RU2785136C1 - Способ получения матрикс-связанных везикул из монослойных культур клеток и клеточных сфероидов - Google Patents
Способ получения матрикс-связанных везикул из монослойных культур клеток и клеточных сфероидов Download PDFInfo
- Publication number
- RU2785136C1 RU2785136C1 RU2021133001A RU2021133001A RU2785136C1 RU 2785136 C1 RU2785136 C1 RU 2785136C1 RU 2021133001 A RU2021133001 A RU 2021133001A RU 2021133001 A RU2021133001 A RU 2021133001A RU 2785136 C1 RU2785136 C1 RU 2785136C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- matrix
- spheroids
- solution
- minutes
- extracellular matrix
- Prior art date
Links
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 title claims abstract description 32
- 238000004264 monolayer culture Methods 0.000 title abstract description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 3
- 210000002744 Extracellular Matrix Anatomy 0.000 claims abstract description 51
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 claims abstract description 45
- 108060005980 Collagenase family Proteins 0.000 claims abstract description 28
- 102000020504 Collagenase family Human genes 0.000 claims abstract description 28
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 claims abstract description 28
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 17
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 claims abstract description 17
- 229940110715 ENZYMES FOR TREATMENT OF WOUNDS AND ULCERS Drugs 0.000 claims abstract description 14
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 13
- 108010007093 dispase Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims abstract description 12
- 230000002255 enzymatic Effects 0.000 claims abstract description 12
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims abstract description 9
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 claims description 32
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 8
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 36
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 35
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 26
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 23
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 19
- 241000702489 Maize streak virus Species 0.000 description 18
- 210000004271 bone marrow stromal cells Anatomy 0.000 description 18
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 18
- 239000001963 growth media Substances 0.000 description 14
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 13
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 13
- 230000002797 proteolythic Effects 0.000 description 13
- 229940020899 hematological Enzymes Drugs 0.000 description 12
- KFSLWBXXFJQRDL-UHFFFAOYSA-N peracetic acid Chemical compound CC(=O)OO KFSLWBXXFJQRDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 239000002609 media Substances 0.000 description 11
- 108010052014 Liberase Proteins 0.000 description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 10
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 10
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 8
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 8
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 8
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 8
- 230000002194 synthesizing Effects 0.000 description 8
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 7
- UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propane-1-sulfonate Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 0.000 description 6
- 210000002236 Cellular Spheroid Anatomy 0.000 description 6
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 6
- 210000003954 Umbilical Cord Anatomy 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 5
- 210000001808 Exosomes Anatomy 0.000 description 5
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N HCl Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 229910000041 hydrogen chloride Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 5
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 4
- 210000004379 Membranes Anatomy 0.000 description 4
- 210000003932 Urinary Bladder Anatomy 0.000 description 4
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M buffer Substances [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 4
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 4
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 210000004207 Dermis Anatomy 0.000 description 3
- 229940088598 Enzyme Drugs 0.000 description 3
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 3
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 3
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 3
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 3
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 3
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory Effects 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 229960001322 trypsin Drugs 0.000 description 3
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 3
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 3
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 3
- 102000001974 Hyaluronidase Human genes 0.000 description 2
- 108010074224 Hyaluronoglucosaminidase Proteins 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- 230000036740 Metabolism Effects 0.000 description 2
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Tris Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 2
- 230000001070 adhesive Effects 0.000 description 2
- 239000000560 biocompatible material Substances 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L cacl2 Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 2
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 description 2
- 230000002519 immonomodulatory Effects 0.000 description 2
- NBQNWMBBSKPBAY-UHFFFAOYSA-N iodixanol Chemical compound IC=1C(C(=O)NCC(O)CO)=C(I)C(C(=O)NCC(O)CO)=C(I)C=1N(C(=O)C)CC(O)CN(C(C)=O)C1=C(I)C(C(=O)NCC(O)CO)=C(I)C(C(=O)NCC(O)CO)=C1I NBQNWMBBSKPBAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000035786 metabolism Effects 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000001172 regenerating Effects 0.000 description 2
- 238000003559 rna-seq method Methods 0.000 description 2
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 2
- 210000004876 tela submucosa Anatomy 0.000 description 2
- 238000011099 tissue engineering Methods 0.000 description 2
- 206010001052 Acute respiratory distress syndrome Diseases 0.000 description 1
- 210000000170 Cell Membrane Anatomy 0.000 description 1
- 206010053983 Corona virus infection Diseases 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 210000003617 Erythrocyte Membrane Anatomy 0.000 description 1
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 1
- 210000000936 Intestines Anatomy 0.000 description 1
- 210000003734 Kidney Anatomy 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000002901 Mesenchymal Stem Cells Anatomy 0.000 description 1
- 210000004400 Mucous Membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000002487 Multivesicular Bodies Anatomy 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000002394 Ovarian Follicle Anatomy 0.000 description 1
- 108010067372 Pancreatic Elastase Proteins 0.000 description 1
- 102000016387 Pancreatic Elastase Human genes 0.000 description 1
- 229940067631 Phospholipids Drugs 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 210000003491 Skin Anatomy 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Vitamin C Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 1
- MIJPAVRNWPDMOR-ZAFYKAAXSA-K [(2R)-2-[(1S)-1,2-dihydroxyethyl]-3-oxido-5-oxo-2H-furan-4-yl] phosphate Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(OP([O-])([O-])=O)=C1[O-] MIJPAVRNWPDMOR-ZAFYKAAXSA-K 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K [O-]P([O-])([O-])=O Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 201000000028 adult respiratory distress syndrome Diseases 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000038129 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007172 antigens Proteins 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- ZRBROGSAUIUIJE-UHFFFAOYSA-N azanium;azane;chloride Chemical compound N.[NH4+].[Cl-] ZRBROGSAUIUIJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive Effects 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000005591 charge neutralization Effects 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 200000000015 coronavirus disease 2019 Diseases 0.000 description 1
- 238000010192 crystallographic characterization Methods 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000001085 differential centrifugation Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N edta Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003890 endocrine cells Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 1
- 229920001239 microRNA Polymers 0.000 description 1
- 230000003387 muscular Effects 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 230000001264 neutralization Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organs Anatomy 0.000 description 1
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000015081 regulation of mesenchymal stem cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000000268 renotropic Effects 0.000 description 1
- 230000018448 secretion by cell Effects 0.000 description 1
- 238000000822 sequential centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000009168 stem cell therapy Methods 0.000 description 1
- 238000009580 stem-cell therapy Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000002485 urinary Effects 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии и клеточной биологии, а именно к способу получения матрикс-связанных везикул из клеточных культур. Для осуществления способа сначала осуществляют децеллюляризацию клеточных культур, затем их ферментативную обработку с получением раствора ферментированного внеклеточного матрикса и матрикс-связанных везикул. После чего отделяют матрикс-связанные везикулы от фибрилл ферментированного внеклеточного матрикса посредством центрифугирования. При этом децеллюляризацию проводят 0,5% раствором Triton X-100 в 20 мM нашатырного спирта в течение не менее 5 минут из расчета не менее 1 мл раствора на 1,5-2 млн клеток или 600-800 сфероидов. При этом ферментативную обработку проводят раствором ферментов, содержащим диспазу, коллагеназу I и коллагеназу II, взятых в концентрациях 1,5 МЕ/мл, 2 мг/мл, 1 мг/мл, соответственно, из расчета не менее 1 мл раствора на 1,5-2 млн клеток или 600-800 сфероидов. Изобретение позволяет обеспечить высокий выход матрикс-связанных везикул из монослойных клеточных культур и трехмерных клеточных культур в форме сфероидов при сокращении времени обработки материала. 3 з.п. ф-лы, 1 табл., 10 пр.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу получения матрикс-связанных везикул (МСВ) из монослойных 2D и трехмерных 3D клеточных культур в форме сфероидов и может быть использовано, в частности, для характеризации субпопуляций нановезикул и получения бесклеточных продуктов для регенеративной медицины. Кроме того, за счет иммуномодулирующих свойств МСВ, выражающихся в регуляции воспалительных реакций, изобретение может найти применение при разработке препаратов для лечения пациентов с COVID-19 для терапии и профилактики острого респираторного дистресс-синдрома, вызванного коронавирусной инфекцией.
