RU2776163C1 - Способ выявления ДНК бактерии Mycobacterium tuberculosis с помощью изотермической петлевой амплификации - Google Patents
Способ выявления ДНК бактерии Mycobacterium tuberculosis с помощью изотермической петлевой амплификации Download PDFInfo
- Publication number
- RU2776163C1 RU2776163C1 RU2021118719A RU2021118719A RU2776163C1 RU 2776163 C1 RU2776163 C1 RU 2776163C1 RU 2021118719 A RU2021118719 A RU 2021118719A RU 2021118719 A RU2021118719 A RU 2021118719A RU 2776163 C1 RU2776163 C1 RU 2776163C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- dna
- amplification
- mycobacterium tuberculosis
- tuberculosis
- fragment
- Prior art date
Links
- 230000003321 amplification Effects 0.000 title claims abstract description 40
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 title claims abstract description 40
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 24
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 title claims abstract description 13
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 title abstract 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 12
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 10
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims abstract description 10
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 claims abstract description 9
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 claims abstract description 8
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 claims abstract description 7
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims abstract description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 6
- 239000000975 dye Substances 0.000 claims description 5
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 abstract description 29
- 239000013615 primer Substances 0.000 abstract description 22
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 40
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 14
- 241001302239 Mycobacterium tuberculosis complex Species 0.000 description 13
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 13
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 12
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 9
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 9
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 9
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 8
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 4
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 241000827781 Geobacillus sp. Species 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 3
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 3
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 2
- 238000007397 LAMP assay Methods 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000000126 in silico method Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- XNWFRZJHXBZDAG-UHFFFAOYSA-N 2-METHOXYETHANOL Chemical compound COCCO XNWFRZJHXBZDAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 101100439426 Bradyrhizobium diazoefficiens (strain JCM 10833 / BCRC 13528 / IAM 13628 / NBRC 14792 / USDA 110) groEL4 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 101001057154 Homo sapiens Melanoma-associated antigen D2 Proteins 0.000 description 1
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102100027251 Melanoma-associated antigen D2 Human genes 0.000 description 1
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 241001646725 Mycobacterium tuberculosis H37Rv Species 0.000 description 1
- QPCDCPDFJACHGM-UHFFFAOYSA-N N,N-bis{2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl}glycine Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(=O)O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O QPCDCPDFJACHGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 208000025174 PANDAS Diseases 0.000 description 1
- 208000021155 Paediatric autoimmune neuropsychiatric disorders associated with streptococcal infection Diseases 0.000 description 1
- 240000000220 Panda oleosa Species 0.000 description 1
- 235000016496 Panda oleosa Nutrition 0.000 description 1
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 208000020329 Zika virus infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 244000037640 animal pathogen Species 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 244000000037 crop pathogen Species 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000007847 digital PCR Methods 0.000 description 1
- XZTWHWHGBBCSMX-UHFFFAOYSA-J dimagnesium;phosphonato phosphate Chemical compound [Mg+2].[Mg+2].[O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XZTWHWHGBBCSMX-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- UQGFMSUEHSUPRD-UHFFFAOYSA-N disodium;3,7-dioxido-2,4,6,8,9-pentaoxa-1,3,5,7-tetraborabicyclo[3.3.1]nonane Chemical compound [Na+].[Na+].O1B([O-])OB2OB([O-])OB1O2 UQGFMSUEHSUPRD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013345 egg yolk Nutrition 0.000 description 1
- 210000002969 egg yolk Anatomy 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150077981 groEL gene Proteins 0.000 description 1
- 101150070420 gyrA gene Proteins 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013048 microbiological method Methods 0.000 description 1
- 238000007431 microscopic evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229960003330 pentetic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000012123 point-of-care testing Methods 0.000 description 1
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 238000011897 real-time detection Methods 0.000 description 1
- 108020004418 ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 1
- 238000013515 script Methods 0.000 description 1
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004328 sodium tetraborate Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
Abstract
Предлагаемое изобретение относится к области биотехнологии и, в частности, к генетической инженерии. Описан способ выявления ДНК бактерии Mycobacterium tuberculosis с помощью изотермической петлевой амплификации. Выделяют ДНК из анализируемой пробы. Проводят изотермическую петлевую амплификацию с помощью олигонуклеотидных праймеров с последующей детекцией результатов амплификации. При этом проводят амплификацию фрагмента ДНК, комплементарного фрагменту мобильного генетического элемента IS6110 геномной ДНК бактерии Mycobacterium tuberculosis праймерами: IS61-c11b CGGAGAATTCCGGTGAGTCCGAGACTCT, IS61-c12b GCCAAAGCTTACCGCCCCGGCATGTCCG, IS6-F3 GTTCTTGGAAAGGATGGGGT, IS6-B3 ATCGACCTGCGCCTGG, IS6-FIP GGATCTCTGCGACCATCCGCTCATCGAGGAGGTACCCG, IS6-BIP CAGCACGATTCGGAGTGGGCACCACTTACGCACCGTCTC, IS6-LF CGCCCGCTCACGCAGC, IS6-LB CGATCAGTGAGGTCGCCC. Кроме того, амплификацию осуществляют, используя большой фрагмент Gss-полимеразы и интеркалирующий флуоресцентный краситель. Детекцию ДНК бактерии Mycobacterium tuberculosis осуществляют путем анализа кривых накопления флуоресценции после проведения амплификации. Технический результат - сокращение длительности анализа и повышение чувствительности способа выявления ДНК М. tuberculosis как по количеству выявляемой ДНК, так и по числу выявляемых штаммов М. tuberculosis. 2 з.п. ф-лы, 1 табл., 3 пр.
