RU2777523C2 - Противораковая композиция, содержащая опухолеспецифический онколитический аденовирус и ингибитор контрольной точки иммунного ответа - Google Patents
Противораковая композиция, содержащая опухолеспецифический онколитический аденовирус и ингибитор контрольной точки иммунного ответа Download PDFInfo
- Publication number
- RU2777523C2 RU2777523C2 RU2020143572A RU2020143572A RU2777523C2 RU 2777523 C2 RU2777523 C2 RU 2777523C2 RU 2020143572 A RU2020143572 A RU 2020143572A RU 2020143572 A RU2020143572 A RU 2020143572A RU 2777523 C2 RU2777523 C2 RU 2777523C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cancer
- antagonist
- gene
- rdb
- gmcsf
- Prior art date
Links
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 118
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 title claims abstract description 100
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 24
- 230000000174 oncolytic Effects 0.000 title claims abstract description 20
- 230000028993 immune response Effects 0.000 title claims description 65
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 title claims description 5
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 title claims description 3
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 title abstract description 51
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 claims abstract description 164
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 claims abstract description 164
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims abstract description 64
- 229940117681 Interleukin-12 Drugs 0.000 claims abstract description 52
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 31
- 230000001629 suppression Effects 0.000 claims abstract description 16
- 229920001891 Small hairpin RNA Polymers 0.000 claims abstract description 4
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 claims abstract description 4
- 230000003042 antagnostic Effects 0.000 claims description 72
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 claims description 72
- 239000012274 immune-checkpoint protein inhibitor Substances 0.000 claims description 57
- 229940121650 immune-checkpoint protein inhibitors Drugs 0.000 claims description 57
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 claims description 32
- 102000009524 Vascular Endothelial Growth Factor A Human genes 0.000 claims description 26
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 claims description 26
- 206010025650 Malignant melanoma Diseases 0.000 claims description 21
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 21
- 210000001744 T-Lymphocytes Anatomy 0.000 claims description 20
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 18
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 13
- 102100019764 PDCD1 Human genes 0.000 claims description 12
- 108060007796 SPATA2 Proteins 0.000 claims description 12
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims description 12
- 230000000259 anti-tumor Effects 0.000 claims description 11
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 11
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 claims description 9
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 9
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 8
- 208000008443 Pancreatic Carcinoma Diseases 0.000 claims description 7
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 7
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 7
- 230000036039 immunity Effects 0.000 claims description 7
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 claims description 7
- 206010005949 Bone cancer Diseases 0.000 claims description 6
- 102100019451 CD80 Human genes 0.000 claims description 6
- 101700080477 CD80 Proteins 0.000 claims description 6
- 206010046392 Ureteric cancer Diseases 0.000 claims description 6
- 206010047741 Vulval cancer Diseases 0.000 claims description 6
- 108010082808 4-1BB Ligand Proteins 0.000 claims description 5
- 102100009333 BTLA Human genes 0.000 claims description 5
- 101700047069 BTLA Proteins 0.000 claims description 5
- 108010094092 Glucocorticoid-Induced TNFR-Related Protein Proteins 0.000 claims description 5
- 102000001009 Glucocorticoid-Induced TNFR-Related Protein Human genes 0.000 claims description 5
- 206010038111 Recurrent cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 claims description 5
- 101710040448 TNFRSF4 Proteins 0.000 claims description 5
- 102100013135 TNFRSF4 Human genes 0.000 claims description 5
- 102100005310 CTLA4 Human genes 0.000 claims description 4
- 210000003169 Central Nervous System Anatomy 0.000 claims description 4
- 102000018358 Immunoglobulins Human genes 0.000 claims description 4
- 108060003951 Immunoglobulins Proteins 0.000 claims description 4
- 102100017213 LAG3 Human genes 0.000 claims description 4
- 108060004270 LAG3 Proteins 0.000 claims description 4
- 208000006265 Renal Cell Carcinoma Diseases 0.000 claims description 4
- 201000009030 carcinoma Diseases 0.000 claims description 4
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 4
- 201000007444 renal pelvis carcinoma Diseases 0.000 claims description 4
- 206010000830 Acute leukaemia Diseases 0.000 claims description 3
- 206010003571 Astrocytoma Diseases 0.000 claims description 3
- 206010004146 Basal cell carcinoma Diseases 0.000 claims description 3
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 210000004369 Blood Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000000133 Brain Stem Anatomy 0.000 claims description 3
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 101700054183 CTLA4 Proteins 0.000 claims description 3
- 206010007953 Central nervous system lymphoma Diseases 0.000 claims description 3
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 claims description 3
- 206010008943 Chronic leukaemia Diseases 0.000 claims description 3
- 206010014733 Endometrial cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 206010017758 Gastric cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 208000005017 Glioblastoma Diseases 0.000 claims description 3
- 101710004393 HAVCR2 Proteins 0.000 claims description 3
- 102100016384 HAVCR2 Human genes 0.000 claims description 3
- 208000006359 Hepatoblastoma Diseases 0.000 claims description 3
- 206010020243 Hodgkin's disease Diseases 0.000 claims description 3
- 206010023825 Laryngeal cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 208000000429 Leukemia, Lymphocytic, Chronic, B-Cell Diseases 0.000 claims description 3
- 210000000088 Lip Anatomy 0.000 claims description 3
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 claims description 3
- 206010052178 Lymphocytic lymphoma Diseases 0.000 claims description 3
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 claims description 3
- 206010027191 Meningioma Diseases 0.000 claims description 3
- 206010061306 Nasopharyngeal cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 claims description 3
- 208000002154 Non-Small-Cell Lung Carcinoma Diseases 0.000 claims description 3
- 108009000071 Non-small cell lung cancer Proteins 0.000 claims description 3
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 claims description 3
- 206010025310 Other lymphomas Diseases 0.000 claims description 3
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 210000001672 Ovary Anatomy 0.000 claims description 3
- 206010034299 Penile cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 210000004303 Peritoneum Anatomy 0.000 claims description 3
- 206010061538 Pituitary tumour benign Diseases 0.000 claims description 3
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 claims description 3
- 206010038038 Rectal cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 206010061934 Salivary gland cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 208000000649 Small Cell Carcinoma Diseases 0.000 claims description 3
- 206010054184 Small intestine carcinoma Diseases 0.000 claims description 3
- 206010062261 Spinal cord neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 206010057644 Testis cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 206010046431 Urethral cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 206010046766 Uterine cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 101710036075 VSIR Proteins 0.000 claims description 3
- 102100015314 VSIR Human genes 0.000 claims description 3
- 206010046885 Vaginal cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 201000005188 adrenal gland cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 3
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 201000000312 duodenum cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000000750 endocrine system Anatomy 0.000 claims description 3
- 201000004101 esophageal cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 201000001342 fallopian tube cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 201000010175 gallbladder cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 201000010536 head and neck cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 230000002147 killing Effects 0.000 claims description 3
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 230000003211 malignant Effects 0.000 claims description 3
- 201000009251 multiple myeloma Diseases 0.000 claims description 3
- 230000000849 parathyroid Effects 0.000 claims description 3
- 201000005746 pituitary adenoma Diseases 0.000 claims description 3
- 201000001275 rectum cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 201000000849 skin cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 201000002314 small intestine cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 201000003120 testicular cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 201000009377 thymus cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 201000002510 thyroid cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 201000011294 ureter cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 108010085277 Adenosine A2A receptor Proteins 0.000 claims description 2
- 102000007471 Adenosine A2A receptor Human genes 0.000 claims description 2
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 2
- 201000000360 urethra cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 102000002627 4-1BB Ligand Human genes 0.000 claims 2
- 101710039842 ADORA2A Proteins 0.000 claims 1
- 102000010565 Apoptosis Regulatory Proteins Human genes 0.000 claims 1
- 108010063104 Apoptosis Regulatory Proteins Proteins 0.000 claims 1
- 101710007023 ESAG4 Proteins 0.000 claims 1
- 210000000244 Kidney Pelvis Anatomy 0.000 claims 1
- 230000001461 cytolytic Effects 0.000 claims 1
- 230000000503 lectinlike Effects 0.000 claims 1
- 101700032180 psaA Proteins 0.000 claims 1
- 239000002464 receptor antagonist Substances 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 22
- 230000002708 enhancing Effects 0.000 abstract description 14
- 230000036737 immune function Effects 0.000 abstract description 2
- 210000003038 Endothelium Anatomy 0.000 abstract 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 102000004965 antibodies Human genes 0.000 description 66
- 108090001123 antibodies Proteins 0.000 description 66
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 41
- 102100006400 CSF2 Human genes 0.000 description 35
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 28
- 102000003743 Relaxin Human genes 0.000 description 21
- 108090000103 Relaxin Proteins 0.000 description 21
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 19
- 230000001965 increased Effects 0.000 description 14
- 102100013077 CD4 Human genes 0.000 description 13
- 101700022938 CD4 Proteins 0.000 description 13
- 108020004684 Internal Ribosome Entry Sites Proteins 0.000 description 13
- 102100016020 IFNG Human genes 0.000 description 12
- 101700086956 IFNG Proteins 0.000 description 12
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 12
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 11
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 10
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 10
- 102100018958 IL12A Human genes 0.000 description 9
- 101700001913 IL12A Proteins 0.000 description 9
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 9
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 description 9
- 210000004443 Dendritic Cells Anatomy 0.000 description 8
- 241000699673 Mesocricetus auratus Species 0.000 description 8
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 8
- 101710012053 CD274 Proteins 0.000 description 7
- 102100007290 CD274 Human genes 0.000 description 7
- 101700003485 CSF2 Proteins 0.000 description 7
- 229920001405 Coding region Polymers 0.000 description 7
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 7
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 7
- 230000002195 synergetic Effects 0.000 description 7
- 210000000612 Antigen-Presenting Cells Anatomy 0.000 description 6
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 description 6
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 6
- 230000002601 intratumoral Effects 0.000 description 6
- 230000001225 therapeutic Effects 0.000 description 6
- 102100006812 IL12B Human genes 0.000 description 5
- 101700055891 IL12B Proteins 0.000 description 5
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 5
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 5
- 108020004999 Messenger RNA Proteins 0.000 description 5
- 201000009910 diseases by infectious agent Diseases 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 5
- 229920002106 messenger RNA Polymers 0.000 description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 5
- 230000001105 regulatory Effects 0.000 description 5
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 206010053759 Growth retardation Diseases 0.000 description 4
- 210000000822 Killer Cells, Natural Anatomy 0.000 description 4
- 210000004698 Lymphocytes Anatomy 0.000 description 4
- 102000011755 Phosphoglycerate kinases Human genes 0.000 description 4
- 108020004454 Phosphoglycerate kinases Proteins 0.000 description 4
- 229920000320 RNA (poly(A)) Polymers 0.000 description 4
- 108020004412 RNA 3' Polyadenylation Signals Proteins 0.000 description 4
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 4
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 230000001506 immunosuppresive Effects 0.000 description 4
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 229920000160 (ribonucleotides)n+m Polymers 0.000 description 3
- 102100008450 AFP Human genes 0.000 description 3
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 3
- 210000001165 Lymph Nodes Anatomy 0.000 description 3
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 description 3
- 229920001850 Nucleic acid sequence Polymers 0.000 description 3
- 210000000400 T-Lymphocytes, Cytotoxic Anatomy 0.000 description 3
- 101710022243 TNFSF18 Proteins 0.000 description 3
- 102100003084 TNFSF9 Human genes 0.000 description 3
- 102000004591 Telomerase Human genes 0.000 description 3
- 108010017842 Telomerase Proteins 0.000 description 3
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 3
- 108010026331 alpha-Fetoproteins Proteins 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 102000038129 antigens Human genes 0.000 description 3
- 108091007172 antigens Proteins 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal Effects 0.000 description 3
- 238000002619 cancer immunotherapy Methods 0.000 description 3
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 3
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 230000001402 polyadenylating Effects 0.000 description 3
- 238000002600 positron emission tomography Methods 0.000 description 3
- 230000001737 promoting Effects 0.000 description 3
- 231100000486 side effect Toxicity 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 1-[(1S,2R,3R,4S,5R,6R)-3-carbamimidamido-6-{[(2R,3R,4R,5S)-3-{[(2S,3S,4S,5R,6S)-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-3-(methylamino)oxan-2-yl]oxy}-4-formyl-4-hydroxy-5-methyloxolan-2-yl]oxy}-2,4,5-trihydroxycyclohexyl]guanidine Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 210000001185 Bone Marrow Anatomy 0.000 description 2
- 101700056583 CD27 Proteins 0.000 description 2
- 102100019459 CD27 Human genes 0.000 description 2
- 102100019461 CD28 Human genes 0.000 description 2
- 101700033362 CD28 Proteins 0.000 description 2
- 102100005830 CD70 Human genes 0.000 description 2
- 101700017377 CD70 Proteins 0.000 description 2
- 101700036477 FOLH1 Proteins 0.000 description 2
- 102100008453 FOLH1 Human genes 0.000 description 2
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 2
- 208000009889 Herpes Simplex Diseases 0.000 description 2
- 102100005026 IL21 Human genes 0.000 description 2
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 2
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- 210000001616 Monocytes Anatomy 0.000 description 2
- 241000714177 Murine leukemia virus Species 0.000 description 2
- 101710011976 PDCD1LG2 Proteins 0.000 description 2
- 102100007289 PDCD1LG2 Human genes 0.000 description 2
- 101700084262 PDE1C Proteins 0.000 description 2
- 102000007066 Prostate-Specific Antigen Human genes 0.000 description 2
- 108010072866 Prostate-Specific Antigen Proteins 0.000 description 2
- 230000025458 RNA interference Effects 0.000 description 2
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 2
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 2
- 210000000952 Spleen Anatomy 0.000 description 2
