RU2786246C2 - Способ получения молекулярных маркеров для определения вероятной внешности человека методом мультиплексной амплификации для работы с образцами деградированной ДНК - Google Patents
Способ получения молекулярных маркеров для определения вероятной внешности человека методом мультиплексной амплификации для работы с образцами деградированной ДНК Download PDFInfo
- Publication number
- RU2786246C2 RU2786246C2 RU2021115050A RU2021115050A RU2786246C2 RU 2786246 C2 RU2786246 C2 RU 2786246C2 RU 2021115050 A RU2021115050 A RU 2021115050A RU 2021115050 A RU2021115050 A RU 2021115050A RU 2786246 C2 RU2786246 C2 RU 2786246C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- determination
- dna
- seq
- appearance
- pcr
- Prior art date
Links
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 title claims abstract description 48
- 230000003321 amplification Effects 0.000 title claims abstract description 20
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 title claims abstract description 20
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract 2
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 claims abstract description 12
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 claims abstract description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 10
- 229920001850 Nucleic acid sequence Polymers 0.000 claims abstract description 7
- 230000002068 genetic Effects 0.000 claims abstract description 6
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims abstract description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 4
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 claims abstract description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 17
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 3
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000001508 Eye Anatomy 0.000 description 22
- 230000037308 hair color Effects 0.000 description 12
- 210000004209 Hair Anatomy 0.000 description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 102100004664 MC1R Human genes 0.000 description 4
- 101710031876 MC1R Proteins 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 229920000798 Ancient DNA Polymers 0.000 description 2
- 108020000992 Ancient DNA Proteins 0.000 description 2
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 2
- 102000009095 Fanconi Anemia Complementation Group A Protein Human genes 0.000 description 2
- 108010087740 Fanconi Anemia Complementation Group A Protein Proteins 0.000 description 2
- 201000000106 Fanconi anemia complementation group A Diseases 0.000 description 2
- 210000000554 Iris Anatomy 0.000 description 2
- 102100011857 NPLOC4 Human genes 0.000 description 2
- 101710027744 NPLOC4 Proteins 0.000 description 2
- 102100007302 PIGU Human genes 0.000 description 2
- 108060006228 PIGU Proteins 0.000 description 2
- 102100001179 RAB38 Human genes 0.000 description 2
- 101700071032 RAB38 Proteins 0.000 description 2
- 102100018409 SLC24A4 Human genes 0.000 description 2
- 108091006617 SLC24A4 Proteins 0.000 description 2
- 102100008054 TUBB3 Human genes 0.000 description 2
- 101710025594 TUBB3 Proteins 0.000 description 2
- 101710028079 UMAG_05828 Proteins 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 2
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002287 Amplicon Polymers 0.000 description 1
- 229910000906 Bronze Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000003855 Cell Nucleus Anatomy 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-N Deoxycytidine triphosphate Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](CO[P@](O)(=O)O[P@](O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N Deoxyguanosine triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- 102100003087 HERC2 Human genes 0.000 description 1
- 101700084236 HERC2 Proteins 0.000 description 1
- 210000003780 Hair Follicle Anatomy 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 102100013274 IRF4 Human genes 0.000 description 1
- 101700047660 IRF4 Proteins 0.000 description 1
- 102100001056 KITLG Human genes 0.000 description 1
- 101710028765 KITLG Proteins 0.000 description 1
- 210000000265 Leukocytes Anatomy 0.000 description 1
- 102200067231 MC1R D294H Human genes 0.000 description 1
- 102200068760 MC1R D84E Human genes 0.000 description 1
- 102200068721 MC1R I155T Human genes 0.000 description 1
- 102200068765 MC1R R142H Human genes 0.000 description 1
- 102200068722 MC1R R151C Human genes 0.000 description 1
