RU2783416C2

RU2783416C2 - Рак

Info

Publication number: RU2783416C2
Application number: RU2018127702A
Authority: RU
Inventors: Сюзан ГРИНФИЛД; Генри ТУ; Пол МОРРИЛЛ; Сара ГАРСИЯ-РЕЙТС; Крис ПЕППЕР; Крис ФЕГАН
Original assignee: Нейро-Био Лтд
Priority date: 2016-01-28
Filing date: 2017-01-30
Publication date: 2022-11-14

Abstract

Заявленное изобретение относится к биотехнологии и медицине. Данное изобретение относится к раку и, в частности, к диагностическим и прогностическим методам при раке и метастазировании, и биомаркерам этих состояний. Предложен способ диагностики субъекта, страдающего от рака или метастазирования, или имеющего предрасположенность к ним, или обеспечения прогноза состояния субъекта. Способ включает детектирование концентрации в образце, полученном от субъекта, пептида SEQ ID No: 3, и сравнение данной концентрации с эталоном концентрации пептида SEQ ID No: 3 у субъекта, не страдающего от рака или метастазирования. Увеличение концентрации пептида SEQ ID No: 3 по сравнению с эталоном означает, что субъект страдает от рака или метастазирования, или имеет предрасположенность к ним, или состояние субъекта имеет негативный прогноз. Предложен набор для диагностики субъекта, страдающего от рака или метастазирования, или имеющего предрасположенность к ним, или для обеспечения прогноза состояния субъекта и применение пептида SEQ ID No: 3 в качестве диагностического или прогностического биомаркера рака или метастазирования. Изобретение обеспечивает применение пептида «Т14» (SEQ ID No: 3) для диагностики рака. 3 н. и 4 з.п. ф-лы, 62 ил.,10 пр.

Description

Данное изобретение относится к раку, в частности к новым фармацевтическим композициям, терапиям и способам лечения, профилактики или улучшения состояния при раке, и особенно при метастазировании. Данное изобретение также относится к диагностическим и прогностическим методам для рака и метастазирования, и биомаркерам этих состояний.

Рак и злокачественные опухоли образуют группу заболеваний, связанных с аномальным клеточным ростом, с потенциалом прорастания или распространения на другие части тела, т.е. метастазирования. В 2012 г. в мире было зарегистрировано приблизительно 14 миллионов новых случаев рака. Таким образом, существует потребность в создании улучшенной диагностики и терапий для лечения рака и метастазирования.

Ацетилхолинэстераза (AChE) экспрессируется на разных стадиях развития в различных формах, которые все обладают одинаковой ферментативной активностью, но имеют очень разный молекулярный состав. Форма "с хвостом" (T-AChE - SEQ ID No: 1) экспрессируется в синапсах, и авторы изобретения ранее идентифицировали два пептида, которые могут быть отщеплены от С-конца, один из которых, обозначенный "Т14" (SEQ ID No: 3), входит в состав другого, известного как "Т30" (SEQ ID No: 2), и которые оба имеют сильную гомологию последовательностей с сопоставимой областью β-амилоида. С-концевой пептид AChE "Т14"' был идентифицирован как существенная часть молекулы AChE, ответственная за спектр ее негидролитической активности. Синтетический аналог пептида из 14 аминокислот (т.е. "Т14") и, следственно, более крупная, более стабильная и более активная (potent) аминокислотная последовательность, в состав которой она входит (т.е. "Т30" - SEQ ID No: 3), демонстрирует активность, сравнимую с описанной для "нехолинергической" AChE, в то время как инертный остаток последовательности Т30 (т.е. "Т15" - SEQ ID No: 4) эффекта не создает.

Пептид Т14 связывается с аллостерическим сайтом α7 никотинового рецептора, где, сам по себе, он не создает эффекта. Однако в присутствии первичного лиганда, такого как ацетилхолин или пищевой холин, Т14 усиливает приток кальция, индуцируемый этими первичными агентами. Избыток кальция может поглощаться митохондриями, где он компрометирует окислительное фосфорилирование и вызывает утечку электронов.

Вследствие этого образуются свободные радикалы, которые затем дестабилизируют мембрану, вследствие чего клетка погибает.

Авторы изобретения исследовали уровни токсичного пептида Т14, α7 никотинового рецептора и белков ацетилхолинэстеразы методом вестерн-блоттинга в клеточном лизате и клеточных культуральных средах семи раковых клеточных линий (МЕС-1, KG1a, Н929, MCF-7, MDA-MB 231, CLL и JJN3). Они обнаружили, что только токсичный пептид Т14 высвобождался раковыми клетками, и что концентрация Т14 вне клеток была выше, чем уровни Т14 внутри раковых клеток. Авторы изобретения затем исследовали соотношение между известным маркером метастазирования CD44 и токсичным пептидом Т14, AChE, и α7 никотиновым рецептором в мембранной и цитозольной фракциях раковых клеточных линий. Они неожиданно обнаружили, что CD44 значимо и позитивно коррелирует с токсичной молекулой Т14. Взятые вместе, эти данные убедительно свидетельствуют, что токсичный пептид Т14, включая его биосинтез и метаболические пути, является надежной (good) мишенью для лечения рака и метастазирования, а кроме того, что Т14 сам по себе выступает в качестве надежного биомаркера раковых метастазов.

Таким образом, в первом аспекте данного изобретения, предусматривается ингибитор синтеза и/или активности пептида SEQ ID No: 3, для применения в лечении, облегчении или профилактике рака или метастазирования.

Во втором аспекте, предусматривается способ лечения, облегчения или профилактики рака или метастазирования у субъекта, включающий введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества ингибитора синтеза и/или активности пептида SEQ ID No: 3.

Как описано в Примере 1, авторы изобретения детектировали уровни белков токсичного пептида Т14 (SEQ ID No: 3), никотинового рецептора альфа-7 и ацетилхолинэстеразы (AChE) с использованием метода вестерн-блоттинга в клеточных лизатах и клеточных культуральных средах семи раковых клеточных линий (МЕС-1, KG1a, Н929, MCF-7, MDA-MB 231, CLL и JJN3) и нормальных В-лимфоцитов, использованных в качестве контроля. Клетки MDA-MB-231, KG1a и МЕС-1 представляют собой далеко мигрирующие раковые клеточные линии, в то время как Н929, JJN3, CLL и MCF-7 являются слабее мигрирующими раковыми клеточными линиями, и В-лимфоциты являются нормальными нераковыми клетками. Т14, альфа-7 рецепторы и AChE были все обнаружены в раковых клетках.

Неожиданно, все три белка имеют схожую подвижность и их уровни позитивно коррелируют друг с другом, позволяя предположить, что они образуют комплексы друг с другом. Однако вне раковых клеток (т.е. в клеточных культуральных средах) детектировался только токсичный пептид Т14. Еще более неожиданным было то, что уровни Т14 вне клеток были выше, чем внутри шести из семи раковых клеточных линий, позволяя предположить, что Т14 продуцируется для высвобождения из клетки. Авторы изобретения также с удивлением обнаружили, что уровни Т14 вне раковых клеток имели существенную отрицательную корреляцию с уровнями альфа-7 рецептора в раковых клетках.

Пример 2 описывает использование вестерн-блоттинга для того, чтобы показать соотношение между хорошо известным маркером метастазирования CD44 и токсичным пептидом Т14, AChE и альфа-7 рецептором в мембранной и цитозольной фракциях шести раковых клеточных линий (JJN3, MDA-MB231, MCF-7, KG1a, МЕС-1 и Н929), а также одной клеточной линии, производной от раковой (PC12). Во всех раковых клеточных линиях, маркер метастазирования (CD44) существенно и позитивно коррелирует с токсичной молекулой Т14, и эта корреляция наблюдается в мембране раковой клетки, а также в цитозоле раковой клетки. Эти результаты убедительно свидетельствуют о том, что Т14 является хорошим предиктором стадии рака и метастазирования, т.е. миграции опухолевых клеток.

Рак, лечение которого проводится в соответствии с первым или вторым аспектом, может быть лейкозом. Например, рак может быть лимфоцитарным лейкозом или хроническим лимфоцитарным лейкозом (CLL). Рак может быть миелоидным лейкозом, или острым миелоидным лейкозом. Рак может быть множественной миеломой. Рак может быть раком молочной железы. Рак может быть плазмацитомой.

Наиболее предпочтительно, синтез и/или активность ингибитора пептида Т14 (SEQ ID No: 3) предназначены для применения в лечении, облегчении или профилактике метастазирующей опухоли или метастазирования.

Ацетилхолинэстераза является сериновой протеазой, которая гидролизует ацетилхолин, и хорошо известна квалифицированным специалистам. Основная форма ацетилхолинэстеразы, присутствующей в мозгу, известна как ацетилхолинэстераза "с хвостом" (T-AChE). Белковая последовательность одного варианта реализации человеческой ацетилхолинэстеразы "с хвостом" (Gen Bank: ААА68151.1) имеет длину 614 аминокислот, и представлена в данном документе как SEQ ID No:1, как приведено ниже:

Следует понимать, что первые 31 аминокислотных остатков SEQ ID No:1 удаляются при высвобождении белка, после чего остается последовательность из 583 аминокислот.

Аминокислотная последовательность Т30 (которая соответствует последним 30 аминокислотным остаткам SEQ ID No:1, представлена в данном документе как SEQ ID No:2, как приведено ниже:

Аминокислотная последовательность токсичного пептида Т14 (которая соответствует 14 аминокислотным остаткам, расположенным рядом с концом SEQ ID No: 1, и не содержит 15 концевых аминокислот, присутствующих в Т30) представлена в данном документе как SEQ ID No:3, как приведено ниже:

Аминокислотная последовательность Т15 (которая соответствует последним 15 аминокислотным остаткам SEQ ID No:1) представлена в данном документе как SEQ ID No:4, как приведено ниже:

Авторы изобретения обнаружили, что ингибирование токсичного пептида Т14 требуется для эффективного лечения рака или метастазов. Ингибиторы по данному изобретению могут быть использованы для предотвращения развития рака или развития и распространения метастазов. Например, ингибиторы могут быть введены субъектам с риском (например, генетической предрасположенностью или неблагоприятным воздействием факторов окружающей среды) развития рака или метастазов. Ингибиторы могут также быть использованы после хирургии, лучевой терапии или химиотерапии для предотвращения регенерации рака у субъекта.

Авторы изобретения показали, что токсичный пептид Т14 связывается с аллостерическим сайтом α7 никотинового рецептора, где, сам по себе, он не оказывает влияния на клетку. Однако в присутствии первичного лиганда, такого как ацетилхолин или пищевой холин, Т14 усиливает приток кальция в клетку, индуцируемый этими первичными агентами. Избыток кальция поглощается митохондриями, где он компрометирует окислительное фосфорилирование, и вызывает утечку электронов. Вследствие этого образуются свободные радикалы, которые затем дестабилизируют мембрану, и клетка погибает.

На основании вышеизложенных представлений, авторы изобретения сконструировали ингибиторы, способные снижать синтез или биологическую активность токсичного пептида Т14, и которые могут проявлять свой эффект посредством ряда биосинтетических и/или метаболических средств. Предпочтительно, ингибитор может связываться с Т14, и предотвращать его связывание с α7 никотиновым рецептором. Авторы изобретения обнаружили, что любой пептид Т14, достигший аллостерического сайта, остается взаимодействовать с рецептором, и что такое взаимодействие может вызывать стимуляцию дополнительных рецепторов в течение 24 часов, т.е. Т14 может увеличивать свою мишень. Соответственно, предотвращение взаимодействия Т14 с аллостерическим сайтом является наиболее предпочтительным.

Например, такие ингибиторы могут:

(a) ослаблять взаимодействие между пептидом Т14 и аллостерическим сайтом альфа-7 рецептора;

(b) конкурировать с эндогенным пептидом Т14 за аллостерический сайт альфа-7 рецептора;

(c) связываться с пептидом Т14 для снижения его биологической активности;

(d) уменьшать посттрансляционное расщепление полипептида ацетилхолинэстеразы с образованием пептида Т14; или

(e) ингибировать транслокацию Т14 к аллостерическому сайту альфа-7 рецептора.

В предпочтительном первом варианте реализации данного изобретения, ингибитор может непосредственно взаимодействовать с пептидом Т14 (например, пункты (а) - (с) выше), снижая биохимическую и/или метаболическую активность Т14 и, таким образом, токсичность Т14, в клетках субъекта. Предпочтительно, ингибитор приводит к ослаблению взаимодействий Т14 с аллостерическим сайтом альфа-7 рецептора.

Предпочтительные ингибиторы включают ингибиторы на основе малых молекул. Такие ингибиторы могут быть идентифицированы как часть высокопроизводительного скрининга библиотек малых молекул. Например, способ скрининга в соответствии с пятым аспектом данного изобретения (см. ниже) представляет собой пригодные средства для идентификации таких ингибиторов, которые могут быть использованы для лечения рака или метастазов.

В предпочтительном варианте реализации, ингибитор содержит соединение Формулы (I):

где:

R₁ обозначает - NR₉R₁₀ или -ОН;

R₂ обозначает

или

R₃ обозначает -Н или линейный или разветвленный C_1-5-алкил или алкенил;

R₄ обозначает

или

R₅ обозначает -Н или линейный или разветвленный C_1-5-алкил или алкенил;

или

R₇ обозначает -Н или линейный или разветвленный C_1-5-алкил или алкенил;

R₈ обозначает -Н; линейный или разветвленный C_1-5-алкил или алкенил или

X₁ обозначает -NR₉R₁₀, -ОН или

или каждый R₉ и R₁₀ обозначают независимо -Н или линейный или разветвленный С_1-5-алкил или алкенил;

R₁₁ обозначает -NH₂, -ОН или арильную группу;

(или) каждый m независимо имеет значение от 0 до 5; и

каждый n независимо имеет значение от 0 до 10;

или его фармацевтически приемлемую соль, сольват, таутомерную форму или полиморфную форму.

Следует понимать, что термин "соль" относится к любой соли соединения, предусматриваемого в данном документе, которая сохраняет его биологические свойства и которая не является токсичной или по другим причинам нежелательной для фармацевтического применения. Такие соли могут быть получены из различных органических и неорганических противоионов, хорошо известных специалистам в данной области техники. Такие соли включают, без ограничения перечисленными: (1) соли присоединения кислоты, образованные с органическими или неорганическими кислотами, такими как хлористоводородная, бромистоводородная, серная, азотная, фосфорная, сульфаминовая, уксусная, трифторуксусная, трихлоруксусная, пропионовая, капроновая, циклопентилпропионовая, гликолевая, глутаровая, пировиноградная, молочная, малоновая, янтарная, сорбиновая, аскорбиновая, яблочная, малеиновая, фумаровая, винная, лимонная, бензойная, 3-(4-гидроксибензоил)бензойная, пикриновая, коричная, миндальная, фталевая, лауриновая, метансульфоновая, этансульфоновая, 1,2-этандисульфоновая, 2-гидроксиэтансульфоновая, бензолсульфоновая, 4-хлорбензолсульфоновая, 2-нафталинсульфоновая, 4-толуолсульфоновая, камфорная, камфорсульфоновая, 4-метилбицикло[2.2.2]-окт-2-ен-1-карбоновая, глюкогептоновая, 3-фенилпропионовая, триметилуксусная, трет-бутилуксусная, лаурилсерная, глюконовая, бензойная, глутаминовая, оксинафтойная, салициловая, стеариновая, циклогексилсульфаминовая, хинная, муконовая кислота и подобные кислоты; или (2) соли присоединения основания, образующиеся, когда кислотный протон, присутствующий в исходном соединении, (а) замещается на ион металла, например, ион щелочного металла, ион щелочноземельного элемента или ион алюминия, или гидроксиды щелочного металла или щелочноземельного металла, такого как натрий, калий, кальций, магний, алюминий, литий, цинк, и гидроксид бария, аммиак или (b) координационные соединения (coordinates) с органическим основанием, таким как алифатические, алициклические или ароматические органические амины, такие как аммиак, метиламин, диметиламин, диэтиламин, пиколин, этаноламин, диэтаноламин, триэтаноламин, этилендиамин, лизин, аргинин, орнитин, холин, N,N'-дибензилэтилендиамин, хлорпрокаин, диэтаноламин, прокаин, N-бензилфенэтиламин, N-метилглюкамин, пиперазин, трис(гидроксиметил)аминометан, тетраметиламмония гидроксид и т.п.

Соли могут дополнительно включать, только в качестве примера и без ограничений, натрий, калий, кальций, магний, аммония, тетраалкиламмоний и т.п., и если соединение содержит основную функциональную группу, соли нетоксичных органических или неорганических кислот, таких как галоидоводороды, например, гидрохлорид и гидробромид, сульфат, фосфат, сульфамат, нитрат, ацетат, трифторацетат, трихлорацетат, пропионат, гексаноат, циклопентилпропионат, гликолят, глутарат, пируват, лактат, малонат, сукцинат, сорбат, аскорбат, малат, малеат, фумарат, тартрат, цитрат, бензоат, 3-(4-гидроксибензоил)бензоат, пикрат, циннамат, манделат, фталат, лаурат, метансульфонат (мезилат), этансульфонат, 1,2-этандисульфонат, 2-гидроксиэтансульфонат, бензолсульфонат (безилат), 4-хлорбензолсульфонат, 2-нафталинсульфонат, 4-толуолсульфонат, камфорат, камфорсульфонат, 4-метилбицикло[2.2.2]-окт-2-ен-1-карбоксилат, глюкогептонат, 3-фенилпропионат, триметилацетат, трет-бутилацетат, лаурилсульфат, глюконат, бензоат, глутамат, гидроксинафтоат, салицилат, стеарат, циклогексилсульфамат, хинат, муконат и т.п.

Можно понять, что термин "сольват" относится к соединению, предусматриваемому в данном документе, или его соли, которые дополнительно содержат стехиометрическое или нестехиометрическое количество растворителя, связанного нековалентными межмолекулярными силами. В тех случаях, когда растворителем является вода, сольват называется гидратом.

Следует понимать, что арильная группа относится к заместителю, образованному ароматическим кольцом. Арильная группа может быть С₆-С₁₂-арильной группой. Предпочтительно, арильная группа представляет собой фенил, бифенил или нафтил.

Наиболее предпочтительно, соединение имеет Формулу (Ia):

R₁ может обозначать -ОН. Однако, предпочтительно, R₁ обозначает -NR₉R₁₀, более предпочтительно, R₁ обозначает -NR₉H, и наиболее предпочтительно, R₁ обозначает -NH₂.

Предпочтительно, R₂ обозначает

или

и n предпочтительно имеет значение от 1 до 5. Соответственно, n может быть равен 1, 2, 3, 4 или 5, и наиболее предпочтительно, n равен 1.