Description
Предлагаемое изобретение относится к области биотехнологии и, в частности, к генетической инженерии и может быть использовано для выявления генетического материала (ДНК) бактерии Mycobacterium tuberculosis в диагностических целях.
В течение нескольких столетий туберкулез (ТБ) входит в число самых сложных для лечения и летальных инфекционных заболеваний. Всемирная организация здравоохранения сообщает о почти 53 миллионах умерших с 2000 по 2016 годы. В 2016 было заявлено о 6,3 миллионах новых случаев туберкулеза, что на 200000 больше, чем было зарегистрировано в 2015 г. Своевременная диагностика ТБ абсолютно необходима как для эффективного лечения, так и для карантинных мероприятий, разрывающих пути передачи это контагиозного заболевания.
Классическими лабораторными методами диагностики возбудителя ТБ - бактерий комплекса Mycobacterium tuberculosis (МБТ) - являются микроскопический анализ мазков мокроты, окрашенных по Цилю-Нильсену или с помощью флуоресцентно меченных антител, специфичных к М. tuberculosis, а также изоляция микобактерий с помощью культуральных микробиологических методов. Культуральные методы диагностики ТБ сегодня являются золотым стандартом, однако требуют много времени (до 12 недель) и организационных мероприятий для поддержания адекватного лабораторного пространства.
Этим обусловлена потребность в более быстрых молекулярно-генетических тестах для выявления присутствия М. tuberculosis в клинических образцах и, сегодня, к ним также добавляются тесты для определения лекарственной резистентности возбудителя ТБ.
Уже через четыре года после эпохальной разработки ПЦР в 1985 году этот метод был предложен для выявления МБТ (1). В работе Hance с соавторами амплифицировали фрагмент размером 383 п.о. гена, кодирующего антиген с молекулярным весом около 65 кД (groEL шаперон), общий для микобактерий, с последующим определением вида путем гибридизации с внутренним специфичным радиоактивно меченным олигонуклеотидом (1). В последующие несколько лет разными авторами были предложены другие гены в качестве мишени для диагностического выявления микобактериальной ДНК (2).
Одним из наиболее значимых и интересных для клинической практики является открытие мобильного генетического элемента IS6110 и дальнейшее его использование в качестве мультикопийной мишени для ПЦР с повышенной чувствительностью в отношении выявления микобактерий туберкулеза (3, 4). Элемент IS6110 (GeneBank no. Х52471) является специфичной для туберкулезного комплекса микобактерий инсерционной последовательностью. Практически сразу после его открытия в 1990 году были разработаны олигонуклеотидные праймеры для выявления последовательности IS6110 с помощью ПЦР, которые были описаны (патент ЕР 0490951 В1, опубл. 24.04.1996). Фрагмент IS6110 был в дальнейшем также использован в качестве гибридизационной пробы для молекулярно-эпидемиологического анализа изолятов микобактерий туберкулеза, получив в этом качестве широкое распространение (5). Несмотря на расширение списка генетических мишеней для диагностики ТВ с помощью различных методов амплификаци ДНК: МТВ64 (6), рибосомальной РНК (7), МТВ65 (8) и других (9), IS6110 остается наиболее часто используемой мишенью для диагностических целей ввиду его специфичности и мультикопийности в большинстве описанных к настоящему моменту изолятов МБТ.
Сегодня огромный пласт информации о структуре генома тысяч изолятов микобактерий туберкулеза, публично доступный в международных базах данных, дает уникальную возможность анализа особенностей копийности и консервативности отдельных регионов генома МБТ in silico для оценки их потенциала в качестве мишеней для дизайна молекулярно-диагностических систем (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/).
Способы диагностики МБТ, основанные на использовании ПЦР, получили широкое распространение в клинической практике, однако ПЦР, как таковая, имеет ряд внутренних ограничений, вытекающих из сути метода. Так, ПЦР требует тщательной очистки образцов нуклеиновых кислот от ингибирующих примесей, наличия специальных приборов-амплификаторов и 1-2 часов на проведение реакции. Последнее обстоятельство в условиях высокой нагрузки на диагностические лаборатории является лимитирующим фактором и ограничивает пропускную способность лабораторий, то есть общее количество тестов, проводимых в течение рабочего дня. Таким образом, существует потребность в разработке более быстрых диагностических способов выявления МБТ.
В течение последних 30 лет, по мере общего развития методологической базы молекулярной биологии, было разработано большое количество методов амплификации нуклеиновых кислот, отличных от классической ПЦР. В части из них, для разделения цепей нуклеиновых кислот не используется циклическое нагревание-охлаждение реакционных смесей, такие изотермические методы подразумевают проведение реакции при постоянной температуре (NASBA, RPA, LAMP, HDA, MDA, RCA, SDA и ряд других подходов (10-12). В результате становится возможным отказ от специального приборного обеспечения и проведение анализа с помощью простейших устройств, в том числе вне рамок диагностических лабораторий, непосредственно пациентами или так называемое тестирование у постели больного (point-of-care testing).