- 102200068724 MC1R R160W Human genes 0.000 description 1
- 102200067234 MC1R R163Q Human genes 0.000 description 1
- 102200068777 MC1R V60L Human genes 0.000 description 1
- 102200068758 MC1R V92M Human genes 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L MgCl2 Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102100016028 OCA2 Human genes 0.000 description 1
- 101700013618 OCA2 Proteins 0.000 description 1
- 208000008627 Oculocutaneous albinism type 2 Diseases 0.000 description 1
- 229920000272 Oligonucleotide Polymers 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 102100002062 SLC45A2 Human genes 0.000 description 1
- 108091007274 SLC45A2 Proteins 0.000 description 1
- 102200034620 SLC45A2 L374F Human genes 0.000 description 1
- 210000003491 Skin Anatomy 0.000 description 1
- 102100007096 TYRP1 Human genes 0.000 description 1
- 101700000513 TYRP1 Proteins 0.000 description 1
- 241000234314 Zingiber Species 0.000 description 1
- 235000006886 Zingiber officinale Nutrition 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000560 biocompatible material Substances 0.000 description 1
- 238000007622 bioinformatic analysis Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000010974 bronze Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-J dATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-J 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- -1 deoxyribonucleotide triphosphates Chemical class 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cells Anatomy 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000001815 facial Effects 0.000 description 1
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 1
- 235000008397 ginger Nutrition 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 201000000461 oculocutaneous albinism type II Diseases 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 238000011176 pooling Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 102210006547 rs12931267 Human genes 0.000 description 1
- 102220115520 rs201326893 Human genes 0.000 description 1
- 102210007360 rs28777 Human genes 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к области молекулярной биологии, биотехнологии, судебной медицины и криминалистики, генетическим исследованиям в области идентификации человека. Предложен способ получения молекулярных маркеров для определения вероятной внешности человека методом мультиплексной амплификации для работы с образцами деградированной ДНК. Для генотипирования используют композицию из 24 пар оригинальных синтетических олигонуклеотидных праймеров, для проведения мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР), фланкирующих участки ДНК, содержащие однонуклеотидные вариации (SNP), или 19 пар синтетических оригинальных олигонуклеотидных праймеров. ПЦР-продукты, соответствующие выбранным праймерам, представляют собой маркеры. Предложен способ определения вероятной внешности человека. Способ включает генетическое исследование биологического образца, содержащего ДНК, с использованием мультиплексной полимеразно-цепной реакции и последующее определение нуклеотидной последовательности продуктов амплификации, содержащих SNP-маркеры определения внешности, полученные способом по п. 1. Предложен набор для генотипирования (тест-система ДНК) индивида для осуществления способа, а также применение способа определения вероятной внешности человека для определения вероятной внешности индивида, происходящего из популяций Российской Федерации. Изобретение позволяет осуществить идентификацию неизвестного индивида и определение черт внешности с высокой чувствительностью, специфичностью и точностью. 4 н. и 10 з.п. ф-лы, 1 табл., 1 пр.
Description
Изобретение относится к области молекулярной биологии и прогностических тестов внешности человека и используется для определения вероятности цвета глаз и волос индивидуума. Изобретение представляет собой набор синтетических олигонуклеотидных праймеров для проведения мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР). Изобретение дает возможность выявить однонуклеотидные ДНК-маркеры цвета глаз и волос из образцов геномной ДНК человека, в том числе в случае, когда ДНК в исследуемом образце находится в деградированном виде, а именно амплифицировать короткие фрагменты ДНК, содержащие специфические мутации в генах MC1R, TUBB3, SLC45A2, KITLG, IRF4, TYR, ОСА2, SLC24A4, HERC2, PIGU, TYRP1, LOC105374875 и LOC105370627, NPLOC4, RAB38 и FANCA.