Следует понимать, что в вариантах реализации, в которых R₂ обозначает

m может быть равен 0, 1, 2, 3, 4 или 5. Предпочтительно, m равен 1. Предпочтительно, X₁ находится в пара-положении.

В предпочтительном варианте реализации, R₂ обозначает

или

Предпочтительно, в вариантах реализации, в которых R₂ обозначает

по меньшей мере один из R₉ или R₁₀ обозначает -Н, и наиболее предпочтительно, R₉ или R₁₀ оба обозначают -Н.

или

В наиболее предпочтительном варианте реализации, R₂ обозначает

или

Следует понимать, что R₃ может быть метильной, этильной, пропильной, бутильной или пентильной группой. Предпочтительно, R₃ обозначает метил. Однако в более предпочтительном варианте реализации, R₃ обозначает -Н.

В одном варианте реализации R₄ обозначает

и n предпочтительно имеет значение от 1 до 5. Соответственно, n может быть равен 1, 2, 3, 4 или 5, и предпочтительно n равен 1.

В вариантах реализации, в которых R₄ обозначает

или

n предпочтительно имеет значение от 1 до 7, и более предпочтительно, от от 2 до 6. Соответственно, n может быть равен 2, 3, 4, 5 или 6, и предпочтительно, n равен 3 или 4.

В одном варианте реализации, R₄ предпочтительно обозначает

Более предпочтительно, R₄ обозначает

или

Следует понимать, что в вариантах реализации, в которых R₄ обозначает

m может быть равен 0, 1, 2, 3, 4 или 5. Предпочтительно m равен 1. Предпочтительно, X₁ находится в пара-положении.

Предпочтительно, R₄ обозначает

или

Более предпочтительно, R₄ обозначает

или

Предпочтительно, в вариантах реализации, в которых R₄ обозначает

Соответственно, R₄ предпочтительно обозначает

Более предпочтительно, R₄ обозначает

или

Наиболее предпочтительно, R₄ обозначает

Следует понимать, что R₅ может быть метильной, этильной, пропильной, бутильной или пентильной группой. Предпочтительно, R₅ обозначает метил. Однако в более предпочтительном варианте реализации R₅ обозначает -Н.

В (вариантах реализации, в которых) R₆ обозначает

или

n имеет значение от 1 до 5. Соответственно, n может быть равен 1, 2, 3, 4 или 5, и предпочтительно n равен 1.

Предпочтительно, R₆ обозначает

или

Следует понимать, что в вариантах реализации, в которых R₆ обозначает

m может быть равен 0, 1, 2, 3, 4 или 5. Предпочтительно, m равен 0. Более предпочтительно, m равен 1. Предпочтительно, X₁ находится в пара-положении.

В предпочтительном варианте реализации R₆ обозначает

или

Предпочтительно, в вариантах реализации, в которых R₆ обозначает

R₁₁ обозначает арил, и наиболее предпочтительно, фенил.

В предпочтительном варианте реализации, R₆ обозначает

или

В наиболее предпочтительном варианте реализации, R₆ обозначает

или

Следует понимать, что R₇ может быть метильной, этильной, пропильной, бутильной или пентильной группой. Предпочтительно, R₇ обозначает метил. Однако, в более предпочтительном варианте реализации, R₇ обозначает -Н.

В одном предпочтительном варианте реализации R₈ обозначает -Н. Однако, в более предпочтительном варианте реализации R₈ обозначает

В предпочтительном варианте реализации, ингибитор содержит соединение Формулы (I),

где:

R₂ обозначает

или

R₃ обозначает Н или линейный или разветвленный C_1-5-алкил или алкенил;

R₄ обозначает

или

R₅ обозначает Н или линейный или разветвленный C_1-5-алкил или алкенил;

R₆ обозначает

или

и

R₇ обозначает Н или линейный или разветвленный C_1-5-алкил или алкенил.

Предпочтительно, R₃ обозначает Н, R₅ обозначает Н, и R₇ обозначает Н.

В более предпочтительном варианте реализации, ингибитор содержит соединение Формулы (I), где:

R₂ обозначает

R₄ обозначает

R₅ обозначает Н или линейный или разветвленный C_1-5-алкил или алкенил; или

R₆ обозначает

и

Предпочтительно, ингибитор содержит соединение Формулы (Ia). Предпочтительно, R₃ обозначает Н, R₅ обозначает Н, и R₇ обозначает Н.

Предпочтительно, R₁ обозначает -ОН, и R₈ обозначает Н. Более предпочтительно, R₁ обозначает NH₂ и R₈; обозначает

В альтернативном более предпочтительном варианте реализации, ингибитор содержит соединение Формулы (I), где:

R₂ обозначает

R₄ обозначает

R₅ обозначает Н или линейный или разветвленный С_1-5-алкил или алкенил; или

R₆ обозначает

и

R₇ обозначает Н или линейный или разветвленный С_1-5-алкил или алкенил.

Предпочтительно, R₁ обозначает -ОН, и R₈ обозначает Н. Более предпочтительно, R₁ обозначает NH₂ и R₈ обозначает

В еще более предпочтительном варианте реализации, ингибитор содержит соединение Формулы (I), где:

R₂ обозначает

или

R₄ обозначает

или

R₆ обозначает

или

и

R₂ обозначает

R₄ обозначает

R₆ обозначает

и

R₂ обозначает

R₄ обозначает

R₆ обозначает

и

Предпочтительно, ингибитор содержит соединение Формулы (101) или (103):

Более предпочтительно, ингибитор содержит соединение Формулы (101а) или (103а):

Следует понимать, что соединения Формул (101а) и (103а) соответствуют соединениям Tri02 и Tri04, соответственно, которые описаны в примерах.

Таким образом, в дополнительном аспекте, предусматривается ингибитор, описанный в данном документе, для применения в лечении, облегчении или профилактике рака или метастазирования, предпочтительно, ингибитор, имеющий Формулу (101а) или (103а).

В одном предпочтительном варианте реализации, ингибитор содержит антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, т.е. антитело, нейтрализующее Т14. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент предпочтительно блокирует взаимодействие Т14 с аллостерическим сайтом альфа-7 рецептора. Предпочтительно, антитело связывается с Т14, образуя при этом комплекс, неспособный связываться с рецептором, вызывая токсичность.

Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут быть поликлональными или моноклональными. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут быть получены в кролике, мыши или крысе.

Предпочтительно, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент специфично связываются с SEQ ID No: 3. Предпочтительно, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент специфично связываются с одной или несколькими аминокислотами на С-конце SEQ ID No: 3. Предпочтительно, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент специфично связываются с одной или несколькими аминокислотами SEQ ID No: 5 (т.е. SYMVHWK, которые представляют собой С-концевые аминокислоты №№7-14 SEQ ID No: 3). Предпочтительно, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент специфично связываются с С-концевым остатком лизина (K) в эпитопе.

Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что С-концевая аминокислотная последовательность VHWK в SEQ ID No: 3, которая описана в данном документе как SEQ ID No. 6 (т.е. С-концевые аминокислоты №№10-14 SEQ ID No.3), выстпает в роли эпитопа антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. Соответственно, более предпочтительно, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент специфично связываются с одной или несколькими аминокислотами SEQ ID No.6. Наиболее предпочтительно, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент специфично связываются с SEQ ID No.6. Таким образом, следует понимать, что эпитоп, с которым связывается антитело, содержит или состоит из SEQ ID No: 6.

На основании открытия того эпитопа VHWK (SEQ ID No: 6) в пептиде Т14, авторы изобретения считают, что эти последовательности могут быть использованы в качестве антигена для продуцирования полезных антител. Как описано в примерах, пептид Т14 (SEQ ID No:3) перекрестно сшивали через цистеин с гемоцианином морского блюдечка (KLH), выступающим в роли белка-носителя, который стимулирует иммунный ответ хозяина. Белок KLH, перекрестно сшитый с Т14, обозначается в данном документе как SEQ ID No:7, т.е. CAEFHRWSSYMVHWK (С был добавлен для связывания KLH с А на N-конце пептида Т14).

Предпочтительно, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент не связываются с SEQ ID No: 2. Предпочтительно, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент не связываются с SEQ ID No: 4.

Поликлональные антитела могут быть получены в виде поликлональных сывороток путем инъекций антигена животным. Предпочтительные поликлональные антитела могут быть выращены путем инокуляции животного (например, кролика) антигеном (например, Т14 или его фрагментами, включающими С-конец) с использованием методик, известных специалистам. Например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут быть получены путем иммунизации животного-хозяина с помощью SEQ ID No: 3, и затем сбора антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. Животное-хозяин, наиболее предпочтительно, является кроликом.

В другом предпочтительном варианте реализации, ингибитор содержит моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. Предпочтительные моноклональные антитела могут быть выращены по гибридомной технологии с использованием Т14 или его фрагментов в качестве антигена. Предпочтительно, антитело по данному изобретению представляет собой человеческое антитело. В используемом в данном документе значении, термин "человеческое антитело" может означать антитело, такое как моноклональное антитело, которое содержит по существу такие же аминокислотные последовательности гипервариабельных участков (CDR) тяжелой и легкой цепей, как и специфическое человеческое антитело, проявляющее иммуноспецифичность по отношению к SEQ ID No: 3. Аминокислотная последовательность, которая является по существу такой же, как CDR тяжелой или легкой цепей, демонстрирует значительную степень идентичности последовательностей при сравнении с референсной последовательностью. Такая идентичность однозначно известна или идентифицируется как представляющая аминокислотную последовательность специфического человеческого антитела. По существу такая же аминокислотная последовательность CDR тяжелой и легкой цепей может иметь, например, незначительные модификации или консервативные замещения аминокислот. Такое человеческое антитело сохраняет свою функцию селективного связывания с SEQ ID No: 3.

Обычные гибридомные методики могут быть использованы для выращивания антител. Антиген, используемый для получения моноклональных антител, может быть цельным белком Т14 или его фрагментом. Предпочтительные фрагменты для получения антител могут также быть пептидами, описанными выше, в частности, SYMVHWK (SEQ ID No: 5) или VHWK (SEQ ID No: 6). Предпочтительно, антитело представляет собой γ-иммуноглобулин (IgG).

Другой предпочтительный ингибитор в соответствии с данным изобретением представляет собой неактивный пептидный фрагмент пептида Т14, который будет конкурировать с эндогенным Т14 и, тем самым, снижать его активность. Например, укороченные мутанты Т14, не связывающиеся с аллостерическим сайтом альфа-7 рецептора, которые ингибируют способность Т14 взаимодействовать с аллостерическим сайтом альфа-7 рецептора, могут также быть использованы в качестве ингибиторов по данному изобретению.

В другом варианте реализации, ингибитор может предотвращать или уменьшать посттрансляционное расщепление ферментом ацетилхолинэстеразой с образованием пептида Т14, т.е. (d) выше. Например, ингибитор в соответствии с данным изобретением может быть молекулой, подавляющей активность генов, предназначенной для блокирования или нарушения ферментативного расщепления полипептида ацетилхолинэстеразы с образованием Т14.

Термин "молекула, подавляющая активность генов" может означать любую молекулу, которая нарушает экспрессию пептида Т14. Такие молекулы включают, без ограничения перечисленными, молекулы интерферирующей РНК (RNAi), включая малые интерферирующие нуклеиновые кислоты (siNA), малые интерферирующие РНК (siRNA), микро-РНК (miRNA), рибозимы и антисмысловые молекулы.

Как описано выше, ген, кодирующий ацетилхолинэстеразу, экспрессируется и транслируется в белок, представленный как SEQ ID NO: 1. Посттрансляционные модификации SEQ ID No: l могут включать расщепление протеазой с образованием Т14 (SEQ ID No: 3). Соответственно, в предпочтительном варианте реализации, ингибитор содержит молекулу, подавляющую активность генов, которые ослабляют или препятствуют экспрессии протеазы, ответственной за отщепление Т15 (SEQ ID No: 4) от T30 с образованием Т14.

В другом варианте реализации, ингибитор может ингибировать транслокацию Т14 к альфа-7 рецептору (т.е. (е) выше).

Следует понимать, что ингибиторы в соответствии с данным изобретением могут быть использованы в лекарственном средстве, которое может быть использовано как монотерапия (т.е. использование одного ингибитора Т14), для лечения, облегчения или профилактики рака или метастазирования. Альтернативно, ингибитор Т14 может быть использован в качестве вспомогательного средства для, или в комбинации с, известными терапиями для лечения, облегчения или профилактики рака или метастазирования, такими как лучевая терапия или химиотерапия, или любыми известными противораковыми лекарственными средствами, такими как лапатиниб.

Ингибиторы в соответствии с данным изобретением могут быть скомбинированы в композициях, имеющих ряд различных форм, зависящих, в частности, от способа предполагаемого применения композиции. Таким образом, например, композиция может иметь форму порошка, таблетки, капсулы, жидкости, жидкой мази, крема, геля, гидрогеля, аэрозоля, спрея, мицеллярного раствора, трансдермального пластыря, липосомальной суспензии или любой другой пригодной формы, которая может быть введена особе или животному, нуждающимся в лечении. Следует понимать, что носитель лекарственных средств в соответствии с данным изобретением должен быть таким, чтобы он хорошо переносился получающим его субъектом, и предпочтительно обеспечивал возможность доставки ингибитора в целевую область, например, через гематоэнцефалический барьер при лечении опухолей мозга.

Ингибиторы в соответствии с данным изобретением могут также быть включены в устройство для замедленного или пролонгированного высвобождения. Такие устройства могут, например, быть установлены на или под кожей, и лекарственное средство может высвобождаться на протяжении недель или даже месяцев. Устройство может быть расположено по меньшей мере рядом с областью проведения лечения. Такие устройства могут быть особенно предпочтительными, когда требуется длительное лечение используемыми ингибиторами в соответствии с данным изобретением, которое будет обычно требовать частого введения (например, по меньшей мере ежедневных инъекций).

В предпочтительном варианте реализации, лекарственные средства в соответствии с данным изобретением могут быть введены субъекту путем инъекции в кровоток или непосредственно в область, требующую лечения. Например, лекарственное средство может быть введено путем инъекции в кровоток. Инъекции могут быть внутривенными (болюсными или инфузиями) или подкожными (болюсными или инфузиями), или интрадермальными (болюсными или инфузиями).

Следует понимать, что требуемое количество ингибитора определяется его биологической активностью и биодоступностью, которые в свою очередь зависят от способа введения, физиохимических свойств ингибитора и от того, используется он как монотерапия или в комбинированной терапии. Частота введения будет также зависеть от периода полувыведения ингибитора у субъекта, получающего лечение. Оптимальные дозировки для введения могут быть определены квалифицированными специалистами в данной области техники, и будут меняться в зависимости от конкретного используемого ингибитора, активности фармацевтической композиции, способа введения и стадии рака или метастазирования. Дополнительные факторы для конкретных получающих лечение субъектов, вызывающие необходимость корректировки дозировок, включают возраст субъекта, вес, пол, рацион питания, и время введения.

В общем, суточная доза от 0,001 мкг/кг веса тела до 10 мг/кг веса тела, или от 0,01 мкг/кг веса тела до 1 мг/кг веса тела, ингибитора в соответствии с данным изобретением может быть использована для лечения, облегчения или профилактики рака или метастазирования, в зависимости от используемого ингибитора.

Ингибитор может быть введен до, во время или после начала рака. Суточные дозы могут быть введены разово с однократным введением (например, разовая ежедневная инъекция или ингаляция назального спрея). Альтернативно, ингибитор может требовать введения два или больше раз в день. В качестве примера, ингибиторы могут быть введены в виде двух (или больше, в зависимости от тяжести рака или метастаз, лечение которых проводится) суточных доз от 0,07 мкг до 700 мг (т.е. принимая вес тела равным 70 кг). Пациент, получающий лечение, может принять первую дозу после пробуждения и затем вторую дозу вечером (при схеме с введением двух доз) или с 3- или 4-часовыми интервалами после этого. Альтернативно, устройство с пролонгированным высвобождением может быть использовано с целью обеспечения для пациента оптимальных доз ингибитора в соответствии с данным изобретением без необходимости введения повторных доз.

Известные процедуры, такие как обычно используемые в фармацевтической промышленности (например, проведение экспериментов in vivo, клинические испытания и т.д.), могут быть использованы для получения конкретных композиций ингибитора в соответствии с данным изобретением и точных схем лечения (таких как суточные дозы агентов и частота введения). Авторы изобретения считают, что они впервые предложили противораковую композицию с использованием ингибиторов по данному изобретению.

Таким образом, в третьем аспекте данного изобретения, предусматривается противораковая или антиметастатическая фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество ингибитора в соответствии с первым аспектом и, необязательно, фармацевтически приемлемый носитель.

Данное изобретение также предусматривает четвертый аспект, способ приготовления противораковой или антиметастатической фармацевтической композиции в соответствии с третьим аспектом, включающий объединение терапевтически эффективного количества ингибитора в соответствии с первым аспектом с фармацевтически приемлемым носителем.

Ингибитор в соответствии с первым аспектом ингибирует синтез и/или активность пептида SEQ ID No: 3, как описано выше.

"Субъект" может быть позвоночным, млекопитающим или домашним животным. Таким образом, лекарственные средства в соответствии с данным изобретением могут быть использованы для лечения любого млекопитающего, например, домашнего скота (например, лошади), домашних животных, или могут быть использованы в других аспектах ветеринарной практики. Наиболее предпочтительно, однако, субъект является человеком.

"Терапевтически эффективное количество" ингибитора обозначает любое количество, которое, при введении субъекту, представляет собой количество активного агента, необходимое для лечения рака или метастаз, или для достижения желательного эффекта. Ингибитор может быть использован в качестве адъюванта для лечения солидных или метастазирующих опухолей, например, методами химиотерапии или лучевой терапии. Это означает, что потребуются более низкие дозы и меньшее время облучения при химиотерапии и/или лучевой терапии.

Например, терапевтически эффективное количество используемого ингибитора может составлять от примерно 0,001 мг до примерно 800 мг, и предпочтительно, от примерно 0,01 мг до примерно 500 мг.

"Фармацевтически приемлемый носитель", в используемом в данном документе значении, представляет собой любое известное соединение или комбинацию известных соединений, известных квалифицированным специалистам в данной области техники как пригодные для применения при составлении фармацевтических композиций.

В одном варианте реализации, фармацевтически приемлемый носитель может быть твердым, и композиция может иметь форму порошка или таблетки. Однако, фармацевтический носитель может быть жидкостью, и фармацевтическая композиция будет иметь форму раствора. Жидкие фармацевтические композиции, представляющие собой стерильные растворы или суспензии, могут быть использованы, например, для внутримышечных, интратекальных, эпидуральных, интраперитонеальных, внутривенных, в частности, подкожных инъекций.