Среди известных методов изотермической амплификации, одним из наиболее широко используемых, является изотермическая петлевая амплификация (LAMP, loop-mediated isothermal amplification) (12). В основе LAMP лежит цепь-вытесняющая активность ряда ДНК-полимераз и 2-3 пары олигонуклеотидных праймеров. Как и в случае ПЦР, результаты LAMP могут быть визуализированы с помощью колориметрии, флуоресцентных интеркалирующих красителей или зондов, турбидиметрически или электрохимически, как в режиме реального времени, так и по окончанию реакции. Чувствительность и специфичность LAMP находится на уровне ПЦР, в то время как устойчивость к ингибиторам и скорость реакции (30-40 минут вместо 1-2 часов) у LAMP выше. Метод LAMP применялся при создании тестов для диагностики патогенов человека, домашних животных и культурных растений, в том числе возбудителей гриппа, лихорадки Зика и малярии (13-16).
Наиболее близким к заявляемому способу - прототипом, является способ выявления ДНК бактерии М. tuberculosis путем выделения ДНК из анализируемой пробы, проведения LAMP с двумя наборами праймеров, комплементарных двум участкам генома М. tuberculosis, gyrA и IS6110 и детекции результатов LAMP с помощью турбидиметра. Наличие в пробе ДНК М. tuberculosis устанавливают по изменению количества рассеянного света при увеличении мутности раствора из-за накопления в реакционной смеси пирофосфата магния и продукта амплификации участков генома М. Tuberculosis (патент KR 20170038995 А, опубл. 10.04.2017).
Недостатками данного способа являются его недостаточная точность, связанная с отсутствием возможности определения степени консервативности нуклеотидной последовательности мобильного генетического элемента IS6110, комплементарных праймерам, что может привести к неспособности выявить некоторые штаммы М. tuberculosis, длительность, связанная с низкой скоростью амплификации и высокий предел чувствительности LoD, составляющий 100 фг ДНК М. tuberculosis, что эквивалентно 23 генам-эквивалентам ДНК М. tuberculosis при среднем размере генома 4000 т.п.о.
Задачей изобретения является разработка более быстрого и высокочувствительного способа выявления ДНК М. tuberculosis с помощью изотермической петлевой амплификации наиболее консервативного участка нуклеотидных последовательностей IS6110.
Технический результат: сокращение длительности анализа и повышение чувствительности способа выявления ДНК М. tuberculosis как по количеству выявляемой ДНК, так и по числу выявляемых штаммов М. tuberculosis.
Поставленная задача достигается предлагаемым способом, заключающимся в следующем.
Проводят изотермическую петлевую амплификацию (LAMP) ДНК, выделенной из анализируемой пробы с помощью специально подобранных олигонуклеотидных праймеров, комплементарных консервативным участкам мобильного генетического элемента IS6110 в геномной ДНК М. tuberculosis. Амплификацию фрагмента ДНК осуществляют, используя большой фрагмент Gss-полимеразы. Детекцию результатов амплификации проводят с помощью интеркалирующего флуоресцентного красителя. Непосредственную амплификацию проводят в приборе для ПЦР в реальном времени. Присутствие ДНК М. tuberculosis в анализируемой пробе устанавливают путем анализа результатов амплификации по появлению кривых накопления флуоресценции, соответствующих накоплению продуктов амплификации. Время проведения амплификации составляет 30-40 минут.
В качестве мишени для праймеров LAMP были выбраны наиболее консервативные участки нуклеотидной последовательности IS6110 44-71, 98-122, 179-205, 259-280, 358-381, 487-511, выявленные в результате выравнивания их последовательностей из геномов 3609 изолятов М. tuberculosis, полученных из базы данных Genome NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/166). В качестве референсного генома использовали геном штамма H37Rv (сборка NC_000962.3), в том числе из него была получена последовательность мобильного элемента IS6110 (имеет координаты в референсном геноме 889021-890375). Для поиска последовательности IS6110 в геномах всех исследуемых штаммов применяли программу blastn из пакета NCBI-BLAST+ (версия 2.7.1) (17). Поиск проводили с выявлением последовательностей, перекрывающихся со всей последовательностью IS6110, а также перекрывающихся хотя бы на 15% (около 200 нуклеотидов). Для анализа последовательностей, статистической обработки данных и визуализации полученных результатов использовали собственные Python-скрипты с применением пакетов scipy (18), numpy (19), pandas (20) и matplotlib (21). Праймеры подбирали в соответствии с рекомендациями, размещенными на сайте primerexplorer.jp. Для разработанной системы праймеров для проведения LAMP предсказанная in silico чувствительность, полученная при анализе геномов 3609 изолятов МТ составила 96,9% против 96,4% для праймеров из литературы.
Эффективность амплификации с помощью подобранных праймеров оценивали, проводя LAMP с ДНК-стандартами в виде плазмид, несущих фрагмент IS6110, которые получали с помощью клонирования рестриктазно-лигазным методом, а также с помощью ДНК из клинических изолятов М. tuberculosis. Концентрацию ДНК-стандартов измеряли с помощью цифровой капельной ПЦР на платформе QX200 (Bio-Rad; США).
Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.