Уровень техники
Системы для ДНК-идентификации черт внешности необходимы как для криминалистических целей, так и широкого круга научных задач, в частности, воспроизведения вероятной внешности индивидов из археологических раскопок. В начале 2000-х годов было выявлено, что цвет глаз и волос не являются моногенными признаками, как это предполагалось ранее. Одна из наиболее значимых работ принадлежит группе Liu и др [1], давшей основу для формирования нескольких альтернативных наборов ДНК-маркеров для определения цвета глаз и волос [2-6]. Наиболее широкое распространение для дальнейших исследовательских и криминалистических работ получили системы, опубликованные в работах Walsh и др. [2] и Ruiz и др [3]. Эти системы были разработаны на основании генетических данных для европейских популяций, а также прошли успешную апробацию на других популяционных исследованиях [7, 8]. Изначально обе системы для ДНК-идентификации цвета глаз и волос были разработаны в качестве вспомогательных средств для криминалистических целей, дополняя ДНК-идентификацию с помощью STR-маркеров. Однако, в работах последнего десятилетия ДНК-идентификация черт внешности также активно используется отдельно для исторических находок и характеристик массовых захоронений [9-11]. Система HirisPlex, предложенная Walsh и др., основана на 23 ОНП и 1 инделе [2] и позволяет различить светлый/темный/промежуточный цвет радужки глаз, цвет волос блондин/шатен/рыжий/брюнет, а также 2 оттенка волос - светлый/темный. Однако, в последних научно-исследовательских работах было выявлено, что данная система менее эффективна для народностей азиатского происхождения, в частности, HirisPlex не определяет различия между темным и промежуточным цветом глаз, в то время как с помощью набора маркеров, опубликованный Ruiz, такое различие возможно [7, 12, 13]. Исследования европейских популяций, наоборот, подтверждают более высокую предиктивную способность системы HirisPlex [8]. Кроме того, за последние несколько лет были выявлены новые гены и однонуклеотидные маркеры, влияющие на цвет глаз и волос, а также окраску меха и шерсти млекопитающих [14-16]. Поскольку Российская федерация расположена как на территории Азии, так и Европы, и населена около 200 народностями, рационально использовать маркеры из обеих систем и учитывать маркеры из последних исследований, не мономорфные для населения России.
Таким образом, техническая проблема, решаемая настоящим изобретением, заключается в расширении арсенала технических средств, которые используются для определения вероятности цвета глаз и волос индивидуумов на территории России.
Выбор набора маркеров
Коллекция данных секвенирования из 330 образцов ДНК граждан РФ с различным цветом глаз, волос и этническим происхождением использовалась для выявления маркеров внешности, информативных для населения РФ. Для всех образцов были доступны оценки экспертов цвета глаз и волос (для глаз: темный, смешанный-темный, смешанный-светлый и светлый цвет, для волос: темный, промежуточный, светлый оттенок и наличие рыжего оттенка). В биоинформатическом анализе участвовали 36 маркеров, включающих 24 маркера HirisPlex [2], 9 маркеров из Ruiz и др. [3] и 3 маркера из гена, выявленного в Manakhov и др. [15]. Для всех маркеров была посчитана корреляция с меткой-цветом глаз, для этого метка принимала числовые значения (1 для "светлого", 2 для "смешанного", 3 для "темного"). Далее, были исключены маркеры, мономорфные для РФ и незначимые после поправки на множественное тестирование по методу Бенджамини-Хохберга. Далее была выполнена проверка сцепленности значимых признаков (в vcftools по алгоритму PLINK), которая выявила две пары маркеров, имеющих коэффициент сцепленности r2>lll0.8. Аналогично был проведен выбор ДНК маркеров, информативных для цвета волос.
К полученному набору ДНК-маркеров были подобраны оригинальные олигонуклеотидные праймеры таким образом, чтобы полученный ПЦР-продукт имел минимальную длину, что позволило бы повысить результативность при исследовании деградированной ДНК (табл. 1). Праймеры подобраны также с учетом того, чтобы можно было эффективно амплифицировать все целевые локусы в ходе одной мультиплексной ПЦР. Авторами была проведена серия испытаний набора реактивов. Авторы изобретения провели полногеномное секвенирование образцов ДНК различных индивидов и выявили соответствие с генотипами маркеров в ПЦР продуктах, полученными с помощью данного набора олигонуклеотидов на тех же образцах ДНК. Возможность точного определения генотипов для всех 28 маркеров была показана для более, чем 50 различных образцов ДНК. Также, было показано преимущество разработанного авторами набора ДНК-маркеров перед системой Forenseq DNA Signature в случаях применения способа выявление внешности индивида для образцов, где ДНК находится в деградированном виде или в малых количествах (например, для работы с "древней ДНК").