- 101710005270 TEF1 Proteins 0.000 description 2
- 102100003096 TNFRSF18 Human genes 0.000 description 2
- 101710038603 TNFRSF18 Proteins 0.000 description 2
- 102100009558 TNFSF18 Human genes 0.000 description 2
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 2
- 108010001801 Tumor Necrosis Factor-alpha Proteins 0.000 description 2
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 2
- 230000003213 activating Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 2
- 230000000295 complement Effects 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic Effects 0.000 description 2
- 125000000267 glycino group Chemical group [H]N([*])C([H])([H])C(=O)O[H] 0.000 description 2
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 2
- 230000001024 immunotherapeutic Effects 0.000 description 2
- 230000001976 improved Effects 0.000 description 2
- 108010074108 interleukin-21 Proteins 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cells Anatomy 0.000 description 2
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 2
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 2
- 230000036961 partial Effects 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000002829 reduced Effects 0.000 description 2
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 2
- 230000002987 rna-interference Effects 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating Effects 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 2
- 230000004083 survival Effects 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 230000000989 vascularization Effects 0.000 description 2
- 230000003612 virological Effects 0.000 description 2
- BRZYSWJRSDMWLG-DJWUNRQOSA-N (2R,3R,4R,5R)-2-[(1S,2S,3R,4S,6R)-4,6-diamino-3-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-amino-4,5-dihydroxy-6-[(1R)-1-hydroxyethyl]oxan-2-yl]oxy-2-hydroxycyclohexyl]oxy-5-methyl-4-(methylamino)oxane-3,5-diol Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]([C@@H](C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-DJWUNRQOSA-N 0.000 description 1
- LNAZSHAWQACDHT-XIYTZBAFSA-N (2R,3R,4S,5R,6S)-4,5-dimethoxy-2-(methoxymethyl)-3-[(2S,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-trimethoxy-6-(methoxymethyl)oxan-2-yl]oxy-6-[(2R,3R,4S,5R,6R)-4,5,6-trimethoxy-2-(methoxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxane Chemical compound CO[C@@H]1[C@@H](OC)[C@H](OC)[C@@H](COC)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](OC)[C@@H](OC)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OC)[C@H](OC)O[C@@H]2COC)OC)O[C@@H]1COC LNAZSHAWQACDHT-XIYTZBAFSA-N 0.000 description 1
- 101710006746 7.5K Proteins 0.000 description 1
- 101700033661 ACTB Proteins 0.000 description 1
- 102100011550 ACTB Human genes 0.000 description 1
- 101710032514 ACTI Proteins 0.000 description 1
- 102100001249 ALB Human genes 0.000 description 1
- 101710027066 ALB Proteins 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N Ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 108010045634 B7 Antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000005738 B7 Antigens Human genes 0.000 description 1
- 102100007326 BIRC5 Human genes 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000282817 Bovidae Species 0.000 description 1
- 210000001266 CD8-Positive T-Lymphocytes Anatomy 0.000 description 1
- 101700068457 CRZ1 Proteins 0.000 description 1
- 108010021064 CTLA-4 Antigen Proteins 0.000 description 1
- JHLNERQLKQQLRZ-UHFFFAOYSA-N Calcium silicate Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[O-][Si]([O-])([O-])[O-] JHLNERQLKQQLRZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282836 Camelus dromedarius Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 229960003669 Carbenicillin Drugs 0.000 description 1
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N Carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 208000008761 Central Nervous System Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 229960005091 Chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N Chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 229920002676 Complementary DNA Polymers 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KAZBKCHUSA-N D-Mannitol Natural products OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KAZBKCHUSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N D-sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 101710038747 EEF1A1 Proteins 0.000 description 1
- 101710038764 EEF1A1P5 Proteins 0.000 description 1
- 101710038745 EEF1A2 Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 230000036826 Excretion Effects 0.000 description 1
- 210000002744 Extracellular Matrix Anatomy 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 102100004985 GUSB Human genes 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 229940014259 Gelatin Drugs 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 1
- 229920000084 Gum arabic Polymers 0.000 description 1
- 102100019126 HBB Human genes 0.000 description 1
- 108091005902 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 1
- 210000000987 Immune System Anatomy 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 102000003810 Interleukin-18 Human genes 0.000 description 1
- 108090000171 Interleukin-18 Proteins 0.000 description 1
- 102000013264 Interleukin-23 Human genes 0.000 description 1
- 108010065637 Interleukin-23 Proteins 0.000 description 1
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N Kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 210000003734 Kidney Anatomy 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-UUNJERMWSA-N Lactose Natural products O([C@@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)O[C@@H]1CO)[C@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1 GUBGYTABKSRVRQ-UUNJERMWSA-N 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase family Proteins 0.000 description 1
- 102000004083 Lymphotoxin-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108090000542 Lymphotoxin-alpha Proteins 0.000 description 1
- 210000002540 Macrophages Anatomy 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 1
- 206010027476 Metastasis Diseases 0.000 description 1
- 206010061289 Metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- OSWPMRLSEDHDFF-UHFFFAOYSA-N Methyl salicylate Chemical compound COC(=O)C1=CC=CC=C1O OSWPMRLSEDHDFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000168 Microcrystalline cellulose Polymers 0.000 description 1
- 241000283898 Ovis Species 0.000 description 1
- 210000004197 Pelvis Anatomy 0.000 description 1
- 241001505332 Polyomavirus sp. Species 0.000 description 1
- 210000000173 Precursor Cells, T-Lymphoid Anatomy 0.000 description 1
- 102000009339 Proliferating Cell Nuclear Antigen Human genes 0.000 description 1
- 108010009063 Proliferating Cell Nuclear Antigen Proteins 0.000 description 1
- QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N Propylparaben Chemical compound CCCOC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002307 Prostate Anatomy 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 102000012121 Retinoblastoma Protein Human genes 0.000 description 1
- 108050002653 Retinoblastoma Protein Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 241000978776 Senegalia senegal Species 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 229960005322 Streptomycin Drugs 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-GDQSFJPYSA-N Sucrose Natural products O([C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)[C@@]1(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-GDQSFJPYSA-N 0.000 description 1
- 108010002687 Survivin Proteins 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 102100018687 TCN1 Human genes 0.000 description 1
- 101710024751 TCN1 Proteins 0.000 description 1
- 229960002180 Tetracycline Drugs 0.000 description 1
- OFVLGDICTFRJMM-WESIUVDSSA-N Tetracycline Chemical compound C1=CC=C2[C@](O)(C)[C@H]3C[C@H]4[C@H](N(C)C)C(O)=C(C(N)=O)C(=O)[C@@]4(O)C(O)=C3C(=O)C2=C1O OFVLGDICTFRJMM-WESIUVDSSA-N 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- WDLRUFUQRNWCPK-UHFFFAOYSA-N Tetraxetan Chemical compound OC(=O)CN1CCN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC1 WDLRUFUQRNWCPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine Kinase Proteins 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H Tricalcium phosphate Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 108060008683 Tumor Necrosis Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000003298 Tumor Necrosis Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 101700068327 VTCN1 Proteins 0.000 description 1
- 102100014952 VTCN1 Human genes 0.000 description 1
- 102000016350 Viral Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010047700 Vomiting Diseases 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000205 acacia gum Substances 0.000 description 1
- 235000010489 acacia gum Nutrition 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000000240 adjuvant Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 229940050528 albumin Drugs 0.000 description 1
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 201000004384 alopecia Diseases 0.000 description 1
- 231100000360 alopecia Toxicity 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960001714 calcium phosphate Drugs 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000000378 calcium silicate Substances 0.000 description 1
- 229910052918 calcium silicate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960003340 calcium silicate Drugs 0.000 description 1
- 235000012241 calcium silicate Nutrition 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 201000007455 central nervous system cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 description 1
- 230000000139 costimulatory Effects 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 230000029578 entry into host Effects 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 230000002349 favourable Effects 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 239000007952 growth promoter Substances 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic Effects 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 238000010185 immunofluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 102000006639 indoleamine 2,3-dioxygenase family Human genes 0.000 description 1
- 108020004201 indoleamine 2,3-dioxygenase family Proteins 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated Effects 0.000 description 1
- 230000003446 memory effect Effects 0.000 description 1
- 230000001394 metastastic Effects 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 235000019813 microcrystalline cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008108 microcrystalline cellulose Substances 0.000 description 1
- 229940016286 microcrystalline cellulose Drugs 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- -1 neomycin Chemical compound 0.000 description 1
- 210000000056 organs Anatomy 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 230000002335 preservative Effects 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000000644 propagated Effects 0.000 description 1
- 229960003415 propylparaben Drugs 0.000 description 1
- 230000036678 protein binding Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000002040 relaxant effect Effects 0.000 description 1
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 102000034377 signal transducing proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006008 signal transducing proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 235000010356 sorbitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000012222 talc Nutrition 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cells Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N β-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
Images
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии. Описан рекомбинантный онколитический аденовирус, содержащий: ген, кодирующий интерлейкин 12 (IL-12); ген, кодирующий shRNA, подавляющую экспрессию VEGF (фактора роста эндотелия сосудов). Также представлена противораковая композиция, содержащая указанный опухолеспецифический онколитический аденовирус. Рекомбинантный аденовирус по настоящему изобретению проявляет превосходный противораковый эффект за счет усиления иммунных функций. Таким образом, настоящее изобретение можно применять в качестве ключевой методики в области лечения рака. 2 н. и 8 з.п. ф-лы, 23 ил., 1 пр.
Description
Уровень техники настоящего изобретения
Настоящее изобретение относится к противораковой композиции, содержащей опухолеспецифический онколитический аденовирус и ингибитор контрольной точки иммунного ответа.
Предшествующий уровень техники настоящего изобретения
Несмотря на стремительную разработку противораковых терапевтических средств, рак по-прежнему является одним из заболеваний с высоким уровнем смертности во всем мире. Основными способами лечения рака, традиционно применяемыми в клинической практике, являются хирургическое вмешательство, лучевая терапия и способы лечения с использованием противораковых средств, или способы максимального удаления из организма пациентов раковых клеток в качестве лечения, проводимого параллельно с вышеперечисленным. Однако эти виды лечения оказывают эффекты лечения только в том случае, когда раковые клетки полностью удалены на стадии, на которой относительно ранний рак еще не метастазирует, а также приводят к уничтожению других нормальных клеток, которые быстро делятся, и, таким образом, имеют недостаток, заключающийся в том, что могут быть вызваны различные побочные эффекты. Соответственно, недавно были проведены исследования по лечению рака с использованием опухолеспецифической иммунной активности организма в качестве иммунотерапевтического способа.
Однако иммунотерапию проводить сложно, поскольку рак характеризуется способностью не только «хитро» избегать и нарушать различные иммунные ответы, и, как результат, непрерывно поддерживать выживание опухолей, индуцируя формирование иммуносупрессорного микроокружения опухоли, но также уклоняться от активированного противоопухолевого иммунного ответа, даже в случае активации иммунной системы. Соответственно, с целью усиления иммунного ответа в отношении раковых клеток за счет улучшения в отношении иммуносупрессорного микроокружения опухоли были осуществлены разнонаправленные исследования с применением генов цитокинов, таких как IL-12, IL-18, IL-23, интерферон гамма (IFN-γ), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), фактор некроза опухоли альфа (TNF-α), костимулирующих факторов, таких как молекулы B7, дендритных клеток (DC), непосредственно служащих в качестве антигенпрезентирующих клеток (APC), T-клеток, активированных опухолевыми антигенами, естественных клеток-киллеров (NKC) и т.д. Известно, что IL-12 продуцируется APC, такими как моноциты, макрофаги и DC, и посредством прямого воздействия на цитотоксические T-лимфоциты (CTL) и NK-клетки, которые могут эффективно устранять раковые клетки, активирует их, стимулирует продукцию IFN-γ, а также повышает способность к уничтожению раковых клеток в результате прямого воздействия на них. Кроме того, IL-12 играет важную роль в содействии дифференцировке в Т-хелперы 1 (TH1) путем воздействия на наивные CD4+ лимфоциты, и, таким образом, активации противоракового иммунного ответа путем индуцирования и усиления клеточноопосредованного иммунного ответа, что играет ключевую роль в выработке противоракового иммунного ответа. Кроме того, VEGF является сигнальным белком, продуцируемым клетками, которые способствуют ангиогенезу и васкуляризации, и он не только воздействует на предшественников T-клеток в костном мозге, приводя к подавлению пролиферации и созревания T-клеток и дендритных клеток, но также выполняет важную функцию в процессе васкуляризации, обуславливая тем самым нежелательное явление, называемое метастазированием рака. Соответственно, VEGF не только является стимулятором роста опухоли, но также действует как супрессор противоракового иммунитета, и ожидается, что отрицательная регуляция VEGF с помощью VEGF shRNA (короткой рибонуклеиновой кислоты, образующей шпильки) будет обеспечивать восстановление иммунных ответов и повышение противораковых эффектов. Кроме того, GM-CSF служит для усиления иммунных ответов CD4+ и CD8+ T-клеток за счет стимуляции DC к содействию дифференцировке DC в APC, и также вовлечен в процесс регуляции экспрессии молекул, составляющих главный комплекс гистосовместимости (MHC) класса II первичных моноцитов. Кроме того, сообщалось, что сильный противораковый иммунный ответ индуцируется в результате индуцирования множества APC к скоплению вокруг опухолей благодаря эффекту экспрессии GM-CSF в опухолях с целью эффективного процессирования опухолевых антигенов.
Исходя из этого, в лаборатории авторов настоящего изобретения также был описан противоопухолевый эффект IL-12 с применением YKL-1 [Ad-E1B55] в качестве избирательного в отношении опухоли онколитического аденовируса с удаленным геном E1B, кодирующим белок весом 55 кДа, и также был описан противоопухолевый эффект GM-CSF с применением аденовируса RdB с избирательной в отношении опухоли способностью к уничтожению, усиленной благодаря удалению гена E1B и модификации Rb-связывающего сайта E1A. Однако, несмотря на улучшение в отношении иммуносупрессорного микроокружения опухоли, при применении иммунотерапевтического способа все еще остается множество ограничений для полного излечения рака из-за низкой иммуногенности опухолей.