Ингибитор и композиции по данному изобретению могут быть введены перорально в форме стерильного раствора или суспензии, содержащих другие растворенные вещества или суспендирующие агенты (например, достаточное количество солевого раствора или глюкозы для обеспечения изотоничности раствора), желчные соли, гуммиарабик, желатин, сорбитанмоноолеат, полисорбат 80 (сложные эфиры олеиновой кислоты и сорбита и его ангидридов, сополимеризованные с этиленоксидом) и т.п. Ингибитор, используемый в соответствии с данным изобретением, может быть также введен перорально в форме жидкой или твердой композиции. Композиции, пригодные для перорального введения, включают твердые формы, такие как пилюли, капсулы, гранулы, таблетки и порошки, и жидкие формы, такие как растворы, сиропы, эликсиры и суспензии. Формы, пригодные для парентерального введения, включают стерильные растворы, эмульсии и суспензии.

Знание неожиданной роли Т14 при раке, и особенно метастазировании, подтверждаемой данными для CD44 в Примере 2, позволило авторам изобретения разработать метод скрининга для определения того, являются ли тестируемые соединения предполагаемыми ингибиторами для лечения, профилактики или улучшения состояния при раке или метастазировании.

Таким образом, в соответствии с пятым аспектом данного изобретения, предусматривается способ скрининга соединения-кандидата для определения того, является ли соединение эффективным для лечения, профилактики или улучшения состояния при раке или метастазировании, включающий:

(i) воздействие на биологическую систему соединением-кандидатом;

(ii) детектирование концентрации, экспрессии или активности пептида Т14 SEQ ID No: 3 в биологической системе; и

(iii) сравнение концентрации, экспрессии или активности пептида Т14 в биологической системе, обработанной соединением, с концентрацией, экспрессией или активностью, наблюдаемой в контрольной биологической системе, которая не обрабатывалась соединением,

причем соединение, эффективное при лечении, профилактике или улучшении состояния при раке или метастазировании, снижает концентрацию, экспрессию или активность пептида Т14 по сравнению с контролем.

Следует понимать, что способ в соответствии с пятым аспектом данного изобретения может быть адаптирован таким образом, чтобы он мог быть использован для проверки того, действительно ли соединение вызывает рак или метастазы.

Таким образом, в соответствии с шестым аспектом, предусматривается способ скрининга соединения для проверки того, вызывает ли соединение рак, включающий:

(i) воздействие на биологическую систему тестируемым соединением;

(iii) сравнение концентрации, экспрессии или активности пептида Т14 в биологической системе, обработанной соединением, с концентрацией, экспрессией или активностью пептида Т14, наблюдаемой в контрольной биологической системе, которая не обрабатывалась соединением,

причем соединение, являющееся канцерогенным или усиливающее метастазирование, увеличивает концентрацию, экспрессию или активность пептида Т14 по сравнению с контролем.

Способы скрининга или скрининговые анализы по данному изобретению основаны на подтвержденном авторами изобретения предположении, что степень экспрессии и/или активности Т14 тесно связана с развитием рака и метастазами. Способ скрининга по пятому аспекту данного изобретения особенно полезен для скрининга библиотек соединений с целью идентификации соединений, которые могут быть использованы в качестве противораковых или антиметастических агентов, используемых в соответствии с первым аспектом данного изобретения. Шестой аспект данного изобретения может быть использован для идентификации соединений, являющихся канцерогенными, и (использования) которых следует избегать. Соответственно, скрининговый анализ в соответствии с шестым аспектом данного изобретения может быть использован для мониторинга состояния окружающей среды (например, для анализов сточных вод промышленных предприятий) или в испытаниях на токсичность (например, для тестирования безопасности предполагаемых фармацевтических средств, косметических средств, пищевых продуктов и т.п.).

Термин "биологическая система" может означать любую экспериментальную систему, позволяющую квалифицированному специалисту получить представление об эффектах, которые соединение может оказывать на концентрацию, экспрессию или активность пептида Т14 в физиологической среде. Система может включать: (а) экспериментальный испытуемый субъект, в случае проведения испытаний in vivo; (b) биологический образец, полученный от испытуемого субъекта (например: кровь или фракция крови (например, сыворотка или плазма), лимфа или образец клеток/биопсийный материал); (с) модель клеточной линии (например, клетки, в природных условиях экспрессирующие пептид Т14, или клетки, генетически модифицированные для экспрессии Т14); или (d) in vitro система, содержащая Т14 или его ген, и имитирующая физиологическую среду таким образом, чтобы концентрацию, экспрессию или активность пептида Т14 можно было измерить.

Скрининговый анализ предпочтительно оценивает биологические клетки или их лизаты. В тех случаях, когда скрининговый анализ предусматривает анализ клеток, они могут находиться в экспериментальном животном (например, мыши или крысе), если способ представляет собой тестирование in vivo. Альтернативно, клетки могут находиться в образце ткани (для тестов ex vivo) или клетки могут выращиваться в культуре. Следует понимать, что такие клетки должны экспрессировать, или могут быть индуцированы для экспрессии, функционального (т.е. токсичного) Т14. Возможно также использование клеток, не имеющих природной предрасположенности к продуцированию Т14, при условии, что такие клетки были трансформированы с помощью экспрессионного вектора. Такие клетки являются предпочтительными тестируемыми клетками для применения в соответствии с пятым или шестым аспектами данного изобретения. Это связано с тем, что животные клетки или даже прокариотические клетки могут быть трансформированы для экспрессии пептида Т14 человека и потому являются хорошей клеточной моделью для тестирования эффективности лекарственных средств-кандидатов для применения при лечении людей.

Наиболее предпочтительно, чтобы биологические клетки, используемые в соответствии со способами скрининга по данному изобретению, были получены от субъекта, и в частности, модели ксенотрансплантатов рака (например, мышиные ксенотрансплантаты).

По отношению к "детектированию концентрации, экспрессии или активности пептида Т14" в соответствии со способами скрининга по данному изобретению, термин "активность" может означать детектирование взаимодействия Т14 с аллостерическим сайтом альфа-7 рецептора или определение конечной точки физиологического эффекта. Термин "экспрессия" может означать детектирование белка Т14 в любом компартменте клетки (например, в цитозоле, эндоплазматическом ретикулуме или аппарате Гольджи).

Экспрессия Т14 в биологической системе может детектироваться методами вестерн-блоттинга, иммунопреципитации (ИП) или ко-ИП, или иммуногистохимии.

Способы скрининга могут также быть основаны на использовании клеточных экстрактов, содержащих пептид Т14. Такие экстракты предпочтительно получают из клеток, описанных выше.

Концентрация, экспрессия или активность пептида Т14 могут быть измерены с использованием ряда обычных методик. Тест может быть тестом на основе иммунологического анализа. Например, меченые антитела могут быть использованы в иммунологическом анализе для оценки связывания соединения с Т14 в образце. Пептид Т14 может быть выделен, и количество связанной с ним метки - детектировано. Снижение количества связанной метки (по сравнению с контролями) позволяет предположить, что тестируемое соединение конкурирует с меткой за связывание с Т14, и что оно также предположительно является противораковым или антиметастическим агентом. Альтернативно, может быть использовано измерение функциональной активности пептида Т14.

Кроме того, методы молекулярной биологии могут быть использованы для детектирования пептида Т14 при скрининговом анализе. Например, кДНК может быть сгенерирована из мРНК, экстрагированной из тестируемых клеток или субъектов, и праймеров, предназначенных для амплификации тестовых последовательностей, используемых при количественной полимеразной цепной реакции для амплификации из кДНК. В тех случаях, когда используется субъект (например, животная модель или даже животная модель, генетически модифицированная для экспрессии Т14 человека), тестируемое соединение должно вводиться субъекту на протяжении предварительно определенного периода времени, и затем у субъекта берут образец для анализа концентрации, экспрессии или активности пептида Т14. Образец может быть, например, кровью или биопсийной тканью.

Как описано в примерах, авторы изобретения четко показали, что токсичный пептид Т14 легко детектируется вне раковых клеток (т.е. в клеточных культуральных средах), в то время как AChE и альфа-7 никотиновый рецептор - нет. Более того, авторы изобретения продемонстрировали сильную корреляцию между маркером метастазирования (CD44) и пептидом токсичной молекулы Т14. Эта корреляция соблюдается как в мембране раковой клетки, так и в цитозоле раковой клетки. Соответственно, авторы изобретения считают, что Т14 представляет собой надежный биомаркер рака per se, и в частности, при метастазировании.

Таким образом, в соответствии с седьмым аспектом данного изобретения, предусматривается использование пептида SEQ ID No: 3, или его фрагмента или варианта, в качестве диагностического или прогностического биомаркера рака или метастазирования.

Наиболее предпочтительно, данное изобретение предусматривает использование пептида SEQ ID No: 3, или его фрагмента или варианта, в качестве диагностического или прогностического биомаркера метастазирования.

В соответствии с восьмым аспектом, предусматривается способ диагностики особы, страдающей от рака или метастазирования, или имеющей предрасположенность к ним, или обеспечение прогноза состояния особы, включающий детектирование, в образце, полученном от особы, присутствия пептида SEQ ID No: 3, или его фрагмента или варианта, причем присутствие пептида SEQ ID No: 3, или его фрагмента или варианта, означает, что особа страдает от рака или метастазирования, или имеет предрасположенность к ним, или состояние особы имеет негативный прогноз.

В соответствии с девятым аспектом данного изобретения, предусматривается набор для диагностики субъекта, страдающего от рака или метастазирования, или имеющего предрасположенность к ним, или для обеспечения прогноза состояния субъекта, включающий средства детектирования для определения концентрации пептида SEQ ID No: 3, или его фрагмента или варианта, присутствующего в образце от испытуемого субъекта, причем присутствие в образце пептида SEQ ID No: 3, или его фрагмента или варианта, позволяет предположить, что субъект страдает от рака или метастазирования, или имеет предрасположенность к ним.

Предпочтительно, использование, способ и набор по данному изобретению позволяют получить диагноз или прогноз для особы, страдающей от рака или метастазирования, или имеющей предрасположенность к ним, наиболее предпочтительно, метастазированию. Авторы изобретения обнаружили, что токсичный пептид Т14 является надежным биомаркером для идентификации особ, страдающих от рака или метастазирования. Таким образом, для особ с диагнозом рака или метастазирования, или имеющие предрасположенность к ним, или имеющие негативный прогноз, в соответствии с использованием, способами и набором по данному изобретению, может быть достигнут полезный эффект раннего терапевтического воздействия с целью предотвращения начальных проявлений рака или метастазирования.

Особа может быть позвоночным, млекопитающим, или домашним животным. Наиболее предпочтительно, однако, особа является человеком. Особа может быть ребенком или взрослым. Предпочтительно, способ осуществляется in vitro.

Предпочтительно, образец включает биологический образец. Образец может быть любым материалом, который может быть получен от особы, из которого может быть выделен белок. Кроме того, образец может быть кровью, плазмой, сывороткой, ликвором, мочой, потом, слюной, слезами, аспиратом молочной железы, соком простаты, семенной жидкостью, влагалищным отделяемым, стулом, соскобом шейки матки, цитами (зародышевыми клетками на стадии сперматоцитов и овоцитов), амниотической жидкостью, внутриглазной жидкостью, мокротой, влагой дыхания, животной тканью, клеточными лизатами, опухолевой тканью, волосами, кожей, буккальным соскобом, лимфой, интерстициальной жидкостью, ногтями, костным мозгом, хрящом, прионами, костным порошком, ушной серой или их комбинациями.

Образец может содержать кровь, мочу, ткань и т.д. Наиболее предпочтительно, образец содержит образец крови. Кровь может венозной или артериальной кровью.

Набор может содержать контейнер для сбора образцов для размещения экстрагированного образца. Образцы крови могут быть проанализированы на уровни Т14 немедленно.

Альтернативно, образец крови может храниться при низких температурах, например, в холодильнике, или даже быть замороженным до проведения анализа Т14. Детектирование Т14 может быть проводиться для цельной крови. Предпочтительно, однако, образец крови содержит сыворотку крови. Предпочтительно, образец крови содержит плазму крови.

Кровь может быть подвергнута дополнительной обработке перед проведением анализа Т14. Например, может быть добавлен антикоагулянт, такой как цитрат (такой как цитрат натрия), гирудин, гепарин, РРАСК (L-пропил-п-фенилаланилхлорметилкетон) или фторид натрия. Таким образом, контейнер для сбора образцов может содержать антикоагулянт для предотвращения свертывания образца крови. Альтернативно, образец крови может быть подвергнут центрифугированию или фильтрации для получения плазмы или фракции сыворотки, которая может быть использована для анализа. Таким образом, предпочтительно, чтобы Т14 анализировали или оценивали в образце плазмы крови или сыворотки крови. Предпочтительно, чтобы концентрацию Т14 измеряли in vitro в образце сыворотки крови или образце плазмы, взятом у особы.

Предпочтительно, набор или способ используют для определения присутствия или отсутствия Т14-позитивных клеток (т.е. клеток, содержащих SEQ ID No: 3) в образце, или для определения их концентрации в образце. Средства детектирования могут включать анализ, предназначенный для детектирования присутствия и/или отсутствия Т14-позитивных клеток в образце. Набор или способ могут включать использование позитивный контроль и/или негативный контроль, с которым может проводиться сравнение анализа. Например, набор предпочтительно включает эталон концентрации Т14-позитивных клеток в образце от особы, страдающей от рака или метастазирования (т.е. позитивный контроль) и/или эталон концентрации Т14-негативных клеток в образце от кого-либо, не страдающего от рака или метастазирования (т.е. негативный контроль).

Анализ пептида Т14 (SEQ ID No: 3) может осуществляться рядом способов, известных квалифицированному специалисту в данной области техники. Например, предпочтительно, иммунологические анализы могут быть использованы для измерения уровней пептида Т14. Однако следует понимать, что могут быть использованы неиммунологические анализы, например, мечение соединением, обладающим аффинностью к лиганду молекулы пептида Т14, и затем количественное определение метки.

Определение пептида Т14 может также проводиться методом вестерн-блоттинга. Таким образом, иммунологические анализы и анализы методом вестерн-блоттинга могут быть использованы для определения общего уровня белка пептида Т14. Концентрация пептида Т14 может также быть определена методами твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА), флуорометрического анализа, хемилюминесцентного анализа или радиоиммунологических анализов.

Набор может дополнительно содержать метку, которая может быть детектирована. Термин "метка" может означать группу, которая может быть присоединена к средствам детектирования, или ее фрагмент. Группы могут быть использованы, например, для терапевтических или диагностических процедур. Терапевтические метки включают, например, группы, которые могут быть присоединены к антителу или его фрагменту по данному изобретению и использованы для контроля связывания антитела с пептидом Т14 (т.е. SEQ ID No: 3). Как описано в данном документе, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент специфично связываются с SEQ ID No: 3, или его фрагментом или вариантом, и могут быть использованы в качестве средств детектирования, или в средствах детектирования. Предпочтительно, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент не связываются с SEQ ID No: 2 (т.е. Т30). Предпочтительно, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент не связываются с SEQ ID No: 4 (т.е. Т15).

Диагностические метки включают, например, группы, которые могут быть детектированы аналитическими методами. Аналитически методы включают, например, качественные и количественные процедуры. Качественные аналитические методы включают, например, иммуногистохимию и непрямую иммунофлуоресценцию. Количественные аналитические методы включают, например, иммуноаффинные процедуры, такие как радиоиммунологический анализ, ИФА или анализ методом проточной цитометрии (FACS). Аналитические методы также включают процедуры как in vitro, так и in vivo визуализации. Конкретные примеры диагностических меток, которые могут быть детектированы аналитическими средствами, включают ферменты, радиоизотопы, флуорохромы, хемилюминесцентные маркеры и биотин.

Примеры 3 и 4 описывают данные ИФА и вестерн-блоттинга для Т14 у ряда раковых пациентов. Следует понимать, что концентрация пептида Т14 у раковых пациентов сильно зависит от ряда факторов, например, от того, насколько далеко прогрессировал рак. Следует также понимать, что концентрация пептида Т14 у особ, не страдающих от рака, может в некоторой степени колебаться, но в среднем за данный период времени, концентрация обычно остается по существу постоянной. Кроме того, следует понимать, что концентрация пептида Т14 в одной группе особ, не больных раком, может отличаться от концентрации пептида Т14 в другой группе особ, не больных раком. Однако квалифицированный специалист знает, как определить среднюю концентрацию пептида Т14 у особ, не больных раком, и она называется "нормальной" концентрацией пептида Т14. Нормальная концентрация соответствует эталонным значениям, описанным выше.

Концентрации пептида Т14 сыворотки или пептида Т14 плазмы могут быть измерены сэндвич-методом твердофазного иммуноферментного анализа с двумя антителами (double-antibody sandwich ELISA), известным квалифицированному специалисту. Метод иммуноферментного анализа (ИФА) может включать использование пригодного антитела для нанесения покрытия на микротитровальный планшет. Например, такое пригодное антитело может включать очищенное аффинными методами поликлональное антитело кролика против пептида Т14 человека. Кроме того, метод ИФА может включать использование пригодного для детектирования антитела. Например, такое пригодное антитело может включать меченное пероксидазой моноклональное мышиное антитело против пептида Т14 человека. Пептид Т14 человека, который может быть получен методами очистки из плазмы, и который затем может быть определен количественно аминокислотным анализом, может быть использован для калибровки стандарта плазмы с использованием стандартных методик, известных квалифицированному специалисту.

Метка может быть присоединена непосредственно к антителу, или может быть присоединена к вторичному связывающему агенту, который специфично связывает Т14. Такой вторичный связывающий агент может быть, например, вторичным антителом. Вторичное антитело может быть поликлональным или моноклональным, и иметь происхождение от человека, грызунов или быть химерным.

Вследствие существующих в настоящее время ограничений для этих анализов (как вестерн-блоттинга, так и ИФА), все значения в обоих случаях могут в настоящее время считаться только относительно разными группами. Однако, хотя данные ИФА могут не быть полностью неопровержимыми, наблюдалось неожиданно четкое и значимое различие между группами с использованием анализа методом вестерн-блоттингом, где низкая выживаемость с большим значением времени до первого лечения соответствует (Р=0,01) более низким уровням Т14. Поскольку вестерн-блоттинг измеряет агрегаты пептида, эти данные позволяют предположить увеличение количества свободного мономера, выступающего в роли сигнальной молекулы в кровотоке у тех, кто еще не начал лечение, и потому имеет худший прогноз. Тот факт, что данные, полученные методом ИФА, в настоящее время не позволяют сделать окончательные выводы, может быть связан с тем, что свободный мономер, который измеряют этим методом, поглощается и/или связывается с его соответствующими мишенями, медиируя миграцию клеток.

