and slightly colored, which adversely affects the measurement accuracy.
При выполнении центрифугирования со скоростью 5000 об./мин в течение 10 минут достигается более полное выделение ацетонитрильного слоя.When centrifugation is performed at 5000 rpm for 10 minutes, a more complete separation of the acetonitrile layer is achieved.
Проведение очистки ацетонитрильного экстракта от компонентов матрицы методом твердофазной экстракции путем добавления к экстракту смеси насыпного сорбента С18 и сульфата магния в массовом соотношении 1:6 соответственно, позволяет получать чистый, прозрачный экстракт, что положительно влияет на достоверность определения. Например, указанную смесь можно использовать из набора vetexQ Тох - набор для анализа наркотических и лекарственных веществ в тканях и органах, производство компании «Интерлаб». Но можно приготовить смесь и из указанных компонентов.Purification of the acetonitrile extract from the matrix components by solid-phase extraction by adding a mixture of bulk C18 sorbent and magnesium sulfate to the extract in a mass ratio of 1:6, respectively, makes it possible to obtain a pure, transparent extract, which positively affects the reliability of the determination. For example, this mixture can be used from the vetexQ Tox kit - a kit for the analysis of narcotic and medicinal substances in tissues and organs, manufactured by Interlab. But you can prepare a mixture of these components.
Благодаря тому, что подготовленную пробу фильтруют через мембранный фильтр с размером пор не более 0,45 мкм, обеспечивается дополнительная очистка анализируемой пробы.Due to the fact that the prepared sample is filtered through a membrane filter with a pore size of not more than 0.45 microns, additional purification of the analyzed sample is provided.
При лабораторном исследовании хроматографическое разделение фенола и пирокатехина выполняли на обращенно-фазной колонке Eclipse XDB С18 длиной 150 мм и внутренним диаметром 4,6 мм зернением 5 мкм. Элюирование проводить смесью ацетонитрила и 0,1% водного раствора уксусной кислоты в соотношении 40:60 (объемные доли). При этом скорость элюирования 0,8 мл/мин. Температура колонки 30°С, объем анализируемой пробы 10 мкл, длина волны возбуждения флуориметрического детектора 275 нм, длина волны эмиссии 315 нм. В данных условиях время выхода пирокатехина составляет 3,0 мин, фенола - 4,7 мин.In a laboratory study, the chromatographic separation of phenol and pyrocatechol was performed on a reversed-phase column Eclipse XDB C18 150 mm long and 4.6 mm in inner diameter with a grain size of 5 μm. Elution is carried out with a mixture of acetonitrile and 0.1% aqueous solution of acetic acid in a ratio of 40:60 (volume fractions). The elution rate was 0.8 ml/min. The column temperature was 30°С, the volume of the analyzed sample was 10 μl, the excitation wavelength of the fluorimetric detector was 275 nm, and the emission wavelength was 315 nm. Under these conditions, the release time of pyrocatechin is 3.0 min, phenol - 4.7 min.
Предлагаемый способ был опробован в лабораторных условиях. Для его реализации были использованы следующие химреактивы, оборудование и расходные материалы: - государственный стандартный образец (ГСО) фенола в этаноле массовой концентрации 1 мг/см3 с чистотой реактива не менее 99,0%;The proposed method was tested in laboratory conditions. For its implementation, the following chemicals, equipment and consumables were used: - state standard sample (SRM) of phenol in ethanol with a mass concentration of 1 mg/cm 3 with a reagent purity of at least 99.0%;
- аналитический стандарт пирокатехина, чистота реактива 99,9%;- analytical standard of pyrocatechol, reagent purity 99.9%;
- ацетонитрил для хроматографии, сорт «0», ТУ 2634-002-54260861-2013;- acetonitrile for chromatography, grade "0", TU 2634-002-54260861-2013;
- кислота ортофосфорная, химически чистая, ГОСТ 6552-80;- orthophosphoric acid, chemically pure, GOST 6552-80;
- кислота уксусная, химически чистая, ледяная ГОСТ 61-75;- acetic acid, chemically pure, glacial GOST 61-75;
- дистиллированная вода, ГОСТ 58144-2018;- distilled water, GOST 58144-2018;
- смесь для твердофазной очистки экстракта, состоящая из 6 мас.ч магния сульфата и из 1 мас.ч сорбента С18);- a mixture for solid-phase purification of the extract, consisting of 6 wt.h magnesium sulfate and 1 wt.h sorbent C18);
- жидкостный хроматограф, оснащенный флуориметрическим детектором, насосом для смешивания двух растворителей;- liquid chromatograph equipped with a fluorimetric detector, a pump for mixing two solvents;
- весы лабораторные электронные аналитические 2 класса точности, погрешность взвешивания ± 0,5 мг, ГОСТ Р 53228;- laboratory electronic analytical scales, 2nd accuracy class, weighing error ± 0.5 mg, GOST R 53228;
- центрифуга с охлаждением, обеспечивающая рабочую температуру 4°С, допустимая скорость центрифугирования не менее 4000 об/мин;- a centrifuge with cooling, providing a working temperature of 4 ° C, an allowable centrifugation speed of at least 4000 rpm;
- Eclipse XDB С18 длиной 150 мм и внутренним диаметром 4,6 мм зернением 5 мкм;- Eclipse XDB С18 150 mm long and 4.6 mm in inner diameter with 5 µm grit;
- мембранные фильтры из политетрафторэтилена (ПТФЭ) с размером пор 0,45 мкм.- Membrane filters made of polytetrafluoroethylene (PTFE) with a pore size of 0.45 µm.