Раскрытие настоящего изобретения
Техническая задача
В результате интенсивных исследований по разработке иммунотерапии для преодоления уклонения опухолей от иммунологического надзора, авторы настоящего изобретения не только подтвердили превосходный противораковый эффект IL-12 и shVEGF (нацеленная на фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) короткая рибонуклеиновая кислота, образующая шпильки) или IL-12 и GM-CSF-релаксина in vivo благодаря получению рекомбинантного аденовируса, экспрессирующего их одновременно, но также подтвердили, что противораковый эффект рекомбинантного аденовируса улучшался при совместном введении с ингибитором контрольной точки иммунного ответа, тем самым завершая настоящее изобретение, основанное на этом.
Соответственно, целью настоящего изобретения является обеспечение рекомбинантного аденовируса, одновременно экспрессирующего IL-12 и shVEGF или IL-12 и GM-CSF-релаксин.
Другой целью настоящего изобретения является обеспечение медицинского применения рекомбинантного аденовируса для предупреждения или лечения рака.
Еще одной целью настоящего изобретения является обеспечение медицинского применения рекомбинантного аденовируса для предупреждения или лечения рака в виде комбинированного состава с ингибитором контрольной точки иммунного ответа.
Однако, подлежащие решению с помощью настоящего изобретения технические задачи не ограничиваются вышеупомянутыми задачами, и другие задачи, которые не упоминались, будут несомненно понятны специалистам в данной области из нижеследующего описания.
Техническое решение
Для достижения целей настоящего изобретения, описанных выше, настоящее изобретение относится к рекомбинантному аденовирусу, содержащему ген, кодирующий интерлейкин 12 (IL-12); ген, кодирующий гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF); и ген, кодирующий релаксин, или рекомбинантному аденовирусу, содержащему ген, кодирующий интерлейкин 12 (IL-12); и ген, кодирующий shRNA, подавляющую экспрессию VEGF.
В качестве варианта осуществления настоящего изобретения, из рекомбинантного аденовируса могут быть удалены одна или несколько из областей, выбранных из группы, состоящей из областей E1 и E3.
В качестве другого варианта осуществления настоящего изобретения, ген, кодирующий IL-12, может предусматривать последовательность гена IL-12A (p35), последовательность, кодирующую IRES, и последовательность гена IL-12B (p40), и может быть вставлен в место области E1 или E3 рекомбинантного аденовируса.
В качестве еще одного варианта осуществления настоящего изобретения, гены, кодирующие GM-CSF и релаксин, могут предусматривать последовательность гена GM-CSF, последовательность, кодирующую IRES, и последовательность гена релаксина, и могут быть вставлены в место области E1 или E3 рекомбинантного аденовируса.
В качестве еще одного варианта осуществления настоящего изобретения, ген, кодирующий shRNA, подавляющую экспрессию VEGF, может комплементарно связываться с мРНК VEGF, и может быть вставлен в место области E1 или E3 рекомбинантного аденовируса.
Кроме того, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для предупреждения или лечения рака, причем композиция включает: рекомбинантный аденовирус; и фармацевтически приемлемый носитель.
В качестве варианта осуществления настоящего изобретения, композицию можно вводить совместно с любым из ингибиторов контрольной точки иммунного ответа, выбранным из группы, состоящей из антагониста PD-1 (белка 1 запрограммированной гибели клеток), антагониста PD-L1 (лиганда белка 1 запрограммированной гибели клеток), антагониста PD-L2, антагониста CD27 (кластера дифференцировки 27), антагониста CD28, антагониста CD70, антагониста CD80, антагониста CD86, антагониста CD137, антагониста CD276, антагониста KIR (иммуноглобулин-подобных рецепторов клеток-киллеров), антагониста LAG3 (белка, кодируемого геном 3 активации лимфоцитов), антагониста TNFRSF4 (члена 4 суперсемейства рецепторов фактора некроза опухоли), антагониста GITR (глюкокортикоид-индуцированного TNFR-родственного белка), антагониста GITRL (лиганда GITR), антагониста 4-1BBL (лиганда 4-1BB), антагониста CTLA-4 (ассоциированного с цитотоксическими T-лимфоцитами антигена 4), антагониста A2AR (рецептора A2A аденозина), антагониста VTCN1 (ингибитора 1 активации T-клеток, содержащего домен, подобный V-домену иммуноглобулина), антагониста BTLA (B- и T-лимфоцитарного аттенюатора), антагониста IDO (индоламин-2,3-диоксигеназы), антагониста TIM-3 (Т-клеточного белка 3, содержащего иммуноглобулиновый домен и домен муцина), антагониста VISTA (супрессора активации Т-клеток, содержащего IgV-подобный домен), антагониста KLRA и их комбинации.
В качестве другого варианта осуществления настоящего изобретения, композиция может обеспечивать усиление противоопухолевого иммунитета.
В качестве еще одного варианта осуществления настоящего изобретения, рак может быть выбран из группы, состоящей из рака желудка, рака легкого, немелкоклеточного рака легкого, рака молочной железы, рака яичника, рака печени, рака бронхов, рака носоглотки, рака гортани, рака поджелудочной железы, рака мочевого пузыря, рака толстой кишки, рака шейки матки, рака кости, немелкоклеточного рака кости, злокачественного заболевания системы крови, рака кожи, рака головы и шеи, рака матки, рака толстой и прямой кишки, рака перианальной области, рака толстой кишки, рака маточной трубы, рака эндометрия, рака влагалища, рака вульвы, болезни Ходжкина, рака пищевода, рака тонкого кишечника, рака эндокринной системы, рака щитовидной железы, рака паращитовидной железы, рака надпочечников, саркомы мягких тканей, рака уретры, рака полового члена, рака предстательной железы, хронического или острого лейкоза, лимфоцитарной лимфомы, рака почки или мочеточника, почечно-клеточной карциномы, карциномы почечной лоханки, рака слюнной железы, саркомы, псевдомиксомы брюшины, гепатобластомы, рака яичка, глиобластомы, карциномы губы, эмбрионально-клеточных опухолей яичника, базальноклеточной карциномы, множественной миеломы, рака желчного пузыря, хороидальной меланомы, рака фатерова сосочка, перитонеального рака, рака языка, мелкоклеточного рака, детской лимфомы, нейробластомы, рака двенадцатиперстной кишки, рака мочеточника, астроцитомы, менингиомы, рака почечной лоханки, рака наружных половых органов, рака тимуса, опухолей центральной нервной системы, первичной лимфомы центральной нервной системы, опухолей спинного мозга, нейроглиомы ствола головного мозга и аденомы гипофиза, и рак также может представлять собой рецидивный рак.
Благоприятные эффекты
Рекомбинантный аденовирус с вставленными в него генами IL-12 и shVEGF или IL-12 и GM-CSF-релаксина, в соответствии с настоящим изобретением, проявляет превосходный противораковый эффект за счет улучшения иммунных функций, и было подтверждено, что такой противораковый эффект заметно усилен за счет совместного введения с ингибитором контрольной точки иммунного ответа, и, таким образом, настоящее изобретение можно применять в качестве ключевой методики в области лечения рака.
Описание чертежей
На фиг. 1 проиллюстрированы характеристики онколитического аденовируса, одновременно экспрессирующего IL-12 и shRNA для VEGF, и она представляет собой изображение, схематически иллюстрирующее генетическую структуру RdB/IL12/shVEGF Ad. RdB содержит модифицированный E1A (мутация в связывающем белки Rb сайте, обозначенном звездочкой), а E1B-19 и E1B, кодирующий белок весом 55 кДа (E1B), и область E3 (E3) удалены; и гены IL-12 мыши и shVEGF мыши вставлены в место области E1 или E3 генома аденовируса соответственно.
На фиг. 2 проиллюстрированы характеристики онколитического аденовируса, одновременно экспрессирующего IL-12 и GM-CSF и релаксин (GMCSF-релаксин), и она представляет собой изображение, схематически иллюстрирующее генетическую структуру RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad. Гены IL-12 и GMCSF-релаксина вставлены в место области E1 или E3 генома аденовируса соответственно. GMCSF и релаксин также могут экспрессироваться в системе экспрессии, соединенной посредством последовательности, кодирующей IRES (участок внутренней посадки рибосомы), и в настоящем изобретении IRES представляет собой регуляторную последовательность, обнаруживаемую в РНК некоторых вирусов и клеток.
На фиг. 3 показаны результаты, подтверждающие противораковый эффект, обусловленный введением RdB/IL12/shVEGF Ad и совместным введением RdB/IL12/shVEGF Ad и ингибитора контрольной точки иммунного ответа (антитела к PD-L1; αPD-L1), у мышей с меланомой, на фиг. 3A показаны результаты, подтверждающие изменение объема опухолей, и на фиг. 3B показаны результаты, подтверждающие изменение доли выживших мышей с меланомой. В опухоли мышей C57BL/6 в день 1, 3 и 5 вводили 5×109 вирусных частиц (VP) (фиг. 3A; исходный объем опухоли: 80-100 мм3) аденовируса, Ad, и внутрибрюшинно вводили 200 мкг антитела к PD-L1. Объем опухолей отслеживали и ежедневно регистрировали до завершения эксперимента. Красной стрелкой указано время инъекции аденовируса, а черной стрелкой указано время инъекции антитела.
На фиг. 4 показаны результаты, подтверждающие противораковый эффект, обусловленный введением RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad и совместным введением RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad и ингибитора контрольной точки иммунного ответа (антитела к PD-L1), у мышей с меланомой, на фиг. 4A показаны результаты, подтверждающие изменение объема опухолей, и на фиг. 4B показаны результаты, подтверждающие изменение доли выживших мышей с меланомой.
На фиг. 5 показаны результаты, подтверждающие противораковый эффект, обусловленный введением RdB/IL12/shVEGF Ad и совместным введением RdB/IL12/shVEGF Ad и ингибитора контрольной точки иммунного ответа (антитела к PD-1), у мышей с меланомой, и показаны результаты, подтверждающие изменение объема опухолей при введении RdB/IL12/shVEGF Ad в относительно низкой дозе, составляющей 1×109 VP.
На фиг. 6 показаны результаты, подтверждающие противораковый эффект, обусловленный введением RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad и совместным введением RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad и ингибитора контрольной точки иммунного ответа (антитела к PD-1), у мышей с меланомой, и показаны результаты, подтверждающие изменение объема опухолей при введении RdB/IL12/GMCSF-RLX в относительно низкой дозе, составляющей 1×109 VP.
На фиг. 7 показаны результаты, подтверждающие противораковый эффект, обусловленный совместным введением HmT-Rd19-K35/IL21 Ad, RdB/GMCSF/shVEGF Ad и YKL-1/GMCSF/B7.1 Ad и ингибитора контрольной точки иммунного ответа (антитела к PD-1), у мышей с меланомой.
На фиг. 8 показаны результаты, подтверждающие противораковый эффект, обусловленный введением RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad и совместным введением RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad и ингибитора контрольной точки иммунного ответа (антитела к PD-1), у мышей с меланомой, на фиг. 8A показаны результаты, подтверждающие изменение объема опухолей, и на фиг. 8B показаны результаты, подтверждающие изменение доли выживших мышей с меланомой.
На фиг. 9 показаны результаты, подтверждающие противораковый эффект, обусловленный введением RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad и совместным введением RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad и ингибитора контрольной точки иммунного ответа (антитела к CTLA-4), у мышей с меланомой, на фиг. 9A показаны результаты, подтверждающие изменение объема опухолей, и на фиг. 9B показаны результаты, подтверждающие изменение доли выживших мышей с меланомой.
На фиг. 10 показаны результаты, подтверждающие противоопухолевый эффект иммунологической памяти, обусловленный введением RdB/IL12/shVEGF Ad и совместным введением RdB/IL12/shVEGF Ad и ингибитора контрольной точки иммунного ответа (антитела к PD-L1), у мышей с меланомой, на фиг. 10A показаны результаты, подтверждающие изменение объема вторичных опухолей при введении RdB/IL12/shVEGF Ad, и на фиг. 10B показаны результаты, подтверждающие изменение объема вторичных опухолей при совместном введении RdB/IL12/shVEGF Ad и ингибитора контрольной точки иммунного ответа (антитела к PD-1).
На фиг. 11 показаны результаты, подтверждающие, на основе ферментного иммуносорбентного анализа (ELISA), изменение экспрессии IL-12 и GMCSF в соответствии с множественностью инфекции (MOI) после инфицирования линии клеток рака поджелудочной железы сирийского хомяка (Hap-T1) с использованием RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad.
На фиг. 12 показаны результаты, подтверждающие, на основе полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (RT-PCR), изменение экспрессии релаксина в соответствии с MOI после инфицирования линии клеток рака поджелудочной железы сирийского хомяка (Hap-T1) с использованием RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad.
На фиг. 13 показаны результаты, подтверждающие изменение объема опухолей, обусловленное совместным введением RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad и ингибитора контрольной точки иммунного ответа (антитела к PD-1) в животной модели опухоли с использованием сирийского хомяка.
На фиг. 14 показаны результаты, подтверждающие, на основе иммуногистологического способа, изменение в опухолевых тканях, обусловленное совместным введением RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad и ингибитора контрольной точки иммунного ответа (антитела к PD-1) в животной модели опухоли с использованием сирийского хомяка.
На фиг. 15 показаны результаты, подтверждающие изменение в отношении популяции интерферон-(IFN)-γ-экспрессирующих CD4+ или CD8+ T-клеток, обусловленное совместным введением RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad и ингибитора контрольной точки иммунного ответа (антитела к PD-1) в дренирующем лимфатическом узле (DLN).
На фиг. 16 показаны результаты, подтверждающие изменение в отношении популяции интерферон-(IFN)-γ-экспрессирующих CD4+ или CD8+ T-клеток, обусловленное совместным введением RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad и ингибитора контрольной точки иммунного ответа (антитела к PD-1) в популяции лимфоцитов, инфильтрованных в опухолевые ткани.
На фиг. 17 показаны результаты, подтверждающие изменение экспрессии IFN-γ в опухолевых тканях, обусловленное совместным введением RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad и ингибитора контрольной точки иммунного ответа (антитела к PD-1).
На фиг. 18 показаны результаты, подтверждающие изменение объема опухолей, обусловленное совместным введением RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad и ингибитора контрольной точки иммунного ответа (антитела к PD-1) в условиях устойчивости к ингибитору контрольной точки иммунного ответа.