Предпочтительно, поэтому, для детектирования Т14 и/или количественного определения уровней Т14 используют вестерн-блоттинг.

Данное изобретение дополнительно охватывает способы лечения.

Таким образом, в соответствии с десятым аспектом данного изобретения, предусматривается способ лечения особы, склонной к развитию рака или метастазирования, включающий:

(i) определение концентрации пептида SEQ ID No: 3, или его фрагмента или варианта, присутствующего в образце от испытуемого субъекта, причем присутствие в образце пептида SEQ ID No: 3, или его фрагмента или варианта, позволяет предположить, что субъект страдает от рака или метастазирования, или имеет предрасположенность к ним; и

(ii) введение особе терапевтического агента или проведение схемы лечения, которая предотвращает, ослабляет или задерживает развитие рака или метастазирования.

Примеры пригодных терапевтических агентов, которые могут быть введены, включают, без ограничений, герцептин. Примеры пригодных схем лечения включают лучевую терапию или химиотерапию.

Следует понимать, что данное изобретение охватывает любую нуклеиновую кислоту или ее пептид или вариант, производное или аналог, которая содержит по существу аминокислотные последовательности или последовательности нуклеиновой кислоты, соответствующие любой из описанных в данном документе последовательностей, включая их функциональные варианты или функциональные фрагменты. Термины "по существу аминокислотная/нуклеотидная/пептидная последовательность", "функциональный вариант" и "функциональный фрагмент" могут обозначать последовательность, имеющую по меньшей мере 40% идентичности последовательностей с аминокислотными/нуклеотидными/пептидными последовательностями, соответствующими любой из описанных в данном документе последовательностей, например, 40% идентичности с последовательностями, обозначенными как SEQ ID No: 1-7, и т.д.

Также предусматриваются аминокислотные/полинуклеотидные/полипептидные последовательности с идентичностью последовательностей более 65%, более предпочтительно, более 70%, еще более предпочтительно, более 75%, и еще более предпочтительно, более 80% идентичности последовательностей с любой из упомянутых последовательностей. Предпочтительно, аминокислотная/полинуклеотидная/полипептидная последовательность имеет по меньшей мере 85% идентичности с любой из упомянутых последовательностей, более предпочтительно, по меньшей мере 90% идентичности, еще более предпочтительно, по меньшей мере 92% идентичности, еще более предпочтительно, по меньшей мере 95% идентичности, еще более предпочтительно, по меньшей мере 97% идентичности, еще более предпочтительно, по меньшей мере 98% идентичности, и наиболее предпочтительно, по меньшей мере 99% идентичности с любой из упомянутых в данном документе последовательностей.

Квалифицированному специалисту будет понятно, как рассчитать процент идентичности между двумя аминокислотными/полинуклеотидными/полипептидными последовательностями. Для расчета процента идентичности между двумя аминокислотными/полинуклеотидными/полипептидными последовательностями нужно сначала провести выравнивание двух последовательностей, с последующим расчетом величины идентичности последовательностей. Процент идентичности двух последовательностей может принимать различные значения, в зависимости от: (i) способа, используемого для выравнивания последовательностей, например, ClustalW, BLAST, FASTA, Smith-Waterman (реализованных в разных программах), или структурное выравнивание по результатам пространственного наложения (3D comparison); и (ii) параметров, используемых в методе выравнивания, например, локальное или глобальное выравнивание, используемая матрица попарного сравнения (например, BLOSUM62, РАМ250, Gonnet и т.д.), и штраф за пробел, например, функциональная форма и константы.

После проведения выравнивания, существует много разных способов расчета процента идентичности между двумя последовательностями. Например, можно разделить число совпадений на: (i) длину самой короткой последовательности; (ii) длину выравнивания; (iii) среднюю длину последовательности; (iv) число положений, не являющихся пробелами (non-gap positions); или (iv) число эквивалентных (equivalenced) положений, за исключением выступающих концов. Кроме того, следует понимать, что процент идентичности также сильно зависит от длины. Таким образом, чем короче пара последовательностей, тем более высокое значение случайной идентичности последовательностей можно ожидать.

Таким образом, следует понимать, что точное выравнивание белковых или ДНК-последовательностей является сложным процессом. Популярная программа множественного выравнивания ClustalW (Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Research, 22, 4673-4680; Thompson et al., 1997, Nucleic Acids Research, 24, 4876-4882) является предпочтительным средством для получения множественных выравниваний белков или ДНК в соответствии с данным изобретением. Пригодными параметрами для ClustalW могут быть такие: для выравнивания ДНК: штраф за открытие пробела = 15.0, штраф за удлинение пробела = 6.66, и матрица = Идентичность (Identity). Для выравнивания белков: штраф за открытие пробела = 10,0, штраф за удлинение пробела = 0,2, и матрица = Gonnet. Для выравнивания ДНК и белков: ENDGAP = -1, и GAPDIST = 4. Квалифицированным специалистам в данной области техники будет понятно, что для оптимального выравнивания последовательностей может потребоваться изменение этих и других параметров.

Предпочтительно, расчет процентов идентичности между двумя аминокислотными/полинуклеотидными/полипептидными последовательностями может быть затем выполнен по результатам такого выравнивания как (N/T)*100, где N обозначает число позиций, в которых последовательности имеют идентичные остатки, и Т обозначает общее число сравниваемых позиций, включая пробелы, но без выступающих концов. Таким образом, наиболее предпочтительный способ расчета процента идентичности между двумя последовательностями включает (i) проведение выравнивания последовательностей с помощью программы ClustalW с использованием пригодного набора параметров, например, как указано выше; и (ii) подстановку значений N и Т в следующую формулу: Идентичность последовательностей = (N/T)*100.

Альтернативные способы идентификации схожих последовательностей известны квалифицированным специалистам в данной области техники. Например, существенно схожая нуклеотидная последовательность будет кодироваться последовательностью, которая гибридизуется с ДНК-последовательностями или комплементарными к ним последовательностями (complements) в жестких условиях. Под жесткими условиями мы подразумеваем, что нуклеотид гибридизуется со связанной с фильтром ДНК или РНК в 3х хлориде натрия/цитрате натрия (SSC) при примерно 45°С с последующей по меньшей мере одной промывкой 0,2х SSC/0,1% ДСН (SDS) при примерно 20-65°С. Альтернативно, существенно схожий полипептид может отличаться по меньшей мере 1, не меньше чем 5, 10, 20, 50 или 100 аминокислотами, от последовательностей, представленных SEQ ID No: 1-4.

Понятно, что, вследствие вырожденности генетического кода, любая последовательность нуклеиновой кислоты, описанная в данном документе, может отличаться или изменяться по существу без влияния на последовательность кодируемого ею белка, с образованием ее функционального варианта. Пригодными вариантами нуклеотида являются такие, которые имеют последовательность, измененную путем замещения разных кодонов, кодирующих в последовательности одну и ту же аминокислоту, с образованием, таким образом, молчащей мутации (silent change). Другими пригодными вариантами являются имеющие гомологичные нуклеотидные последовательности, но включающие всю последовательность, или ее части, которые были изменены путем замещения разных кодонов, кодирующих аминокислоту с боковой цепью, обладающей схожими биофизическими свойствами с заменяемой ею аминокислотой, с образованием консервативного замещения. Например, малые неполярные гидрофобные аминокислоты включают глицин, аланин, лейцин, изолейцин, валин, пролин и метионин. Большие неполярные гидрофобные аминокислоты включают фенилаланин, триптофан и тирозин. Полярные нейтральные аминокислоты включают серии, треонин, цистеин, аспарагин и глутамин. Положительно заряженные (основные) аминокислоты включают лизин, аргинин и гистидин. Отрицательно заряженные (кислотные) аминокислоты включают аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту. Таким образом, понятно, какие аминокислоты могут быть замещены на аминокислоту, имеющие схожие биофизические свойства, и квалифицированному специалисту известны нуклеотидные последовательности, кодирующие такие аминокислоты.

Все признаки, описанные в данном документе (включая любые приложения, такие как формула изобретения, реферат и чертежи), и/или все стадии любого способа или процесса, раскрытого таким образом, могут быть объединены с любым из вышеописанных аспектов в любой комбинации, за исключением комбинаций, в которых по меньшей мере некоторые из таких признаков и/или стадий являются взаимоисключающими.

Для лучшего понимания данного изобретения, и в качестве иллюстрации осуществления возможных вариантов его реализации, далее описаны, для примера, сопровождающие Фигура, на которых:

Фигура 1 изображает данные вестерн-блоттинга, показывающие схожую подвижность между Т14 (А), альфа-7 рецептором (В) и AChE (С) в клеточном лизате семи раковых клеточных линий (CL), а именно МЕС-1, KG1a, Н929, MCF-7, MDA-MB-231, CLL и JJN3, и нормальных В-лимфоцитов, используемых в качестве контроля. Клетки MDA-MB-231, KG1a, и МЕС-1 представляют собой далеко мигрирующие раковые клеточные линии. Н929, JJN3, CLL и MCF-7 представляют собой слабее мигрирующие раковые клеточные линии. В-лимфоциты являются нормальными нераковыми клетками. Уровни пептида/белка были нормированы по общему белку (TP) и собраны на одном графике для всех клеточных линий. Уровни пептида/белка были схожими в каждой клеточной линии, за исключением клеток MCF-7, в которых уровни Т14 были более низкими. Между клеточными линиями наблюдались различия в уровнях пептида/белка. Уровни белка вышеуказанных (линий) были впоследствии определены количественно, как показано на Фигуре 2 и Фигуре 5;

Фигура 2 изображает графики данных вестерн-блоттинга, показывающие различающиеся уровни (variable levels) Т14, альфа-7 рецептора и AChE в клеточных лизатах между раковыми клеточными линиями, но схожие уровни в каждой клеточной линии;

Фигура 3 изображает графики, построенные на основе данных вестерн-блоттинга, представленных на Фигуре 1. Уровни Т14, альфа-7 рецептор и AChE были нормированы по общему белку (TP), была установлена зависимость уровня каждого пептида/белка с другими на графиках функциональной зависимости в координатах х-у, и проведен линейно-регресионный анализ, давший линии наилучшего соответствия (сплошная линия) вместе с их 95% доверительным интервалом (пунктирные линии). А): Т14 и альфа-7 рецептор, R²=0,6262, Р=0,0193. В): Альфа-7 рецептор и AChE, R²=0,6705, Р=0,0129.С): Т14 и AChE. Кружок на (С) показывает аномальную точку данных, исключение которой дает значимую положительную корреляцию (R²=0,7032, Р=0,0184). Тот факт, что все корреляции были по существу линейными, позволяет предположить, что пептид/белки существуют в виде комплекса с соотношением компонентов 1:1:1 (D);

Фигура 4 изображает данные вестерн-блоттинга, показывающие, что Т14 детектировался в культуральных средах раковых клеток для всех семи раковых клеточных линий, но AChE и альфа7 не детектировались. Подвижность Т14 в клеточных средах немного отличалась от результатов для клеточного лизата. Уровни белка для вышеуказанных были впоследствие определены количественно, как показано на Фигуре 5;

Фигура 5 изображает графики данных вестерн-блоттинга, показывающие, что концентрация Т14 в культуральных средах раковых клеток значительно превышают концентрации уровни клеточного пептида/белка Т14 в клеточных линиях МЕС-1, KG1a, нормальных В-лимфоцитов и MDA-MB-231. Сигналы альфа-7 и AChE не детектировались в средах раковых культур. Уровни пептида/белка были нормированы по общему белку (TP) и объединены на графиках для всех клеточных линий;

Фигура 6 изображает графики, основанные на данных вестерн-блоттинга, представленных на Фигуре 1 и Фигуре 4. Уровни Т14, альфа-7 рецептора и AChE были нормированы по общему белку (TP) и уровень Т14 в средах раковых культур (внеклеточный Т14) были скоррелированы с каждым внутриклеточным пептидом/белком на графиках функциональной зависимости в координатах х-у, и был проведен линейно-регресионный анализ, определивший линии наилучшего соответствия (сплошная линия) вместе с их 95% доверительным интервалом (пунктирные линии). А): Внеклеточный Т14 и внутриклеточный альфа-7 рецептор, R²=0,6518, Р=0,0154. В): Внеклеточный Т14 и внутриклеточный Т14. Клеточные линии были разделены на две группы (темно-серые и светло-серые кружки). Для взятых отдельно темно-серых было определено R²=0,9794, Р=0,0105. С): Внеклеточный Т14 и внутриклеточная AChE;

Фигура 7 изображает график, показывающий, что уровни Т14 значительно различаются для клеточных линий и между клеточными средами и клеточными лизатами при определении методом ИФА;

Фигура 8 изображает графики, демонстрирующие значимую обратную корреляцию между уровнями Т14, измеряемыми методами ИФА и вестерн-блоттинга для клеточных сред и клеточных лизатов в раковых клеточных линиях;

Фигура 9 изображает данные вестерн-блоттинга, показывающие схожую подвижность между CD44, Т14 и AChE во фракциях клеточных мембран и цитозоля для шести раковых клеточных линий и одной клеточной линии ракового происхождения. Альфа-7 рецептор демонстрировал подвижность, отличную от CD44, Т14 и AChE. Порядок дорожек слева направо: JJN3, MDA-MB231, MCF-7, KG1a, МЕС-1, Н929 и РС12. Клетки MDA-MB-231, KG1a и МЕС-1 представляют собой далеко мигрирующие раковые клеточные линии, в то время как Н929, JJN3, MCF-7 и PC12 являются слабее мигрирующими раковыми клеточными линиями;

Фигура 10 показывает относительные экспрессии CD44, Т14, AChE и альфа-7 рецептора к уровню общего белка (TP). Сильно метастатичные раки имеют больше белков у мембраны по сравнению с цитозолем, тогда как слабо метастатичных раков это соотношение меняется;

Фигура 11 показывает значимую положительную корреляцию между CD44, Т14 и AChE, позволяя убедительно предположить, что Т14 и AChE являются хорошими предикторами степени метастазирования рака;

Фигура 12 показывает данные для клеточных культур (а именно, активность ацетилхолинэстеразы) для соединения-пептидомиметика 1 (т.е. Tri02);

Фигура 13 показывает данные для клеточных культур (а именно, приток ионов кальция) для соединения-пептидомиметика 1 (т.е. Tri02);

Фигура 14 показывает результаты визуализации потенциал-чувствительным красителем (VSDI) на срезах мозга для контрольного циклического пептида NBP-14;

Фигура 15 показывает результаты визуализации потенциал-чувствительным красителем (VSDI) на срезах мозга для соединения-пептидомиметика 1 (т.е. Tri02);

Фигура 16 изображает корреляционный анализ изменений, индуцируемых прибавлением пептидов, по сравнению с соответствующей базовой интенсивностью реакции (baseline response amplitude), с использованием визуализации потенциал-чувствительным красителем (VSDI) на срезах мозга. Было обнаружено, что изменения интенсивности реакции, индуцируемые Т30, негативно коррелируют с интенсивностью их соответствующих базовых значений (А). Поэтому, были проведены дополнительные (subsequent) корреляционные анализы для каждого эксперимента, в котором проводилась перфузия экзогенных пептидов: В) Т15, С) NBP14, D) Tri02, Е) Т30 в присутствии NBP14 и F) Т30 в присутствии Tri02. Единицы измерения по оси у=ΔF/F0; по оси х=∑δF/F0;

Фигура 17 показывает количественную оценку эффектов, медиируемых прибавлением Tri02 и Т30;

Фигура 18 показывает график сравнения (эффекта) совместного применения Т30 и NBP14 с Tri02 и Т30 при блокировании воздействия Т30 на активность в базальных отделах переднего мозга. Совместное применение NBP14 было способно полностью заблокировать индуцируемые Т30 эффекты, в то время как Т30 с (w/) Tri02 вызывал схожую, но приглушенную модуляторную реакцию;

Фигура 19 показывает данные для клеточной культуры PC12 (а именно, приток ионов кальция) для соединения-пептидомиметика 2 (а именно, Tri04);

Фигура 20 показывает (А) карты пространство-время (space-time maps) изменений активности базальных отделов переднего мозга, индуцируемых прибавлением пептидов (Т30 и Tri04), по сравнению с базовой интенсивностью реакции, с использованием визуализации потенциал-чувствительным красителем (VSDI) на срезах мозга. На (В) показан график сравнения вызванной активности базальных отделов переднего мозга для записей (recordings) с использованием Т30 и Tri04 (2 мкМ) с результатами для одного лишь Т30 в базальных отделах переднего мозга;

Фигура 21 показывает относительное изменение флуоресценции (временной ряд ответной реакции (response time-series), n=29) для записей, выполненных в присутствии одного лишь T30 или после совместного применения T30 и его блокатора Tri04, по сравнению с базовыми условиями;

Фигура 22 изображает столбчатую диаграмму активности базальных отделов переднего мозга при использовании блокатора Tri04 в концентрации 4 мкМ. Совместное применение Tri04 было способно полностью заблокировать индуцируемые T30 эффекты в базальных отделах переднего мозга крысы;

Фигура 23 изображает столбчатую диаграмму диапазонов значений уровней Т14, измеренных методом ИФА, по сравнению с известной концентрацией экзогенного Т14. Пациенты ранжированы по относительной концентрации Т14 в исследованной когорте пациентов с хроническим лимфолейкозом (CLL);

Фигура 24 изображает таблицу значений Т14, измеренных методом ИФА, по сравнению с известной концентрацией экзогенного Т14 в исследованной когорте пациентов с хроническим лимфолейкозом, и статистическое группирование;

Фигура 25 изображает анализ методом Каплана-Мейера, проведенный для 100 образцов сыворотки (пациентов с) CLL, разделенных на "темно-серую" группу (верхняя кривая), (расположенную) над медианой, и "светло-серую" группу (нижняя кривая) под медианой. Отношение рисков, значение Р и прогностическое медианное TTFT (время до лечения) указаны выше;

Фигура 26 изображает анализ методом Каплана-Мейера, проведенный для 100 образцов сыворотки CLL, разделенных на четыре статистически не различающиеся группы (into four groups non different groups). Отношение рисков, значение Р и прогностическое медианное TTFT указаны выше;

Фигура 27 изображает таблицу значений Т14 для исследованной когорты пациентов с хроническим лимфолейкозом, и статистическое группирование;

Фигура 28 изображает анализ методом Каплана-Мейера, проведенный для 100 образцов сыворотки CLL, разделенных на "темно-серую" группу (верхняя кривая) над медианой и "светло-серую" группу (нижняя кривая) под медианой. Отношение рисков, значение Р и прогностическое медианное TTFT указаны выше; и

Фигура 29 показывает результаты анализа клеточной пролиферации. Как Т14, так и T30 демонстрируют одинаковый токсичный эффект в высокой концентрации (10 мкМ), трофический эффект в низкой концентрации на астроглии выражен сильнее для T30 (120±4% при 1 пМ и 135±9% при 10 пМ), чем для Т14 (96±5% при 1 пМ и 121±8% при 10 пМ).