Приготовление растворов и подготовку проб к анализу проводят в условиях:Preparation of solutions and preparation of samples for analysis is carried out under the following conditions:
- температура воздуха (20±5)°С;- air temperature (20±5)°C;
- атмосферное давление от 84,0 до 106,7 кПа (630-800 мм рт.ст.);- atmospheric pressure from 84.0 to 106.7 kPa (630-800 mm Hg);
- влажность воздуха от 30 до 80%.- air humidity from 30 to 80%.
Приготовление растворов:Preparation of solutions:
1. Подвижная фаза для элюирования1. Mobile phase for elution
Состав подвижной фазы - смесь ацетонитрила и 0,1%-го водного раствора уксусной кислоты в соотношении 35:65 (объемные доли) задают на двух каналах насоса жидкостного хроматографа.The composition of the mobile phase - a mixture of acetonitrile and a 0.1% aqueous solution of acetic acid in a ratio of 35:65 (volume fractions) is set on two channels of a liquid chromatograph pump.
2. Исходный раствор пирокатехина с концентрацией 1 г/дм3 2. The initial solution of pyrocatechol with a concentration of 1 g / dm 3
Взвешивают 0,1 г пирокатехина, переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3, доводят дистиллированной водой до метки, закрывают пробкой и перемешивают. Массовая концентрация пирокатехина в исходном растворе составляет 1 г/дм3. Срок хранения раствора 3 дня.Weigh 0.1 g of catechol, transfer to a volumetric flask with a capacity of 100 cm 3 , bring to the mark with distilled water, stopper and mix. The mass concentration of pyrocatechol in the initial solution is 1 g/DM 3 . The shelf life of the solution is 3 days.
3. Рабочий раствор фенола и пирокатехина в ацетонитриле с концентрацией 5 мг/дм3 3. Working solution of phenol and pyrocatechol in acetonitrile with a concentration of 5 mg / dm 3
В колбу на 100 см3 переносили с помощью дозатора 0,5 см3 исходного раствора пирокатехина с концентрацией 1 г/дм3, 0,5 см3 стандартного образца фенола в этаноле массовой концентрацией 5 мг/см3, доводили дистиллированной водой до метки и перемешивали. Используют свежеприготовленный раствор.0.5 cm 3 of the initial solution of pyrocatechol with a concentration of 1 g/dm 3 , 0.5 cm 3 of a standard sample of phenol in ethanol with a mass concentration of 5 mg/cm 3 was transferred into a 100 cm 3 flask using a dispenser, brought to the mark with distilled water, and mixed. Use freshly prepared solution.
4. Приготовление 0,1%-го водного раствора уксусной кислоты4. Preparation of a 0.1% aqueous solution of acetic acid
В мерную колбу вместимостью 500 см3, приливают 100 см3 дистиллированной воды и 0,5 см3 уксусной кислоты, перемешивают, доводят дистиллированной водой до метки, закрывают пробкой и перемешивают. Используют свежеприготовленный раствор.In a volumetric flask with a capacity of 500 cm 3 , pour 100 cm 3 of distilled water and 0.5 cm 3 of acetic acid, mix, bring to the mark with distilled water, stopper and mix. Use freshly prepared solution.