Пример 1
Предел детекции ДНК бактерии М. tuberculosis с помощью LAMP оценивали двумя способами, используя плазмидные стандарты и образцы искусственной мокроты.
В качестве модельных микобактериальных клеток использовали лиофилизированную вакцину БЦЖ-1 (Микроген). Лиофилизат разводили 5 мл стерильного физиологического раствора, для инактивации прогревали 60 мин при 95°С. Суспензию дополнительно гомогенизировали, пропуская 5 раз через иглу 21G, крупные конгломераты клеток осаждали центрифугированием 5 мин при 2000×g. Далее готовили 10-кратные разведения суспензии БЦЖ в физиологическом растворе. Определение концентрации клеток в разведениях осуществляли с помощью метода Виноградского-Брида (22). Бактериальные клетки в мазке окрашивали с помощью метода Циля-Нильсена (Mycobacteriology Laboratory Manual, First Edition, April 2014, https://www.who.int/tb/laboratory/mycobacteriology-laboratory-manual.pdf). Подсчет клеток вели с помощью объектива 100× с масляной иммерсией и окулярной измерительной сеткой.
Искусственная мокрота, содержащая ДНК из спермы лосося, муцин из желудка свиньи (тип II), полный набор L-аминокислот, диэтилентриаминпентауксусную кислоту, (все регенты Sigma, США), NaCl, KCl (хч, производства Реахим, Россия) и эмульсию яичного желтка, была приготовлена, как описано Kirchner с соавторами (23). Полученную искусственную мокроту контаминировали клетками БЦЖ в концентрации 10-10000 клеток на мл и использовали для выделения ДНК. Для этого 200 мкл искусственной мокроты контаминировали клетками БЦЖ и центрифугировали 5 мин при 6000×g. ДНК выделяли из осадка с использованием набора реагентов QIAGEN QIAamp DNA mini kit (QIAGEN, Германия) с небольшими модификациями, ранее описанными в (24). Добавляли стадию ферментативного переваривания в течение 15 мин с добавлением лизоцима 30 мг/мл в буфер для лизиса ткани с последующим кипячением в течение 15 мин, инкубацию с протеиназой К осуществляли при 56°С в течение 1 ч. Далее ДНК очищали в соответствии с рекомендациями производителя.
Плазмидные стандарты, несущие фрагмент IS6110 размером 1342 п.н. для конструирования стандартных образцов амплифицировали с помощью праймеров IS61-cl1b и IS61-cl2b, последовательности которых представлены в таблице 1. Реакционная смесь ПЦР объемом 50 мкл содержала: 1× буфер для Taq- полимеразы (65 мМ Tris-HCl (рН 8,9); 16 мМ (NH4)2SO4; 0,05% Tween 20; 3,5 мМ MgCl2, 0,2 мМ дНТФ, 50 нг геномной ДНК М. tuberculosis H37Rv, 1 е.а. Taq-полимеразы (Биосан, Россия), 0,5 е.а. Pfu-полимеразы (Биосан, Россия). Амплификацию проводили в амплификаторе «Терцик» (ДНК-технология, Россия) по следующей программе: 3 мин при 95°С начальной денатурации, 30 циклов: 10 с при 95°С для денатурации, 10 с при 60°С для гибридизации праймеров, 60 с при 72°С для элонгации.
Продукты амплификации гидролизовали эндонуклеазой рестрикции HindIII и EcoRI (Сибэнзим, Россия) и лигировали с вектором pBluscriptII SK(+), гидролизованным теми же эндонуклеазами, в течение 3-х часов с 100 е.а. Т4 ДНК-лигазы (Биосан, Россия). Лигазной смесью трансформировали компетентные клетки Е. coli штамма XL1-Blue (Stratagene, США). У плазмидных клонов, отобранных по результатам рестрикционного анализа, для подтверждения структуры определяли нуклеотидную последовательность вставки секвенированием по методу Сенгера. Секвенирование было выполнено на автоматическом секвенаторе ABI 3130XL Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США) с использованием набора BigDye 3.1 (Центр коллективного пользования «Геномика», ИХБФМ СО РАН). Плазмидные ДНК (pST-IS6110) выделяли из 100 мл ночной культуры в среде LB с помощью QIAGEN Plasmid Midi Kit (QIAGEN, Германия) согласно инструкции фирмы-производителя.
Концентрацию полученных стандартных плазмидных ДНК определяли спектрофотометрически и флюорометрически (набор Qubit™ BR, Invitrogen, США). 2 мкг ДНК подвергали гидролизу эндонуклеазой рестрикции EcoRI (Сибэнзим, Россия) для линеаризации. Полученные линейные стандарты разводили до концентрации 107-1 копий плазмидной ДНК на мкл в стерильном буфере, содержащем 10 мМ Tris-HCl, рН7,6 и полиА РНК (5 нг/мкл). Концентрацию ДНК в полученных стандартах уточняли с использованием цифровой ПЦР на платформе QX100™ Droplet Digital™ PCR System (Bio-Rad, США) согласно инструкциям фирмы-производителя. Для этого готовили 20 мкл ПЦР-смеси, содержащей исследуемую ДНК (<20000 копий на 20 мкл), 1× ПЦР-смесь (Bio-Rad, США), 900 нМ олигонуклеотидные праймеры Lac-U, Lac-R и 250 нМ TaqMan-зонд Lac-P, специфичные для гена бета-лактамазы, содержащегося в плазмиде. Последовательности праймеров и зонда представлены в таблице 1. Для получения микрокапель 20 мкл приготовленной ПЦР-смеси и 70 мкл масла для генерации капель помещали в соответствующие лунки картриджа DG8, который переносили в генератор капель (Bio-Rad, США). 40 мкл полученных микрокаплей переносили в 96-луночный ПЦР-планшет, запечатывали фольгой и помещали в амплификатор. Программа амплификации: 96°С - 10 мин и далее 50 циклов 96°С - 30 сек, 57°С - 60 сек с финальным прогревом в течение 10 мин при 98°С. После этого микрокапли подвергали считыванию с помощью считывателя капель (Bio-Rad, США), полученные данные обрабатывали в программе QuantaSoft (Bio-Rad, США).