Уровень техники
Международное общество по внеклеточным везикулам (ISEV) определило внеклеточные везикулы как частицы естественного происхождения, образующиеся в результате секреции клетками, окруженные липидной мембраной и не способные к репликации (Théry C, Witwer KW, Aikawa E t al., Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 2018 Nov 23;7(1):1535750. doi: 10.1080/20013078.2018.1535750). По размерам, составу липидов и белков, способам синтеза и происхождению выделяют многочисленные подгруппы внеклеточных везикул. В последние годы активно изучают их регуляторную роль в регенерации и онтогенезе (Cha H, Hong S, Park JH, Park HH. Stem Cell-Derived Exosomes and Nanovesicles: Promotion of Cell Proliferation, Migration, and Anti-Senescence for Treatment of Wound Damage and Skin Ageing. Pharmaceutics. 2020 Nov 24;12(12):1135. doi: 10.3390/pharmaceutics12121135). Внеклеточные везикулы находят широкое применение в тканевой инженерии, в том числе при формировании биочернил для биопечати и бесклеточных биоактивных конструктов (Balistreri CR, De Falco E, Bordin A, Maslova O, Koliada A, Vaiserman A. Stem cell therapy: old challenges and new solutions. Mol Biol Rep. 2020 Apr;47(4):3117-3131. doi: 10.1007/s11033-020-05353-2). Матрикс-связанные везикулы (МСВ) - новый, недавно открытый тип нановезикул, секретируемых клетками вместе с компонентами внеклеточного матрикса и играющих важную роль в поддержании гомеостаза, регуляции регенерации и воспалительного ответа (Hussey GS, Pineda Molina C, Cramer MC, Tyurina YY, Tyurin VA, Lee YC, El-Mossier SO, Murdock MH, Timashev PS, Kagan VE, Badylak SF. Lipidomics and RNA sequencing reveal a novel subpopulation of nanovesicle within extracellular matrix biomaterials. Sci Adv. 2020 Mar 20;6(12):eaay4361. doi: 10.1126/sciadv.aay4361; Huleihel L, Hussey GS, Naranjo JD, Zhang L, Dziki JL, Turner NJ, Stolz DB, Badylak SF. Matrix-bound nanovesicles within ECM bioscaffolds. Sci Adv. 2016 Jun 10;2(6):e1600502. doi: 10.1126/sciadv.1600502). МСВ устойчивы к действию детергентов и ряда ферментов, отличаются от секретируемых клетками в ростовые среды экзосом липидным составом мембраны и профилем регуляторных микроРНК, выполняют иммуномодулирующую функцию (Патент WO202181231 A1). Активация МСВ связана с повреждением внеклеточного матрикса, на чем и основаны механизмы локальной регуляции регенерации и воспаления с участием МСВ (Huleihel L, Hussey GS, Naranjo JD, Zhang L, Dziki JL, Turner NJ, Stolz DB, Badylak SF. Matrix-bound nanovesicles within ECM bioscaffolds. Sci Adv. 2016 Jun 10;2(6):e1600502. doi: 10.1126/sciadv.1600502). Высокий регенеративный потенциал внеклеточного матрикса может быть обусловлен именно наличием в нем МСВ. Добавление выделенных очищенных и охарактеризованных МСВ в тканеинженерные конструкты повышает их биологическую активность и совместимость с тканями реципиента.
Разработаны и подробно описаны протоколы выделения МСВ из внеклеточного матрикса таких органов как мочевой пузырь, подслизистая оболочка тонкой кишки, дерма кожи, а также из монослойных культур фибробластов мыши линии NIH/3T3 и мультипотентных мезенхимных стромальных клеток (МСК) человека. Но отсутствует единый протокол выделения МСВ из 2D монослойных клеточных культур и из 3D культур в форме клеточных сфероидов.
Для выделения МСВ из внеклеточного матрикса из различных тканей (мочевой пузырь, кишечник, дерма кожи) применяют различные ферменты и их комбинации: пепсин, коллагеназу, эластазу, гиалуронидазу, либеразу, протеиназу К или солевые растворы, иногда совмещая обработку с циклами замораживания/расставания или механической дезагрегацией, обработкой детергентами. Ферментирование внеклеточного матрикса из тканей занимает 12, или 36, или 48 часов при +4°С или +25°С, время и протокол варьируют в зависимости от источника внеклеточного матрикса.
Длительное время занимает подготовка внеклеточного матрикса к ферментированию, особенно, если его получают из тканей. Так, при выделении МСВ из дермы кожи ткань обрабатывают 0.25% раствором трипсина 6 часов, 70% этанолом 10 часов, 3% H2O2 15 минут, 1% Triton X-100 0,26% ЭДТА/0,6% трис 6 часов и дополнительно 2 часа смесью 0.1% перуксусной кислоты и 4% этанола, инкубацию проводят на шейкере с частотой перемешивания 300 раз в мин, осуществляют лиофилизацию и измельчение через сито с размером пор 0.4мм (40 mesh size). При выделении МСВ из подслизистой оболочки тонкой кишки и стенки мочевого пузыря применяют механическую дезагрегацию, децеллюляризацию смесью 0.1% перуксусной кислоты и 4% этанола 2 часа на шейкере с частотой перемешивания 300 раз в мин, лиофилизацию и измельчение через сито с размером пор 0.25 мм (60 mesh size). Для последующего ферментирования внеклеточного матрикса и выделения МСВ берут по 5 мг полученного порошка и обрабатывают 24 часа при 25°С в профильтрованных через шприцевые насадки с диаметром пор 0.22 мкм растворах ферментов: 1) протеиназой К (0.1 мг/мл) в буфере (50 мМ tris HCl pH 8 и 200 мМ NaCl) 2) коллагеназой (0.1 мг/мл) в буфере (50 мМ tris HCl pH 8 5 мМ CaCl2 и 20 0мМ NaCl) 3) пепсином (1 мг/мл) в 0.01 M HCl с последующей нейтрализацией до рН 7.4 с помощью NaOH. В контрольных образцах без ферментирования 5 мг порошка внеклеточного матрикса ресуспендировали в 50 мМ tris HCl (pH 7.4) и 200 мМ NaCl. Дальнейшее выделение МСВ осуществляли последовательным центрифугированием ферментированного внеклеточного матрикса: 10 мин при 500g (3 раза), 20 мин при 2500g (3 раза), 30 мин при 10 000g (3 раза), ультрацентрифугированием 70 мин при +4°С 100 000g с последующим ресуспендированием в 500 мкл фосфатно-солевого буфера и фильтрацией через шприцевую фильтрационную насадку с диаметром пор 0.22 мкм (Huleihel L, Hussey GS, Naranjo JD, Zhang L, Dziki JL, Turner NJ, Stolz DB, Badylak SF. Matrix-bound nanovesicles within ECM bioscaffolds. Sci Adv. 2016 Jun 10;2(6):e1600502. doi: 10.1126/sciadv.1600502).