На фиг. 19 показаны результаты, подтверждающие изменение объема опухолей в день 23 после введения, обусловленное совместным введением RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad и ингибитора контрольной точки иммунного ответа (антитела к PD-1) в условиях устойчивости к ингибитору контрольной точки иммунного ответа.
На фиг. 20 показаны результаты, подтверждающие изменение в отношении инфильтрации ингибитора контрольной точки иммунного ответа (антитела к PD-1) в опухолевые ткани при введении RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad, и показаны результаты количественного определения накопления меченного Alexa 488 αPD-1 в опухолевых тканях с помощью иммунофлуоресцентного анализа.
На фиг. 21 показаны результаты, подтверждающие изменение в отношении инфильтрации ингибитора контрольной точки иммунного ответа (антитела к PD-1) в опухолевые ткани при введении RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad, и показаны результаты, подтверждающие, на основе иммунофлуоресценции, что меченное Alexa 488 αPD-1 локализируется в участке, где имеет место экспрессия CD4+ или CD8+ T-клетками.
На фиг. 22 показаны результаты, подтверждающие изменение в отношении системной инфильтрации ингибитора контрольной точки иммунного ответа (антитела к PD-1) при введении RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad, и показаны результаты анализа изображения, полученного c помощью позитронной эмиссионной томографии (PET) с использованием антител, в динамике.
На фиг. 23 показаны результаты, подтверждающие изменение в отношении системной инфильтрации ингибитора контрольной точки иммунного ответа (антитела к PD-1) при введении RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad, и показаны результаты оценки и сравнения распределения или поглощения 64CU-αPD-1 в различных тканях, включая опухолевые ткани, в виде %ID/г.
Способы осуществления настоящего изобретения
Далее настоящее изобретение будет описано более подробно.
Настоящее изобретение относится к рекомбинантному аденовирусу, включающему: ген, кодирующий интерлейкин 12 (IL-12); ген, кодирующий гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF); и ген, кодирующий релаксин, или рекомбинантному аденовирусу, включающему: ген, кодирующий IL-12; и ген, кодирующий shRNA, подавляющую экспрессию VEGF.
Хотя генная иммунотерапия рака была разработана как более перспективный подход, опухоли также выработали множество «стратегий», позволяющих избежать системы иммунологического надзора. С целью преодоления этих сложностей и усиления эффектов противоракового иммунитета была сконструирована система на основе онколитического аденовируса (RdB/IL12/shVEGF Ad, RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad), одновременно экспрессирующая IL-12 и нацеленную на ген фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) короткую РНК, образующую шпильки (shRNA), или IL-12 и GM-CSF-релаксин, в качестве подходящего терапевтического адъюванта для восстановления иммуносупрессии и повышения противоопухолевого иммунитета. IL-12 служит для повышения противоопухолевого иммунитета путем индуцирования дифференцировки Т-хелперов 1 и активации цитотоксичности цитотоксических T-лимфоцитов и естественных клеток-киллеров. Известно, что shVEGF и GM-CSF служат для усиления иммунного ответа CD4+ и CD8+ T-клеток посредством содействия пролиферации и созреванию T-клеток и дендритных клеток и стимуляции DC к содействию дифференцировке DC в APC соответственно, и ожидается, что такие эффекты дополнительно усиливают функцию IL-12. Таким образом, авторы настоящего изобретения впервые предприняли попытки протестировать генную иммунотерапию с применением технического признака аденовируса, одновременно экспрессирующего IL-2 и shVEGF или IL-12 и GM-CSF-релаксин, на опухолях. Согласно одному примеру настоящего изобретения, в результате введения рекомбинантного аденовируса (RdB/IL12/shVEGF Ad, RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad) в модели меланомы на животных было экспериментально подтверждено, что степень ингибирования роста опухоли, доля животных с полной ремиссией и доля выживших мышей увеличивались.
Кроме того, IL-12 привлек значительное внимание в качестве основного цитокина для применения при противораковой иммунотерапии, и, в частности, в методе противораковой иммунотерапии в случае пациентов с ослабленным иммунитетом организма повторное введение IL-12 зачастую рассматривалось для достижения оптимальной терапевтической эффективности. Однако в клинической практике известно, что IL-12 характеризуется цитокин-ассоциированной токсичностью для всего организма, в частности, почек, и, таким образом, его применение характеризуется техническим ограничением, заключающимся в том, что IL-12 в качестве противоракового терапевтического средства должен применяться в пределах ограниченного диапазона доз. Исходя из этих технических условий, рекомбинантный аденовирус, одновременно экспрессирующий ген IL-12 в соответствии с настоящим изобретением и дополнительный ген, характеризуется отличающимся техническим признаком, заключающимся в решении проблемы токсичности для нормальных клеток вследствие высокой дозы и необходимости повторного введения IL-12, что было отмечено как ограничение противораковой иммунотерапии в предшествующем уровне техники, посредством индуцирования высокого онколитического эффекта даже при низком титре вируса.
Соответственно, рекомбинантный аденовирус по настоящему изобретению характеризуется тем, что он включает ген, кодирующий IL-12, и включает любое из гена, кодирующего GM-CSF, гена, кодирующего релаксин, и гена, кодирующего shRNA, подавляющую экспрессию VEGF.
Применяемый в настоящем изобретении «ген, кодирующий IL-12», предусматривает последовательность гена IL-12A (p35) и последовательность гена IL-12B (p40), и может предусматривать последовательность, кодирующую IRES, между последовательностью гена IL-12A (p35) и последовательностью гена IL-12B (p40) для обеспечения эффективной трансляции вирусного белка. Предпочтительно последовательность гена IL-12A (p35), последовательность гена IL-12B (p40) и последовательность, кодирующая IRES, могут состоять из SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 и SEQ ID No. 3 соответственно, но не ограничиваются ими.
Применяемые в настоящем изобретении «ген, кодирующий GM-CSF» и «ген, кодирующий релаксин» предусматривают последовательность гена GM-CSF и последовательность гена релаксина соответственно, и могут также предусматривать последовательность, кодирующую IRES, между последовательностью гена GM-CSF и последовательностью гена релаксина. Предпочтительно последовательность гена GM-CSF, последовательность гена релаксина и последовательность, кодирующая IRES, могут состоять из SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5 и SEQ ID No. 3 соответственно, но не ограничиваются ими.
Применяемый в настоящем изобретении «ген, кодирующий shRNA, подавляющую экспрессию VEGF», имеет шпилечную структуру, и относится к гену, способному опосредовать РНК-интерференцию или сайленсинг генов. Ген содержит последовательность, комплементарную мРНК VEGF, и термин «комплементарный» означает не только случай 100% комплементарности, но также неполную комплементарность, достаточную для обеспечения возможности подавления экспрессии гена VEGF посредством механизма РНК-интерференции, и означает предпочтительно 90% комплементарность, более предпочтительно 98% комплементарность и наиболее предпочтительно 100% комплементарность. В настоящем описании случай 100% комплементарности конкретно описан как полная комплементарность. В настоящем изобретении, хотя продукт гена также описан как shVEGF, но не ограничивается им, продукт гена может комплементарно связываться с мРНК VEGF, представленной SEQ ID No. 6 или 7, для подавления экспрессии VEGF.
Подразумевается, что последовательности гена также предусматривают последовательность гена, характеризующуюся значительной степенью идентичности или значительной степенью подобия. Вышеупомянутая значительная степень идентичности относится к случайной последовательности, отличающейся от последовательности по настоящему изобретению, и характеризующейся по меньшей мере 80% гомологией, более предпочтительно 90% гомологией и наиболее предпочтительно 95% гомологией с последовательностью по настоящему изобретению при выравнивании ее на соответствие последовательности по настоящему изобретению в максимально возможной степени, и выровненные последовательности анализируют с применением алгоритма, обычно применяемого в данной области. Вышеупомянутая значительная степень подобия в совокупности относится ко всем изменениям в последовательности гена, таким как удаление или вставка одного или нескольких оснований, которые не влияют на цель настоящего изобретения по минимизации гомологичной рекомбинации с рекомбинантным аденовирусным вектором. Следовательно, последовательность гена по настоящему изобретению не ограничена приведенными в качестве примера последовательностями SEQ ID NO 1-6, и подразумевается, что она входит в объем правовой охраны настоящего изобретения при условии, что последовательность в значительной степени не влияет на активность конечного продукта, требуемого согласно настоящему изобретению.
Между тем, в качестве рекомбинантного аденовируса по настоящему изобретению можно применять онколитический аденовирус, широко известный в данной области. Согласно одному примеру настоящего изобретения, рекомбинантный аденовирус содержит активный ген E1A и инактивированный ген E1B-19, инактивированный ген E1B-55 или инактивированный ген E1B-19/E1B-55. В настоящем описании термин «инактивация», применяемый по отношению к гену, означает, что транскрипция гена и/или трансляция продукта гена не осуществляется надлежащим образом, и функция нормального белка, кодируемого геном, не проявляется. Например, инактивированный ген E1B-19 представляет собой ген, неспособный продуцировать активный белок E1B весом 19 кДа вследствие модификации в гене (замены, добавления и частичного или полного удаления). Удаление E1B-19 может обеспечить повышение способности к уничтожению клеток, и удаление гена E1B-55 делает рекомбинантный аденовирус опухолеспецифическим (см. заявку на патент Республики Корея №2002-23760). Термин «удаление», применяемый по отношению к вирусной геномной последовательности в настоящем описании, означает полное удаление и частичное удаление соответствующей последовательности.
В соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения рекомбинантный аденовирус содержит область E1A, причем его область E1B, то есть E1B, кодирующий белки весом 19 кДа и 55 кДа (E1B), удалена, и удалена область E3 (E3). Рекомбинантный аденовирус, включающий ген E1A, будет обладать воспроизводимыми характеристиками. Ген, кодирующий IL-12, вставляют в место удаленной области E1B рекомбинантного аденовируса, и гены, кодирующие GM-CSF и релаксин или ген, кодирующий shRNA, подавляющую экспрессию VEGF, вставляют в место области E3. Между тем, сайт E1A предусматривает модификацию, при которой остаток Glu 45 заменен на Gly, и модификацию, при которой последовательность из аминокислот 121-127 полностью заменена на Gly, в нуклеотидной последовательности, кодирующей Rb-связывающий сайт, расположенный в последовательности гена E1A.
Кроме того, в настоящем изобретении также можно применять вирусы, отличные от аденовируса. Вирусы, которые можно применять в настоящем изобретении, предпочтительно могут представлять собой вирусы осповакцины (Puhlmann M. et al., Human Gene Therapy 10:649-657(1999)), лентивирусы (Wang G. et al., J. Clin. Invest. 104(11): R55-62(1999)) или вирусы простого герпеса (Chamber R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 92:1411-1415(1995)), но не ограничиваются ими.
Применяемый в настоящем изобретении рекомбинантный аденовирус содержит промотор, функционирующий в животных клетках, предпочтительно клетках млекопитающих. Промотор, подходящий для настоящего изобретения, предусматривает промотор, происходящий из вируса млекопитающего, и промотор, происходящий из генома клеток млекопитающего, и предусматривает, например, промотор цитомегаловируса (CMV), промотор U6 и промотор H1, длинный концевой повтор (LTR) вируса лейкоза мышей (MLV) в качестве промотора, ранний промотор аденовируса, поздний промотор аденовируса, промотор гена 7.5K вируса осповакцины, промотор вируса обезьян 40 (SV40), промотор гена тимидинкиназы вируса простого герпеса (HSV tk), промотор вируса саркомы Рауса (RSV), промотор гена фактора элонгации 1-альфа (EF1 α), промотор гена металлотионеина, промотор гена β-актина, промотор гена IL-2 человека, промотор гена IFN человека, промотор гена IL-4 человека, промотор гена лимфотоксина человека, промотор гена GM-CSF человека, индуцируемый промотор, специфический в отношении раковых клеток промотор [например, промотор гена обратной транскриптазы теломеразы (TERT), модифицированный TERT-промотор, промотор гена простатического специфического антигена (PSA), промотор гена простатического специфического мембранного антигена (PSMA), промотор гена эмбрионального опухолевого антигена (CEA), промотор гена сурвивина, промотор гена E2F, модифицированный промотор гена E2F, промотор гена альфа-фетопротеина (AFP), модифицированный AFP-промотор, гибридный E2F-AFP-промотор и гибридный E2F-TERT-промотор], тканеспецифичный промотор (например, промотор гена альбумина), промотор гена фосфоглицераткиназы (PGK) человека и промотор гена фосфоглицераткиназы (PGK) мыши, но не ограничивается ими. Наиболее предпочтительно промотором является промотор CMV. Предпочтительно, чтобы в экспрессионной конструкции для экспрессии трансгена последовательность полиаденилирования была присоединена ниже трансгена по последовательности. Последовательность полиаденилирования предусматривает терминатор гена бычьего гормона роста (Gimmi, E. R., et al., Nucleic Acids Res. 17:6983-6998(1989)), происходящую из SV40 последовательность полиаденилирования (Schek, N, et al., Mol. Cell Biol. 12:5386-5393(1992)), поли(А) ВИЧ-1 (Klasens, B. I. F., et al., Nucleic Acids Res. 26:1870-1876(1998)), поли(А) гена β-глобина (Gil, A., et al, Cell 49:399-406(1987)), поли(А) гена TK HSV (Cole, C. N. and T. P. Stacy, Mol. Cell. Biol. 5:2104-2113(1985)) или поли(А) полиомавируса (Batt, D. B and G. G. Biol. 15:4783-4790(1995)), но не ограничивается ими.
В применяемом в настоящем изобретении рекомбинантном аденовирусе последовательность гена IL-12, последовательность гена GM-CSF-релаксина или последовательность гена shVEGF функционально связаны с промотором. В контексте настоящего документа термин «функционально связан» относится к функциональному связыванию регуляторной последовательности для экспрессии нуклеиновой кислоты (например, набора промоторов, сигнальной последовательности и сайта связывания факторов регуляции транскрипции) и отличной последовательности нуклеиновой кислоты, и, соответственно, регуляторная последовательность осуществляет регуляцию транскрипции и/или трансляции отличной последовательности нуклеиновой кислоты.