LAMP проводили в реакционном объеме 20 мкл, содержавшем 1× реакционный буфер для Bst-полимеразы (20 мМ Tris-HCl рН 8,8, 10 мМ (NH4)2SO4, 150 мМ KCl, 0,1% Tween-20, 2 мМ М MgSO4), 1,4 мМ каждого дНТФ, по 0,2 мкМ внешних праймеров (IS6-F3/IS6-B3), 0,6 мкМ петлевых праймеров (IS6-LF/IS6-BF), 1,6 мкМ внутренних праймеров (IS6-FIP/ IS6-BIP), последовательности которых представлены в таблице 1, ДНК-матрицу, 2 е.а. Gss-полимеразы из Geobacillus sp. 777 (25), интеркалирующий краситель SYTO-82 до концентрации 1 мкМ. Реакцию проводили в амплификаторе CFX96 (Bio-Rad, США). Программа включала в себя следующие стадии: отжиг праймеров и элонгацию при температуре 64°С 90 циклов длиной 20 с каждый с регистрацией сигнала флуоресценции на канале HEX; определение температуры плавления продуктов амплификации в диапазоне 70-95°С после амплификации для определения наработанных продуктов амплификации. Результаты изотермической амплификации оценивали по параметру Tt (time-to-threshold - времени до пересечения кривой накопления продукта амплификации порогового значения).
Количество плазмидных стандартов варьировали от 2 до 32 копий на реакцию (2, 4, 8, 16, 32 копии на реакцию), несущих участок IS6110 и линеаризованных эндонуклеазой рестрикции EcoRI. С каждой концентрацией плазмидного стандарта проводили 20 повторов LAMP и рассчитывали LoD (95%), согласно методике Forootan с соавторами (26). Измеренный для LAMP LOD (95%), полученный на ДНК плазмиды с участком IS6110, составил 16 копий на реакцию. Образцы искусственной мокроты контаминировали известным количеством клеток БЦЖ (100, 200, 400, 800 и 1600 бактериальных клеток на мл) в 10 повторах с последующим выделением ДНК, амплификацией и расчетом LOD (90%) согласно методике Forootan с соавторами (26). Измеренный для LAMP LOD (90%), полученный на образцах искусственной мокроты, составил 400 клеток БЦЖ на мл.
Пример 2
Оценку чувствительности LAMP для определения Mycobacterium tuberculosis проводили с помощью коллекции ДНК из 282 позитивных культур.
Клинические изоляты М. tuberculosis были выделены в микробиологической лаборатории НИИТуб г. Новосибирска от пациентов, проживающих в г. Новосибирске и Новосибирской области. При заборе материала соблюдали все биоэтические нормы и было получено одобрение локального комитета по медицинской этике. Грубые лизаты бактериальных клеток получали нагреванием в 300 мкл буфера, содержащего 10 мМ тетраборат натрия и 1% 2-метоксиэатанола, в течение 10 мин при 98°С с последующим центрифугированием для осаждения клеточного дебриса. Выделение геномной ДНК МБТ осуществляли как описано в Eric с соавторами (27).
LAMP проводили в реакционном объеме 20 мкл, содержавшем 1× реакционный буфер для Bst-полимеразы (20 мМ Tris НС1 рН 8,8, 10 мМ (NH4)2SO4, 150 мМ KCl, 0,1% Tween-20, 2 мМ М MgSO4), 1,4 мМ каждого дНТФ, по 0,2 мкМ внешних праймеров IS6-F3/ IS6-B3), 0,6 мкМ петлевых праймеров (IS6-LF7IS6-BF), 1,6 мкМ внутренних праймеров (IS6-FIP/ IS6-BIP), последовательности которых представлены в таблице 1, ДНК-матрицу, 2 е.а. Gss-полимеразы из Geobacillus sp. 777 (25), интеркалирующий краситель SYTO-82 до концентрации 1 мкМ. Реакцию проводили в амплификаторе CFX96 (Bio-Rad, США). Программа включала в себя следующие стадии: отжиг праймеров и элонгацию при температуре 64°С 90 циклов длиной 20 с каждый с регистрацией сигнала флуоресценции на канале HEX; определение температуры плавления продуктов амплификации в диапазоне 70-95°С после амплификации для определения наработанных продуктов амплификации. Результаты изотермической амплификации оценивали по параметру Tt (time-to-threshold - времени до пересечения кривой накопления продукта амплификации порогового значения).