5. Приготовление 0,1%-го водного раствора ортофосфорной кислоты5. Preparation of a 0.1% aqueous solution of phosphoric acid
В мерную колбу вместимостью 50 см3, приливают 10 см3 дистиллированной воды и 0,05 см3 ортофосфорной кислоты, перемешивают, доводят дистиллированной водой до метки, закрывают пробкой и перемешивают. Используют свежеприготовленный раствор.In a volumetric flask with a capacity of 50 cm 3 , pour 10 cm 3 of distilled water and 0.05 cm 3 of orthophosphoric acid, mix, bring to the mark with distilled water, stopper and mix. Use freshly prepared solution.
6. Построение градуировочной характеристики проводят в мерных колбах вместимостью 25 см3, в которые вносят рабочий раствор фенола и пирокатехина с концентрацией аналитов 5 мг/дм3 в количестве, указанном в таблице 1. Доводят содержимое колб до метки дистиллированной водой и перемешивают. Используют свежеприготовленные градуировочные растворы. Растворы фильтруют через тефлоновые фильтры с диаметром пор 0,45 мкм в стеклянную виалу и аликвотную часть (10 мм3) анализируют на жидкостном хроматографе в рабочем режиме работы хроматографа.6. The construction of the calibration characteristics is carried out in volumetric flasks with a capacity of 25 cm 3 , into which a working solution of phenol and pyrocatechol is added with an analyte concentration of 5 mg / dm 3 in the amount indicated in table 1. The contents of the flasks are brought to the mark with distilled water and mixed. Use freshly prepared calibration solutions. The solutions are filtered through Teflon filters with a pore diameter of 0.45 μm into a glass vial and an aliquot (10 mm 3 ) is analyzed on a liquid chromatograph in the operating mode of the chromatograph.
Рассчитывают градуировочный коэффициент по формуле:The calibration coefficient is calculated by the formula:
Ci - концентрация фенола и пирокатехина в градуировочном растворе i-й концентрации, мг/дм3;C i - concentration of phenol and catechol in the calibration solution of the i-th concentration, mg/DM 3 ;
Si - среднее значение измерений площади пика фенола и пирокатехина i-й концентрации, единицы оптической плотности (е.о.п.);S i is the average value of measurements of the area of the peak of phenol and pyrocatechol of the i-th concentration, units of optical density (e.o.p.);
n - количество градуировочных смесей (n=5).n - number of calibration mixtures (n=5).
Градуировку проверяют 1 раз в квартал и при смене партии реактивов.The calibration is checked once a quarter and when changing the batch of reagents.
Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.The proposed method is carried out as follows.
Производят отбор проб крови в количестве 2 мл в химически чистые полипропиленовые пробирки с добавлением антикоагулянта (гепарин) или в вакуумные пробирки с внесенным антикоагулянтом.Blood samples are taken in the amount of 2 ml into chemically clean polypropylene tubes with the addition of an anticoagulant (heparin) or into vacuum tubes with an anticoagulant added.
Далее проводят подготовку проб крови способом жидкостной экстракции. В полипропиленовую пробирку вместимостью 15 см3 помещают 1 см3 цельной крови, вносят 50 мм3 0,1% раствора ортофосфорной кислоты, перемешивают 1 минуту, добавляют 1 см3 ацетонитрила, перемешивают 1 минуту и центрифугируют 10 мин со скоростью 5000 об/мин при температуре +4°С. Отбирают 1 см3 верхнего (ацетонитрильного) слоя, добавляют в него 0,1 г смеси магния сульфата и сорбента С18 для очистки экстракта, перемешивают 1 мин и центрифугируют 10 мин в тех же условиях. Очищенный экстракт фильтруют через фильтр ПТФЭ с размером пор 0,45 мкм. Вводят в хроматограф 10 мм3 экстракта и дважды анализируют в рабочем режиме хроматографа.Next, blood samples are prepared by the method of liquid extraction. 1 cm 3 of whole blood is placed in a polypropylene tube with a capacity of 15 cm 3 , 50 mm 3 of a 0.1% solution of phosphoric acid is added, stirred for 1 minute, 1 cm 3 of acetonitrile is added, mixed for 1 minute and centrifuged for 10 minutes at a speed of 5000 rpm at temperature +4°С. 1 cm 3 of the upper (acetonitrile) layer is taken, 0.1 g of a mixture of magnesium sulfate and C18 sorbent is added to it to purify the extract, stirred for 1 min and centrifuged for 10 min under the same conditions. The purified extract is filtered through a 0.45 µm PTFE filter. Enter into the chromatograph 10 mm 3 extract and twice analyzed in the operating mode of the chromatograph.
Концентрацию фенола и пирокатехина в крови определяют с использованием градуировочных графиков.The concentration of phenol and catechol in the blood is determined using calibration curves.