Рекомбинантный аденовирус по настоящему изобретению может дополнительно содержать ген устойчивости к антибиотикам и репортерный ген (например, зеленого флуоресцентного белка (GFP), люциферазы и β-глюкуронидазы) в качестве селективных маркеров. Ген устойчивости к антибиотикам предусматривает ген устойчивости к антибиотикам, обычно применяемый в данной области, например, ген, обеспечивающий устойчивость к ампициллину, гентамицину, карбенициллину, хлорамфениколу, стрептомицину, канамицину, генетицину, неомицину и тетрациклину, и, предпочтительно, представляет собой ген устойчивости к неомицину. Вышеупомянутый селективный маркер может экспрессироваться даже в системе экспрессии, соединенной посредством отдельного промотора или последовательности, кодирующей IRES (участок внутренней посадки рибосомы), систем 2A (системы F2A, системы P2A, системы T2A), и IRES, который можно применять в настоящем изобретении, представляет собой регуляторную последовательность, обнаруживаемую в РНК некоторых типов вирусов и клеток.
Другой аспект настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции для предупреждения или лечения рака, причем композиция включает рекомбинантный аденовирус; и фармацевтически приемлемый носитель; медицинскому применению рекомбинантного аденовируса для предупреждения или лечения рака; и способу лечения рака, причем способ предусматривает стадию введения индивидууму терапевтически эффективного количество рекомбинантного аденовируса.
Поскольку в фармацевтической композиции по настоящему изобретению применяется вышеописанный рекомбинантный аденовирус, описание общего содержания между ними будет опущено во избежание излишнего усложнения настоящего описания.
В контексте настоящего документа термин «предупреждение» относится ко всем механизмам, которые обеспечивают подавление рака (опухолей) или задержку проявления рака (опухолей) путем введения фармацевтической композиции в соответствии с настоящим изобретением.
В контексте настоящего документа термин «лечение» относится ко всем механизмам, которые обеспечивают уменьшение интенсивности или благоприятное изменение симптомов рака (опухолей) путем введения фармацевтической композиции в соответствии с настоящим изобретением.
В настоящем изобретении «индивидуум» относится к субъекту, нуждающемуся в лечении заболевания, и, более конкретно, относится к млекопитающему, такому как человек или отличный от человека примат, грызун (крыса, мышь, морская свинка и т.д.), мышь, собака, кошка, лошадь, корова, овца, свинья, коза, верблюд и антилопа.
«Рак», который представляет собой заболевание, подлежащее предупреждению или лечению с помощью фармацевтической композиции по настоящему изобретению, в общем случае относится к заболеваниям, связанным с клетками, характеризующимися «агрессивными» признаками, в случае которых клетки игнорируют нормальные ограничения в отношении роста и продолжают делиться и расти, признаками, проявляющимися в инвазии с проникновением в окружающие ткани, и метастатическими признаками, проявляющимися в распространении в другие участки организма. В настоящем изобретении термин «рак» применяют в том же смысле, что и злокачественная опухоль, и он может предусматривать солидную опухоль и опухоль кроветворных органов. Например, рак может представлять собой любое, выбранное из группы, состоящей из рака желудка, рака легкого, немелкоклеточного рака легкого, рака молочной железы, рака яичника, рака печени, рака бронхов, рака носоглотки, рака гортани, рака поджелудочной железы, рака мочевого пузыря, рака толстой кишки, рака шейки матки, рака кости, немелкоклеточного рака кости, злокачественного заболевания системы крови, рака кожи, рака головы и шеи, рака матки, рака толстой и прямой кишки, рака перианальной области, рака толстой кишки, рака маточной трубы, рака эндометрия, рака влагалища, рака вульвы, болезни Ходжкина, рака пищевода, рака тонкого кишечника, рака эндокринной системы, рака щитовидной железы, рака паращитовидной железы, рака надпочечников, саркомы мягких тканей, рака уретры, рака полового члена, рака предстательной железы, хронического или острого лейкоза, лимфоцитарной лимфомы, рака почки или мочеточника, почечно-клеточной карциномы, карциномы почечной лоханки, рака слюнной железы, саркомы, псевдомиксомы брюшины, гепатобластомы, рака яичка, глиобластомы, карциномы губы, эмбрионально-клеточных опухолей яичника, базальноклеточной карциномы, множественной миеломы, рака желчного пузыря, хороидальной меланомы, рака фатерова сосочка, перитонеального рака, рака языка, мелкоклеточного рака, детской лимфомы, нейробластомы, рака двенадцатиперстной кишки, рака мочеточника, астроцитомы, менингиомы, рака почечной лоханки, рака наружных половых органов, рака тимуса, опухолей центральной нервной системы (ЦНС), первичной лимфомы центральной нервной системы, опухолей спинного мозга, нейроглиомы ствола головного мозга и аденомы гипофиза, и может также представлять собой рецидивный рак, но не ограничивается указанным.
Кроме того, фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может дополнительно содержать ингибитор контрольной точки иммунного ответа.
В контексте настоящего документа термин «контрольная точка иммунного ответа» в общем случае относится к белку, вовлеченному в опосредование стимуляции или подавления сигнальных молекул иммунного ответа на поверхности иммунных клеток, и раковые клетки избегают системы иммунологического надзора подвергаясь такому воздействию, в результате которого стимуляция иммунного ответа и, как результат, ингибирование раковых клеток, не осуществляются надлежащим образом с участием контрольной точки иммунного ответа. Предпочтительно ингибитор контрольной точки иммунного ответа может представлять собой антагонист PD-1, антагонист PD-L1, антагонист PD-L2, антагонист CD27, антагонист CD28, антагонист CD70, антагонист CD80, антагонист CD86, антагонист CD137, антагонист CD276, антагонист KIR, антагонист LAG3, антагонист TNFRSF4, антагонист GITR, антагонист GITRL, антагонист 4-1BBL, антагонист CTLA-4, антагонист A2AR, антагонист VTCN1, антагонист BTLA, антагонист IDO, антагонист TIM-3, антагонист VISTA, антагонист KLRA и их комбинацию, но не ограничивается ими.
Ингибитор контрольной точки иммунного ответа представляет собой антагонист или антитело, нацеленное на белок, являющийся контрольной точкой иммунного ответа, и проявляет противораковый эффект, обусловленный иммунным ответом в результате усиления действия белка, который стимулирует иммунный ответ, или в результате блокирования белка, который подавляет иммунный ответ. Поскольку ингибитор контрольной точки иммунного ответа использует систему иммунного ответа, которая обладает превосходным свойством памяти, в дополнение к преимуществам, заключающимся в меньшем числе случаев побочных эффектов, таких как рвота или алопеция, по сравнению с общепринятыми цитотоксическими противораковыми средствами, и значительных терапевтических эффектах, терапевтический эффект может сохраняться в течение длительного периода времени, даже после прекращения введения лекарственного средства, однако об усилении противоракового эффекта за счет совместного введения с рекомбинантным аденовирусом ранее не было известно. Таким образом, авторы настоящего изобретения предприняли попытки протестировать совместное введение с ингибитором контрольной точки иммунного ответа с целью усиления противоракового эффекта рекомбинантного аденовируса, и имеет место еще один технический признак, заключающийся в том, что обеспечивается медицинское применение рекомбинантного аденовируса для предупреждения или лечения рака в виде состава для совместного введения с ингибитором контрольной точки иммунного ответа.
Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может содержать фармацевтически приемлемый носитель в дополнение к активному ингредиенту. В этом случае фармацевтически приемлемый носитель обычно применяют в процессе составления, и он предусматривает лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбит, маннит, крахмал, гуммиарабик, фосфат кальция, альгинат, желатин, силикат кальция, микрокристаллическую целлюлозу, поливинилпирролидинон, целлюлозу, воду, сироп, метилцеллюлозу, метилгидроксибензоат, пропилгидроксибензоат, тальк, стеарат магния, минеральное масло и т.д., но не ограничивается ими. Кроме того, фармацевтически приемлемый носитель может дополнительно предусматривать смазывающее вещество, смачивающее средство, подсластитель, вкусоароматическое средство, эмульгатор, суспендирующее средство, консервант и т.д., в дополнение к вышеупомянутым ингредиентам. Подходящие фармацевтически приемлемые носители и составы подробно описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995).
Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно вводить перорально или парентерально (например, внутривенно, подкожно, внутрибрюшинно или наносить местно), и в соответствии с примером по настоящему изобретению усиливающую противоопухолевый иммунитет композицию по настоящему изобретению предпочтительно можно водить прямо в опухоль. Доза будет варьироваться в зависимости от состояния пациента и веса тела, тяжести заболевания, формы лекарственного средства, пути и продолжительности введения, но при этом может быть соответствующим образом выбрана специалистами в данной области.
Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению вводят в фармацевтически эффективном количестве. В настоящем изобретении «фармацевтически эффективное количество» означает количество, достаточное для лечения заболеваний при обоснованном соотношении польза/риск, приемлемом для терапевтического лечения, и уровень эффективной дозы может быть определен в соответствии с факторами, включающими тип заболевания у пациентов, тяжесть заболевания, активность лекарственных средств, чувствительность к лекарственным средствам, время введения, путь введения, скорость экскреции, период лечения и одновременно применяемые лекарственные средства, и другие факторы, хорошо известные в области медицины. Другую фармацевтическую композицию в соответствии с настоящим изобретением можно вводить в виде отдельного терапевтического средства или в комбинации с другими терапевтическими средствами, можно вводить с терапевтическими средствами предшествующего уровня техники последовательно или одновременно, и можно вводить в виде однократной дозы или в виде многократных доз. Важно вводить композицию в минимальном количестве, которое позволяет достичь максимального эффекта без каких-либо побочных эффектов, принимая во внимание все вышеупомянутые факторы, и специалисты в данной области без труда смогут определить такое количество.
Далее предлагаются предпочтительные примеры, помогающие понять настоящее изобретение. Однако нижеследующие примеры приведены исключительно для более легкого понимания настоящего изобретения, и содержание настоящего изобретения не ограничивается нижеследующими примерами.
Примеры
Материалы для экспериментов и экспериментальные способы
1. Эксперимент на животных
Самцы мышей C57BL/6 возрастом 6-8 недель были приобретены у Charles River Laboratories International, Inc. (Уилмингтон, Массачусетс), и их размножали в камере с ламинарным потоком воздуха в стерильных условиях. Все эксперименты на животных осуществляли с одобрения Ассоциации по аттестации и аккредитации содержания лабораторных животных (Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care, AAALAC), и проводили в соответствии с руководящими принципами, установленными Институциональным комитетом по содержанию и использованию животных Университета Ханьянг.
2. Получение онколитического аденовируса
Аденовирус (Ad), в котором гены IL-12 и GM-CSF-релаксина или shVEGF были введены в место области E1 и область E3 соответственно, получали, как проиллюстрировано на фигурах 1 и 2.
В частности, для конструирования челночного вектора Ad E1, экспрессирующего IL-12, был получен челночный вектор pXC1RdB/IL12 E1 путем вырезания гена IL-12 мыши из pCA14/IL12 и субклонирования гена в челночный вектор pXC1RdB E1. Кроме того, для конструирования shVEGF-экспрессирующего челночного вектора E3, полноразмерную комплементарную ДНК мыши, кодирующую shVEGF, клонировали с помощью RT-PCR с применением общей РНК, полученной из происходящих из костного мозга дендритных клеток. Комплементарная ДНК, кодирующая shVEGF (нуклеотиды 53-982 L15435 в Национальном центре биотехнологической информации), была получена с применением следующего набора праймеров: смысловой (5'-gatcccggaaggagagcagaagtcccatgttcaagagacatgggacttctgctctcctt tttttttggaaa-3'), антисмысловой (5'-tttccaaaaaaa aaggagagcagaagtcccatgtctcttgaacatgggacttctgctctccttccgggatc-3'). ПЦР-продукт расщепляли с использованием BamHI/Hind III, а затем клонировали в BamHI/Hind III-обработанный челночный вектор pSP72 E3/CMV-polA Ad E3, с получением тем самым челночного вектора pSP72 E3/shVEGF E3. Кроме того, получали челночный вектор pSP72 E3/GMCSF-RLX E3 путем клонирования гена GMCSF-IRES-релаксина в челночный вектор pSP72 E3/CMV-polA Ad E3.
Для гомологичной рекомбинации E. coli BJ5183 трансформировали одновременно челночным вектором pXC1RdB/IL12 E1 и pdE1/shVEGF или pdE1/GMCSF-RLX, с получением тем самым pRdB/IL12/shVEGF Ad и pRdB/IL12/GMCSF-RLX Ad. Все вирусы были получены с применением клеток 293, и очистку, титрование и качественный анализ аденовируса осуществляли в соответствии с уровнем техники.
3. Оценка противоракового эффекта с применением животной модели
Клетки B16-F10 (5×105) путем подкожной инъекции вводили в правый бок 6-7-недельных самцов иммунокомпетентных мышей C57BL/6. Если объем опухоли достигал примерно 100 мм3, мышей делили на группы с подобными показателями размера опухоли, и вводили им онколитические аденовирусы (RdB/IL12/shVEGF Ad; RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad) внутриопухолево в концентрации 5×109 VP в день 1, 3 и 5. Кроме того, с целью подтверждения противоракового эффекта, обусловленного совместным введением с ингибитором контрольной точки иммунного ответа, в день 3, 6 и 9 мышам, которым вводили онколитический аденовирус, внутрибрюшинно вводили антитело к PD-L1, антитело к PD-1 и антитело к CTLA-4 в качестве ингибиторов контрольной точки иммунного ответа в концентрации 200 мкг, и с целью дополнительной оценки синергического эффекта, обусловленного совместным введением с ингибитором контрольной точки иммунного ответа, проводили эксперимент, аналогичный вышеописанному, снова с применением онколитического аденовируса в дозе 1×109 VP, которая является в пять раз более низкой, чем доза из предыдущего эксперимента с применением 5×109 VP. Кроме того, в этом эксперименте PBS-обработанную группу (PBS) и группы, обработанные только ингибитором контрольной точки иммунного ответа (антитело к PD-L1, антитело к PD-1 и антитело к CTLA-4), применяли в качестве контролей.