С помощью LAMP была выявлена ДНК 280 изолятов МБТ. С помощью секвенирования было установлено, что два негативных изолята не несут инсерционного элемента IS6110.
Пример 3
Оценка клинической диагностической значимости коллекции ДНК из образцов мокроты от пациентов, проживающих в Новосибирской области, собранной в 2012-2013 годах.
ДНК из собранных образцов мокроты выделяли методом, описанным Eric с соавторами (27) и хранили при -70°С до использования. Коллекция составляла 46 образцов положительных в культуральном анализе и 41 образец с отрицательными результатами бактериального посева.
LAMP проводили в реакционном объеме 20 мкл, содержавшем 1× реакционный буфер для Bst-полимеразы (20 мМ Tris-HCl рН 8,8, 10 мМ (NH4)2SO4, 150 мМ KC1, 0,1% Tween-20, 2 мМ M MgSO4), 1,4 мМ каждого дНТФ, по 0,2 мкМ внешних праймеров IS6-F3/ IS6-B3), 0,6 мкМ петлевых праймеров (IS6-LF/IS6-BF), 1,6 мкМ внутренних праймеров (IS6-FIP/ IS6-BIP), последовательности которых представлены в таблице 1, ДНК-матрицу, 2 е.а. Gss-полимеразы из Geobacillus sp. 777 (25), интеркалирующий краситель SYTO-82 до концентрации 1 мкМ. Реакцию проводили в амплификаторе CFX96 (Bio-Rad, США). Программа включала в себя следующие стадии: отжиг праймеров и элонгацию при температуре 64°С 90 циклов длиной 20 с каждый с регистрацией сигнала флуоресценции на канале HEX; определение температуры плавления продуктов амплификации в диапазоне 70-95°С после амплификации для определения наработанных продуктов амплификации. Результаты изотермической амплификации оценивали по параметру Tt (time-to-threshold - времени до пересечения кривой накопления продукта амплификации порогового значения).
Из положительных в культуральном анализе образцов с помощью LAMP было определено 40 из 46 образцов (86,9%) как содержащие ДНК МБТ, все негативные по бактериальному посеву образцы были негативными по анализу с помощью LAMP.
Таким образом, разработанный новый способ выявления ДНК бактерии М. tuberculosis с помощью изотермической петлевой амплификации консервативного участка нуклеотидной последовательности мобильного генетиеского элемента IS6110 позволяет детектировать в режиме реального времени генетический материал МБТ в течение 30-40 минут с пределом детекции LoD (95%) не менее 16 геном-эквивалентов МБТ в реакционной смеси.
Источники информации
1. Hance AJ, Grandchamp В, 
V, Lecossier D, Rauzier J, Bocart D, et al. Detection and identification of mycobacteria by amplification of mycobacterial DNA. Mol Microbiol Mol Microbiol; 1989; 3: 843-9.
2. Tiwari RP, Hattikudur NS, Bharmal RN, Kartikeyan S, Deshmukh NM, Bisen PS. Modern approaches to a rapid diagnosis of tuberculosis: promises and challenges ahead. Tuberculosis (Edinb) 2007; 87: 193-201.
3. Thierry D, 
A, 
V, Nguyen S, Guesdon JL, Gicquel B. Characterization of a Mycobacterium tuberculosis insertion sequence, IS6110, and its application in diagnosis. J Clin Microbiol 1990; 28: 2668-73.
4. Eisenach KD, Cave MD, Bates JH, Crawford JT. Polymerase chain reaction amplification of a repetitive DNA sequence specific for Mycobacterium tuberculosis. J Infect Dis 1990; 161: 977-81.
5. Cave MD, Eisenach KD, McDermott PF, Bates JH, Crawford JT. IS6110: conservation of sequence in the Mycobacterium tuberculosis complex and its utilization in DNA fingerprinting. Mol Cell Probes 1991; 5: 73-80.
6. Manjunath N, Shankar P, Rajan L, Bhargava A, Saluja S, Shriniwas. Evaluation of a polymerase chain reaction for the diagnosis of tuberculosis. Tubercle 1991; 72: 21-7.
7. 
B, Rogall T, Flohr T, 
H, 
EC. Detection and identification of mycobacteria by amplification of rRNA. J Clin Microbiol 1990; 28: 1751-9.
8. KIKUCHI Y, OKA S, KIMURA S, MITAMURA K, SHJMADA K. Clinical Application of the Polymerase Chain Reaction for a Rapid Diagnosis of Mycobacterium tuberculosis Infection. Intern Med 1992; 31: 1016-22.
9. Zhao J, Wang Y, Li D, Liu J, Zhang X, He Y, et al. An efficient alternative marker for specific identification of Mycobacterium tuberculosis. World J Microbiol Biotechnol 2014; 30: 2189-97.
10. Compton J. Nucleic acid sequence-based amplification. Nature 1991; 350: 91-2.
11. Fire A, Xu SQ. Rolling replication of short DNA circles. Proc Natl Acad SciUS A 1995; 92: 4641-5.
12. Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, Yonekawa T, Watanabe K, Amino N, et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res 2000; 28: E63.