Известен способ выделения МСВ из мочевого пузыря свиньи, включающий следующие этапы: механическое удаление серозной, подслизистой и мышечных оболочек, децеллюляризацию слизистой оболочки (0.1% перуксусная кислота, 4% этанол 4 часа на шейкере с частотой перемешивания 300 раз в мин), лиофилизацию и измельчение через сито с размером пор 0.25 мм (60 mesh size). В дальнейшем по 100 мг порошка ткани ресуспендировали в 10 мл диссоциирующего раствора, использовали несколько вариантов: 1) коллагеназа (0.1 мг/мл, type XI, Sigma-Aldrich), 2) Либераза (0.01 мг/мл, Liberase TH, Sigma-Aldrich), 3) протеиназа К (0.1 мг/мл, Invitrogen), 4) буфер (50 мМ трис рН 8, 5 мМ CaCl2, 200 mM NaCl), перемешивали на вортексе на максимальной скорости 10 сек и инкубировали ночь при комнатной температуре на шейкере, затем последовательно центрифугировали 500g 10 мин, 2500g 20 мин, 10 000g 30 мин 3 раза, супернатант после стерилизации через шприцевую фильтрационную насадку с диаметром пор 0.22 мкм хранили при -80°С. Впоследствии для выделения МСВ применили 1) ультрацентрифугирование 100 000g 2 часа +4°С, 2) ультрафильтрацию через фильтр 100 KDa Amicon с центрифугированием 20 мин при 4000g, 3) разделение в градиенте плотности с помещением 2 мл 50% OptiPrep на дно чистой пробирки для ультрацентрифуги, сверху наслаиванием 10 мл 2% OptiPrep и образца, ультрацентрифугированием 100 000g 2 часа +4°С и сбором средней фракции, 4) хроматографию с лиофилизацией и ресуспендированием образцов в 1 мл воды без частиц, нанесением на миниколонки 1,5х12см с сефарозой 2В, отбором фракций с высоким содержанием частиц и низким содержанием белка и ультрафильтрацией (Quijano LM, Naranjo JD, El-Mossier SO, Turner NJ, Pineda Molina C, Bartolacci J, Zhang L, White L, Li H, Badylak SF. Matrix-Bound Nanovesicles: The Effects of Isolation Method upon Yield, Purity, and Function. Tissue Eng Part C Methods. 2020 Oct;26(10):528-540. doi: 10.1089/ten.TEC.2020.0243).
Во всех описанных выше протоколах подготовка тканей, внеклеточного матрикса и его ферментирование перед выделением МСВ длительны, многостадийны и связаны с применением многочисленных химических агентов, которые могут оказать влияние на содержимое выделяемых везикул. Так, известно, что перуксусная кислота влияет на метаболизм и жизнеспособность клеток, воздействуя непосредственно на белки (Viola KS, Rodrigues EM, Tanomaru-Filho M, Carlos IZ, Ramos SG, Guerreiro-Tanomaru JM, Faria G. Cytotoxicity of peracetic acid: evaluation of effects on metabolism, structure and cell death. Int Endod J. 2018 May;51 Suppl 4:e264-e277. doi: 10.1111/iej.12750), т.е. может повлиять и на структурно-функциональный состав выделяемых МСВ. Также перуксусная кислота не всегда эффективно удаляет клетки из ткани, что было показано при децеллюляризации почек (Poornejad N, Schaumann LB, Buckmiller EM, Momtahan N, Gassman JR, Ma HH, Roeder BL, Reynolds PR, Cook AD. The impact of decellularization agents on renal tissue extracellular matrix. J Biomater Appl. 2016 Oct;31(4):521-533. doi: 10.1177/0885328216656099). Либераза при выделении клеток из биоптатов хорошо сохраняет поверхностные белки и обеспечивает высокие выходы жизнеспособных клеток (Lv D, Ma QH, Duan JJ, Wu HB, Zhao XL, Yu SC, Bian XW. Optimized dissociation protocol for isolating human glioma stem cells from tumorspheres via fluorescence-activated cell sorting. Cancer Lett. 2016 Jul 10;377(1):105-15. doi: 10.1016/j.canlet.2016.04.022). Однако при выделении овариальных фолликулов либераза малоэффективна (Schmidt VM, Isachenko V, Rappl G, Rahimi G, Hanstein B, Morgenstern B, Mallmann P, Isachenko E. Comparison of the enzymatic efficiency of Liberase TM and tumor dissociation enzyme: effect on the viability of cells digested from fresh and cryopreserved human ovarian cortex. Reprod Biol Endocrinol. 2018 Jun 2;16(1):57. doi: 10.1186/s12958-018-0374-6), при выделении эндокринных клеток поджелудочной железы либераза дает меньший выход функциональных клеток, чем коллагеназа NB1 (Brandhorst H, Friberg A, Nilsson B, Andersson HH, Felldin M, Foss A, Salmela K, Tibell A, Tufveson G, Korsgren O, Brandhorst D. Large-scale comparison of Liberase HI and collagenase NB1 utilized for human islet isolation. Cell Transplant. 2010;19(1):3-8. doi: 10.3727/096368909X477507).
Известен способ получения МСВ с использованием цвиттерионного детергента CHAPS и ДНКазы 1 типа для децеллюляризации клеточных пластов из МСК и с последующим выделением МСВ или коллагеназой I-типа, или смесью коллагеназы I-типа и гиалуронидазы, или трипсина (Патент RU2739912 C14 Селина Д.В, Efimenko A. Y. Матрикс-связанные везикулы, выделенные из внеклеточного матрикса, в регуляции дифференцировки мезенхимных стволовых клеток in vitro. Тезисы конференции «Ломоносов 2021»). Известно, что применение CHAPS не влияет на морфологию и белковый состав экзосом (Musante L, Saraswat M, Duriez E, Byrne B, Ravidà A, Domon B, Holthofer H. Biochemical and physical characterisation of urinary nanovesicles following CHAPS treatment. PLoS One. 2012;7(7):e37279. doi: 10.1371/journal.pone.0037279; Wubbolts R, Leckie RS, Veenhuizen PT, Schwarzmann G, Möbius W, Hoernschemeyer J, Slot JW, Geuze HJ, Stoorvogel W. Proteomic and biochemical analyses of human B cell-derived exosomes. Potential implications for their function and multivesicular body formation. J Biol Chem. 2003 Mar 28;278(13):10963-72. doi: 10.1074/jbc.M207550200.), однако может стабилизировать некоторые белки (Sah H, Kim KS. Improvement of interfacial protein stability by CHAPS. Biotechnol Lett. 2006 Apr;28(8):567-70. doi: 10.1007/s10529-006-0016-5). Также CHAPS не проникают через липидные мембраны, хотя в высоких концентрациях могут влиять на фосфолипиды (Rodi PM, Bocco Gianello MD, Corregido MC, Gennaro AM. Comparative study of the interaction of CHAPS and Triton X-100 with the erythrocyte membrane. Biochim Biophys Acta. 2014 Mar;1838(3):859-66. doi: 10.1016/j.bbamem.2013.11.006). Ферментативная обработка трипсином может удалять важные сигнальные пептиды с поверхности клеточных мембран и секретируемых ими везикул (Zhang, B., Shan, H., Li, D., Li, Z. R., Zhu, K. S., Jiang, Z. B., & Huang, M. S. (2012). Different methods of detaching adherent cells significantly affect the detection of TRAIL receptors. Tumori Journal, 98(6), 800-803; Tsuji, K., Ojima, M., Otabe, K., Horie, M., Koga, H., Sekiya, I., & Muneta, T. (2017). Effects of different cell-detaching methods on the viability and cell surface antigen expression of synovial mesenchymal stem cells. Cell transplantation, 26(6), 1089-1102.). Кроме того, применение центрифугирования при 10 000g может существенно снижать выход нановезикул (Livshits, M. A., Khomyakova, E., Evtushenko, E. G., Lazarev, V. N., Kulemin, N. A., Semina, S. E., Generozov, E. V., & Govorun, V. M. (2015). Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol. Scientific reports, 5, 17319. https://doi.org/10.1038/srep17319).