Примеры

Материалы и методы

Синтез поликлонального антитела

Антитело было синтезировано на заказ фирмой Genosphere Biotechnologies (Paris, France). Использовали двух новозеландских кроликов с четырьмя иммунизациями KLH-пептидом ("Рер4":Т14-гаптен CAEFHRWSSYMVHWK - SEQ ID No. 7) в качестве иммуногена на протяжении 70 дней. Был включен С для связывания пептида Т14 с KLH, выступающим в роли иммуногена. У животных четыре раза брали кровь и образцы крови объединяли. Антисыворотку затем пропускали через колонку с гравитационным элюированием с ковалентно связанными пептидом-подложкой, после промывки антитела элюировали кислотным буфером и раствор нейтрализовали. Процесс завершали дополнительный диализ против фосфатно-солевого (PBS) буфера и лиофилизация.

Оптимизации условий для антитела Т14

Отчет изготовителя антитела был использован для проведения экспериментов ИФА в оптимальных условиях. Изготовитель приводит в отчете оптическую плотность, для определенных концентраций антитела (см. таблицу ниже) и протокол ИФА, используемый для этой процедуры (см. протокол ниже).

Протокол изготовителя:

Антигены наносят в виде покрытия на полоски для иммуноферментного анализа (EIA) по 10 мкг на лунку. Лунки промывают 200 мкл фосфатно-солевого (PBS) буфера.

Антисыворотку разбавляют последовательно, прибавляют в отдельные лунки и инкубируют в течение 2 часов. Несвязанные антитела удаляют промывкой и прибавляют конъюгат антикроличьего IgG-HRP (пероксидаза хрена). Планшеты промывают и проявляют окрашиванием в течение 15 минут субстратом ТМВ. Считывают поглощение при 405 нм (фотометрический диапазон 2,00 абсорбционные единицы (AUFS)). Интенсивность окраски была прямо пропорциональна количеству антител. Антитело было позитивным, если поглощение более чем в 2 раза превышало показатель для преиммунной сыворотки. Фоновое поглощение для преиммунной сыворотки могло составлять от 0,1 до 0,3.

Заключение:

Для всех экспериментов, описанных в данном документе, было выбрано разбавление антитела 1:1000.

Вестерн-блоттинг

Фракционирование клеток

Осадок цельных клеток раковых клеточных линий (JJN3, MDA-MB231, MCF-7, KG1a, МЕС-1, Н929, РС12) ресуспендируют в 300 мкл буфера для субклеточного фракционирования (Hepes-NaOH 10 мМ, MgCl₂ 1,5 мМ, KCl 10 мМ, ЭДТА 1 мМ, DTT (дитиотреитол) 1 мМ, 1х коктейль ингибиторов протеиназы, Nonidet Р-40 0,05%) и оставляют на льду на 10 мин. после этого, смеси гомогенизируют с помощью политрона для обеспечения лизиса клеток. Затем, смеси центрифугируют при 500g в течение 5 мин. Полученный супернатант содержал цитозольную фракцию и сохранялся. Полученный осадок содержал мембранные фракции, которые затем ресуспендируют в дополнительных 300 мкл буфера для субклеточного фракционирования и сохраняют.

Приготовление клеточного лизата

Осадок цельных клеток семи раковых клеточных линий (МЕС-1, CLL, KG1a, JJN3, Н929, MCF-7 и MDA-MB) и нормальных В-лимфоцитов был любезно предоставлен Prof. Chris Pepper (School of Bioscience, Cardiff University). Осадки цельных клеток солюбилизируют в 1х буфере для лизиса (20 мМ Tris Base, 137 мМ NaCl, 1% Tween-20, 2 мМ ЭДТА), содержащем коктейли ингибиторов протеазы (фосфатаза 1:1, PMSF (фенилметилсульфонилфторид) 1:1, апротинин 1:1) с соотношением 17% об./об. Затем смесь тритурируют с использованием политрона в течение 10 секунд и встряхивают при 4°С в течение 2 часов. Затем, образцы центрифугируют при 13000g в течение 30 минут при 4°С и супернатанты собирают и хранят при -80°С.

Измерение концентрации образца белка

Концентрации белков вышеуказанных образцов измеряют с использованием прибора Pierce™ 660nm Protein Assay (Thermo Scientific). Вкратце, проводят серийное разбавление (от 0 до 2 мг/мл) 10 мг/мл маточного раствора бычьего сывороточного альбумина (БСА). Готовят три параллельных образца каждой концентрации БСА путем переноса 10 мкл белка в прозрачный 96-луночный планшет (Greiner). Затем образцы разбавляют в трех концентрациях (1:1, 1:2, 1:10) и по три параллельных образца каждой концентрации помещают на этот же 96-луночный планшет, причем каждый эксперимент содержит 10 мкл образца. Затем к стандартам прибавляют 150 мкл реагента Реагсе и все образцы и смесь оставляют для инкубации в течение 5 мин при осторожном встряхивании. Наконец, планшет считывают с помощью спектрофотометра (Molecular Devices) при 660 нм. Концентрации белка в образцах определяют по наклону и точке пересечения с осью у калибровочной кривой БСА, рассчитанными с помощью Microsoft Excel.

Электрофорез образцов белка на полиакриламидном геле

Полиакриламидные гели (гели mini-PROTEAN® TGX stain free™, BIO-RAD) помещают в танк для электрофореза (BIO-RAD, mini-PROTEAN tetra system) и прибавляют подвижный буфер (25 мМ TRIS-base, рН 8,6, 192 мМ глицина, 0,1% ДСН) (в) резервуары для геля и танк (BioRad). Образцы белка готовят путем смешения с дистиллированной водой и 4х буфером Лэммли (Laemmli) для образцов (конечные концентрации: 69,5 мМ TRIS-HCl, рН 6,8, 1,1% LDS (додецилсульфат лития), 11,1% (мас./об.) глицерина, 0,005% бромфенолового синего, BIO-RAD) и 2,5% меркаптоэтанола (BIO-RAD). Смеси нагревают при 95°С в течение 5 мин, после чего охлаждают на льду. Образцы и позитивный контроль загружают на гели и проводят электрофорез вместе с маркером молекулярного веса (Precision Plus Protein™ Dual Xtra Standards, BIO-RAD) при 35 мВ в течение 90 мин. Для предотвращения перегрева в танк для проведения электрофореза (running tank) помещают блок льда.

Перенос образцов белка на поливинилиденфторидную (PVDF) мембрану

Концентрирующие гели обрезают и разделяющий гель переносят на ПВДФ-мембрану для переноса (PVDF Transfer Membrane) (Thermo Scientific) в ячейке Mini Transblot Cell (BIO-RAD). Вкратце, ПВДФ-мембрану для переноса активируют пропиткой метанолом в течение 1 мин с последующей пропиткой дистиллированной водой в течение 2 мин. Все слои затем насыщают буфером для переноса (20 мМ TRIS-base, рН 8,6, 154 мМ глицина, 0,8% мас./об. ДСН и 20% метанола). Сэндвич для переноса, состоящий, снизу вверх, из губки для переноса, фильтровальной бумаги, геля, ПВДФ-мембраны для переноса, фильтровальной бумаги, губки для переноса, помещают в кассету для переноса, которую вставляют в ячейку Mini Transblot Cell, заполненную буфером для переноса. Наконец, проводят электрофоретический перенос в течение 90 мин при 200 мА. Для предотвращения перегрева в танк для переноса помещают блок льда.

Окрашивание ПВДФ-мембраны

Для окрашивания общего белка используют BLOT-Faststain™ (G-Biosciences, USA), выполняющий роль контроля загрузки. Немедленно после электрофоретического переноса, ПВДФ-мембрану для переноса окрашивают разбавленным (10-кратно) раствором фиксатора BLOT-Faststain™ в течение 2 мин при осторожном встряхивании. Мембрану затем инкубируют с разбавленным (4-кратно) раствором проявителя BLOT-Faststain™ в течение 1 мин при осторожном встряхивании. Затем мембрану выдерживают при 4°С в темноте в растворе проявителя в течение 30 мин для достижения белковыми зонами максимальной интенсивности. Наконец, мембрану промывают холодной водой для удаления фонового окрашивания и визуализируют с помощью G box (Syngene). Мембрана может быть затем подвергнута обесцвечиванию с использованием теплой деионизированной воды (40-45°С) и подготовлена к стадии блокирования.

Детектирование белковых полос

ПВДФ-мембрану для переноса блокируют в TBS (TRIS-буферный солевой раствор, 20 мМ TRIS-base, рН 7,5, 0,5 мМ NaCl), содержащем 5% сухого обезжиренного молока, в течение 1 ч, затем промывают дважды, каждый раз по 7 мин, в TTBS (TBS с добавкой 0,05% об./об. Tween-20). Мембрану инкубируют в течение ночи при 4°С с первичным антителом, разбавленным в TTBS, содержащем 1% сухого обезжиренного молока. На следующий день, первичное антитело удаляют. Мембрану промывают три раза, каждый раз в течение 5 мин, в TTBS, затем инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре со вторичным антителом. Выбор вторичного антитела зависит от типа использованного первичного антитела. Это может быть козье анти-мышиное вторичное антитело, конъюгированное с пероксидазой хрена (HRP) (а9309, Sigma), разбавленная в TTBS, содержащем 1% сухого обезжиренного молока (рабочая концентрация: 1:1000) или козье анти-кроличье вторичное антитело, конъюгированное с HRP (ab6721, abcam), разбавленное в TTBS, содержащем 1% сухого обезжиренного молока (рабочая концентрация: 1:5000). После инкубирования вторичного антитела, мембраны промывают три раза в течение 5 мин в TTBS перед окончательной 10-минутной промывкой в TBS. Полосы белка детектируют с помощью G box (Syngene).

Визуализация полос белка и анализ данных

ПВДФ-мембрану помещают в G box (Syngene). Регулируют настройки фокусировки и увеличения, чтобы большая часть мембраны была расположена по центру экрана. Смешивают равные части растворов люминола и пероксида из субстрата Clarity™ Western ECL substrate (BIO-Rad) и наносят на мембрану. Изображения регистрируют в темноте с интервалами 1 мин в течение 5 мин для получения оптимального сигнала для полос белка. После этого мембрану экспонируют белым светом с использованием автоматической настройки для получения изображения набора молекулярных маркеров (molecular ladder). Затем анализируют изображения блота с помощью ImageJ (image J). Вокруг белковых зон на каждой дорожке размещают равные по размеру прямоугольники, позволяющие проводить измерение интенсивностей полос белка. Затем вычитают фон из интенсивностей полос и результаты анализируют в прикладных программах Microsoft Excel и Graphpad.

Отмывка (stripping) антител для повторного зондирования

Белковый сигнал ПВДФ-мембраны для переноса может быть подвергнут отмывке и повторному зондированию другим белком. Вкратце, мембрану промывают два раза по 10 мин. слабым буфером для отмывки (200 мМ глицина, 3,5 мМ ДСН, 1% об./об. Tween-20, рН 2,2). Затем мембрану промывают PBS два раза по 10 мин и затем промывают два раза TTBS по 5 мин. Прибавляют к мембране субстрат Clarity™ Western ECL substrate (BIO-Rad) и визуализируют с использованием the G Box (Syngene) для выявления остаточных белковых сигналов. Если остаточный сигнал очень сильный, то повторяют весь процесс отмывки. После этого мембрана готова к последующей стадии блокирования и зондирования первичным антителом (см. выше).

ИФА антитела пептида Т14

Построение калибровочных кривых и анализы образцы проводили с тремя параллельными измерениями. Образцы клеточных культуральных сред и клеточных лизатов разбавляют 1:10 фосфатно-солевым буфером (PBS). Калибровочную кривую для определения пептида Т14 в образцах тканей мозга разбавляют PBS-буфером. Калибровочная кривая охватывает диапазон концентраций от 8 до 100 нМ Т14, и для холостого опыта использовался один PBS-буфер. Вкратце, 96-луночные иммунопланшеты (NUNC) покрывают 100 мкл/лунку образца или стандарта Т14, закрывают пленкой парафильм (parafilm) и инкубируют в течение ночи при 4°С. На следующий день образец удаляют стряхиванием резким движением (flicking) планшета над раковиной с проточной водой, и прибавляют 200 мкл блокирующего раствора, содержащего 2% бычьего сывороточного альбумина (БСА) в Tris-буферном солевом растворе и Tween 20 (TBS-T) и инкубируют в течение 4 ч при комнатной температуре. Затем удаляют блокирующий раствор и прибавляют 100 мкл антитела, разбавленного блокирующим раствором до 1 мкг/мл, и инкубируют в течение ночи при 4°С. Первичное антитело удаляют на следующий день и лунки промывают 3 раза 200 мкл TBS-T. После прибавления 100 мкл вторичного конъюгированного с ферментом антитела, разбавленного блокирующим раствором до 0,1 мкг/мл, и инкубирования в течение 2 ч при комнатной температуре; планшет закрывают парафильмом на весь период инкубирования (during all incubations). Через 2 ч, планшет промывают 4 раза TBS-T. Добавление 3,3,5,5-тетраметилбензидина запускает цветную реакцию. Реакцию останавливают через 20 мин останавливающим раствором, содержащим 2М H₂SO₄, и измеряют оптическую плотность при 450 нм с помощью планшет-ридера Vmax (Molecular Devices, Wokingham, UK).

Пример 1

Авторы изобретения сделали попытку детектировать уровни токсичного пептида Т14 (AEFHRWSSYMVHWK - SEQ ID No: 3), белков никотинового рецептора альфа-7 и ацетилхолинэстеразы (AChE) с использованием метода вестерн-блоттинга в клеточных лизатах и клеточных культуральных средах семи раковых клеточных линий (МЕС-1, KG1a, Н929, MCF-7, MDA-MB 231, CLL, JJN3) и нормальных В-лимфоцитов, используемых в качестве контроля. Кроме того, они детектировали уровни пептида Т14 с использованием ИФА.

Результаты вестерн-блоттинга

Использовали вестерн-блоттинг (WB) для детектирования уровней Т14, AChE и альфа-7 никотинового ацетилхолинового рецептора в клеточном лизате (CL) семи разных раковых клеточных линий и нормальных В-лимфоцитов в качестве контроля. Качественные данные показали, что Т14, AChE и альфа-7 рецептор все детектировались в клеточных лизатах (CL) всех клеточных линий. Неожиданно, все три белка имели практически идентичную подвижность (см. Фигуру 1А, В и С). Авторы изобретения не считают это проявлением перекрестной реактивности антитела, потому что эти три белка продемонстрировали разную подвижность в гомогенате человеческого мозга (данные не приведены). Затем, проводили количественное определение уровней Т14, AChE и альфа-7 рецептора и нормировали по уровням общего белка (Colins et al., 2015).

Количественные данные показали, что уровни Т14, альфа-7 рецептор и AChE в каждой клеточной линии были схожими, за исключением линии MCF-7, имеющей низкие уровни клеточного Т14 (см. Фигуру 2). Однако, уровни Т14, альфа-7 рецептора и AChE различались между клеточными линиями (см. Фигуру 2).

Интересно отметить, что в клеточном лизате была найдена значимая положительная корреляция между уровнями Т14 и альфа-7 рецептора (см. Фигуру 3А), альфа-7 рецептора и AChE (см. Фигуру 3В), уровнями Т14 и AChE (см. Фигуру 3С). Эти корреляции и идентичная подвижность белковых зон позволяют предположить, что Т14, AChE и альфа-7 рецептор существуют в раковых клетках в виде белкового комплекса с соотношением, равным 1:1:1.

Затем был проведен вестерн-блоттинг для детектирования уровней Т14 и, возможно, альфа-7 рецептора и AChE, высвобождаемых в культуральные среды раковых клеток (ССМ) вышеуказанных клеточных линий. Качественные данные показали, что наблюдалось высвобождение в клеточные культуральные среды только Т14 (см. Фигуру 4), но не AChE (см. Фигуру 4). В клеточные культуральные среды высвобождалось незначительное количество альфа-7 рецептора (см. Фигуру 4), что позволяет предположить их происхождение из мертвых плавающих раковых клеток.

Количественные данные показали, что высвобождение Т14 в клеточные культуральные среды превышало уровни клеточного Т14, альфа-7 рецептора и AChE в клеточных линиях МЕС-1, KG1a, нормальных В-лимфоцитов и MDA-MB-231 (см. Фигуру 5). Однако высвобождение Т14 в клеточные культуральные среды было схожим с уровнями Т14, альфа-7 рецептора и AChE в клеточных линиях первичного CLL, JJN3, Н929 и MCF-7 (см. Фигуру 5).

Затем, было проведено определение корреляции уровней Т14 в клеточных культуральных средах с уровнями Т14, AChE и альфа-7 рецептора в клеточном лизате. Была обнаружена значимая обратная корреляция между уровнями высвобождаемого Т14 в клеточных культуральных средах и уровнями альфа-7 рецептора в клеточном лизате (см. Фигуру 6а). Авторы изобретения считают, что это может быть общим патологическим механизмом, поскольку этот эффект также наблюдался в коре головного мозга и голубом пятне пациентов с болезнью Альцгеймера (данные не приведены). Не было обнаружено кажущейся (apparent) корреляции между Т14 в клеточных культуральных средах и уровнями Т14 в клеточном лизате, хотя наблюдалась значимая обратная корреляция при включении в анализ только четырех клеточных линий (см. Фигуру 6В, "темно-серая" группа). Более того, не было обнаружено кажущейся корреляции между Т14 в клеточных культуральных средах и уровнями AChE в клеточном лизате, даже если клеточные группы анализировать раздельно (см. Фигуру 6С).