Таблица 1. Олигонуклеотидные праймеры к целевым SNP-маркерам внешности. | ||||
SEQ IID | ID маркера | Ген | Нуклеотидная последовательность праймеров | Размер ампликона, п.н. |
1 2 |
rs16891982 | SLC45A2 | >AAGTGAGGAAAACACGGAGTTG >TAGTGCACACAACTCCACAGAG |
94 |
3 4 |
rs28777 | SLC45A2 | >TCCACTCAGTTGATTTCATGTGATC >CCTGATAGATTATCTACCTCTTTGA |
133 |
5 6 |
rs12203592 | IRF4 | >AGTAGTGCCTTATCATGTGAAACCA >TGGCTAAACCTGGCACCAAAAGTAC |
141 |
9 10 |
rs683 | TYRP1 | >TAGTATCACAAAACCACCTGGTTGA >GGTCTTCCCAGCTTTGAAAA |
138 |
11 12 |
rs1042602 | TYR | >AAATGAAAAATGGATCAACACCCAT >CTTCATGGGCAAAATCAATGTCTCT |
138 |
13 14 |
rs1393350 | TYR | >TGCGTGCATATCCACCAACTCCTAC >AACAGAAAGTCACTGTTTGTATCTG |
131 |
15 16 |
rs12821256 | KITLG | >ATAAGGAATTCAGGTGTGAAGTTGT >TGTTCCAACTTAGTCATAAAGTTCC |
133 |
17 18 |
rs12896399 | LOCI 05370 627 | >TCTGGCGATCCAATTCTTTGTTCTT >GACCCTGTGTGAGACCCAGTACTTA |
126 |
19 20 |
rs2402130 | SLC24A4 | >GCTGTGTGACACCACATGCTGTATG >CCTGGACTTCACCTCGATGACGATG |
140 |
21 22 |
rs12913832 | HERC2 | >TGTTAATACAAAGGTACAGGAACAA >CCCCTGATGATGATAGCGTGCAGAA |
125 |
23 24 |
rs1800407 | OCA2 | >CGATGAGACAGAGCATGATGA >CACTCTGGCTTGTACTCTCTCTG |
96 |
25 26 |
rs11547464 | MC1R | >GTGATCACCTGCAGCTCC >TGCGTAGAAGATGGAGATGT |
84 |
27 28 |
rs1805005 | MC1R | >TCCATCTCTGACGGGCTC >CAGTACATGGGTGAGTGCA |
110 |
29 | rs1805006, | MC1R | >ATCGCCAAGAACCGGAAC | 120 |
30 | rs2228479 | >CTCCAGCAGGAGGATGAC | ||
31 32 |
rs1805007, rs201326893, rs1110400, rs1805008, |
MC1R | >GGACCGCTACATCTCCATC >ATGAAGAGCGTGCTGAAGAC |
120 |
33 34 |
rs1805009 | TUBB3 | >CTTTCTCGCCCTCATCATCTGCAAT >CCCTCTGCCCAGCACACTTAAAGCC |
147 |
35 36 |
rs312262906 | MC1R | >GCTGTGCAGGGATCCCAGAGAAGAC >GGCTGAGGAAGAGCCCGTCAGAGAT |
139 |
37 38 |
rs885479 | MC1R | >CCGTGGACCGCTACATCTCCATCTT >CACGTGGTCGTAGTAGGCGATGAAG |
142 |
39 40 |
rs2378249 | PIGU | >TACTCTACCTGCAGAAGACCTCAGT >TTTCAGTCTGGAGACTTTATTTAAT |
138 |
41 42 |
rs4778138 | OCA2 | >GAAAGTCTCAAGGGAAATCAGA >GCTGTAAATTTCCTCCCATCA |
109 |
43 44 |
rs9894429 | NPLOC4 | >TGCTGTTTCTCTCTTTGTTGC >GGCTGTGCAGTAACCATCAT |
99 |
45 46 |
rs302646 | RAB38 | >AAGTCCACGCCGATTGT >TGGTGATTGGCGACCTG |
100 |
47 48 |
rs 12931267 | FANCA | >TGCTGAAGTTCCCAGTTCTC >TTGTTGACTAATGTGAGGGTCA |
87 |
Данная система полностью совместима с маркерами внешности коммерческой системы для масштабного параллельного секвенирования Forenseq DNA Signature (Ilumina) и Ion Ampliseq DNA Phenotyping Panel (Thermo Fisher).
Осуществление способа
Пример генотипирования биологического образца.
Возможность определения маркеров цвета глаз и волос показана на образцах полногеномной ДНК и деградированной геномной ДНК индивидов с различными цветами глаз и волос путем проведения мультиплексного ПНР-анализа с последующим масштабным параллельным секвенированием полученных ДНК-образцов. ДНК-идентификация по маркерам цвета глаз и волос проводится на образце ДНК в количестве не менее 100 пкг, выделенная из любого биоматериала человека.