Недостатками описанных примеров выделения МСВ являются долгая обработка материала и применение последовательно различных химических агентов и ферментов с промежуточными этапами трудоемкой пробоподготовки.
При выделении МСВ из монослойных культур клеток протоколы подготовки внеклеточного матрикса быстрее, чем при выделениях из тканей. Так, культуры МСК человека и линии эмбриональных фибробластов мыши NIH/3Т3 после 14 дней культивирования на культуральных флаконах площадью 75см2 с посевной плотностью 3500 клеток/см2 при смене ростовой среды раз в 3 суток и добавлении на последние 7 суток в среду 50 мкМ фосфата аскорбиновой кислоты (ascorbic acid 2-phosphate Sigma -Aldrich) децеллюляризовали 5 мин в 0.5% Triton Х-100 в 20 мМ хлориде аммония - нашатырном спирте с последующими 3 отмывками очищенной деионизованной водой. Ферментирование полученного внеклеточного матрикса осуществляли 1 час при 37°С в растворе 100 нг/мл либеразы (Liberase DL Roche) в буфере (50 мМ tris HCl pH 7.5 5 мМ CaCl2 и 200 мМ NaCl). Для выделения МСВ применяли последовательное центрифугирование: 500g 10 мин, 2500g 20 мин, 10 000g 30 мин и ультрацентрифугирование 100 000g 70 мин при +4°С. Перед ультрацентрифугированием раствор пропускали через шприцевые фильтрационные насадки с размером пор 0.22 мкм, после ультрацентрифугирования ресуспендировали осадки МСВ в фосфатно-солевом буфере (Hussey GS, Pineda Molina C, Cramer MC, Tyurina YY, Tyurin VA, Lee YC, El-Mossier SO, Murdock MH, Timashev PS, Kagan VE, Badylak SF. Lipidomics and RNA sequencing reveal a novel subpopulation of nanovesicle within extracellular matrix biomaterials. Sci Adv. 2020 Mar 20;6(12):eaay4361. doi: 10.1126/sciadv.aay4361). Недостатком описанного способа является применение единственного фермента при достаточно длительном времени обработки материала.
Наиболее близким к предлагаемому изобретению (прототипом) является способ получения матрикс-связанных везикул (международная заявка WO2017151862A1). Способ заключается в ферментативной обработке высушенного и измельченного в порошок внеклеточного матрикса коллагеназой (0.1 мг/мл), протеиназой К (0.1 мг/мл) или пепсином (1.0 мг/мл) в течение 12, 24, 36 или 48 часов при температуре +4°С - +25°С, с/без замораживанием и оттаиванием, с/без обработкой детергентами. Для отделения МСВ от фибрилл ферментированного внеклеточного матрикса проводят центрифугирование при 300-1000g в течение 10-15 мин, затем при 2000-3000g в течение 20-30 мин, затем при 10 000-15 000g в течение 25-40 мин, описанные этапы проводят однократно или 2-5 раз каждый. Из полученного супернатанта выделяют МСВ ультрацентрифугированием при 100 000-150 000g в течение 60-90 мин и осадок ресуспендируют в фосфатно-солевом буфере или в стерильной воде. Также высушенный и измельченный в порошок внеклеточный матрикс после децеллюляризации без ферментирования обрабатывают в солевом растворе, например, 0.1-3 М KCl в течение 10-120 мин при +4°С - +50°С, затем последовательно центрифугируют при 2000-5000g в течение 20-40 мин, и ультрацентрифугируют при 100 000-150 000g в течение 30-180 мин. Для удаления крупных частиц диаметром более 500-10000 нм может быть применена микрофильтрация с последующей ультрафильтрацией.
Недостатками описанного способа являются трудоемкая длительная обработка и отсутствие протокола получения внеклеточного матрикса от трехмерных клеточных культур - сфероидов.
Технической проблемой, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является разработка простого и эффективного способа получения МСВ из монослойных культур и клеточных сфероидов, обеспечивающего сокращение времени обработки.
Раскрытие сущности изобретения
Техническим результатом изобретения является обеспечение высокого выхода (2,9x109 - 3,8x109 везикул с 1 млн клеток) матрикс-связанных везикул из монослойных клеточных культур и трехмерных клеточных культур в форме сфероидов при сокращении времени обработки материала до 3 часов. Предлагаемый способ обеспечивает короткое время обработки материала с высоким выходом матрикс-связанных везикул как из двумерных монослойных культур, так и из трехмерных клеточных культур в форме сфероидов.
Технический результат достигается за счет реализации способа получения матрикс-связанных везикул из культур клеток, включающего децеллюляризацию клеточных культур, их ферментативную обработку с получением ферментированного внеклеточного матрикса, отделение матрикс-связанных везикул от фибрилл ферментированного внеклеточного матрикса посредством центрифугирования. При этом децеллюляризацию проводят 0,5% раствором Triton X-100 в 20 мМ нашатырного спирта в течение не менее 5 минут из расчета не менее 1 мл раствора на 1,5-2 млн клеток или 600-800 сфероидов, а ферментативную обработку проводят раствором ферментов, содержащим диспазу, коллагеназу I и коллагеназу II, взятых в концентрациях 1,5 МЕ/мл, 2 мг/мл, 1 мг/мл, соответственно, из расчета не менее 1 мл раствора на 1,5-2 млн клеток или 600-800 сфероидов.
При этом ферментативную обработку проводят, предпочтительно, при инкубации раствора при 37°С в течение не менее 40 мин на мини-рокер-шейкере с частотой перемешивания содержимого пробирок 15-20 раз/мин, а отделение матрикс-связанных везикул проводят при последовательном центрифугировании при 500g в течение 10 минут, при 2500g в течение 20 минут с последующим ультрацентрифугированием. Ультрацентрифугирование проводят, предпочтительно, при 100000g в течение 70 минут при 4°C.
Использование заявляемого изобретения сокращает суммарное время обработки материала, включающее децеллюляризацию клеточных культур, ферментирование внеклеточного матрикса и отделение МСВ от фибрилл внеклеточного матрикса до 3 часов, тогда как в прототипе этап ферментативной обработки внеклеточного матрикса составляет не менее 12 часов (течение 12, 24, 36 или 48 часов), и последующий этап отделения МСВ от фибрилл матрикса занимает 4-10 часов.