После этого с применением животной модели оценивали противораковый эффект путем измерения диаметра опухоли по вертикали с применением штангенциркуля для ежедневного отслеживания роста опухолей и подтверждения изменения в отношении доли выживших животных с течением времени. Кроме того, рассчитывали объем опухоли с применением следующей формулы: объем = 0,523L (W)2, в которой L обозначает длину, а W обозначает ширину.
4. Оценка противоракового эффекта по иммунологической памяти
В день 50 после введения путем инъекции первичной опухоли в 3 животных моделях, в которых индуцировали меланому, успешно обработанным мышам путем инъекции вводили вторичную опухоль (повторная стимуляция) (в день 25 начиная с момента времени, когда первичная опухоль не могла быть привита). После этого таким же образом, как описано выше, оценивали противоопухолевой эффект иммунологической памяти путем измерения диаметра опухоли по вертикали для отслеживания роста опухолей раз в два дня и расчета среднего объема опухоли. В этом эксперименте группу, в которой развитие меланомы индуцировалось у здоровых мышей (нормальных), применяли в качестве контроля.
5. Статистический анализ
Все данные выражены в виде среднего ± стандартная ошибка. Сравнения выполняли с применением программного обеспечения Stat View (Abacus Concepts, Inc., Беркли, Калифорния) и критерия Манна-Уитни (непараметрический критерий суммы рангов). P-значения, равные 0,05 или меньше, свидетельствуют о статистической значимости (*, P<0,05; **, P<0,01).
Результаты экспериментов
1. Подтверждение противоракового эффекта у мышей с меланомой
Целью авторов настоящего изобретения было подтвердить противораковый эффект рекомбинантного аденовируса и/или ингибитора контрольной точки иммунного ответа путем сравнения объема опухоли, введенной путем инъекции мышам с меланомой, наличия полной ремиссии и доли выживших мышей.
В результате было подтверждено, что у контрольных мышей, обработанных PBS или антителом к PD-L1, опухоли увеличивались достаточно быстро, чтобы соответственно к дню 11 или дню 15 объем опухоли достиг 3000 мм3 или более, что, таким образом, считается агрессивным ростом опухоли, тогда как в группе, обработанной RdB/IL12/shVEGF Ad или RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad, по результатам сравнения с PBS-обработанной группой в день 22, рост опухоли был подавлен на 99,3% или 99,5% (фигуры 3A и 4A) соответственно. Кроме того, если аденовирус и антитело к PD-L1 вводили совместно (RdB/IL12/shVEGF Ad+PD-L1, RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad+PD-L1), объем опухоли уменьшался более заметно, чем в группе, обработанной аденовирусом или антителом к PD-L1 по отдельности, таким же образом, как описано выше. Хотя противораковый эффект, аналогично таковому в группе, обработанной только аденовирусом (RdB/IL12/shVEGF Ad, RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad), проявлялся до дня 27, начиная с момента, когда проходил один месяц, рост опухолей непрерывно подавлялся в группе, которой совместно с аденовирусом вводили антитело к PD-L1 , тогда как в группе, обработанной только аденовирусом, темп роста опухолей со временем повышался, следовательно, можно было подтвердить значимую разницу в объеме опухоли между группой, обработанной только аденовирусом, и группой, которой совместно вводили аденовирус и антитело (фигуры 3A и 4A). Кроме того, можно было наблюдать, что в день 50 в контрольной группе, обработанной PBS или антителом к PD-L1, не можно было подтвердить полную ремиссию, тогда как в группе с введением RdB/IL12/shVEGF Ad или RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad доли выживших мышей составляли 66% (4/6) и 50% (3/6) соответственно, и в случае, когда аденовирус и антитело к PD-L1 вводили совместно, доли выживших животных составляли 66% (4/6) и 100% (6/6), что соответствует полной ремиссии. Кроме того, было подтверждено, что все мыши в группе с введением RdB/IL12/shVEGF Ad+PD-L1 или RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad+PD-L1 выживали до дня 44 или дня 50 соответственно, тогда как к тому же моменту времени в группе с введением RdB/IL12/shVEGF Ad или RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad наблюдали долю выживших животных 66% (4/6), и все мыши в контрольной группе погибали от опухолей (фигуры 3B и 4B). Эти результаты означают, что противораковый эффект в результате лечения только антителом к PD-L1 в качестве ингибитора контрольной точки иммунного ответа был довольно незначительным, тогда как в случае RdB/IL12/shVEGF Ad или RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad проявлялся превосходный противораковый эффект, и противораковый эффект рекомбинантного аденовируса дополнительно усиливался при совместном введении с антителом к PD-L1.
2. Противораковый эффект, обусловленный совместным введением с ингибитором контрольной точки иммунного ответа
Авторы настоящего изобретения сравнили противораковые эффекты между введением только рекомбинантного аденовируса и совместным введением рекомбинантного аденовируса и ингибитора контрольной точки иммунного ответа с применением онколитического аденовируса в дозе (1×109 VP), которая является в пять раз более низкой, чем доза из предыдущего эксперимента с применением 5×109 VP, для более подробной оценки синергического эффекта, обусловленного совместным введением с ингибитором контрольной точки иммунного ответа. Кроме того, на основе полученных результатов, в случае, когда в качестве ингибитора контрольной точки иммунного ответа применяли антитело к PD-L1, антитело к PD-1 или антитело к CTLA-4, сравнивали противораковые эффекты этих антител, и в этом эксперименте в качестве рекомбинантного аденовируса применяли RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad.
В итоге, в день 18 по результатам сравнения с объемом опухоли в PBS-обработанной группе, процент подавления роста опухоли в группе с введением RdB/IL12/shVEGF Ad составлял 92,9%, при этом процент подавления роста опухоли повышался до 99,7% в результате совместного введения с антителом к PD-1, и процент подавления роста опухоли в группе с введением RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad (90,1%) также значительно повышался до 98,9% в результате совместного введения с антителом к PD-1 (фигуры 5 и 6). Кроме того, только у 17% (1/6) мышей в группе с введением RdB/IL12/shVEGF Ad была достигнута полная ремиссия, при этом в группе с введением RdB/IL12/shVEGF Ad+PD-1 доля животных с полной ремиссией составляла 83% (5/6), что соответствует значительному повышению.
Кроме того, с целью подтверждения того, проявлялся ли синергический эффект, обусловленный совместным введением с ингибитором контрольной точки иммунного ответа также в случае других типов рекомбинантных аденовирусов, вводили совместно HmT-Rd19-K35/IL21 Ad, RdB/GMCSF/shVEGF Ad или YKL-1/GMCSF/B7.1 Ad и антитело к PD-1, а затем подтверждали обусловленные ими противораковые эффекты. В результате, как проиллюстрировано на фиг. 7, факт заключается в том, что в случае большинства рекомбинантных аденовирусов объем опухоли уменьшался до некоторой степени за счет совместного введения антитела к PD-1, однако большинство рекомбинантных аденовирусов не характеризовались таким же заметным эффектом, как рекомбинантный аденовирус по настоящему изобретению (RdB/IL12/shVEGF Ad, RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad), и, в частности, эффект YKL-1/GMCSF/B7.1 Ad в целом не был превосходным при сравнении с таковым для группы, обработанной только антителом к PD-1. Из этих результатов можно было увидеть, что синергический эффект, обусловленный совместным введением с ингибитором контрольной точки иммунного ответа, не применим ко всем рекомбинантным аденовирусам, и является уникальным эффектом рекомбинантного аденовируса по настоящему изобретению.
Кроме того, было подтверждено, что, в результате подтверждения противоракового эффекта, обусловленного определенным типом ингибитора контрольной точки иммунного ответа, у контрольных мышей, обработанных PBS, антителом к PD-L1, антителом к PD-1 или антителом к CTLA-4, опухоли увеличивались достаточно быстро, чтобы соответственно к дню 11, 15, 18 или 11 объем опухоли достиг 3000 мм3 или более, что, таким образом, считается агрессивным ростом опухоли, тогда как в случае групп, обработанных RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad+антитело к PD-L1, RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad+антитело к PD-1 и RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad+антитело к CTLA-4, к дню 21, по результатам сравнения с PBS-обработанной группой, рост опухоли был значительно подавлен на 99,9%, 99,9% или 99,2% соответственно (фигуры 4A, 8A и 9A). Кроме того, в день 50 в группе с введением RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad доля животных с полной ремиссией составляла 50% (3/6), тогда как при совместном введении с антителом к PD-L1, антителом к PD-1 или антителом к CTLA-4 доля животных с полной ремиссией составляла 100% (6/6), 83% (5/6) и 83% (5/6) соответственно, что соответствует повышению. Кроме того, мыши, обработанные RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad+антитело к PD-L1, RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad+антитело к PD-1 и RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad+антитело к CTLA-4, выживали до дня 50, дня 50 или дня 30 соответственно, тогда как к тем же моментам времени в группе с введением RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad наблюдали долю выживших животных 66% (4/6), 66 (4/6) и 83% (5/6) соответственно (фигуры 4B, 8B и 9B). Из этих результатов видно, что даже при применении не только антитела к PD-L1, но также антитела к PD-1 или антитела к CTLA-4, противораковый эффект рекомбинантного аденовируса усиливался, однако можно было наблюдать, что при совместном введении с антителом к PD-L1 или антителом к PD-L1 ассоциированный с противораковым эффектом синергический эффект RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad был более значительным, чем таковой при совместном введении с антителом к CTLA-4.
3. Подтверждение наличия эффекта иммунологической памяти в отношении рецидивного рака
Целью авторов настоящего изобретения было подтвердить наличие эффекта иммунологической памяти и противоракового эффекта в отношении рецидивного рака, обусловленных рекомбинантным аденовирусом по настоящему изобретению или совместным введением рекомбинантного аденовируса и ингибитора контрольной точки иммунного ответа путем сравнения объема вторичных опухолей, введенных путем инъекции мышам с меланомой и т.д.
В результате, могло быть подтверждено, что в группе с введением RdB/IL12/shVEGF Ad рост вторичных опухолей был заметно ингибирован (фиг. 10A), и, в частности, рост вторичных опухолей был заметно ингибирован в результате совместного введения с антителом к PD-1 в качестве ингибитора контрольной точки иммунного ответа (фиг. 10B). Эти результаты означают, что рекомбинантный аденовирус по настоящему изобретению может обеспечить предупреждение рецидива опухолей в досрочной перспективе благодаря эффекту усиления противоопухолевого иммунного ответа за счет иммунологической памяти, что свидетельствует о том, что эффект может быть усилен в результате совместного введения с ингибитором контрольной точки иммунного ответа, как и в случае вышеописанного противоракового эффекта.
4. Верификация противоракового эффекта RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad
(1) Подтверждение паттернов экспрессии IL-12, GM-CSF и релаксина
С целью верификации противоракового эффекта, обусловленного коэкспрессией генов IL-12, GM-CSF и релаксина (RLX), был получен RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad, который представляет собой аденовирус, в котором ген IL-12 был вставлен в место области E1 аденовируса, а гены GM-CSF и релаксина были вставлены в место области E3 аденовируса, как описано выше. RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad представляет собой специфический в отношении раковых клеток онколитический аденовирус, в котором ген E1B, будучи ранним геном аденовируса, был удален, а ген E1A был модифицирован, и подтверждали уровень экспрессии IL-12, GM-CSF или RLX полученным аденовирусом. В частности, линию клеток рака поджелудочной железы сирийского хомяка (Hap-T1) инфицировали RdB/IL12/GMCSF-RLX при множественности инфекции (MOI) 0,2, 0,5, 1, 2 и 5, и спустя 48 часов собирали их среду. После этого уровни экспрессии IL-12 и GM-CSF подтверждали с помощью ферментного иммуносорбентного анализа (ELISA), а уровень экспрессии релаксина подтверждали с помощью полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (RT-PCR).
В результате, как проиллюстрировано на фигурах 11 и 12, уровень экспрессии IL-12, GM-CSF или релаксина повышался в зависимости от MOI аденовируса, следовательно, коэкспрессия генов могла быть экспериментально подтверждена.
(2) Усиление противоракового эффекта, обусловленного совместным введением с αPD-1, в животной модели опухоли с использованием сирийского хомяка
С целью верификации усиления противоракового эффекта, обусловленного совместным введением RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad и αPD-1, в животной модели опухоли с использованием сирийского хомяка, индуцированной введением путем подкожной инъекции линии клеток рака поджелудочной железы HaP-T1, животным внутриопухолево вводили 7×107 вирусных частиц (VP)/30 мкл RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad, и наряду с этим, внутрибрюшинно вводили 10 мг/кг αPD-1, а затем наблюдали обусловленное в результате изменение объема опухолей. Кроме того, в качестве группы сравнения применяли группу с введением только RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad.
В результате, как проиллюстрировано на фиг. 13, в случае опухолевой ткани, в которую вводили только RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad, опухоли росли непрерывно, так что в день 30 после первого введения вируса объем опухоли достигал 1,982±126 мм3, тогда как в группе с совместным введением RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad и αPD-1 рост опухолей до дня 30 после первого введения вируса был подавлен, с подавлением тем самым роста опухолей до уровня приблизительно 79% по сравнению с таковым в группе с введением одного из препаратов. Кроме того, в группе с совместным введением RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad и αPD-1 доля животных с полной ремиссией опухолей составляла приблизительно 50%, а в группе с введением только RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad полная ремиссия вовсе не наблюдалась (не проиллюстрировано). Таким образом, эти результаты свидетельствуют о том, что противораковая терапевтическая эффективность RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad заметно улучшается при совместном введении с αPD-1.
(3) Изменение опухолевой ткани, обусловленное совместным введением с αPD-1, в животной модели опухоли с использованием сирийского хомяка
С целью конкретного подтверждения изменения опухолевых тканей, обусловленного совместным введением RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad и αPD-1, после совместного введения 7×107 VP RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad и 10 мг/кг αPD-1, как описано выше, собранные опухолевые ткани подвергали иммуногистологическому анализу. Кроме того, в качестве группы сравнения и контроля применяли соответственно группу с введением только αPD-1 или RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad и группу с введением PBS.