Получение ДНК
ДНК может быть получена из любой ткани человека, содержащей клеточные ядра, например, лейкоцитов, волосяных фолликулов, клеток буккального эпителия и др. Пригодная для проведения ПЦР ДНК может быть выделена из образа при помощи любого ранее широко применяемого метода выделения ДНК должен быть в равной степени эффективным. В частности, есть несколько готовых наборов для выделения ДНК из различных тканей человека (например, представленных фирмой Qiagen)
Амплификация участков генома содержащих исследуемые маркеры
Амплификация участков генома содержащих исследуемые маркеры может быть осуществлена с помощью наборов Multiplex PCR kit компании «Qiagen», на приборах GeneAmp PCR System 9700 Thermal Cycler компании «Applied Biosystems».
Состав реакционной смеси для мультиплексной ПЦР:
- исследуемая ДНК
- полимераза (Taq-, HotTaq-, или иная);
- буфера, оптимизированного для работы соответствующей полимеразы, например: 70 mM Tris-HCl (рН 8.8 при 25°С); 17 mM (NH4)2SO4; 0.01% Tween-20. 2 ммоль MgCl2;
- смеси дезоксирибонуклеотидтрифосфатов четырех типов (dATP, dTTP, dGTP, dCTP);
- смеси праймеров в конечной концентрации от 1 нМ до 0,5 мкМ.
Рекомендуемое количество ДНК для мультиплексной ПЦР - 1 нг. Также необходимо проводить параллельно контрольную реакцию (отрицательный контроль), где вместо ДНК добавляется деионизированная вода.
Амплификацию следует проводить в пробирках, стрипах, или планшетах предназначенных для ПЦР. После приготовления, смесь для амплификации помещают в амплификатор и выставляется программа:
№ | Температура | Время | Количество циклов |
1 | 95°С | 15 мин | 1 |
2 | 95°С | 30 сек | |
3 | 57°С | 90 сек | 35 |
4 | 72°С | 90 сек | |
5 | 72°С | 10 мин | 1 |
Наличие продуктов амплификации исследуемой ДНК и отсутствие продуктов амплификации в отрицательном контроле проверяют с помощью электрофореза в агарозном геле. Продукты амплификации очищают от остаточных праймеров с помощью соответствующих мини-колонок (например, Qiagen MinElute system) в соответствии с инструкцией к используемому набору реагентов. Полученные в результате мультиплексной амплификации очищенные ПЦР продукты, содержащие маркеры для определения вероятной внешности неизвестного индивида используются в качестве матрицы для приготовления фрагментных геномных библиотек для секвенирования.
Приготовление фрагментных библиотек
Предварительно необходимо провести измерение концентрации очищенных ПЦР-фрагментов, полученных на предыдущем этапе мультиплексной амплификации на приборах NanoDrop или Qubit (ThermoFisher) в соответствии с инструкцией к прибору. Для приготовления фрагментных библиотек оптимально использовать около 300 нг ДНК очищенных ПЦР-продуктов мультиплексной амплификации. Приготовление фрагментных геномных библиотек проводят с использованием наборов реагентов Illumina®. TruSeq® DNA PCR-Free library prep kit в соответствии с инструкцией к набору. Для секвенирования нескольких образцов фрагментных библиотек одновременно необходимо использовать индексированные адаптеры (например, Dual index adaptors Illumina). Для каждого образца библиотеки используется отдельный индексируемый адаптер, который необходимо записать в таблицу для дальнейшего учета при анализе результатов секвенирования нескольких образцов фрагментных библиотек. Для приготовления фрагментных библиотек рекомендуется/возможно использовать 1/2 от объема всех реагентов, входящих в набор Illumina®. TruSeq® UN A PCR-Free library prep kit, прописанного в инструкции к набору.
Этапы 1-3 являются рекомендованными, но не обязательными.
1. Очистка фрагментных библиотек: необходимо нанести весь объем элюата в одну лунку 2% агарозного геля с красителем SYBR Gold (например, с использованием готового 2%-ного E-gel (Invitrogen)). Провести электрофорез с использованием маркера молекулярных весов 50 bp Ladder в течение 10 минут (в случае использования системы e-gel (Invitrigen)).
2. С использованием стерильного одноразового скальпеля вырезать кусочки геля, с фрагментами библиотеки от 220 п. н. и больше. Светящиеся фрагменты длиной меньше 150 п. н. соответствуют димерам адаптеров и не должны быть использованы для дальнейшего анализа.