Осуществление изобретения
Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.
Клетки культивируют на чашках Петри в течение 14 дней для достаточного синтеза внеклеточного матрикса. Клеточные сфероиды формируют путем культивирования клеток в неадгезивных условиях в течение 3-7 суток в микролунках агарозных планшетов, полученных, например, с помощью 3D Petri Dish (Microtissue, США). Непосредственно перед выделением матрикс-связанных везикул (МСВ) сфероиды собирают в центрифужные пробирки путем промывания планшетов со сфероидами средой при помощи механической пипетки. Контроль снятия сфероидов с планшета осуществляется при помощи микроскопа, при необходимости процедура промывки планшета средой повторяется. В случае работы с монослойными культурами клеток из адгезивных культуральных емкостей с клетками, например, чашек Петри, сливают ростовую среду, трижды промывают фосфатно-солевым буфером. Аналогично промывают собранные в центрифужную пробирку клеточные сфероиды, для этого после пассивного осаждения сфероидов на дно пробирки ростовую среду отбирают и добавляют фосфатно-солевой буфер. Пробирку аккуратно встряхивают несколько раз, процедуру промывки сфероидов повторяют трижды.
Затем клеточные монослои и сфероиды обрабатывают децеллюляризирующим раствором 0.5% Triton X-100 в 20 мМ гидроксида аммония в течение 5 минут из расчета не менее 1 мл на 1,5-2 млн клеток или 600-800 сфероидов. Монослойные культуры клеток после децеллюляризации трижды промывают деионизированной водой, клеточные сфероиды также трижды отмывают деионизированной водой, пассивно осаждая их между отмывками.
Затем осуществляют протеолиз внеклеточного матрикса путем добавления раствора следующих ферментов: диспаза (1,5 МЕ/мл), коллагеназа I (2 мг/мл) и коллагеназа II (1 мг/мл) из расчета не менее 1 мл на 1,5-2 млн клеток или 600-800 сфероидов и инкубируют при 37°С в течение 40 мин на мини-рокер-шейкере с частотой перемешивания содержимого пробирок 15-20 раз/мин для более эффективного расщепления матрикса.
Полученный после протеолиза внеклеточного матрикса раствор помещают в центрифужные пробирки и центрифугируют при 500g в течение 10 минут. Затем супернатант переносят в чистые пробирки и центрифугируют при 2500g в течение 20 минут. Шприцем собирают супернатант из центрифужных пробирок и переносят в пробирки для ультрацентрифуги, пропуская через фильтрационную шприцевую насадку с диаметром пор не менее 0,22 мкм.
Пробирки для ультрацентрифуги попарно уравновешивают с точностью до 0,01 г, при необходимости допускается разведение проб стерильной деионизированной водой. Ультрацентрифугирование проводят при 100000g в течение 70 минут при 4°C. По окончании ультрацентрифугирования супернатант осторожно отбирают, ресуспендируют осадок в стерильном фосфатно-солевом буфере или стерильной деионизованной воде, переносят в чистые эппендорфы или криовиалы и используют или хранят при -80°С.
Ниже представлены примеры выделения МСВ из монослойных культур и сфероидов из мультипотентных мезенхимных стромальных клеток (МСК) и клеток линий эмбриональных фибробластов мыши NIH 3Т3 при ферментативной обработке различными диссоциирующими агентами, при этом суммарное время обработки материалов не превышало 3 часов.
Пример 1
МСК пупочного канатика человека культивировали на чашке Петри в течение 14 дней до достижения монослоя и количества 1,5 млн клеток для достаточного синтеза внеклеточного матрикса. Из чашки сливали культуральную среду и трижды промывали ее фосфатно-солевым буфером. Затем чашку обрабатывали 1 мл децеллюляризирующего 0,5% раствора Triton X-100 (Panreac, 142314.1611) в 20 мМ нашатырного спирта (Сигма Тек, Ч.Д.А. ГОСТ 3760-79 ОКП 26 1141 0012 10) в течение 5 минут и снова трижды промывали деионизированной водой. Протеолиз внеклеточного матрикса осуществляли путем добавления 1 мл раствора диспазы (1,5 МЕ/мл, Gibco™, 17105041). Чашку инкубировали в термостате при 37°С в течение 40 мин, затем переносили ее содержимое в центрифужную пробирку и центрифугировали при 500g в течение 10 минут. Затем супернатант переносили в чистую пробирку и центрифугировали при 2500g в течение 20 минут. Стерильным шприцем супернатант собирали из центрифужной пробирки и переносили в пробирки для ультрацентрифуги, пропуская через фильтрационную шприцевую насадку с диаметром пор 0,22 мкм. Ультрацентрифугирование проводили при 100 000g в течение 70 минут при 4°C. По окончании ультрацентрифугирования супернатант осторожно отбирали, затем ресуспендировали осадок в стерильном фосфатно-солевом буфере, переносили в чистые эппендорфы и хранили при -80°С.
Пример 2
МСК пупочного канатика человека культивировали на чашке Петри в течение 14 дней до достижения монослоя и количества 1,5 млн клеток для достаточного синтеза внеклеточного матрикса. Из чашки сливали культуральную среду и трижды промывали ее фосфатно-солевым буфером. Затем чашку обрабатывали 1 мл децеллюляризирующего 0,5% раствора Triton X-100 (Panreac, 142314.1611) в 20 мМ нашатырного спирта (Сигма Тек, Ч.Д.А. ГОСТ 3760-79 ОКП 26 1141 0012 10) в течение 5 минут и снова трижды промывали деионизированной водой. Протеолиз внеклеточного матрикса осуществляли путем добавления 1 мл раствора коллагеназы I (2 мг/мл, Gibco™, 17100017). Чашку инкубировали в термостате при 37°С в течение 40 мин, затем переносили ее содержимое в центрифужную пробирку и центрифугировали при 500g в течение 10 минут. Затем супернатант переносили в чистую пробирку и центрифугировали при 2500g в течение 20 минут. Стерильным шприцем супернатант собирали из центрифужной пробирки и переносили в пробирки для ультрацентрифуги, пропуская через фильтрационную шприцевую насадку с диаметром пор 0,22 мкм. Ультрацентрифугирование проводили при 100 000g в течение 70 минут при 4°C. По окончании ультрацентрифугирования супернатант осторожно отбирали, затем ресуспендировали осадок в стерильной деионизованной воде и переносили в чистые эппендорфы.
Пример 3
МСК пупочного канатика человека культивировали на чашке Петри в течение 14 дней до достижения монослоя и количества 2 млн клеток для достаточного синтеза внеклеточного матрикса. Из чашки сливали культуральную среду и трижды промывали ее фосфатно-солевым буфером. Затем чашку обрабатывали 1 мл децеллюляризирующего 0,5% раствора Triton X-100 (Panreac, 142314.1611) в 20 мМ нашатырного спирта (Сигма Тек, Ч.Д.А. ГОСТ 3760-79 ОКП 26 1141 0012 10) в течение 5 минут и снова трижды промывали деионизированной водой. Протеолиз внеклеточного матрикса осуществляли путем добавления 1 мл раствора коллагеназы II (1 мг/мл, Gibco™, 17101015). Чашку инкубировали в термостате при 37°С в течение 40 мин, затем переносили ее содержимое в центрифужную пробирку и центрифугировали при 500g в течение 10 минут. Затем супернатант переносили в чистую пробирку и центрифугировали при 2500g в течение 20 минут. Стерильным шприцем супернатант собирали из центрифужной пробирки и переносили в пробирки для ультрацентрифуги, пропуская через фильтрационную шприцевую насадку с диаметром пор 0,22 мкм. Ультрацентрифугирование проводили при 100 000g в течение 70 минут при 4°C. По окончании ультрацентрифугирования супернатант осторожно отбирали, затем ресуспендировали осадок в стерильном фосфатно-солевом буфере, переносили в чистые эппендорфы и хранили при -80°С.