Результаты ИФА

Уровни Т14 в клеточных лизатах и клеточных культуральных средах

Целью было определение уровней эндогенного Т14 в раковых клетках с различной способность, к метастазированию, любезно предоставленных проф. Крисом Пеппером (Prof. Chris Pepper, Cardiff University), как во внутриклеточном материале, выделенном из лизированных клеток, так и уровней Т14, высвобождаемого в питательную среду клеток (ССМ), с использованием метода ИФА. Этот метод использовал объединенные результаты определения общего белка (анализ Pierce) для определения количества Т14 в мкг на мг белка в образце. Результаты показывают высокую степень изменчивости уровней Т14 между клеточными линиями и между клеточными лизатами и клеточными средами в клеточных линиях, как показано на Фигуре 7.

Наибольшие уровни Т14 наблюдались в клеточном лизате клеточной линии MDA-MB, но эта же клеточная линия продемонстрировала относительно более низкие уровни Т14 в клеточных средах. Наибольшие уровни Т14 были у клеточной линии MCF-7, однако эта клеточная линия также имела одну из низших концентраций Т14 в клеточном лизате, позволяя предположить, что несмотря на высокую экспрессию Т14 в этой клеточной линии, его концентрация вне клеток приблизительно в 5 больше, чем в клетках. Только JJN3 и KG1a имели значимо различные уровни Т14 при сравнении внутриклеточных и внеклеточных уровней. В JJN3 наблюдался такой же профиль, как и в клеточной линии MDA-MB, со значительно большими внеклеточными уровнями Т14 по сравнению с внутриклеточными уровнями. Клеточная линия KG1a является единственной клеточной линией, демонстрирующей значительно более высокий уровень Т14 в клеточном лизате по сравнению со средой. Т14 в среде клеточной линии CLL был ниже предела детектирования для данного анализа.

Сравнение данных ИФА Т14 раковой клеточной линии с данными вестерн-блоттинга раковой клеточной линии

Используя результаты, полученные методом ИФА и при проведении вестерн-блоттинга, авторы изобретения сравнили показатели мкг Т14/мг белка и Т14/общий белок как в клеточных лизатах, так и в клеточных средах. Наблюдалась значимая обратная корреляция между уровнями Т14 по методу вестерн-блоттинга и Т14 по методу ИФА, измеренными в клеточных средах, а также в клеточном лизате, как видно на Фигуре 8.

Как клеточные среды, так и клеточные лизаты демонстрировали обратную корреляцию между уровнями Т14, измеренными методами вестерн-блоттинга и ИФА (Р<0,0001, R²=0,4956 и Р=0,0315, R²=0,1451, соответственно) после проведения линейно-регресионного анализа, отображаемую линиями наилучшего соответствия (сплошные линии) вместе с 95% доверительным интервалом (пунктирные линии).

Выводы

1) Т14, альфа-7 рецепторы и AChE все детектировались в раковых клетках, хотя и в разных количествах. Неожиданно, все три белка имели схожую подвижность, и их уровни позитивно коррелируют друг с другом, позволяя предположить, что они закомплексованы друг с другом.

2) Вне раковых клеток (а именно, в клеточных культуральных средах) детектировался только токсичный пептид Т14, a AChE и альфа-7 не высвобождались во внешнюю среду. Более того, уровни Т14 вне клеток были выше, чем внутри, для шести из семи раковых клеточных линий, позволяя предположить, что Т14 продуцируется для высвобождения из клетки. Кроме того, подвижность Т14 вне клетки отличалась от значений внутри клетки.

3) Интересно, что уровни Т14 вне раковых клеток имели значимую негативную корреляцию с уровнями альфа-7 рецептора в раковых клетках. Авторы изобретения постулировали, что этот факт может лежать в основе механизма болезни, поскольку он также имеет место в коре головного мозга и гомогенате голубого пятна пациентов с болезнью Альцгеймера (но не контрольных пациентов), у которых вместо этого существует положительная корреляция между Т14 и альфа-7. Авторы изобретения считают, что это может объясняться высокими концентрациями пептида Т14, приводящими к понижающей регуляции его рецептора-мишени у больных.

4) Уровни Т14 внутри и вне раковых клеток также измеряли методом ИФА. Уровни Т14 в средах раковых клеток и клеточных лизатах, измеренные методом ИФА, имели значимую обратную корреляцию с результатами вестерн-блоттинга. Это позволяет предположить, что ИФА может измерять мономеры Т14, в то время как вестерн-блоттинг измеряет уровни агрегатов Т14, и потому значения уровней являются взаимодополняющими.

Пример 2

Целью данного примера были исследования, с использованием метода вестерн-блоттинга, соотношения между маркером метастазирования CD44 и токсичным пептидом Т14, AChE и альфа-7 рецептором в мембранной и цитозольной фракциях шести раковых клеточных линий (JJN3, MDA-MB231, MCF-7, KG1a, МЕС-1, Н929) и одной клеточной линии, производной от раковой (PC12).

Результаты вестерн-блоттинга

Качественные данные показали, что, в мембранной фракции всех клеточных линий, CD44, AChE и Т14 все имеют схожую подвижность (как показано на Фигуре 9А, С, Е), но альфа-7 демонстрирует другую подвижность белка (см. Фигуру 9G). Такое же соотношение между CD44, AChE и T14 было обнаружено в цитозольной части всех клеточных линий (см. Фигуру 9В, D, F), причем альфа-7 снова был исключением (см. Фигуру 9Н).

Затем, проводили количественное определение уровней всех четырех пептидов/белков (CD44, AChE, альфа-7 и Т14) и нормировали по уровню общего белка (Colins et al., 2015). Количественные данные показали, что сильно метастатичные раковые клеточные линии (KG1a, MDA-MB231, МЕС-1) имели больше пептидов/белков в своих мембранах по сравнению с цитозолем, в то время как слабо метастатичные раковые клеточные линии/клеточная линия, производная от раковой (JJN3, Н929, MCF-7 и PC12) продемонстрировали переменные соотношения между мембранными и цитозольными пептидами/белками (см. Фигуру 10).

Самое важное, что уровни маркера метастазирования CD44 значимо и позитивно коррелируют с AChE как в мембранной (см. Фигуру 11А), так и в цитозольной фракциях (см. Фигуру 11В), а также с Т14 как в мембранной (Фигура 11С), так и в цитозольной фракциях (Фигура 11D). Более того, AChE и уровни Т14 значимо и позитивно коррелируют друг с другом как в мембранной (Фигура 11Е), так и в цитозольной фракциях (Фигура 11F). Эти результаты позволяют со значительной степенью уверенности предположить, что AChE и Т14 оба являются надежными предикторами степени метастазирования рака, и возможно, ключевыми (pivotal) молекулярными посредниками. Таким образом, блокирование сигнальной активности AChE и Т14 может быть использовано в качестве противораковой терапии.

Выводы

1) В шести раковых клеточных линиях и клетках PC12, маркер метастазирования (CD44) значимо и позитивно коррелирует с токсичной молекулой Т14, а также с AChE.

2) Эта корреляция имеет место как для мембраны раковой клетки, так и в цитозоле раковой клетки.

3) Этот результат позволяет предположить, со значительной долей уверенности, что Т14 и AChE являются надежными предикторами степени метастазирования рака и, возможно, ключевыми молекулярными посредниками.

Пример 3 - ИФА Т14 - когорта CLL (хронический лимфоцитарный лейкоз)

Четко определив роль Т14 в метастазировании рака, авторы изобретения исследовали, с использованием ИФА, потенциал Т14 в качестве биомаркера рака и его связь с выживаемостью пациентов.

Материалы и методы

Антитело Т14: Антитело было синтезировано фирмой Genosphere Biotechnologies (Paris, France). Использовали двух новозеландских кроликов с четырьмя иммунизациями пептидом гемоцианина морского блюдечка (KLH) (Т14-гаптен: CAEFHRWSSYMVHWK (SEQ ID No: 7); С был включен для связывания с KLH в качестве иммуногена) на протяжении 70 дней. У животных четыре раза брали кровь и взятые образцы объединяли. Антисыворотку затем пропускали через гравитационную колонку с ковалентно связанными пептидом-носителем и, после промывки, антитела элюируют в кислотном буфере и раствор нейтрализуют. Процесс завершают дополнительный диализ против фосфатно-солевого буфера (PBS) и лиофилизация.

ИФА антитела пептида Т14: Построение калибровочных кривых и измерения образцов проводят с тремя параллельными измерениями. Образцы сыворотки человека разбавляют 1:10000, и калибровочную кривую для определения относительного содержания Т14 в образцах разбавляют PBS-буфером. Калибровочная кривая охватывает диапазон концентраций от 3,3 до 40 нМ Т14. Вкратце, 96-луночные иммунопланшеты (NUNC) покрывают образцом или стандартом Т14 из расчета 100 мкл/лунку, закрывают парафильмом и инкубируют в течение ночи при 4°С. На следующий день образец удаляют стряхиванием планшета над раковиной с проточной водой и прибавляют 200 мл блокирующего раствора, содержащего 2% бычьего сывороточного альбумина (БСА) в Tris-буферном солевом растворе и Tween 20 (TBS-T) и инкубируют в течение 4 ч при комнатной температуре. Блокирующий раствор затем удаляют и прибавляют 100 мкл антитела, разбавленного блокирующим раствором до 1 мкг/мл, и инкубируют в течение ночи при 4°С. Первичной антитело удаляют на следующий день и лунки промывают 3 раза 200 мкл TBS-T. Затем прибавляют 100 мл вторичного конъюгированного с ферментом антитела, разбавленного блокирующим раствором до 0,1 мг/мл и инкубируют в течение 2 ч при комнатной температуре; планшет во время всех инкубирований закрывают парафильмом. Через 2 ч, планшет промывают 4 раза TBS-T. Прибавление 3,3,5,5-тетраметилбензидина запускает цветную реакцию. Реакцию останавливают через 30 мин останавливающим раствором, содержащим 2М H₂SO₄, и измеряют поглощение при 450 нм с помощью планшет-ридера Versamax (Molecular Devices, Wokingham, UK).

Анализ: Результаты анализа регистрируют в произвольных единицах оптической плотности (OD). Значение OD для холостого образца вычитают из сигнала каждого образца перед проведением анализа. OD каждого анализируемого образца сравнивают с базовым значением наименьшей известной концентрации Т14 на калибровочной кривой. Оптическая плотность может быть затем представлена по отношению к известному сигналу, и зарегистрирована как пропорциональная часть этого сигнала. Все образцы сравнивали по их относительному уровню Т14, поскольку прямой отсчет по калибровочной кривой еще не возможен в данном методе для образцов крови человека. Группирование образцов в группы "высокие", "средние/высокие", "низкие/средние" и "низкие" определяется по расстоянию относительного значения от среднего значения для когорты в целом. Поскольку значения имеют нормальное распределение, все значения в пределах стандартного отклонения, равного 1, от среднего значения, находятся в среднем диапазоне, и обозначаются как "средние/высокие", если они выше среднего значения, или "низкие/средние", если они ниже среднего значения. "Низкими" являются значения Т14, которые ниже среднего значения, и выходят за пределы стандартного отклонения. Наоборот, "высокими" являются значения выше среднего значения, и также выходящие за пределы стандартного отклонения.

Результаты и обсуждение

На Фигуре 23 изображена столбчатая диаграмма диапазонов значений уровней Т14, измеренных методом ИФА, по сравнению с известной концентрацией экзогенного Т14. Пациенты ранжированы по относительным концентрациям Т14 в исследованной когорте пациентов с хроническим лимфолейкозом.

На Фигуре 24, приведена таблица значений Т14, измеренных методом ИФА по сравнению с известной концентрацией экзогенного Т14 в исследованной когорте пациентов с хроническим лимфолейкозом, и статистическое группирование.

На Фигуре 25 представлены значения ИФА в 2 разных группах, разделенных по относительной концентрации Т14, проанализированной статистическими методами с использованием анализа методом Каплана-Мейера, проведенного для 100 образцов сыворотки CLL.

На Фигуре 26 представлены значения ИФА в 4 разных группах, разделенных по относительной концентрации Т14, проанализированной статистическими методами с использованием анализа методом Каплана-Мейера, проведенного для 100 образцов сыворотки CLL.

Пример 4 - Данные вестерн-блоттинга раковых образцов (когорта CLD)

Определив роль Т14 в метастазировании рака, авторы изобретения исследовали, с использованием вестерн-блоттинга, потенциал Т14 в качестве биомаркера рака и его связь с выживаемостью пациентов.

Материалы и методы

Образцы: В общей сложности у 100 пациентов с хроническим лимфоцитарным лейкозом (CLL) брали сыворотку до начала их лечения и затем проводили лечение и осуществляли мониторинг в течение 16 лет.

Вестерн-блоттинг: Концентрации белка определяют в вышеописанных образцах сыворотки с использованием системы для анализа белков Pierce™ 660 nm Protein Assay (Thermo Scientific, 22660). Затем, проводили анализ образцов методом вестерн-блоттинга с использованием ранее разработанного метода [Garcia Rates et al., 2016 -

S., Morrill, P., Tu, H., Pottiez, G., Badin, A., Tormo-Garcia, C, Heffner, C, Coen, C. and Greenfield, S. (2016)

pharmacological profiling of a novel modulator of the α7 nicotinic receptor: Blockade of a toxic acetylcholinesterase-derived peptide increased in Alzheimer brains', Neuropharmacology, doi: 10.1016/j.neuropharm.2016.02.006.]. Используемыми первичными антителами было анти-Т14 антитело (1:1000) [Garcia Rates et al., 2016]. Используемым вторичным антителом было козье анти-кроличье антитело, конъюгированное с пероксидазой хрена (Abcam, ab6721, 1:5000). Проводили количественное определение белковых зон, полученных из клеточных лизатов с использованием (программы) ImageJ, измеряя общую оптическую интенсивность, и затем нормировали по уровням общего белка с использованием Blot FastStain для контроля погрешности загрузки (loading error).

Анализ данных: Значения Т14 50 кДа/общий белок (TP) ранжировали от низких до высоких и рассчитывали медиану. Затем значения были разделены на две группы, где "светло-серая" группа содержала значения ниже медианы, и "темно-серая" группа содержала значения выше медианы (Фигура 28). Наконец, проводили анализ методом Каплана-Мейера двух вышеуказанных групп. Анализ позволяет оценить эффект лечения на число субъектов, выживших или спасенных после такого лечения в течение периода времени (TTFT: время до первого лечения). Кривую выживания рассчитывают путем вычисления вероятностей наступления события в определенный момент времени и умножения этих последующих вероятностей на ранее вычисленные вероятности для получения окончательной оценки.

Результаты

На Фигуре 27 представлена таблица с исходными значениями Т14 50 кДа, нормированными по общему белку для 100 образцов сыворотки от пациентов с лейкозом, определенными методом вестерн-блоттинга (WB), разделенными (на) группы ниже и выше медианы.

На Фигуре 28, анализ методом Каплана-Мейера, проведенный для двух групп, продемонстрировал высокую прогностическую значимость в этой когорте. Пациенты с значениями сывороточного Т14 50 кДа/общий белок (TP) меньше медианы ("светло-серая" группа) имели в 2,37 раза большую вероятность необходимости в лечении в единицу времени, чем у пациентов с значениями сывороточного Т14/общий белок (TP) выше медианы ("темно-серая" группа), как проиллюстрировано отношением рисков (HR=2,37, Р=0,01, Фигура 42). Более того, этот анализ выживания показал, что значения Т14 50 кДа/общий белок (TP) являются прогностическими для TTFT. Оценочное значение медианного времени выживания не было достигнуто для группы низкого риска и составляло 8,05 лет для группы высокого риска.

Обсуждение

Авторы изобретения ранее показали, что Т14 задействован в механизме рака и является надежным биомаркером рака. Таким образом, Т14 вместе с обычными прогностическими инструментами может предсказывать выживание пациента и время до первого лечения.

Заключение

В заключение, вестерн-блоттинг неожиданно оказался надежным методом детектирования статуса при лейкозе. Однако, хотя в настоящее время данные ИФА не могут достоверно использоваться в качестве клинического показания, они могут тем не менее выявить базовый (underlying) механизм, медиирующий миграцию клеток.

Пример 5 - Конструирование и продуцирование пептидомиметиков ингибиторов T14

Авторы изобретения сконструировали и синтезировали соединения-пептидомиметики, которые ингибируют активность Т14, и тем самым успешно конкурируют с T30 за аллостерический активный сайт никотинового рецептора.

Соединение 1 -Tri02 (Оценка: - 10.2)

4-((S)-2((S)-2-ацетамидо-3-(нафталин-2-ил)пропанамидо)-3-(((S)-1-амино-3-(1Н-индол-3-ил)-1-оксопропан-2-ил)амино)-3-оксопропил)бензенаминий

Соединение 2 - Tri04 (Оценка: - 9.4)

4-((S)-2-((S)-2-((S)-2-ацетамидо-3-(4-бензоилфенил)пропанамидо)-6-((амино(иминио)метил)амино)гексанамидо)-3-амино-3-оксопропил)бензенаминий

Пример 6 - Синтез идентифицированных соединений

Материалы и методы

Соединения-ингибиторы Т14 1 и 2 (Tri 02 и Tri 04) из Примера 5 были синтезированы фирмой Genosphere Biotechnologies и проанализированы на чистоту методом обращенно-фазовой ВЭЖХ (RP-HPLC) (чистота>99%), и на массу методом масс-спектроскопии (средний результат МС (MS) 604,79 для Tri02 и 628,83 для Tri04).

Краткое постадийное описание синтеза Tri02 - Последовательность: [ацетил]-[2Nal][4nh2-F]-Trp-[амид]

1) Boc-Trp-OH+ClooEt+NH3.H2O------Boc-Trp-NH2, реакция в ТГФ, экстрагирование уксусным эфиром.

2) Boc-Trp-NH2,4NHcl, удаление Boc-, получение H-Trp-NH2.HCl, реакция осаждения диэтиловым эфиром.

3) (2-Naphtyl)-Ala+уксусный ангидрид----Ас-(2-нафтил)-Ala-OH, реакция ТГФ/H2O, экстрагирование уксусным эфиром.

4) Boc-(4-NH2)-Phe-OH+H-Trp-NH2.Hcl----Boc-(4-NH2)-Phe-Trp-NH2, реакция в ДМФ, экстрагирование уксусным эфиром.

5) Boc-(4-NH2)-Phe-Trp-NH2,4NHcl, удаление Boc-, получение H-(4-NH2)-Phe-Trp-NH2.Hcl, реакция осаждения диэтиловым эфиром.

6) Ас-(2-нафтил)-Ala-ОН+Н-(4-NH2)-Phe-Trp-NH2.Hcl--Ас-(2-нафтил)-Ala-(4-NH2)-Phe-Trp-NH2 реакция в ДМФ, экстрагирование уксусным эфиром.