Результат определения представляется как среднее арифметическое двух измерений пробы.The result of the determination is presented as the arithmetic mean of two measurements of the sample.
Массовую концентрацию фенола и пирокатехина в крови рассчитывают по формуле:The mass concentration of phenol and pyrocatechol in the blood is calculated by the formula:
С - массовая концентрация определяемого соединения в крови, мг/дм3;C is the mass concentration of the analyte in the blood, mg/dm 3 ;
К - градуировочный коэффициент;K - calibration coefficient;
V1 - объем экстракта, см3;V 1 - extract volume, cm 3 ;
V - объем крови, взятой на анализ, см3.V is the volume of blood taken for analysis, cm3.
Полученные результаты измерения фенола и пирокатехина в крови (рабочие пробы) предлагаемым способом приведены в таблице 2.The results of the measurement of phenol and catechol in the blood (working samples) by the proposed method are shown in table 2.
Для расчета относительной погрешности предлагаемого способа использовали способ «введено-найдено».To calculate the relative error of the proposed method, the "introduced-found" method was used.
Для этого проводят анализ проб крови без добавления и с добавлением в них определенного количества анализируемого компонента (добавка составляет 50-150% от найденной концентрации фенола и пирокатехина в рабочей пробе) для выяснения правильности и точности заявляемого способа (относительная погрешность). Полученные результаты измерений фенола и пирокатехина в рабочей пробе крови без добавки приведены в таблицах 3 и 4 соответственно.To do this, blood samples are analyzed without adding and with the addition of a certain amount of the analyzed component (the additive is 50-150% of the found concentration of phenol and pyrocatechol in the working sample) to determine the correctness and accuracy of the proposed method (relative error). The results of measurements of phenol and catechol in the working blood sample without additive are shown in tables 3 and 4, respectively.
Результаты измерений фенола и пирокатехина в подготовленной пробе с добавкой аналитов в пробу крови приведены в таблицах 5 и 6 соответственно. В данном примере величина добавки фенола в пробу крови была равна 0,007 мг/дм3, добавка пирокатехина 0,026 мг/дм3. Среднее обнаруженное значение внесенной добавки фенола составило 0,0705 мг/дм3, добавки пирокатехина - 0,024 мг/дм3.The results of measurements of phenol and catechol in the prepared sample with the addition of analytes to the blood sample are shown in tables 5 and 6, respectively. In this example, the value of the addition of phenol to the blood sample was equal to 0.007 mg/dm 3 , the addition of catechol 0.026 mg/dm 3 . The average found value of the added phenol additive was 0.0705 mg/dm 3 , the pyrocatechol additive - 0.024 mg/dm 3 .
Данные, приведенные в таблицах 5 и 6, показывают, что предлагаемый способ характеризуется высокой точностью и правильностью анализа.The data shown in tables 5 and 6 show that the proposed method is characterized by high accuracy and correctness of the analysis.
Также в ходе лабораторных испытаний предлагаемого способа были установлены следующие его характеристики: диапазоны измерений фенола и пирокатехина в крови, значения показателей точности, правильности, повторяемости и внутрилабораторной прецизионности. Полученные данные приведены в таблицах 7 и 8.Also, in the course of laboratory tests of the proposed method, the following characteristics were established: measurement ranges of phenol and catechol in the blood, values of accuracy, accuracy, repeatability and intralaboratory precision. The data obtained are shown in tables 7 and 8.
Приведенные в таблицах 7 и 8 данные показывают, что предлагаемый способ позволяет с высокой точностью определять в цельной крови фенол и пирокатехин в диапазоне концентраций 0,004-1,0 мг/дм3.The data given in tables 7 and 8 show that the proposed method allows to determine with high accuracy in whole blood phenol and catechol in the concentration range of 0.004-1.0 mg/DM 3 .
Чувствительность заявляемого способа позволяет обнаружить низкие концентрации, в том числе на уровне фоновых значений (как продуктов метаболизма), а также высокие концентрации, связанные с контаминацией биологических сред в условиях производства.The sensitivity of the proposed method makes it possible to detect low concentrations, including at the level of background values (as metabolic products), as well as high concentrations associated with contamination of biological media in production conditions.