13. Yongkiettrakul S, Kampeera J, Chareanchim W, Rattanajak R, Pornthanakasem W, Kiatpathomchai W, et al. Simple detection of single nucleotide polymorphism in Plasmodium falciparum by SNP-LAMP assay combined with lateral flow dipstick. Parasitol Int 2017; 66: 964-71.
14. Global Tuberculosis Programme. The use of loop-mediated isothermal amplification (ТВ-LAMP) for the diagnosis of pulmonary tuberculosis: policy guidance.
15. Guo XG, Zhou YZ, Li Q, Wang W, Wen JZ, Zheng L, et al. Rapid and reliable diagnostic method to detect Zika virus by real-time fluorescence reverse transcription loop-mediated isothermal amplification. AMB Express 2018; 8.
16. Poon LLM, Leung CSW, Chan KH, Lee JHC, Yuen KY, Guan Y, et al. Detection of human influenza A viruses by loop-mediated isothermal amplification. J Clin Microbiol 2005; 43: 427-30.
17. Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ. Basic local alignment search tool. J Mol Biol 1990; 215: 403-10.
18. Oliphant ТЕ. Python for Scientific Computing. Comput Sci Eng 2007;9:10-20.
19. van der Walt S, Colbert SC, Varoquaux G. The NumPy Array: A Structure for Efficient Numerical Computation. Comput Sci Eng 2011; 13: 22-30.
20. McKinney W. Data Structures for Statistical Computing in Python. In: van der Walt S, Millman J, editors. Proc 9th Python Sci Conf 2010. page 51-6.
21. Hunter JD. Matplotlib: A 2D graphics environment. Comput Sci Eng IEEE COMPUTER SOC; 2007; 9: 90-5.
22. Prescott SC, Breed RS. The Determination of the Number of Body Cells in Milk by a Direct Method. Am J Public Hygiene 1910; 20: 663.
23. Kirchner S, Fothergill JL, Wright EA, James CE, Mowat E, Winstanley C. Use of artificial sputum medium to test antibiotic efficacy against Pseudomonas aeruginosa in conditions more relevant to the cystic fibrosis lung. J Vis Exp 2012; e 3857.
24. Aldous WK, Pounder JI, Cloud JL, Woods GL. Comparison of six methods of extracting Mycobacterium tuberculosis DNA from processed sputum for testing by quantitative real-time PCR. J Clin Microbiol 2005; 43: 2471-3.
25. Oscorbin IP, Boyarskikh UA, Filipenko ML. Large Fragment of DNA Polymerase I from Geobacillus sp.777: Cloning and Comparison with DNA Polymerases I in Practical Applications. Mol Biotechnol 2015; 57: 947-59.
26. Forootan A, 
R, Bjorkman J, 
B, Linz L, Kubista M. Methods to determine limit of detection and limit of quantification in quantitative real-time PCR (qPCR). Biomol Detect Quantif 2017; 12: 1-6.
27. Leung ETY, Zheng L, Wong RYK, Chan EWC, Au TK, Chan RCY, et al. Rapid and simultaneous detection of Mycobacterium tuberculosis complex and Beijing/W genotype in sputum by an optimized DNA extraction protocol and a novel multiplex real-time PCR. J Clin Microbiol 2011; 49: 2509-15.
Claims (3)
1. Способ выявления ДНК бактерии Mycobacterium tuberculosis с помощью изотермической петлевой амплификации, включающий выделение ДНК из анализируемой пробы, проведение изотермической петлевой амплификации с помощью олигонуклеотидных праймеров с последующей детекцией результатов амплификации, отличающийся тем, что проводят амплификацию фрагмента ДНК, комплементарного фрагменту мобильного генетического элемента IS6110 геномной ДНК бактерии Mycobacterium tuberculosis праймерами: IS61-c11b CGGAGAATTCCGGTGAGTCCGAGACTCT, IS61-c12b GCCAAAGCTTACCGCCCCGGCATGTCCG, IS6-F3 GTTCTTGGAAAGGATGGGGT, IS6-B3 ATCGACCTGCGCCTGG, IS6-FIP GGATCTCTGCGACCATCCGCTCATCGAGGAGGTACCCG, IS6-BIP CAGCACGATTCGGAGTGGGCACCACTTACGCACCGTCTC, IS6-LF CGCCCGCTCACGCAGC, IS6-LB CGATCAGTGAGGTCGCCC, при этом амплификацию осуществляют, используя большой фрагмент Gss-полимеразы и интеркалирующий флуоресцентный краситель, а детекцию ДНК бактерии Mycobacterium tuberculosis осуществляют путем анализа кривых накопления флуоресценции после проведения амплификации.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что используют набор олигонуклеотидных праймеров, комплементарных наиболее консервативному участку нуклеотидной последовательности мобильного генетического элемента IS6110 в геноме бактерии Mycobacterium tuberculosis.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве интеркалирующего красителя используют интеркалирующий флуоресцентный краситель SYTO-82 в концентрации не более 1 мкМ.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2776163C1 true RU2776163C1 (ru) | 2022-07-14 |
Family
ID=
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2799413C1 (ru) * | 2022-12-27 | 2023-07-05 | Общество с ограниченной ответственностью "Иннова плюс" | Способ выявления streptococcus mutans методом изотермической петлевой амплификации |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102399901A (zh) * | 2011-12-21 | 2012-04-04 | 中国人民解放军疾病预防控制所 | 结核杆菌的lamp检测方法及其专用引物与试剂盒 |