3. Провести очистку вырезанных фрагментов ДНК с использованием набора реагентов MinElute gele extraction kit (Qiagen). Эллюировать в 20-22 мкл буфера ЕВ (Qiagen).
Приготовленные описанным выше способом фрагментные библиотеки можно напрямую использовать для секвенирования на технологической платформе Illumina, предварительно проведя оценку качества полученных фрагментных библиотек.
Качественную и количественную оценку фрагментных библиотек можно проводить стандартными методами, рекомендованными фирмой производителем платформ для секвенирования Illumina. Для оптимизации рабочего процесса рекомендуем использовать следующие этапы: Измерить концентрации фрагментных библиотек на приборе Qubit с использованием набора реагентов HS. Для дальнейшего секвенирования рекомендуется использовать фрагментные библиотеки с концентрацией не менее 2 нМ/мкл.
Перед секвенированием необходимо провести мультиплексирование библиотек в эквимолярных количествах (объединение библиотек для нескольких образцов). Не допускается объединение в один пул библиотек с одинаковыми индексами.
Приготовленные фрагментные библиотеки секвенируют методом параллельного широкомасштабного секвенирования на технологической платформе Illumina в парноконцевом режиме с длинной прочтения не менее 75+75 п.о. Рекомендуемый прибор секвенатор MiSeq (Illumina).
Анализ результатов секвенирования
Анализ результатов секвенирования проводят следующим образом:
- Картировать полученные прочтения на референсного генома человека с помощью программы bwamem или аналогичной.
- Определить генотипы по исследуемым маркерам с помощью программ GATK, freebayes или аналогичных.
Литературные источники
1. Liu F. et al. Digital Quantification of Human Eye Color Highlights Genetic Association of Three New Loci // PLoS Genet. / ed. McCarthy M.I. 2010. Vol. 6, №5. P. e1000934.
2. Walsh S. et al. The HirisPlex system for simultaneous prediction of hair and eye colour from DNA// Forensic Sci. Int. Genet. Elsevier Ireland Ltd, 2013. Vol. 7, №1. P. 98-115.
3. Ruiz Y. et al. Further development of forensic eye color predictive tests // Forensic Sci. Int. Genet. 2013. Vol. 7, №1. P. 28-40.
4. Allwood J.S., Harbison S. SNP model development for the prediction of eye colour in New Zealand // Forensic Sci. Int. Genet. 2013. Vol. 7, №4. P. 444-452.
5. Hart K.L. et al. Improved eye- and skin-color prediction based on 8 SNPs // Croat. Med. J. 2013. Vol. 54, №3. P. 248-256.
6. Chaitanya L. et al. The HIrisPlex-S system for eye, hair and skin colour prediction from DNA: Introduction and forensic developmental validation // Forensic Sci. Int. Genet. 2018. Vol. 35. P. 123-135.
7. Freire-Aradas A. et al. Exploring iris colour prediction and ancestry inference in admixed populations of South America // Forensic Sci. Int. Genet. 2014. Vol. 13. P. 3-9.
8. Salvoro C. et al. Performance of four models for eye color prediction in an Italian population sample // Forensic Sci. Int. Genet. 2019. Vol. 40. P. 192-200.
9. Chaitanya L. et al. Bringing colour back after 70 years: Predicting eye and hair colour from skeletal remains of World War II victims using the HirisPlex system // Forensic Sci. Int. Genet. 2017. Vol. 26. P. 48-57.
10. King Т.Е. et al. Identification of the remains of King Richard III // Nat. Commun. 2014. Vol. 5, №1. P. 5631.
11. Gomes C. et al. Phenotyping the ancient world: The physical appearance and ancestry of very degraded samples from a chalcolithic human remains // Forensic Sci. Int. Genet. Suppl. Ser. 2017. Vol. 6. P. e484-e486.
12. Schmidt N. et al. Genome wide SNP typing of ancient DNA: Determination of hair and eye color of Bronze Age humans from their skeletal remains // Am. J. Phys. Anthropol. 2020. Vol. 172, №1. P. 99-109.
13. Bulbul O., Zorlu Т., Filoglu G. Prediction of human eye colour using highly informative phenotype SNPs (PISNPs) // Aust. J. Forensic Sci. 2020. Vol. 52, №1. P. 27-37.