В результате, как проиллюстрировано на фиг. 14, могло быть подтверждено, что в опухолевой ткани, в которую вводили PBS, место некроза почти не подтверждалось, тогда как большинство опухолевых тканей, в которые совместно вводили RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad и αPD-1, подвергались некрозу. Кроме того, эффект, обусловленный совместным введением, то есть заметно сниженная степень пролиферации опухолевых клеток (PCNA) и повышенная степень некроза (TUNEL), были исключительными в сравнении со случаем, когда вводили только αPD-1 или только RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad.
(4) Изменение в отношении популяций клеток и экспрессии IFN-γ в опухолевых тканях, обусловленное совместным введением с αPD-1
Для оценки того, могла ли быть индуцирована инфильтрация T-клеток в опухолевые ткани, и активация указанных клеток, вследствие повышения степени инфильтрации αPD-1 в опухолевые ткани посредством RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad, оценивали изменение в отношении популяции интерферон-(IFN)-γ-экспрессирующих CD4+ или CD8+ T-клеток в популяции инфильтрованных лимфоцитов в дренирующем лимфатическом узле (DLN) и опухолевых тканях. В результате, как проиллюстрировано на фигурах 15 и 16, в группе с введением только RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad или αPD-1 и в группе с совместным введением RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad и αPD-1 наблюдали, что популяция IFN-γ-экспрессирующих CD4+ и CD8+ T-клеток присутствовала на высоком уровне, по сравнению с группой с введением только PBS или αPD-1 (P<0,001 или P<0,01). В частности, могло быть подтверждено, что в группе с совместным введением RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad и αPD-1 популяция IFN-γ-экспрессирующих CD4+ и CD8+ T-клеток также была значимо увеличена по сравнению с группой, которой вводили только RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad или αPD-1 (P<0,001), и этот результат указывает на то, что совместное введение RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad и αPD-1 индуцирует инфильтрацию интерферон-(IFN)-γ-экспрессирующих CD4+ или CD8+ T-клеток в опухоли, и активацию указанных клеток.
Кроме того, для оценки уровня экспрессии IFN-γ в опухолевой ткани, в которую вводили аденовирус, опухолевые ткани извлекали из организма мышей, которым вводили аденовирус и т.д., и подвергали тонкому измельчению, а затем осуществляли ELISA-анализ уровня IFN-γ. В результате, как проиллюстрировано на фиг. 17, могло быть подтверждено, что при внутриопухолевом введении только PBS или αPD-1 IFN-γ вовсе не был выявлен, и в группе с введением только RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad было выявлено только 8,3 пг/мг IFN-γ на 1 г опухолевой ткани, тогда как в группе с совместным введением RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad и αPD-1 было выявлено 18,7 пг/мг IFN-γ на 1 г опухолевой ткани. Таким образом, было обнаружено, что вышеупомянутое совместное введение обеспечивало повышение активности иммунных клеток за счет повышения уровня экспрессии IFN-γ в опухолях, и, в конечном итоге, способствовало усилению противоракового эффекта.
(5) Подтверждение противоракового эффекта в условиях устойчивости к ингибитору контрольной точки иммунного ответа
Для оценки того, могло ли совместное введение RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad и αPD-1 характеризоваться оптимальной терапевтической эффективностью в условиях устойчивости к ингибитору контрольной точки иммунного ответа, оценивали эффект совместного введения в опухоли, предварительно обработанные αPD-1, в отношении подавления роста опухолей. В частности, если рост опухолей не подвергался эффективному подавлению путем введения только αPD-1 (в день 9 после первой обработки антителом), вводили RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad в общей сложности четыре раза с интервалом 2 дня. Кроме того, в качестве группы сравнения применяли группу с введением только αPD-1.
В результате, как проиллюстрировано на фиг. 18, введение RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad, начинающееся в случае, когда объем опухоли достигал 915±78 мм3, обеспечивало эффективное подавление роста опухолей в течение 10 дней, начиная с первого дня введения. Интересно, что в группе с введением только αPD-1 наблюдали быстрое увеличение скорости роста опухоли, и, таким образом, в ней не происходило подавление роста опухолей, тогда как в группе с совместным введением происходило непрерывное подавление роста опухолей, даже в ходе вышеупомянутого периода. Кроме того, по результатам сравнения изменения объема опухоли (в день 23 после введения), эффект в виде подавления роста в группе с совместным введением был наиболее заметным. Таким образом, в случае вышеупомянутого совместного введения оптимальную противораковую терапевтическую эффективность наблюдали даже в условиях устойчивости к ингибитору контрольной точки иммунного ответа. Соответственно, это свидетельствует о том, что вышеупомянутое совместное введение может стать видом терапии для пациента с толерантностью к ингибитору контрольной точки иммунного ответа в качестве единственного терапевтического препарата.
(6) Изменение в отношении инфильтрации αPD-1 в опухолевые ткани при введении RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad
Предполагалось, что экспрессия RLX в опухолевых тканях будет обуславливать синергическую противораковую терапевтическую эффективность за счет содействия внутриопухолевой инфильтрации αPD-1. Соответственно, была предусмотрена оценка того, обеспечивает ли RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad повышенную степень внутриопухолевой инфильтрации αPD-1 в ткани десмопластической опухоли поджелудочной железы. RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad вводили прямо в опухолевые ткани в день 0 или день 2, αPD-1 вводили внутрибрюшинно в день 2 (c: RdB/IL12/GMCSF-RLX + меченное Alexa 488 антитело к PD-1), и группу с введением только конъюгированного с Alexa 488 αPD-1 (b; меченное Alexa 488 антитело к PD-1) и группу с введением только PBS (a; PBS) применяли в качестве группы сравнения и контроля соответственно. Опухолевую ткань, обработанную, как описано выше, собирали в день 7, и с помощью иммунофлуоресцентного анализа количественно определяли накопление меченного Alexa 488 αPD-1 в опухолевой ткани. По результатам количественного определения накопления меченного Alexa 488 αPD-1 на единицу площади ткани, как проиллюстрировано на фиг. 20, в группе с введением только PBS или в группе с введением только αPD-1 наблюдали 14±2 A.U./мкм2 или 21±1 A.U./мкм2 соответственно, тогда как в группе с совместным введением наблюдали 32±6 A.U./мкм2. Исходя из результата можно было увидеть, что RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad обеспечивал заметное улучшение в отношении инфильтрации αPD-1 в опухолевые ткани и способствовал улучшению в отношении локализации αPD-1 в опухолевых тканях. Кроме того, с целью подтверждения того, локализировалось ли меченное Alexa 488 αPD-1 в участке, где имела место экспрессия CD4+ или CD8+ T-клетками, по отношению к каждой опухолевой ткани, в которую вводили PBS (a: PBS) или конъюгированное с Alexa 488 αPD-1 (b: меченное Alexa 488 антитело к PD-1) по отдельности или совместно вводили RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad и конъюгированное с Alexa 488 αPD-1 (c: RdB/IL12/GMCSF-RLX + меченное Alexa 488 антитело к PD-1), осуществляли иммуноокрашивание по CD4+ CD8+. В результате, как проиллюстрировано на фиг. 21, в группе с совместным введением совместную локализацию αPD-1 и CD4+ или CD8+ T-клеток наблюдали на более высоком уровне, чем в группе с введением только меченного Alexa 488 αPD-1.
Для оценки внутриопухолевой инфильтрации αPD-1 в отношении всего организма, 64Cu-αPD-1, в котором были конъюгированы αPD-1 и 64Cu, вводили наряду с RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad хомякам, которым вводили HaP-Ti с применением 1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7,10-тетрауксусной кислоты, с помощью вышеописанного способа, с получением тем самым иммуно-ПЭТ изображения. ПЭТ-сканирование осуществляли через 2, 12, 36 и 60 часов после введения 64Cu-αPD-1, и для анатомического описания основную ПЭТ-визуализацию осуществляли наряду с КТ. В качестве группы сравнения применяли группу с введением только 64Cu-αPD-1. В результате, как проиллюстрировано на фиг. 22, внутриопухолевое поглощение 64Cu-αPD-1 в группе с совместным введением и в группе с введением одного из препаратов, рассчитанное в виде SUV, было следующим: 0,26±0,06 и 0,36±0,05 (P=0,072) через 2 часа; 0,90±0,22 и 1,68±0,45 (P=0,018) через 12 часов; 2,14±0,19 и 2,97±0,67 (P=0,062) через 36часов; и 3,37±0,57 и 4,50±1,02 (P=0,043) через 60 часов. Таким образом, было обнаружено, что во все вышеупомянутые моменты времени внутриопухолевое поглощение 64Cu-αPD-1 в группе с совместным введением было значимо более высоким, чем в группе с введением только 64Cu-αPD-1. Кроме того, распределение или поглощение 64Cu-αPD-1 в различных тканях, включая опухолевые ткани, рассчитывали как %ID/г через 60 часов после введения 64Cu-αPD-1. В результате, как проиллюстрировано на фиг. 23, могло быть подтверждено, что поглощение, наблюдаемое в группе с введением одного из препаратов и в группе с совместным введением, было следующим: 1,80±0,13%ID/г, 2,80±0,41%ID/г (P<0,05) соответственно в опухолевых тканях; и 1,10±0,11%ID/г, 1,94±0,23%ID/г (P<0,05) соответственно в селезенке, и в группе с совместным введением степень поглощения 64Cu-αPD-1 была повышена как в опухолевых тканях, так и в селезенке. Кроме того, помимо этих тканей, дренирующий лимфатический узел (DLN), известный как обогащенный T-клетками участок, был увеличен в результате инфицирования RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad (результат не проиллюстрирован). Таким образом, если обобщить вышеупомянутые результаты экспериментов, можно увидеть, что инфицирование RdB/IL12/GMCSF-RLX Ad обеспечивало ремоделирование или разрушение внеклеточного матрикса в опухолевых тканях и повышение степени поглощения αPD-1 в опухолевых тканях за счет усиленного иммунного ответа, обусловленного IL-12 и GM-CSF, и, в результате, синергического эффекта, имеющего место при совместном введении.
Вышеизложенное описание настоящего изобретения приведено в иллюстративных целях, и специалисту в области, к которой относится настоящее изобретение, будет понятно, что настоящее изобретение без труда может быть модифицировано с получением других конкретных форм без изменения технической сути или основных признаков настоящего изобретения. Таким образом, следует понимать, что вышеописанные примеры во всех аспектах являются лишь иллюстративными, а не ограничивающими.
--->
<110> Genemedicine Co.,Ltd.