| WO2017207825A1 (en) * | 2016-06-03 | 2017-12-07 | MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Methods for the detection of a latent tuberculosis infection |
| RU2017113727A (ru) * | 2014-10-10 | 2018-11-13 | Рутгерс, Зе Стейт Юниверсити Оф Нью-Джерси | Праймеры и зонды для полимеразной цепной реакции для обнаружения mycobacterium tuberculosis |
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102399901A (zh) * | 2011-12-21 | 2012-04-04 | 中国人民解放军疾病预防控制所 | 结核杆菌的lamp检测方法及其专用引物与试剂盒 |
| RU2017113727A (ru) * | 2014-10-10 | 2018-11-13 | Рутгерс, Зе Стейт Юниверсити Оф Нью-Джерси | Праймеры и зонды для полимеразной цепной реакции для обнаружения mycobacterium tuberculosis |
| WO2017207825A1 (en) * | 2016-06-03 | 2017-12-07 | MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Methods for the detection of a latent tuberculosis infection |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| WEN-WEN SUN, QIN SUN и др., The application of IS6110-baced loop-mediated isothermal amplication (LAMP) in the early diagnosis of tuberculous meningitis, Oncotarget, Advance Publications 2017, найдено в интернет 17.02.2022 https://www.researchgate.net/publication/314083876_The_application_of_IS6110-baced_loop-mediated_isothermal_amplification_LAMP_in_the_early_diagnosis_of_tuberculous_meningitis. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2809735C1 (ru) * | 2022-12-22 | 2023-12-15 | Федеральное государственное бюджетное учреждение Федерального научно-клинического центра физико-химической медицины имени академика Ю.М. Лопухина Федерального медико-биологического агентства (ФГБУ ФНКЦ ФХМ им. Ю.М. Лопухина ФМБА России) | Способ определения бактерии вида Mycobacterium tuberculosis методом петлевой изотермической амплификации (LAMP) |
| RU2799413C1 (ru) * | 2022-12-27 | 2023-07-05 | Общество с ограниченной ответственностью "Иннова плюс" | Способ выявления streptococcus mutans методом изотермической петлевой амплификации |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN112522429B (zh) | Rpa联合crispr技术检测炭疽杆菌的方法及成套试剂 | |
| CN110541022B (zh) | 基于CRISPR-Cas12a系统的结核分枝杆菌复合群检测试剂盒 | |
| US6699670B2 (en) | Quantitative assay for the simultaneous detection and speciation of bacterial infections | |
| US20220325324A1 (en) | Systems and methods for the detection of infectious diseases | |
| Altay et al. | Evaluation of a PCR and comparison with RLB for detection and differentiation of Theileria sp. MK and other Theileria and Babesia species of small ruminants | |
| Hawkey | The role of polymerase chain reaction in the diagnosis of mycobacterial infections | |
| US11549153B2 (en) | Methods of detecting and typing pathogenic strains of Francisella tularensis | |
| KR20090100950A (ko) | 실시간 ｐｃｒ을 이용한 브루셀라 속 균주의 검출 방법 | |
| EP2753629B1 (en) | Methods for detecting lyme disease | |
| JP2012531908A (ja) | 結核菌を検出するための方法および／またはプライマー | |
| RU2163638C1 (ru) | Способ обнаружения днк микобактерий туберкулезного комплекса с дифференциальным выявлением днк mycobacterium tuberculosis и набор реагентов для его осуществления | |
| RU2776163C1 (ru) | Способ выявления ДНК бактерии Mycobacterium tuberculosis с помощью изотермической петлевой амплификации | |
| KR101425149B1 (ko) | 원-튜브 네스티드 실시간 피시알을 이용한 개선된 결핵균 진단방법 | |
| Marks | Genetics of tuberculosis | |
| CN103205502A (zh) | 一种检测狗钩端螺旋体核酸的荧光定量pcr引物、探针及试剂盒 | |
| KR20200048076A (ko) | 중증 열성 혈소판 감소 증후군(sfts) 바이러스 감염 질환 진단용 키트 | |
| RU2542395C1 (ru) | Набор реагентов и способ для выявления днк возбудителей чумы, сибирской язвы и туляремии методом пцр с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов | |
| Helmy et al. | Evaluation of different PCR-based techniques in diagnosis of bovine tuberculosis in infected cattle lymph nodes | |
| RU2455364C2 (ru) | Способ идентификации микобактерий с помощью полимеразной цепной реакции | |
| Albandar et al. | Nucleic acid probes as potential tools in oral microbial epidemiology | |
| RU2770803C1 (ru) | Способ выявления ДНК бактерии Mycobacterium tuberculosis для диагностики туберкулеза | |
| RU2792156C1 (ru) | Способ молекулярного типирования типичных (O1) и атипичных (RO) нетоксигенных штаммов V. cholerae El Tor с помощью ПЦР в режиме реального времени | |
| Chandan et al. | Molecular detection of Leptospira using polymerase chain reaction based on LipL32 and rpoBgene | |
| RU2738358C1 (ru) | Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов и способ выявления ДНК возбудителей сапа и мелиоидоза методом ПЦР с детекцией продукта в режиме реального времени | |
| JP7589434B2 (ja) | Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ属菌の検出方法 |