14. Simcoe M. et al. Genome-wide association study in almost 195,000 individuals identifies 50 previously unidentified genetic loci for eye color // Sci. Adv. 2021. Vol. 7, №11. P. eabd1239.
15. Manakhov A.D. et al. Genome analysis of American minks reveals link of mutations in Ras-related protein-38 gene to Moyle brown coat phenotype // Sci. Rep. 2020. Vol. 10, №1. P. 15876.
16. Manakhov A.D. et al. Genome analysis identifies the mutant genes for common industrial Silverblue and Hedlund white coat colours in American mink. // Sci. Rep.2019.
Claims (14)
1. Способ получения молекулярных маркеров для определения вероятной внешности человека методом мультиплексной амплификации для работы с образцами деградированной ДНК, характеризующийся тем, что для генотипирования используют композицию из 24 пар оригинальных синтетических олигонуклеотидных праймеров для проведения мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР), фланкирующих участки ДНК, содержащие однонуклеотидные вариации (SNP), выбранных из группы SEQ ID NO: 1- SEQ ID NO: 48, или 19 пар синтетических оригинальных олигонуклеотидных праймеров, выбранных из группы SEQ ID NO: 1- SEQ ID NO: 38, представленных в Табл. 1; ПЦР-продукты, соответствующие выбранным праймерам, представляют собой маркеры.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что композиция для генотипирования образована 24 парами синтетических оригинальных олигонуклеотидных праймеров, выбранных из группы SEQ ID NO: 1- SEQ ID NO: 48, представленных в Табл. 1.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что композиция для генотипирования может быть представлена в сокращенном виде, путем исключения части праймеров, и образована 19 парами синтетических оригинальных олигонуклеотидных праймеров, выбранных из группы SEQ ID NO: 1- SEQ ID NO: 38.
4. Способ определения вероятной внешности человека, включающий генетическое исследование биологического образца, содержащего ДНК, с использованием мультиплексной полимеразно-цепной реакции (мультиплексной ПЦР) и последующего определения нуклеотидной последовательности продуктов амплификации, содержащих SNP-маркеры определения внешности, полученные способом по п. 1.
5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что олигонуклеотидные праймеры для мультиплексной ПЦР выбраны из композиции по п. 2.
6. Способ по п. 4, отличающийся тем, что размер полученных ПЦР-продуктов составляет не более 150 п.н.
7. Способ по п. 4, отличающийся тем, что полученные в результате мультиплексной амплификации ПЦР-продукты, содержащие маркеры для определения вероятной внешности неизвестного индивида, используются в качестве матрицы для приготовления геномных библиотек.
8. Способ по п. 4, где определение нуклеотидной последовательности продуктов амплификации (ПЦР-продуктов) проводят секвенированием по методу "массового параллельного секвенирования" (NGS).
9. Способ по п. 4, где определение нуклеотидной последовательности продуктов амплификации (ПЦР-продуктов) проводят секвенированием по методу Сэнгера.
10. Способ по п. 4, где определение нуклеотидной последовательности продуктов амплификации (ПЦР-продуктов) проводят методом TaqMan Real-Time PCR.
11. Способ по п. 4, отличающийся тем, что определение нуклеотидной последовательности продуктов амплификации (ПЦР-продуктов) проводят любым доступным методом секвенирования.
12. Способ по п. 4, отличающийся тем, что биологический образец содержит деградированную ДНК или ДНК в малых количествах.
13. Набор для генотипирования (тест-система ДНК) индивида для осуществления способа по п. 4, используемый для детектирования присутствия молекулярных SNP-маркеров, определяющий вероятную внешность, включающий композицию из 24 пар оригинальных синтетических олигонуклеотидных праймеров, выбранных из группы SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 48, или из 19 пар синтетических оригинальных олигонуклеотидных праймеров, выбранных из группы SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 38, представленных в Табл. 1.
14. Применение способа по п. 4 для определения вероятной внешности индивида, происходящего из популяций Российской Федерации.