Пример 4
МСК пупочного канатика человека культивировали на чашке Петри в течение 14 дней до достижения монослоя и количества 2 млн клеток для достаточного синтеза внеклеточного матрикса. Из чашки сливали культуральную среду и трижды промывали ее фосфатно-солевым буфером. Затем чашку обрабатывали 1 мл децеллюляризирующего 0,5% раствора Triton X-100 (Panreac, 142314.1611) в 20 мМ нашатырного спирта (Сигма Тек, Ч.Д.А. ГОСТ 3760-79 ОКП 26 1141 0012 10) в течение 5 минут и снова трижды промывали деионизированной водой. Протеолиз внеклеточного матрикса осуществляли путем добавления 1 мл раствора следующих ферментов: диспаза (1,5 МЕ/мл, Gibco™, 17105041), коллагеназа I (2 мг/мл, Gibco™, 17100017) и коллагеназа II (1 мг/мл, Gibco™, 17101015). Чашку инкубировали в термостате при 37°С в течение 40 мин, затем переносили ее содержимое в центрифужную пробирку и центрифугировали при 500g в течение 10 минут. Затем супернатант переносили в чистую пробирку и центрифугировали при 2500g в течение 20 минут. Стерильным шприцем супернатант собирали из центрифужной пробирки и переносили в пробирки для ультрацентрифуги, пропуская через фильтрационную шприцевую насадку с диаметром пор 0,22 мкм. Ультрацентрифугирование проводили при 100 000g в течение 70 минут при 4°C. По окончании ультрацентрифугирования супернатант осторожно отбирали, затем ресуспендировали осадок в стерильной деионизованной воде и переносили в чистые эппендорфы, хранили при -80°С.
Пример 5
Клеточные сфероиды из МСК пупочного канатика человека (600 сфероидов, 1500 клеток в сфероиде), культивировавшиеся в течение 7 суток на агарозных планшетах, полученных с помощью 3D Petri Dish (Microtissue, США), собирали в центрифужную пробирку объемом 15 мл путем многократного промывания планшетов средой при помощи механической пипетки. Контроль снятия сфероидов с планшета осуществлялся при помощи микроскопа. Собранные в центрифужную пробирку клеточные сфероиды трижды промывали фосфатно-солевым буфером от остатков культуральной среды. Для этого после пассивного осаждения сфероидов на дно пробирки среду отбирали и добавляли фосфатно-солевой буфер, пробирку аккуратно встряхивали несколько раз, и затем дважды повторяли процедуру осаждения и промывки. После промывки сфероиды обрабатывали 1 мл децеллюляризирующего 0,5% раствора Triton X-100 (Panreac, 142314.1611) в 20 мМ нашатырного спирта (Сигма Тек, Ч.Д.А. ГОСТ 3760-79 ОКП 26 1141 0012 10) в течение 5 минут, описанную выше процедуру осаждения и промывки сфероидов деионизированной водой проводили три раза. Протеолиз внеклеточного матрикса осуществляли путем добавления 1 мл раствора диспазы (1,5 МЕ/мл, Gibco™, 17105041). Инкубировали в термостате при 37°С в течение 40 мин на мини-рокер-шейкере (MR-1, BioSan) с частотой перемешивания содержимого пробирки 15-20 раз/мин. Пробирку с расщепленным внеклеточным матриксом центрифугировали при 500g в течение 10 минут. Затем супернатант переносили в чистые пробирки и центрифугировали при 2500g в течение 20 минут. Стерильным шприцем супернатант собирали из центрифужной пробирки и переносили в пробирки для ультрацентрифуги, пропуская через фильтрационную шприцевую насадку с диаметром пор 0,22 мкм. Ультрацентрифугирование проводили при 100 000g в течение 70 минут при 4°C. По окончании ультрацентрифугирования супернатант осторожно отбирали, ресуспендировали осадок в стерильном фосфатно-солевом буфере, переносили в чистые эппендорфы и хранили при -80°С.
Пример 6
Клеточные сфероиды из МСК пупочного канатика человека (800 сфероидов, 2000 клеток в сфероиде), культивировавшиеся в течение 7 суток на агарозных планшетах, полученных с помощью 3D Petri Dish (Microtissue, США), собирали в центрифужную пробирку объемом 15 мл путем многократного промывания планшетов средой при помощи механической пипетки. Контроль снятия сфероидов с планшета осуществляли при помощи микроскопа. Собранные в центрифужную пробирку клеточные сфероиды трижды промывали фосфатно-солевым буфером от остатков культуральной среды. Для этого после пассивного осаждения сфероидов на дно пробирки среду отбирали и добавляли фосфатно-солевой буфер, пробирку аккуратно встряхивали несколько раз, и затем дважды повторяли процедуру осаждения и промывки. После промывки сфероиды обрабатывались 1 мл децеллюляризирующего 0,5% раствора Triton X-100 (Panreac, 142314.1611) в 20 mM нашатырного спирта (Сигма Тек, Ч.Д.А. ГОСТ 3760-79 ОКП 26 1141 0012 10) в течение 5 минут, после чего трижды повторяли описанную выше процедуру осаждения и промывки сфероидов деионизированной водой. Протеолиз внеклеточного матрикса осуществляли путем добавления 1 мл раствора следующих ферментов: диспаза (1,5МЕ/мл, Gibco™, 17105041), коллагеназа I (2 мг/мл, Gibco™, 17100017) и коллагеназа II (1 мг/мл, Gibco™, 17101015). Инкубировали в термостате при 37°С в течение 40 мин на мини-рокер-шейкере с частотой перемешивания содержимого пробирки 15-20 раз/мин. Пробирки с расщепленным матриксом центрифугировали при 500g в течение 10 минут. Затем супернатант переносили в чистые пробирки и центрифугировали при 2500g в течение 20 минут. Стерильным шприцем супернатант собирали из центрифужной пробирки и переносили в пробирки для ультрацентрифуги, пропуская через фильтрационную шприцевую насадку с диаметром пор 0,22 мкм. Ультрацентрифугирование проводили при 100 000g в течение 70 минут при 4°C. По окончании ультрацентрифугирования супернатант осторожно отбирали, затем ресуспендировали осадок в стерильном фосфатно-солевом буфере, переносили в чистые эппендорфы и хранили при -80°С.