<120> Anticancer composition comprising oncolytic adenovirus and immune
checkpoint inhibitor
<130> G19E10C0255P/RU
<150> KR 10-2017-0026339
<151> 2017-02-28
<160> 9
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 648
<212> DNA
<213> IL-12A
<400> 1
atgtgtcaat cacgctacct cctctttttg gccacccttg ccctcctaaa ccacctcagt 60
ttggccaggg tcattccagt ctctggacct gccaggtgtc ttagccagtc ccgaaacctg 120
ctgaagacca cagatgacat ggtgaagacg gccagagaaa aactgaaaca ttattcctgc 180
actgctgaag acatcgatca tgaagacatc acacgggacc aaaccagcac attgaagacc 240
tgtttaccac tggaactaca caagaacgag agttgcctgg ctactagaga gacttcttcc 300
acaacaagag ggagctgcct gcccccacag aagacgtctt tgatgatgac cctgtgcctt 360
ggtagcatct atgaggactt gaagatgtac cagacagagt tccaggccat caacgcagca 420
cttcagaatc acaaccatca gcagatcatt ctagacaagg gcatgctggt ggccatcgat 480
gagctgatgc agtctctgaa tcataatggc gagactctgc gccagaaacc tcctgtggga 540
gaagcagacc cttacagagt gaaaatgaag ctctgcatcc tgcttcacgc cttcagcacc 600
cgcgtcgtga ccatcaacag ggtgatgggc tatctgagct ccgcctga 648
<210> 2
<211> 1008
<212> DNA
<213> IL-12B
<400> 2
atgtgtcctc agaagctaac catctcctgg tttgccatcg ttttgctggt gtctccactc 60
atggccatgt gggagctgga gaaagacgtt tatgttgtag aggtggactg gactcccgat 120
gcccctggag aaacagtgaa cctcacctgt gacacgcctg aagaagatga catcacctgg 180
acctcagacc agagacatgg agtcataggc tctggaaaga ccctgaccat cactgtcaaa 240
gagtttctag atgctggcca gtacacctgc cacaaaggag gcgagactct gagccactca 300
catctgctgc tccacaagaa ggaaaatgga atttggtcca ctgaaatttt aaaaaatttc 360
aaaaacaaga ctttcctgaa gtgtgaagca ccaaattact ccggacggtt cacgtgctca 420
tggctggtgc aaagaaacat ggacttgaag ttcaacatca agagcagtag cagttcccct 480
gactctcggg cagtgacatg tggaatggcg tctctgtctg cagagaaggt cacactggac 540
caaagggact atgagaagta ttcagtgtcc tgccaggagg atgtcacctg cccaactgcc 600
gaggagaccc tgcccattga actggcgttg gaagcacggc agcagaataa atatgagaac 660
tacagcacca gcttcttcat cagggacatc atcaaaccag acccgcccaa gaacttgcag 720
atgaagcctt tgaagaactc acaggtggag gtcagctggg agtaccctga ctcctggagc 780
actccccatt cctacttctc cctcaagttc tttgttcgaa tccagcgcaa gaaagaaaag 840
atgaaggaga cagaggaggg gtgtaaccag aaaggtgcgt tcctcgtaga gaagacatct 900
accgaagtcc aatgcaaagg cgggaatgtc tgcgtgcaag ctcaggatcg ctattacaat 960
tcctcatgca gcaagtgggc atgtgttccc tgcagggtcc gatcctag 1008
<210> 3
<211> 597
<212> DNA
<213> IRES
<400> 3
tagcgatccg cccctctccc tccccccccc ctaacgttac tggccgaagc cgcttggaat 60
aaggccggtg tgcgtttgtc tatatgttat tttccaccat attgccgtct tttggcaatg 120
tgagggcccg gaaacctggc cctgtcttct tgacgagcat tcctaggggt ctttcccctc 180
tcgccaaagg aatgcaaggt ctgttgaatg tcgtgaagga agcagttcct ctggaagctt 240
cttgaagaca aacaacgtct gtagcgaccc tttgcaggca gcggaacccc ccacctggcg 300
acaggtgcct ctgcggccaa aagccacgtg tataagatac acctgcaaag gcggcacaac 360
cccagtgcca cgttgtgagt tggatagttg tggaaagagt caaatggctc tcctcaagcg 420
tattcaacaa ggggctgaag gatgcccaga aggtacccca ttgtatggga tctgatctgg 480
ggcctcggta cacatgcttt acatgtgttt agtcgaggtt aaaaaaacgt ctaggccccc 540
gaaccacggg gacgtggttt tccttttgaa aaacacgatg ataatatggc cacaacc 597
<210> 4
<211> 426
<212> DNA
<213> GM-CSF
<400> 4
atgtggctgc agaatttact tttcctgggc attgtggtct acagcctctc agcacccacc 60
cgctcaccca tcactgtcac ccggccttgg aagcatgtag aggccatcaa agaagccctg 120
aacctcctgg atgacatgcc tgtcacattg aatgaagagg tagaagtcgt ctctaacgag 180
ttctccttca agaagctaac atgtgtgcag acccgcctga agatattcga gcagggtcta 240
cggggcaatt tcaccaaact caagggcgcc ttgaacatga cagccagcta ctaccagaca 300
tactgccccc caactccgga aacggactgt gaaacacaag ttaccaccta tgcggatttc 360
atagacagcc ttaaaacctt tctgactgat atcccctttg aatgcaaaaa accagtccaa 420
aaatga 426
<210> 5
<211> 558
<212> DNA
<213> Relaxin
<400> 5
atgcctcgcc tgttcttgtt ccacctgcta gaattctgtt tactactgaa ccaattttcc 60
agagcagtcg cggccaaatg gaaggacgat gttattaaat tatgcggccg cgaattagtt 120
cgcgcgcaga ttgccatttg cggcatgagc acctggagca aaaggtctct gagccaggaa 180
gatgctcctc agacacctag accagtggca gaaattgtac catccttcat caacaaagat 240
acagaaacta taattatcat gttggaattc attgctaatt tgccaccgga gctgaaggca 300
gccctatctg agaggcaacc atcattacca gagctacagc agtatgtacc tgcattaaag 360
gattccaatc ttagctttga agaatttaag aaacttattc gcaataggca aagtgaagcc 420
gcagacagca atccttcaga attaaaatac ttaggcttgg atactcattc tcaaaaaaag 480
agacgaccct acgtggcact gtttgagaaa tgttgcctaa ttggttgtac caaaaggtct 540
cttgctaaat attgctga 558
<210> 6
<211> 441
<212> DNA
<213> Murine VEGF mRNA sequence
<400> 6
atgaactttc tgctctcttg ggtgcactgg accctggctt tactgctgta cctccaccat 60
gccaagtggt cccaggctgc acccacgaca gaaggagagc agaagtccca tgaagtgatc 120
aagttcatgg atgtctacca gcgaagctac tgccgtccga ttgagaccct ggtggacatc 180
ttccaggagt accccgacga gatagagtac atcttcaagc cgtcctgtgt gccgctgatg 240
cgctgtgcag gctgctgtaa cgatgaagcc ctggagtgcg tgcccacgtc agagagcaac 300
atcaccatgc agatcatgcg gatcaaacct caccaaagcc agcacatagg agagatgagc 360
ttcctacagc acagcagatg tgaatgcaga ccaaagaaag acagaacaaa gccagaaaaa 420
tgtgacaagc caaggcggtg a 441
<210> 7
<211> 576
<212> DNA
<213> Homo sapiens VEGF mRNA
<400> 7
atgaactttc tgctgtcttg ggtgcattgg agccttgcct tgctgctcta cctccaccat 60
gccaagtggt cccaggctgc acccatggca gaaggagggg ggcagaatca tcacgaagtg 120
gtgaagttca tggatgtcta tcagcgcagc tactgccatc caatcgagac cctggtggac 180
atcttccagg agtaccctga tgagatcgag tacatcttca agccatcctg tgtgcccctg 240
atgcgatgcg ggggctgctg caatgacgag ggcctggagt gtgtgcccac tgaggagtcc 300
aacatcacca tgcagattat gcggatcaaa cctcaccaag gccagcacat aggagagatg 360
agcttcctac agcacaacaa atgtgaatgc agaccaaaga aagatagagc aagacaagaa 420
aatccctgtg ggccttgctc agagcggaga aagcatttgt ttgtacaaga tccgcagacg 480
tgtaaatgtt cctgcaaaaa cacagactcg cgttgcaagg cgaggcagct tgagttaaac 540
gaacgtactt gcagatgtga caagccgagg cggtga 576
<210> 8
<211> 71
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> shVEGF sense
<400> 8
gatcccggaa ggagagcaga agtcccatgt tcaagagaca tgggacttct gctctccttt 60
ttttttggaa a 71
<210> 9
<211> 71
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> shVEGF anti-sense
<400> 9
tttccaaaaa aaaaggagag cagaagtccc atgtctcttg aacatgggac ttctgctctc 60
cttccgggat c 71
<---
Claims (10)
1. Рекомбинантный онколитический аденовирус, содержащий: ген, кодирующий интерлейкин 12 (IL-12); ген, кодирующий shRNA, подавляющую экспрессию VEGF (фактора роста эндотелия сосудов).
2. Рекомбинантный онколитический аденовирус по п. 1, отличающийся тем, что из рекомбинантного аденовируса удалены любая одна или несколько из областей, выбранных из группы, состоящей из гена E1B-19, гена E1B-55 и областей E3.
3. Рекомбинантный онколитический аденовирус по п. 2, отличающийся тем, что в рекомбинантном аденовирусе ген, кодирующий IL-12, вставлен в место области E1, и ген, кодирующий shRNA, подавляющую экспрессию VEGF (фактора роста эндотелия сосудов), вставлен в место области E3.
4. Фармацевтическая композиция для предупреждения или лечения рака, причем композиция содержит: (a) рекомбинантный аденовирус по любому из пп. 1-3; и (b) фармацевтически приемлемый носитель.
5. Фармацевтическая композиция по п. 4, отличающаяся тем, что композиция вводится одновременно, отдельно или последовательно в комбинации с ингибитором контрольной точки иммунного ответа.
6. Фармацевтическая композиция по п. 5, отличающаяся тем, что ингибитор контрольной точки иммунного ответа представляет собой любое, выбранное из группы, состоящей из антагониста белка 1 запрограммированной гибели клеток (PD-1), антагониста лиганда белка 1 запрограммированной гибели клеток (PD-L1), антагониста лиганда белка 2 запрограммированной гибели клеток (PD-L2), антагониста кластера дифференцировки 27 (CD27), антагониста кластера дифференцировки 28 (CD28), антагониста кластера дифференцировки 70 (CD70), антагониста кластера дифференцировки 80 (CD80, также известного как B7-1), антагониста кластера дифференцировки 86 (CD86, также известного как B7-2), антагониста кластера дифференцировки 137 (CD137), антагониста кластера дифференцировки 276 (CD276), антагониста иммуноглобулин-подобных рецепторов клеток-киллеров (KIR), антагониста белка, кодируемого геном 3 активации лимфоцитов (LAG3), антагониста члена 4 суперсемейства рецепторов фактора некроза опухоли (TNFRSF4, также известного как CD134), антагониста глюкокортикоид-индуцированного TNFR-родственного белка (GITR), антагониста лиганда глюкокортикоид-индуцированного TNFR-родственного белка (GITRL), антагониста лиганда 4-1BB (4-1BBL), антагониста ассоциированного с цитолитическими T-лимфоцитами антигена 4 (CTLA-4), антагониста рецептора A2A аденозина (A2AR), антагониста ингибитора 1 активации T-клеток, содержащего домен, подобный V-домену иммуноглобулина (VTCN1), антагониста B- и T-лимфоцитарного аттенюатора (BTLA), антагониста индоламин-2,3-диоксигеназы (IDO), антагониста Т-клеточного белка 3, содержащего иммуноглобулиновый домен и домен муцина (TIM-3), антагониста супрессора активации Т-клеток, содержащего IgV-подобный домен (VISTA), антагониста лектин-подобных рецепторов подсемейства A клеток-киллеров (KLRA) и их комбинации.
7. Фармацевтическая композиция по п. 4, отличающаяся тем, что рак представляет собой любое, выбранное из группы, состоящей из рака желудка, рака легкого, немелкоклеточного рака легкого, рака молочной железы, рака яичника, рака печени, рака бронхов, рака носоглотки, рака гортани, рака поджелудочной железы, рака мочевого пузыря, рака толстой кишки, рака шейки матки, рака кости, немелкоклеточного рака кости, злокачественного заболевания системы крови, рака кожи, рака головы и шеи, рака матки, рака толстой и прямой кишки, рака перианальной области, рака толстой кишки, рака маточной трубы, рака эндометрия, рака влагалища, рака вульвы, болезни Ходжкина, рака пищевода, рака тонкого кишечника, рака эндокринной системы, рака щитовидной железы, рака паращитовидной железы, рака надпочечников, саркомы мягких тканей, рака уретры, рака полового члена, рака предстательной железы, хронического или острого лейкоза, лимфоцитарной лимфомы, рака почки или мочеточника, почечно-клеточной карциномы, карциномы почечной лоханки, рака слюнной железы, саркомы, псевдомиксомы брюшины, гепатобластомы, рака яичка, глиобластомы, карциномы губы, эмбрионально-клеточных опухолей яичника, базальноклеточной карциномы, множественной миеломы, рака желчного пузыря, хороидальной меланомы, рака фатерова сосочка, перитонеального рака, рака языка, мелкоклеточного рака, детской лимфомы, нейробластомы, рака двенадцатиперстной кишки, рака мочеточника, астроцитомы, менингиомы, рака почечной лоханки, рака наружных половых органов, рака тимуса, опухолей центральной нервной системы (ЦНС), первичной лимфомы центральной нервной системы, опухолей спинного мозга, нейроглиомы ствола головного мозга и аденомы гипофиза.
8. Фармацевтическая композиция по п. 4, отличающаяся тем, что рак представляет собой рецидивный рак.
9. Фармацевтическая композиция по п. 4, отличающаяся тем, что композиция обеспечивает усиление противоопухолевого иммунитета.
10. Фармацевтическая композиция по п. 4, отличающаяся тем, что композиция дополнительно содержит ингибиторы контрольной точки иммунного ответа.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2020143572A RU2777523C2 (ru) | 2018-02-28 | Противораковая композиция, содержащая опухолеспецифический онколитический аденовирус и ингибитор контрольной точки иммунного ответа |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2020143572A RU2777523C2 (ru) | 2018-02-28 | Противораковая композиция, содержащая опухолеспецифический онколитический аденовирус и ингибитор контрольной точки иммунного ответа |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2019126842A Division RU2740713C1 (ru) | 2017-02-28 | 2018-02-28 | Противораковая композиция, содержащая опухолеспецифический онколитический аденовирус и ингибитор контрольной точки иммунного ответа |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2020143572A RU2020143572A (ru) | 2021-03-12 |
RU2020143572A3 RU2020143572A3 (ru) | 2021-07-23 |
RU2777523C2 true RU2777523C2 (ru) | 2022-08-05 |
Family
ID=
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2016008976A1 (en) * | 2014-07-16 | 2016-01-21 | Transgene Sa | Oncolytic virus for expression of immune checkpoint modulators |
RU2573912C2 (ru) * | 2008-10-08 | 2016-01-27 | Интрексон Корпорейшн | Сконструированные клетки, экспрессирующие множественные иммуномодуляторы, и их применения |
RU2014137169A (ru) * | 2012-02-14 | 2016-04-10 | Те Риджентс Оф Те Юниверсити Оф Калифорния | Системная доставка и регулируемая экспрессия паракринных генов для лечения сердечно-сосудистых и иных заболеваний |
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2573912C2 (ru) * | 2008-10-08 | 2016-01-27 | Интрексон Корпорейшн | Сконструированные клетки, экспрессирующие множественные иммуномодуляторы, и их применения |
RU2014137169A (ru) * | 2012-02-14 | 2016-04-10 | Те Риджентс Оф Те Юниверсити Оф Калифорния | Системная доставка и регулируемая экспрессия паракринных генов для лечения сердечно-сосудистых и иных заболеваний |
WO2016008976A1 (en) * | 2014-07-16 | 2016-01-21 | Transgene Sa | Oncolytic virus for expression of immune checkpoint modulators |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2740713C1 (ru) | Противораковая композиция, содержащая опухолеспецифический онколитический аденовирус и ингибитор контрольной точки иммунного ответа | |
RU2742726C2 (ru) | Противораковая композиция, содержащая рекомбинантный аденовирус, экспрессирующий разрушающий фактор для внеклеточного матрикса | |
EP3329934B1 (en) | Antitumor immunity enhancing composition containing adenovirus simultaneously expressing il-12 and shvegf | |
US20210324014A1 (en) | A new oncolytic virus platform to treat cancers with myxoma virus | |
WO2000063405A1 (en) | Vectors containing a gene coding for cd40 and/or cd40l under the control of a cytokine-inducible promoter, methods for their production and uses thereof | |
RU2777523C2 (ru) | Противораковая композиция, содержащая опухолеспецифический онколитический аденовирус и ингибитор контрольной точки иммунного ответа | |
JP2024508920A (ja) | 多武装の粘液腫ウイルス | |
CN114657150A (zh) | 用于改善免疫疗法的重组溶瘤腺病毒及其应用 | |
WO2023212566A1 (en) | Compositions and methods for preventing t cell exhaustion |