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2021115050A RU2021115050A (ru) | 2022-11-28 |
RU2786246C2 true RU2786246C2 (ru) | 2022-12-19 |
Family
ID=
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
LIU F. et al., Digital Quantification of Human Eye Color Highlights Genetic Association of Three New Loci, PLoS Genet, ed. McCarthy M.I. 2010. Vol. 6, N 5. P. e1000934. WALSH S. et al., The HirisPlex system for simultaneous prediction of hair and eye colour from DNA, Forensic Sci. Int. Genet. Elsevier Ireland Ltd, 2013, vol. 7, N1. P. 98-115. CHAITANYA L. et al., The HIrisPlex-S system for eye, hair and skin colour prediction from DNA: Introduction and forensic developmental validation, Forensic Sci. Int. Genet., 2018. vol. 35., p. 123-135. БАЛАНОВСКИЙ О.П. и др., Точность предикции пигментации волос и глаз по генетическим маркерам для популяции России, Вестник РГМУ, 5, 2019, с. 25-41. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN105339508B (zh) | Hla基因的多重dna分型方法和试剂盒 | |
EP2735617B1 (en) | Method and kit for dna typing of hla gene | |
JP6798697B2 (ja) | Hla遺伝子のpcrプライマーセット及びそれを用いたシークエンス法 | |
EP4105341B1 (en) | A primer for next generation sequencer and a method for producing the same, a dna library obtained through the use of a primer for next generation sequencer and a method for producing the same, and a dna analyzing method using a dna library | |
EP2971087B1 (en) | Assessing dna quality using real-time pcr and ct values | |
CN109371146B (zh) | 绵羊多胸椎数性状的snp分子标记、引物对、检测试剂盒及其应用 | |
CN110863056A (zh) | 一种人类dna精准分型的方法、试剂和应用 | |
ES2607185T3 (es) | GNLY como marcador epigenético para la identificación de linfocitos citolíticos naturales que expresan CD56 | |
RU2786246C2 (ru) | Способ получения молекулярных маркеров для определения вероятной внешности человека методом мультиплексной амплификации для работы с образцами деградированной ДНК | |
US10704089B1 (en) | DNA methylation assays for body fluid identification | |
RU2471872C1 (ru) | Способ дифференциации штаммов yersinia pestis различных подвидов и биоваров методами полимеразной цепной реакции и мультилокусного сиквенс-типирования | |
Amarger et al. | Molecular analysis of RAPD DNA based markers: their potential use for the detection of genetic variability in jojoba (Simmondsia chinensis L Schneider) | |
CN116064842A (zh) | 一种用于降解检材推断的生物地理祖先DIPs和性别鉴定的复合扩增盒 | |
Zhang et al. | Hypomethylation upregulates the expression of CD30 in lymphoma induced by Marek's disease virus | |
RU2799797C2 (ru) | Способ получения молекулярных STR-маркеров Y-хромосомы человека для идентификации неизвестного индивида и определения биологического родства методом мультиплексной амплификации, набор олигонуклеотидов для осуществления способа | |
RU2818323C2 (ru) | Способ получения полноразмерной последовательности митохондриальной ДНК человека с использованием набора олигонуклеотидов методом мультиплексной амплификации для работы с образцами деградированной ДНК | |
RU2800084C2 (ru) | Способ получения молекулярных STR-маркеров Х-хромосомы для идентификации неизвестного индивида и определения биологического родства для работы с образцами малых количеств ДНК и набор олигонуклеотидов для его осуществления | |
CA2551144C (en) | Polymorphisms of chromosome 9 implicated in premature canities | |
Pliss et al. | The link between mitochondrial DNA hypervariable segment I heteroplasmy and ageing among genetically unrelated Latvians | |
RU2800083C2 (ru) | Способ получения молекулярных однонуклеотидных маркеров для идентификации неизвестного индивида методом мультиплексной амплификации для работы с образцами деградированной ДНК, набор для получения молекулярных маркеров | |
RU2800082C2 (ru) | Способ получения молекулярных однонуклеотидных маркеров для определения вероятного этногеографического происхождения человека, набор олигонуклеотидов для осуществления способа | |
CN105886497A (zh) | 多态性短串联重复基因座等位基因梯、其制备方法、鉴定及应用 | |
RU2800087C2 (ru) | Способ получения молекулярных аутосомных STR-маркеров человека для идентификации неизвестного индивида, набор олигонуклеотидов для его осуществления, способ идентификации неизвестного индивида | |
US20090208958A1 (en) | Methods and kits for detecting single nucleotide polymorphisms of chromosome implicated in premature canities | |
RU2006101561A (ru) | Способы обнаружения болезни альцгеймера |