Пример 7
Клетки линии эмбриональных фибробластов мыши NIH/3Т3 культивировали на чашке Петри в течение 14 дней до достижения монослоя и количества 2 млн клеток для достаточного синтеза внеклеточного матрикса. Из чашки сливали культуральную среду и трижды промывали ее фосфатно-солевым буфером. Затем чашку обрабатывали 1 мл децеллюляризирующего 0,5% раствора Triton X-100 (Panreac, 142314.1611) в 20 мМ нашатырного спирта (Сигма Тек, Ч.Д.А. ГОСТ 3760-79 ОКП 26 1141 0012 10) в течение 5 минут и снова трижды промывали деионизированной водой. Протеолиз внеклеточного матрикса осуществляли путем добавления 1 мл раствора диспазы (1,5 МЕ/мл, Gibco™, 17105041). Чашку инкубировали в термостате при 37°С в течение 40 мин, затем переносили ее содержимое в центрифужную пробирку и центрифугировали при 500g в течение 10 минут. Затем супернатант переносили в чистую пробирку и центрифугировали при 2500g в течение 20 минут. Стерильным шприцем супернатант собирали из центрифужной пробирки и переносили в пробирки для ультрацентрифуги, пропуская через фильтрационную шприцевую насадку с диаметром пор 0,22 мкм. Ультрацентрифугирование проводили при 100 000g в течение 70 минут при 4°C. По окончании ультрацентрифугирования супернатант осторожно отбирали, затем ресуспендировали осадок в стерильной деионизованной воде, переносили в чистые эппендорфы.
Пример 8
Клетки линии эмбриональных фибробластов мыши NIH/3Т3 культивировали на чашке Петри в течение 14 дней до достижения монослоя и количества 1,5 млн для достаточного синтеза внеклеточного матрикса. Из чашки сливали культуральную среду и трижды промывали ее фосфатно-солевым буфером. Затем чашку обрабатывали 1 мл децеллюляризирующего 0,5% раствора Triton X-100 (Panreac, 142314.1611) в 20 мМ нашатырного спирта (Сигма Тек, Ч.Д.А. ГОСТ 3760-79 ОКП 26 1141 0012 10) в течение 5 минут и снова трижды промывали деионизированной водой. Протеолиз внеклеточного матрикса осуществляли путем добавления 1 мл раствора следующих ферментов: диспаза (1,5 МЕ/мл, Gibco™, 17105041), коллагеназа I (2 мг/мл, Gibco™, 17100017) и коллагеназа II (1 мг/мл, Gibco™, 17101015). Чашку инкубировали в термостате при 37°С в течение 40 мин, затем переносили ее содержимое в центрифужную пробирку и центрифугировали при 500g в течение 10 минут. Затем супернатант переносили в чистую пробирку и центрифугировали при 2500g в течение 20 минут. Стерильным шприцем супернатант собирали из центрифужной пробирки и переносили в пробирки для ультрацентрифуги, пропуская через фильтрационную шприцевую насадку с диаметром пор 0,22 мкм. Ультрацентрифугирование проводили при 100 000g в течение 70 минут при 4°C. По окончании ультрацентрифугирования супернатант осторожно отбирали, затем ресуспендировали осадок в стерильном фосфатно-солевом буфере, переносили в чистые эппендорфы и хранили при -80°С.
Пример 9
Клеточные сфероиды из линии эмбриональных фибробластов мыши NIH/3Т3 (600 сфероидов, 2000 клеток в сфероиде), культивировавшиеся в течение 7 суток на агарозных планшетах, полученных с помощью 3D Petri Dish (Microtissue, США), собирали в центрифужную пробирку объемом 15 мл путем многократного промывания планшетов средой при помощи механической пипетки. Контроль снятия сфероидов с планшета осуществляли при помощи микроскопа. Собранные в центрифужную пробирку клеточные сфероиды трижды промывали фосфатно-солевым буфером от остатков культуральной среды. Для этого после пассивного осаждения сфероидов на дно пробирки среду отбирали и добавляли фосфатно-солевой буфер, пробирку аккуратно встряхивали несколько раз, и затем дважды повторяли процедуру осаждения и промывки. После промывки сфероиды обрабатывались 1 мл децеллюляризирующего 0,5% раствора Triton X-100 (Panreac, 142314.1611) в 20 mM нашатырного спирта (Сигма Тек, Ч.Д.А. ГОСТ 3760-79 ОКП 26 1141 0012 10) в течение 5 минут, после чего трижды повторяли описанную выше процедуру осаждения и промывки сфероидов деионизированной водой. Протеолиз внеклеточного матрикса осуществляли путем добавления 1 мл раствора диспазы (1,5 МЕ/мл, Gibco™, 17105041). Инкубировали в термостате при 37°С в течение 40 мин на мини-рокер-шейкере с частотой перемешивания содержимого пробирки 15-20 раз/мин. Пробирки с расщепленным матриксом центрифугировали при 500g в течение 10 минут. Затем супернатант переносили в чистые пробирки и центрифугировали при 2500g в течение 20 минут. Стерильным шприцем супернатант собирали из центрифужной пробирки и переносили в пробирки для ультрацентрифуги, пропуская через фильтрационную шприцевую насадку с диаметром пор 0,22 мкм. Ультрацентрифугирование проводили при 100 000g в течение 70 минут при 4°C. По окончании ультрацентрифугирования супернатант осторожно отбирали, затем ресуспендировали осадок в стерильной дионизованной воде и переносили в чистые эппендорфы.
Пример 10
Клеточные сфероиды из линии эмбриональных фибробластов мыши NIH/3Т3 (800 сфероидов, 2000 клеток в сфероиде), культивировавшиеся в течение 7 суток на агарозных планшетах, полученных с помощью 3D Petri Dish (Microtissue, США), собирали в центрифужную пробирку объемом 15 мл путем многократного промывания планшетов средой при помощи механической пипетки. Контроль снятия сфероидов с планшета осуществлялся при помощи микроскопа. Собранные в центрифужную пробирку клеточные сфероиды трижды промывали фосфатно-солевым буфером от остатков культуральной среды. Для этого после пассивного осаждения сфероидов на дно пробирки среду отбирали и добавляли фосфатно-солевой буфер, пробирку аккуратно встряхивали несколько раз, и затем дважды повторяли процедуру осаждения и промывки. После промывки сфероиды обрабатывали 1 мл децеллюляризирующего 0.5% раствора Triton X-100 (Panreac, 142314.1611) в 20 мМ нашатырного спирта (Сигма Тек, Ч.Д.А. ГОСТ 3760-79 ОКП 26 1141 0012 10) в течение 5 минут, после чего трижды повторяли описанную выше процедуру осаждения и промывки сфероидов деионизированной водой. Протеолиз внеклеточного матрикса осуществляли путем добавления 1 мл раствора следующих ферментов: диспаза (1,5 МЕ/мл, Gibco™, 17105041), коллагеназа I (2 мг/мл, Gibco™, 17100017) и коллагеназа II (1 мг/мл, Gibco™, 17101015). Инкубировали в термостате при 37°С в течение 40 мин на мини-рокер-шейкере с частотой перемешивания содержимого пробирки 15-20 раз/мин. Пробирки с расщепленным матриксом центрифугировали при 500g в течение 10 минут. Затем супернатант переносили в чистые пробирки и центрифугировали при 2500g в течение 20 минут. Стерильным шприцем супернатант собирали из центрифужной пробирки и переносили в пробирки для ультрацентрифуги, пропуская через фильтрационную шприцевую насадку с диаметром пор 0,22 мкм. Ультрацентрифугирование проводили при 100 000g в течение 70 минут при 4°C. По окончании ультрацентрифугирования супернатант осторожно отбирали, затем ресуспендировали осадок в стерильном фосфатно-солевом буфере, переносили в чистые эппендорфы и хранили при -80°С.