7) Очистка

Краткое постадийное описание синтеза TRI04 - Последовательность: [ацетил] -[bpa]R[4NH2-F]- [амид]

1) Смолу Rink Amide МВНА замачивают в ДХМ (DCM) на 30 мин, откачивают досуха, промывают ДМФ 3 раза, откачивают досуха.

2) Прибавляют Fmoc-(4-NH2)Phe-OH, DIEA (диизопропилэтиламин), HBTU, ДМФ, N2, проводят реакцию в течение 30 мин, откачивают досуха, промывают ДМФ 6 раз, откачивают досуха.

3) Прибавляют пиперидин/ДМФ для удаления Fmoc-, продолжительность реакции 20 мин, откачивают досуха, промывают ДМФ 3 раза, откачивают досуха.

4) Прибавляют Fmoc-Arg(Pbf)-OH, DIEA, HBTU, ДМФ, N2, реакция в течение 30 мин, откачивают досуха, промывают ДМФ 6 раз, откачивают досуха.

5) Повторяют стадию 3.

6) Прибавляют Fmoc-Bpa-OH, DIEA, HBTU, ДМФ, N2, реакция в течение 30 мин, откачивают досуха, промывают ДМФ 6 раз, откачивают досуха.

7) Повторяют стадию 3.

8) Прибавляют уксусный ангидрид/ДМФ, N2, реакция в течение 30 мин, откачивают досуха, промывают ДМФ 3 раза, откачивают досуха, промывают DCM 3 раза, откачивают досуха, промывают МеОН 3 раза, откачивают досуха.

9) Пептид отщепляют от смолы, откачивают досуха, реакция осаждения диэтиловым эфиром, получают неочищенный пептид, центробежная сушка.

10) Очистка

Пример 7 - Сравнение T30 и Т14:

На Фигуре 29 (43) представлена первоначальная работа авторов изобретения, проведенная с 14-мером Т14, продемонстрировавшая его трофическую токсичность в ряде препаратов. Хотя активная последовательность AChE-пептида может быть соотнесена с конкретной 14 аминокислотной последовательностью, начинающейся на С-терминальном конце AChE (Т14) (Greenfield, 2013 - Greenfield, S.A. (2013)

and targeting the basic mechanism of neurodegeneration: The role of peptides from the c-terminus of acetylcholinesterase: Non-hydrolytic effects of ache: The actions of peptides derived from the c-terminal and their relevance to neurodegeneration', Chemico-biological interactions. 203(3), pp. 543-6. doi: 10.1016/j.cbi.2013.03.015), использовавшийся впоследствии для исследований экзогенный AChE-пептид представлял собой состоящий из 30 аминокислот пептид (T30), содержащий активный Т14-мотив: больший по размеру T30 имеет меньшую склонность к образованию фибрил в растворе, благодаря чему обладает большей стабильностью и большей эффективностью, чем Т14 (Bond et al., 2009 - Bond, С, Zimmermann, M. and Greenfield, S. (2009)

of alpha7 Nicotinic receptors by Acetylcholinesterase c-terminal peptides', PloS one., 4(3). doi: 0.1371/jouPHKl.pone.0004846).

Таким образом, в данных исследованиях использовался пептид T30 (Badin, A.S., Morrill, P., Devonshire, I., Greenfield, S.A., 2016 Jan 7. (II) Physiological profiling of an endogenous acetylcholinesterase-derived peptide in the basal forebrain: age-related bioactivity and blockade with a novel modulator. Neuropharmacology. 105, 47e60). 15 аминокислотных остатков на С-конце T30, (обозначенные)

использовались в качестве контроля, поскольку они оказались инертными сами по себе и потому не участвовали в биоактивности Т14. Более того, было продемонстрировано, что эффективность самого Т14 нуждается в связывании антитела с терминальным лизином на С-конце, который становится недоступным (would not be exposed) в более длинной последовательности T30. Таким образом, T30 полезен для исследования эффектов экзогенного пептида или его эндогенного аналога.

В заключение, T30 представляет собой удобный экспериментальный инструмент для исследования трофических токсичных эффектов, обеспечения инертного контроля, и обеспечения возможности для антитела детектировать эндогенный Т14 без перекрестного загрязнения экзогенным (T30) пептидным зондом. Соответственно, любые данные, показывающие ингибирование активности T30, являются демонстрацией того, что активность Т14 также ингибируется.

Пример 8 - Оценка соединения 1 (Tri02) и соединения 3 (Tri04) в клеточных культурах

Авторы изобретения испытали T30, NBP-14 и Tri02 в исследованиях клеточных культур для определения их влияния на активность ацетилхолинэстеразы и приток кальция, и влияния Tri04 на приток кальция.

Материалы и методы

1. Анализ активности AChE

Активность AChE измеряют с использованием реагента Эллмана, который измеряет присутствие тиольной группы вследствие активности AChE. В случае эксперимента с G4, активность AChE (G4) анализировали отдельно, а также вместе с пептидами NBP14 или Tri. Клетки PC12 высеивали за день до эксперимента, как для анализа жизнеспособности клеток. Клетки обрабатывают T30 (1 мкМ), одним или или в комбинации с пептидом NBP14 или Tri (0,5 мкМ). После обработки, супернатант (перфузат) каждой обработки собирают и 25 мкл из каждого эксперимента (condition) прибавляют на новый плоскодонный 96-луночный планшет с последующим прибавлением 175 мкл реагента Эллмана (Раствор А: KH₂PO₄ 139 мМ и K₂HPO₄ 79,66 мМ, рН 7,0; раствор В (субстрат): ацетилтиохолина йодид 11,5 мМ; Раствор С (реагент): 5, 5'-дитиобис(2-нитробензойная кислота) 8 мМ и NaHCO₃ 15 мМ). Реагент Эллмана готовят в виде смеси 3 растворов в соотношении 33(А):3(В):4(С). Измерения поглощения проводят в течение периода времени 60 минут для параллельных экспериментов при 405 нм на планшет-ридере Vmax (Molecular devices, Wokingham, UK).

2. Флуорометрия кальция

Клетки PC12 высеивают в 200 мкл модифицированной по Дульбекко среды Игла (DMEM) плюс 2 мМ L-глутамина за день до эксперимента на 96-луночных планшетах. В день эксперимента, готовят раствор Fluo-8 (Abcam), как описано поставщиком, путем прибавления 20 мкл Fluo-8 в буфер для анализа, содержащий 9 мл сбалансированного солевого раствора Хенкса (HBSS) и 1 мл плюроника F127 Plus. Затем удаляют 100 мкл питательной среды и прибавляют 100 мкл раствора Fluo-8. Прибавляют тестируемые растворы для обработки T30 в сочетании с пептидами NBP14 или Tri и инкубируют в течение 30 минут в термостате и 30 минут (при) комнатной температуре. Через 1 ч планшет помещают во флуоресцентный планшет-ридер (Fluostar, Optima, BMG Labtech, Ortenberg, Germany). Перед считыванием флуоресценции, готовят PNU282987 1 мкМ, альфа7-специфиический агонист никотиновых рецепторов, и помещают в инжектор Fluostar. Для каждой лунки, считываемые показания сформированы из базового считывания флуоресценции с последующим впрыскиванием PNU282987, который индуцирует прирост кальция посредством никотиновых рецепторов.

3. Анализ данных

В каждой из различных клеточных методик, проводят статистический анализ средних процентных значений 3 или больше экспериментов. Сравнения между группами разных видов обработки (multiple treatment) и одним контролем проводят путем однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) и тестов с апостериорным критерием Тьюки с использованием прикладной программы GraphPAD Instat (GraphPAD software, San Diego, CA). Статистическую значимость определяют при значении р<0,05.

Результаты

Результаты для Tri02 представлены на Фигурах 12 и 13, на которых значения n, указанные на последующих графиках, относятся к числу повторных экспериментов. Как видно, 1 мкМ T30 увеличивает приток кальция и активность AChE и, как было показано в предшествующей работе (см. WO 2005/004430), 1 мкМ NBP14 защищает от этих токсичных эффектов.

Кроме того, как видно на фигурах, Tri02 также несомненно защищает от токсичных эффектов T30, уменьшая как приток кальция, так и активность AChE. Фактически, авторы изобретения убеждены в том, что Tri02 выступает в роли ингибитора активности Т14 и может быть использован для лечения рака или метастазирования (metastasis).

Результаты для Tri04 в клеточной культуре PC12 представлены на Фигуре 19. Клетки были получены из клеточной линии PC12, происходящей от опухоли надпочечника, и выступали в качестве нейронов (Bornstein et al., Mol. Psychiatry (2012), 17, 354-358). Как видно, Tri04 также защищает (от) токсичных эффектов T30 путем уменьшения притока кальция в эти клетки, что указывает на его действие как ингибитора Т14 и, таким образом, может быть использован для лечения рака или метастазирования.

Пример 9 - Оценка соединения 1 в срезах мозга

Авторы изобретения провели исследования с испытанием NBP-14 и Tri02 в срезах мозга с использованием визуализации потенциал-чувствительным красителем (VSDI).

Материалы и методы

1. Приготовление срезов мозга

Самцов крыс Wistar (в возрасте 14 дней) анестезировали с помощью изофлурана (ок. 15 мл, 100% мас./мас.). Изофлуран наносили на хлопковую подстилку на дне камеры для анестезирования (стеклянный ящик размером 20×15×15 см), в который затем помещали крыс приблизительно на 45 с достижения полной анестезии. Заднюю лапу каждой анестезированной крысы прищемляют для проверки требуемой глубины наркоза. После подтверждения анестезии, крыс быстро обезглавливают, мозг быстро извлекают и погружают в охлаждаемый льдом оксигенированную искусственную спинномозговую жидкость для приготовления срезов (aCSF, в ммоль: 120 NaCl, 5 KCL, 20 NaHCO₃, 2,4 CaCl₂, 2 MgSO₄, 1,2 KH₂PO₄, 10 глюкозы, 6,7 HEPES-соли и 3,3 HEPES-кислоты; рН=7,1). Затем делают фронтальные срезы (толщиной 400 мкм) блоков с мозгом, содержащих базальные отделы переднего мозга, а именно комплекс MS-dBB (медиальный септум, диагональный пучок Брока) (между + 9,20 и + 9,48 мм интераурального интервала (Interaural) и +0,48 и +0,2 мм брегмы, Фигура 4А) и бочонковое поле соматосенсорной коры (S1BF, между +8,08 и +7,20 мм интераурального интервала и -0,92 мм и -1,80 мм брегмы) (Paxinos and Watson, 1998) с использованием Vibratome (Leica VT1000S). Срезы затем переносят в барботер, содержащий оксигенированный aCSF при комнатной температуре (aCSF для регистрации, в ммоль: 124 NaCl, 5 KCL, 20 NaHCO₃, 2,4 CaCl₂, 2 MgSO₄, 1,3 KH₂PO₄, 10 глюкозы; рН=7,4) который был идентичен используемому при регистрации визуализации потенциал-чувствительным красителем (VSDI). Срезы затем оставляли на приблизительно 1-1,5 часов перед их подготовкой к окрашиванию потенциал-чувствительным красителем (VSD).

2. Параметры VSD

Срезы помещают в темную камеру с высокой влажностью, наполненную aCSF, барботируемым 95% O2, 5% CO₂. После помещения в камеру, на срезы наносят раствор красителя (4% 0,2 мМ стириловый краситель пиридиния 4-[2-[6-(дибутиламино)-2-нафталенил]этенил]-1-(3-сульфопропил)гидроксид (Di-4-NEPPS), Invitrogen, Paisley, UK в 48% aCSF, 48% сыворотка плода коровы, 3,5% ДМСО и 0,4% кремофора EL) (Tominaga et al., 2000) на 20-25 минут перед переносом назад в барботер, содержащий оксигенированный aCSF, при комнатной температуре на 30 минут.

Для начала регистрации VSDI, срезы помещают в кювету для регистрации на маленький кусочек фильтровальной бумаги для обеспечения потока оксигенированного aCSF с нижней стороны среза поддержания его жизнеспособности. Срез затем придавливают самодельной (home-made) пластиковой сеткой, которую размещают поверх среза. Перфузионный раствор нагревают до 30±1°С с помощью нагревательной пластины (stage heater). Концентрический биполярный стимулирующий электрод (FHC, Maine, USA) помещают в вентральный диагональный пучок базальных отделов переднего мозга со стимуляцией, установленной на 30 В. Для регистрации данных VSD, записывают 2-мерные изображения, эквивалентные 88x60 пикселей, с использованием камеры высокого разрешения MiCam02 High Resolution (Brain Vision, Japan) с программой визуализации BV_Analyze. регистрация изображений была сопряжена с прикладной программой Spike2 V4.23 (CED Ltd, Cambridge, UK) для синхронизации (to align) регистрации изображений с протоколом стимуляции (30 повторов через каждые 28 с) с помощью Micro 1401 MkII (CED Ltd, Cambridge, UK). Свет генерировали с помощью лампы Osram halogen xenophot 64634 HLX EFR Display/Optic и фильтровали для эмиссии зеленого света (530±10 нм) с использованием MHF-G150LR (Moritex Corporation), сопряженного с системой визуализации высокого разрешения MiCam02 и фильтровали излучаемую флуоресценцию через фильтр верхних частот >590 нм.

3. Приготовление и применение лекарственного средства

Состоящий из 30 аминокислот С-концевой пептид ацетилхолинэстеразы (AChE) (T30; последовательность:

- KAEFHRWSSYMVHWKNQFDHYSKQDRCSDL - SEQ ID No: 2), циклический вариант активной состоящей из 14 аминокислот области T30 (NBP14; последовательность: c[AEFHRWSSYMVHWK] - SEQ ID No: 3; c[] = циклический, от N-конца к С-концу), и инертный состоящий из 15 аминокислот пептид, входящий в состав последовательности T30 (Т15; последовательность:

- NQFDHYSKQDRCSDL - SEQ ID No: 4) были синтезированы на заказ и приобретены у фирмы Genosphere Biotechnologies (Paris, France) с чистотой >99%. Линейный пептидомиметик Tri02 был сконструирован in silico фирмой Iproteos (Barcelona, Spain) и синтезирован и приобретен у Genosphere Biotechnologies с чистотой >99%. Все маточные растворы лекарственных средств и пептидов были приготовлены в виде замороженных аликвот перед проведением экспериментов. Для приготовления перфузионных растворов, маточные растворы оттаивали и прибавляли к aCSF для регистрации, в зависимости от конкретного случая, и подавали в ванну с постоянной скоростью перфузии 1,5 мл/мин с использованием перистальтического насоса Minipulse 3 (Gilson Scientific Ltd., Bedfordshire, UK). Каждый эксперимент продолжался 52 минуты - 20 минут для установления базового регистрируемого значения (перфузия одной лишь aCSF для регистрации), 12 минут для прохождения перфузии раствора лекарственного средства в ванну, а также для возврата молекул красителя (to reseat themselves) в клеточные мембраны и, наконец, 20-минутный период регистрации измерений ответа в присутствии раствора лекарственного средства.

4. Анализ данных и статистика

Из 2-мерных изображений, полученных для каждых условий эксперимента с лекарственным средством (drug condition), были извлечены критические данные, такие как динамика (time-course) активации, интенсивность и распространение общего сигнала флуоресценции. Эти данные обрабатывали с использованием специального скрипта для преобразования файлы, пригодные для применения в программе MatLab (Mathworks Inc. Massachusetts, US), и затем анализировали с использованием инструментальных средств Matlab, специально разработанных для анализа данных VSDI (Bourgeois et al., 2014). Эти инструментальные средства позволяют выбрать постоянную геометрию изучаемой области (ROI), которая может быть применена к каждому срезу, для извлечения и сопоставления данных от идентичных ROI для всех срезов, используемых в каждом эксперименте. Для срезов базального переднего мозга используемым ROI будет комплекс MSdBB, выбранный таким образом, чтобы он охватывал MS (медиальные септальные ядра), VDB (вентральный диагональный пучок) и HDB (горизонтальный диагональный пучок). Более важно, чтобы эта ROI была выбрана так, чтобы она полностью включала вызываемый ответ. Этот ответ может быть представлен графически в виде одиночного усредненного временного ряда (single averaged time series) или в пространстве и времени на "пространственно-временной карте", позволяющей проводить качественное описание данных. Однако для получения количественно определяемых значений рассчитывали площадь под временным рядом (суммарное относительное изменение флуоресценции) от момента стимуляции (t=0) до 156 мс после него. Из-за дисперсии ответов, наблюдающихся для каждого отдельного среза, необработанные данные, полученные в каждом эксперименте, нормировали по его собственному базовому значению для получения нормированных значений флуоресценции. Этот метод количественного определения был выбран с целью учета множества компонентов сигнала, генерируемого VSDI (Chemla and Chavane, 2010), a именно непосредственный пик и длительный латентный отклик (Badin et al., 2016). Статистическая обработка проводилась в программе Prism Graphpad 6.

5. Анализ модуляторных пептидов

Во всех экспериментах, в которых использовался T30, наблюдалось увеличение или уменьшение сигнала. Таким образом, после усреднения всех этих результатов детектируемого изменения не наблюдали. Однако, с учетом ранее наблюдавшихся модуляторных эффектов этого пептида в различных препаратах (Bon and Greenfield, 2003, Day and Greenfield, 2004, Greenfield et al., 2004, Badin et al., 2013) и того факта, что изменения, индуцируемые применением T30 в этом типе препаратов, имеют умеренно негативную корреляцию (r=-0,4286, р=0,0257, коэффициент ранговой корреляции Спирмена, n=27, Фигура 13А) с базовой интенсивностью реакции, было решено, что эти результаты нужно дихотомизировать в зависимости от того, что наблюдается - увеличение или уменьшение.

Затем проводился аналогичный корреляционный анализ для каждого эксперимента, в котором прибавляли экзогенное соединение (Фигура 16). При определении значимой корреляции, данные затем категоризировали в зависимости от наблюдавшегося увеличения или уменьшения.

Результаты

На Фигурах 14 и 15, прибавление 4 мкМ Tri02 повторяет результаты, наблюдавшиеся при применении 4 мкМ NBP14.

На Фигуре 14, прибавление NBP14 (4 мкМ) к перфузату индуцировало небольшие незначимые изменения величины (суммарной флуоресценции) вызванных ответов. Несмотря на их незначительность, для этих небольших индуцируемых изменений была определена обратная корреляция с величиной базового ответа; в результате, данные были разделены на испытания, которые привели к небольшим уменьшениям (левые гистограммы), и испытания, которые вызвали увеличения (правые гистограммы), в форматах как реальных (сверху), так и нормированных (внизу) данных. При совместном рассмотрении, набор данных не демонстрирует отклонения от базового уровня (поскольку увеличения и уменьшения уравновешивают друг друга), но было необходимо убедиться в том, что NBP14 не индуцирует значимых эффектов, даже при раздельном анализе изменений флуоресценции.