Claims (1)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2786509C1 true RU2786509C1 (en) | 2022-12-21 |
Family
ID=
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2188416C1 (en) * | 2001-10-04 | 2002-08-27 | Пермский научно-исследовательский клинический институт детской экопатологии | Method for carrying out quantitative blood phenol determination |
| RU2205398C1 (en) * | 2001-12-24 | 2003-05-27 | Государственное образовательное учреждение Воронежская государственная технологическая академия | Method of determining hydroquinone and pyrocatechol in aqueous media |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2188416C1 (en) * | 2001-10-04 | 2002-08-27 | Пермский научно-исследовательский клинический институт детской экопатологии | Method for carrying out quantitative blood phenol determination |
| RU2205398C1 (en) * | 2001-12-24 | 2003-05-27 | Государственное образовательное учреждение Воронежская государственная технологическая академия | Method of determining hydroquinone and pyrocatechol in aqueous media |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| NIWA T. "PHENOL AND P-CRESOL ACCUMULATED IN UREMIC SERUM MEASURED BY HPLC WITH FLUORESCENCE DETECTION", CLINICAL CHEMISTRY, V. 39(1), PP. 108-111, 1993. * |
| МУК 4.1.2108-06 "ОПРЕДЕЛЕНИЕ МАССОВОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ ФЕНОЛА В БИОСРЕДАХ (КРОВЬ) ГАЗОХРОМАТОГРАФИЧЕСКИМ МЕТОДОМ", 2006. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Mills et al. | Headspace solid-phase microextraction procedures for gas chromatographic analysis of biological fluids and materials | |
| Gupta et al. | Gas-chromatographic analysis for valproic acid as phenacyl esters. | |
| Evenson et al. | Simultaneous Measurement of Diphenylhydantoin and Primidone in Serum by Gas—Liquid Chromatography | |
| JPS63258882A (en) | Reagent and method for measuring cation | |
| RU2786509C1 (en) | Method for determination of mass concentrations of phenol and pyrocatechol in blood by high performance liquid chromatography | |
| CN108152425A (en) | A kind of method of high performance liquid chromatography detection sesame oil lignanoid | |
| Knight et al. | Improved colorimetry of urinary 3-methoxy-4-hydroxyphenylacetic acid (homovanillic acid). | |
| CN111579684B (en) | Method for measuring content of total capsaicin in capsule wall material of capsule | |
| Lu et al. | An endo-functionalized molecular cage for selective potentiometric determination of creatinine | |
| Korzun et al. | Rapid chromatographic method for the identification and estimation of glutethimide (Doriden) in blood | |
| Pattayeva et al. | METHOD FOR MASS CONCENTRATION DETERMINATION OF PHENOL AND PYROCATECHOL IN BLOOD USING HIGH-PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY | |
| Tasset et al. | Liquid-chromatographic determination of amoxapine and 8-hydroxyamoxapine in human serum. | |
| RU2324185C1 (en) | Method of quantitative determination of phthalic acid in blood serum | |
| RU2188416C1 (en) | Method for carrying out quantitative blood phenol determination | |
| RU2190854C1 (en) | Method for quantitative determination of urinary 2-chlorophenol | |
| LU502074B1 (en) | Method for rapidly detecting residual quantity of sulfonamides in honey | |
| RU2322674C1 (en) | Method of determining 2,6-bis[bis(beta-hydroxyethyl)amino]-4,8-di-n-pyperidino-pyrimido(5,4-d)pyrimidine in biological material | |
| RU2018113C1 (en) | Method of novocainamide assay in the objects of biological origin | |
| RU2702330C1 (en) | Method for quantitative determination of 2-[(z)-1-(3,5-diphenyl-1,3,4-thiadiazole-2(3h)-ylidene)methyl]-3,5-diphenyl-1,3,4-thiadiazole-3-ium in biological objects | |
| RU2636231C1 (en) | Method of quantitation 2,2,6,6-tetramethyl-n-{1-[5-(4-methyl-3-chloroaniline)-1,2,4-thiadiazole-3-yl]propan-2-yl}piperidin-4-amine dihydrochloride in biological matrices | |
| Diamandis et al. | An enzymatic method for measuring serum mannitol and its use in hemodialysis patients | |
| RU2430372C1 (en) | Method of determining 2,4-dinitrophenol and 2-amino-4-nitrophenol when both are present in biological fluids | |
| RU2145511C1 (en) | Method of separating mixture of fatty acid c2-c7-fraction by liquid chromatography technique | |
| RU2416798C1 (en) | Method of blood dichlorobromomethane measurement | |
| RU2617176C1 (en) | Method for determination of 2,6-bis-[bis-(beta-oxyethyl)-amino]-4,8-di-n-piperidino-pyrimido(5,4-d)pyrimidine in biological material |