Проводили оценку выхода матрикс-связанных везикул, выделенных в соответствии с примерами 1-10.
Выход матрикс-связанных везикул оценивали путем анализа траекторий наночастиц на приборе NanoSight NS300 (Malvern, Великобритания). В таблице 1 приведены данные о концентрации матрикс-связанных везикул в образцах при использовании разных ферментов и их комбинаций на этапе протеолиза внеклеточного матрикса (примеры 1-10).
Таблица 1. Выход матрикс-связанных везикул | |||
Пример | Культура | Условия культивирования | Концентрация частиц, выделенных с 1млн клеток |
1 | МСК | 2D | 2,1x109 ±1,0 |
2 | МСК | 2D | 0,9x109 ±0,2 |
3 | МСК | 2D | 1,8x109 ±0,7 |
4 | МСК | 2D | 3,8x109 ±0,6 |
5 | МСК | 3D | 0,7x109 ±0,2 |
6 | МСК | 3D | 3,5x109 ±0,2 |
7 | 3Т3 | 2D | 1,3x109 ±0,3 |
8 | 3Т3 | 2D | 2,9x109 ±0,3 |
9 | 3Т3 | 3D | 1,6x109 ±0,3 |
10 | 3Т3 | 3D | 3,4x109 ±0,2 |
Как видно из таблицы 1, применение в качестве диссоциирующего агента смеси ферментов - диспазы (1,5 МЕ/мл), коллагеназы I (2 мг/мл) и коллагеназы II (1 мг/мл), примеры 4, 6, 8, 10 позволяет добиться большего выхода матрикс-связанных везикул. Использование каждого из ферментов в отдельности (примеры 1-3, 5, 7, 9) приводило к уменьшению выхода везикул.
Claims (4)
1. Способ получения матрикс-связанных везикул из культур клеток, включающий децеллюляризацию клеточных культур, их ферментативную обработку с получением раствора ферментированного внеклеточного матрикса и матрикс-связанных везикул, последующее отделение матрикс-связанных везикул от фибрилл ферментированного внеклеточного матрикса посредством центрифугирования, отличающийся тем, что децеллюляризацию проводят 0,5% раствором Triton X-100 в 20 мM нашатырного спирта в течение не менее 5 минут из расчета не менее 1 мл раствора на 1,5-2 млн клеток или 600-800 сфероидов, а ферментативную обработку проводят раствором ферментов, содержащим диспазу, коллагеназу I и коллагеназу II, взятых в концентрациях 1,5 МЕ/мл, 2 мг/мл, 1 мг/мл, соответственно, из расчета не менее 1 мл раствора на 1,5-2 млн клеток или 600-800 сфероидов.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что ферментативную обработку проводят при инкубации раствора при 37 °С в течение не менее 40 мин на мини-рокер-шейкере с частотой перемешивания содержимого пробирок 15–20 раз/мин.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что отделение матрикс-связанных везикул проводят при последовательном центрифугировании при 500g в течение 10 минут, при 2500g в течение 20 минут с последующим ультрацентрифугированием.
4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что ультрацентрифугирование проводят при 100000g в течение 70 минут при 4 °C.
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2785136C1 true RU2785136C1 (ru) | 2022-12-05 |
Family
ID=
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2017151862A1 (en) * | 2016-03-02 | 2017-09-08 | University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education | Matrix bound nanovesicles and their use |
RU2739912C1 (ru) * | 2020-01-20 | 2020-12-29 | ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ «АКСОГЕН» (ООО «Аксоген») | Способ стимулирования регенерации спинного мозга при помощи везикул, полученных из мезенхимных стволовых клеток жировой ткани |
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2017151862A1 (en) * | 2016-03-02 | 2017-09-08 | University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education | Matrix bound nanovesicles and their use |
RU2739912C1 (ru) * | 2020-01-20 | 2020-12-29 | ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ «АКСОГЕН» (ООО «Аксоген») | Способ стимулирования регенерации спинного мозга при помощи везикул, полученных из мезенхимных стволовых клеток жировой ткани |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
HULEIHEL L. et al., Matrix-bound nanovesicles within ECM bioscaffolds, SCIENCE ADVANCES, 2016, Vol 2, Issue 6, e1600502, pp. 1-11, DOI: 10.1126/sciadv.1600502. HUSSEY G. et al., Lipidomics and RNA sequencing reveal a novel subpopulation of nanovesicle within extracellular matrix biomaterials, SCIENCE ADVANCES, 2020, Vol 6, Issue 12, eaay4361, pp. 1-13, DOI: 10.1126/sciadv.aay4361. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
WO2018223830A1 (zh) | 一种人间充质干细胞外泌体冻干粉的制备方法、使用方法 | |
Shimizu et al. | Construction of multi‐layered cardiomyocyte sheets using magnetite nanoparticles and magnetic force | |
CN107007541A (zh) | 外泌体在皮肤美白制剂中的应用 | |
Luzzani et al. | A therapy-grade protocol for differentiation of pluripotent stem cells into mesenchymal stem cells using platelet lysate as supplement | |
US9546353B2 (en) | Optimized and defined method for isolation and preservation of precursor cells from human umbilical cord | |
US20110217385A1 (en) | Method for extracting mesenchymal stem cell from human or animal embryo and for extracting the secretion product thereof | |
AU2005279878A1 (en) | Conditioned medium comprising Wnt proteins to promote repair of damaged tissue | |
CN114591905B (zh) | 一种人红细胞制备凋亡囊泡的方法与应用 | |
JP2010539970A5 (ru) | ||
KR20220024060A (ko) | 질환 치료용 엑소좀 | |
RU2785136C1 (ru) | Способ получения матрикс-связанных везикул из монослойных культур клеток и клеточных сфероидов | |
CN105452446A (zh) | 用于体外培养干细胞的方法和培养基 | |
US9670460B2 (en) | Method for using directing cells for specific stem/progenitor cell activation and differentiation | |
KR102043603B1 (ko) | 폐암세포의 분리 및 부유배양 기법을 이용한 증식 | |
Tyukavin et al. | Apoptotic bodies of cardiomyocytes and fibroblasts—Regulators of directed differentiation of heart stem cells | |
KR20210100449A (ko) | 줄기세포 유래의 엑소좀의 동결건조 제제 | |
US9687512B2 (en) | Isolated cardiac stem cells and methods of their use | |
JP6721504B2 (ja) | 多能性幹細胞及び前駆細胞を生産するためのプロセス | |
TWI742399B (zh) | 無酵素前處理與培養脂肪間質幹細胞的方法 | |
CN114085811B (zh) | 一种利用肌层细胞外泌体体外扩增子宫内膜间充质干细胞的方法 | |
US8956870B2 (en) | Method for using directing cells for specific stem/progenitor cell activation and differentiation | |
KR102563616B1 (ko) | 줄기세포 유래 수용성 세포외기질 및 이의 제조방법 | |
RU2718907C1 (ru) | Биоматериал на основе бесклеточного матрикса, производимого мезенхимными стромальными клетками человека, способ его получения и способ применения для стимуляции регенеративных процессов | |
Sekenova et al. | GENERATION OF THREE-DIMENSIONAL SPHEROIDS FROM MOUSE MESENCHYMAL STEM CELL | |
Gobin | Assessment of High Purity Mesenchymal Stromal Cells Derived Extracellular Vesicles Presenting NRP1 Show Functional Suppression of Activated Immune Cells |