Как показано на Фигуре 15, прибавление Tri02 (4 мкМ) к перфузату индуцировало незначительные изменения величины (суммарной флуоресценции) вызванных ответов, причем индуцируемые уменьшения (n=8 из всего 11) демонстрировали значимое отклонение от нормированного базового уровня (нижняя левая гистограмма, p<0,05). Для этих изменений также была определена обратная корреляция с величиной базового ответа;

в результате, данные были разделены на испытания, которые привели к уменьшению (левые гистограммы), и испытания, которые вызвали увеличения (правые гистограммы), в форматах как реальных (сверху), так и нормированных (внизу) данных. При совместном рассмотрении, набор данных не демонстрирует отклонений от базового уровня (поскольку увеличения и уменьшения уравновешивают друг друга), но было необходимо убедиться в том, что NBP14 не индуцирует значимых эффектов, даже при раздельном анализе изменений флуоресценции.

Анализ модуляторных пептидомиметиков

На Фигуре 16 представлен корреляционный анализ данных для Tri02 (4 мкМ) и T30 (2 мкМ) (n=15), показывающий, что их совместная перфузия индуцирует некоторые изменения в величине вызванных ответов, причем некоторые срезы проявляют небольшое увеличение активности (n=6), в то время как большая их часть демонстрирует небольшое уменьшение (n=9). Эта корреляция была определена как значимая (р=0,0405; r²=-0,534), обосновывая разделение данных на демонстрирующие увеличение и уменьшение вызванной активности в результате применения Tri02 и T30, так же, как это было сделано для прибавления NBP14 и Tri02 (Фигуры 14 и 15, соответственно).

На Фигуре 17 показана количественная оценка эффектов, медиируемых прибавлением Tri02 и T30: В случае индуцируемых как увеличений, так и уменьшений, Tri02 не продемонстрировал защиты от индуцируемых T30 отклонений от базового уровня, при значимых уменьшениях (левая панель, р<0,01, n=9) и увеличениях (правая панель, р<0,05, n=6), найденных для общего эффекта.

Как показано на Фигуре 18, обобщенный линейный график нормированных по базовому уровню эффектов для экспериментов по испытанию эффектов нормальной aCSF (черная линия), 2 мкМ T30 (красные линии), T30 (2 мкМ) и 4 мкМ NBP14 (синие линии), T30 (2 мкМ) и 4 мкМ Tri02, экспериментов с контролем NBP14 (4 мкМ) (Фигура 11, оранжевые линии), экспериментов с контролем Tri02 (4 мкМ) (Фигура 15, фиолетовые линии). Этот график демонстрирует нормированное уменьшение по сравнению с базовым уровнем и друг с другом, причем отдельно взятый T30 индуцирует наибольшее отклонение, и Tri02 демонстрирует определенную эффективность блокирования такого T30-индуцируемого отклонения, но со значимыми изменениями, происходящими при их совместной перфузии (зеленые линии).

Пример 10 - Оценка соединения 2 в срезах мозга

Авторы изобретения провели исследования по тестированию Tri04 в срезах мозга с использованием визуализации потенциал-чувствительным красителем (VSDI).

Материалы и методы

1. Препараты срезов мозга

Срезы мозга готовят, как в Примере 8.

2. Параметры VSD

Срезы помещают в темную камеру с высокой влажностью, наполненную aCSF, барботируемым 95% O₂, 5% CO₂. После помещения в камеру, на срезы наносят раствор красителя (4% 0,2 мМ стириловый краситель пиридиния 4-[2-[6-(дибутиламино)-2-нафталенил]этенил]-1-(3-сульфопропил)гидроксид (Di-4-ANEPPS), Invitrogen, Paisley, UK в 48% aCSF, 48% сыворотка плода коровы, 3,5% ДМСО и 0,4% кремофора EL) (Tominaga et al., 2000) на 20-25 минут перед переносом в барботер с aCSF (комнатная температура, 22+/-1,5°С) на 1 ч для отмывки избытка красителя и восстановления.

Для начала регистрации VSDI, срезы помещают в кювету для регистрации на маленький кусочек фильтровальной бумаги для поддержания жизнеспособности среза и придавливают соответствующим образом самодельной пластиковой сеткой, размещаемой поверх среза. Перфузионный раствор нагревают до 30+/-1°С с помощью нагревательной пластины. Концентрический биполярный стимулирующий электрод (FHC, Maine, USA) помещают в вентральный диагональный пучок базальных отделов переднего мозга со стимуляцией, установленной на 30 В. Для регистрации данных VSD, записывают 16-битные изображения с разрешением 1 мс с помощью цифровой камеры (Brain Vision MiCAM Ultima R3-V20 Master) с программой визуализации Ultima 2004/08 (Brain Vision), сопряженной с программой Spike 2 V6.0 (CED Ltd, Cambridge, UK), которая использовалась для инициирования стимуляции по соответствующим ISI. Для регистрации данных VSD, свет генерировали с помощью лампы Osram halogen xenophot 64634 HLX EFR Display/Optic и фильтровали для эмиссии зеленого света (530+/-10 нм) с использованием MHF-G150LR (Moritex Corporation), сопряженного с системой сверхбыстрой визуализации MiCAM Ultima и фильтровали излучаемую флуоресценцию через фильтр верхних частот >590 нм.

Линейный пептидомиметик, Tri04, был разработан in silico фирмой Iproteos (Barcelona, Spain) и синтезирован и приобретен у фирмы Genosphere Biotechnologies с чистотой >99%. Все маточные растворы лекарственных средств и пептидов были приготовлены в виде замороженных аликвот перед проведением экспериментов. Для приготовления перфузионных растворов, маточные растворы оттаивали и прибавляли к aCSF для регистрации, в зависимости от конкретного случая, и подавали в ванну с постоянной скоростью перфузии 1,5 мл/мин с использованием перистальтического насоса Minipulse 3 (Gilson Scientific Ltd., Bedfordshire, UK). Каждый эксперимент продолжался 52 минуты - 20 минут для установления базового регистрируемого значения (перфузия одной лишь aCSF для регистрации), 12 минут для прохождения перфузии раствора лекарственного средства в ванну, а также для возврата молекул красителя в клеточные мембраны и, наконец, 15-минутный период регистрации измерений ответа в присутствии раствора лекарственного средства.

5. Анализ модуляторных пептидов

В большинстве экспериментов с использованием T30 наблюдалось уменьшение сигнала. T30 индуцировал суммарное ингибирование (n=21) регистрируемых сигналов VSDI в базальных отделах переднего мозга получавших р14 крыс, это значение фактически включает меньшее число случаев, в которых наблюдались незначительные или минимально позитивные эффекты при перфузии T30 (Badin et al., 2016).

Результаты и обсуждение

На Фигурах 20, 21 и 22, прибавление 4 мкМ Tri04 приводит к повторению результатов, ранее наблюдавшихся для применения 4 мкМ NBP14, в то время как 2 мкМ Tri04 в перфузионном растворе обуславливает значимый эффект на популяционную активность базальных отделов переднего мозга.

Анализ модуляторных пептидомиметиков

На Фигуре 20А показано, что карты пространство-время демонстрируют восстановление активности базальных отделов переднего мозга, обусловленное присутствием 2 мкМ Tri04 в перфузате, содержащем 2 мкМ T30 (n=29). Более конкретно, 2 мкМ Tri04 обуславливает обращение ингибирующего эффекта T30 на активность, измеряемую прямой стимуляцией базальных отделах переднего мозга крысы.

На Фигуре 20В, столбчатые диаграммы, касающиеся 3 эпох записи, показывают изменения вызванного ответа после применения Tri04, подтверждающие, что совместная перфузия 2 мкМ Тп04 индуцирует возрастание сетевой активности (n=29, р=0,06, двусторонний парный критерий Стьюдента), вызываемое ингибированием индуцируемых T30 эффектов.

На Фигуре 21 показано, что временные ряды ответной реакции для трех условий регистрации результатов (базовые, введение T30 в искусственную спинномозговую жидкость (aCSF) и совместное введение T30 и Tri04 в aCSF) демонстрируют схожий профиль активации при регистрации результатов для T30 и T30 + Tri04 на протяжении первых 100 мс, в то время как впоследствии детектируется более высокий уровень активности при записи в присутствии Tri04, что подтверждает защитную роль Tri04 от воздействия T30.

На Фигуре 22 представлены столбчатые диаграммы, относящиеся к трем условиям регистрации результатов. Совместная перфузия 4 мкМ Tri04 в искусственной спинномозговой жидкости (aCSF), содержащей 2 мкМ T30, обуславливает значимый эффект обращения активности T30. В частности, было обнаружено, что Tri04 защищает от индуцируемых T30 отклонений от базовой линии со значимым увеличением (n=20, р<0,05, двусторонний парный критерий Стьюдента) активности базальных отделов переднего мозга по сравнению с записями, выполненными в присутствии одного лишь T30. Таким образом, Tri04 демонстрирует определенную эффективность блокирования токсичных эффектов T30 на мезомасштабную сетевую активность.

Заключения

Лечение рака

Авторы изобретения продемонстрировали в данном документе, что антитело и два пептидомиметика, Tri02 и Tri04, действуют как ингибиторы активности пептида Т14, благодаря четко выраженному ингибирующему эффекту на T30, по данным, представленным в данном документе. Соответственно, эти соединения могут быть использованы для лечения, облегчения или предотвращения рака, и особенно метастазирования.

Диагностирование/прогнозирование рака

Авторы изобретения также показали, что Т14, или его варианты, такие как его укороченные варианты, могут быть использованы в качестве диагностического или прогностического маркера рака, и особенно метастазирования. Низкие уровни Т14 в крови, измеренные методом вестерн-блоттинга, указывают на более низкие показатели выживания и соответствующее большее время до первого лечения (т.е. клинический статус).

--->

Список последовательностей

<110> НЕЙРО-БИО ЛТД

<120> Рак

<130> AXH/78632PCT1

<150> GB1601585.1

<151> 2016-01-28

<160> 7

<170> PatentIn версия 3.5

<210> 1

<211> 614

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Arg Pro Pro Gln Cys Leu Leu His Thr Pro Ser Leu Ala Ser Pro

1 5 10 15

Leu Leu Leu Leu Leu Leu Trp Leu Leu Gly Gly Gly Val Gly Ala Glu

20 25 30

Gly Arg Glu Asp Ala Glu Leu Leu Val Thr Val Arg Gly Gly Arg Leu

35 40 45

Arg Gly Ile Arg Leu Lys Thr Pro Gly Gly Pro Val Ser Ala Phe Leu

50 55 60

Gly Ile Pro Phe Ala Glu Pro Pro Met Gly Pro Arg Arg Phe Leu Pro

65 70 75 80

Pro Glu Pro Lys Gln Pro Trp Ser Gly Val Val Asp Ala Thr Thr Phe

85 90 95

Gln Ser Val Cys Tyr Gln Tyr Val Asp Thr Leu Tyr Pro Gly Phe Glu

100 105 110

Gly Thr Glu Met Trp Asn Pro Asn Arg Glu Leu Ser Glu Asp Cys Leu

115 120 125

Tyr Leu Asn Val Trp Thr Pro Tyr Pro Arg Pro Thr Ser Pro Thr Pro

130 135 140

Val Leu Val Trp Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Tyr Ser Gly Ala Ser Ser

145 150 155 160

Leu Asp Val Tyr Asp Gly Arg Phe Leu Val Gln Ala Glu Arg Thr Val

165 170 175

Leu Val Ser Met Asn Tyr Arg Val Gly Ala Phe Gly Phe Leu Ala Leu

180 185 190

Pro Gly Ser Arg Glu Ala Pro Gly Asn Val Gly Leu Leu Asp Gln Arg

195 200 205

Leu Ala Leu Gln Trp Val Gln Glu Asn Val Ala Ala Phe Gly Gly Asp

210 215 220

Pro Thr Ser Val Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val

225 230 235 240

Gly Met His Leu Leu Ser Pro Pro Ser Arg Gly Leu Phe His Arg Ala

245 250 255

Val Leu Gln Ser Gly Ala Pro Asn Gly Pro Trp Ala Thr Val Gly Met

260 265 270

Gly Glu Ala Arg Arg Arg Ala Thr Gln Leu Ala His Leu Val Gly Cys

275 280 285

Pro Pro Gly Gly Thr Gly Gly Asn Asp Thr Glu Leu Val Ala Cys Leu

290 295 300

Arg Thr Arg Pro Ala Gln Val Leu Val Asn His Glu Trp His Val Leu

305 310 315 320

Pro Gln Glu Ser Val Phe Arg Phe Ser Phe Val Pro Val Val Asp Gly

325 330 335

Asp Phe Leu Ser Asp Thr Pro Glu Ala Leu Ile Asn Ala Gly Asp Phe

340 345 350

His Gly Leu Gln Val Leu Val Gly Val Val Lys Asp Glu Gly Ser Tyr

355 360 365

Phe Leu Val Tyr Gly Ala Pro Gly Phe Ser Lys Asp Asn Glu Ser Leu

370 375 380

Ile Ser Arg Ala Glu Phe Leu Ala Gly Val Arg Val Gly Val Pro Gln

385 390 395 400

Val Ser Asp Leu Ala Ala Glu Ala Val Val Leu His Tyr Thr Asp Trp

405 410 415

Leu His Pro Glu Asp Pro Ala Arg Leu Arg Glu Ala Leu Ser Asp Val

420 425 430

Val Gly Asp His Asn Val Val Cys Pro Val Ala Gln Leu Ala Gly Arg

435 440 445

Leu Ala Ala Gln Gly Ala Arg Val Tyr Ala Tyr Val Phe Glu His Arg

450 455 460

Ala Ser Thr Leu Ser Trp Pro Leu Trp Met Gly Val Pro His Gly Tyr

465 470 475 480

Glu Ile Glu Phe Ile Phe Gly Ile Pro Leu Asp Pro Ser Arg Asn Tyr

485 490 495

Thr Ala Glu Glu Lys Ile Phe Ala Gln Arg Leu Met Arg Tyr Trp Ala

500 505 510

Asn Phe Ala Arg Thr Gly Asp Pro Asn Glu Pro Arg Asp Pro Lys Ala

515 520 525

Pro Gln Trp Pro Pro Tyr Thr Ala Gly Ala Gln Gln Tyr Val Ser Leu

530 535 540

Asp Leu Arg Pro Leu Glu Val Arg Arg Gly Leu Arg Ala Gln Ala Cys

545 550 555 560

Ala Phe Trp Asn Arg Phe Leu Pro Lys Leu Leu Ser Ala Thr Asp Thr

565 570 575

Leu Asp Glu Ala Glu Arg Gln Trp Lys Ala Glu Phe His Arg Trp Ser

580 585 590

Ser Tyr Met Val His Trp Lys Asn Gln Phe Asp His Tyr Ser Lys Gln

595 600 605

Asp Arg Cys Ser Asp Leu

610

<210> 2

<211> 30

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 2

Lys Ala Glu Phe His Arg Trp Ser Ser Tyr Met Val His Trp Lys Asn

1 5 10 15

Gln Phe Asp His Tyr Ser Lys Gln Asp Arg Cys Ser Asp Leu

20 25 30

<210> 3

<211> 14

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 3

Ala Glu Phe His Arg Trp Ser Ser Tyr Met Val His Trp Lys

1 5 10

<210> 4

<211> 15

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 4

Asn Gln Phe Asp His Tyr Ser Lys Gln Asp Arg Cys Ser Asp Leu

1 5 10 15

<210> 5

<211> 7

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 5

Ser Tyr Met Val His Trp Lys

1 5

<210> 6

<211> 4

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 6

Val His Trp Lys

1

<210> 7

<211> 15

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 7

Cys Ala Glu Phe His Arg Trp Ser Ser Tyr Met Val His Trp Lys

1 5 10 15

<---

Claims

1. Способ диагностики субъекта, страдающего от рака или метастазирования, или имеющего предрасположенность к ним, или обеспечения прогноза состояния субъекта, включающий:

(i) детектирование концентрации в образце, полученном от субъекта, пептида SEQ ID No: 3, и

(ii) сравнение данной концентрации с эталоном концентрации пептида SEQ ID No: 3 у субъекта, не страдающего от рака или метастазирования,

причем увеличение концентрации пептида SEQ ID No: 3 по сравнению с эталоном означает, что субъект страдает от рака или метастазирования, или имеет предрасположенность к ним, или состояние субъекта имеет негативный прогноз.

2. Способ по п. 1, отличающиеся тем, что образец представляет собой кровь, плазму, сыворотку, ликвор, мочу, пот, слюну, слезы, аспират молочной железы, сок простаты, семенную жидкость, влагалищное отделяемое, стул, соскоб шейки матки, циты, амниотическую жидкость, внутриглазную жидкость, мокроту, влагу дыхания, животную ткань, клеточные лизаты, опухолевую ткань, волосы, кожу, буккальный соскоб, лимфу, интерстициальную жидкость, ногти, костный мозг, хрящ, прионы, костный порошок, ушную серу или их комбинации, предпочтительно, образец содержит образец крови.

3. Способ по любому из пп. 1-2, отличающийся тем, что детектирование включает анализ, предназначенный для детектирования присутствия и/или отсутствия Т14-позитивных клеток в образце, предпочтительно, тест на основе иммунологического анализа, более предпочтительно, анализ включает применение антитела.

4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что анализ включает применение вестерн-блоттинга.

5. Набор для диагностики субъекта, страдающего от рака или метастазирования, или имеющего предрасположенность к ним, или для обеспечения прогноза состояния субъекта, включающий средство детектирования для определения концентрации пептида SEQ ID No: 3, присутствующего в образце от испытуемого субъекта, причем присутствие в образце пептида SEQ ID No: 3 позволяет предположить, что субъект страдает от рака или метастазирования, или имеет предрасположенность к ним, и контейнер для сбора образцов для размещения экстрагированного образца.

6. Набор по п. 5, причем образец представляет собой кровь, плазму, сыворотку, ликвор, мочу, пот, слюну, слезы, аспират молочной железы, сок простаты, семенную жидкость, влагалищное отделяемое, стул, соскоб шейки матки, циты, амниотическую жидкость, внутриглазную жидкость, мокроту, влагу дыхания, животную ткань, клеточные лизаты, опухолевую ткань, волосы, кожу, буккальный соскоб, лимфу, интерстициальную жидкость, ногти, костный мозг, хрящ, прионы, костный порошок, ушную серу или их комбинации, предпочтительно, образец содержит образец крови.

7. Применение пептида SEQ ID No: 3 в качестве диагностического или прогностического биомаркера рака или метастазирования.