RU2776044C1 - Способ оценки генетического потенциала овец породы манычский меринос на основе молекулярно-генетических маркеров - Google Patents
Способ оценки генетического потенциала овец породы манычский меринос на основе молекулярно-генетических маркеров Download PDFInfo
- Publication number
- RU2776044C1 RU2776044C1 RU2021134831A RU2021134831A RU2776044C1 RU 2776044 C1 RU2776044 C1 RU 2776044C1 RU 2021134831 A RU2021134831 A RU 2021134831A RU 2021134831 A RU2021134831 A RU 2021134831A RU 2776044 C1 RU2776044 C1 RU 2776044C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cast
- gdf9
- cca
- genotypes
- gene
- Prior art date
Links
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 title claims abstract description 50
- 241001494479 Pecora Species 0.000 title claims abstract description 44
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 21
- 101001075110 Homo sapiens Growth/differentiation factor 9 Proteins 0.000 claims abstract description 45
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 40
- 102100035970 Growth/differentiation factor 9 Human genes 0.000 claims abstract description 30
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 claims abstract description 18
- 101150055782 gH gene Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 claims abstract description 15
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 14
- 101150066999 GDF9 gene Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 108010012003 GGCC-specific type II deoxyribonucleases Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 3
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 claims 1
- 101000836313 Moraxella sp Type II restriction enzyme MspI Proteins 0.000 claims 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 abstract description 15
- 108010008345 Deoxyribonuclease HpaII Proteins 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 abstract 1
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 59
- 102100038803 Somatotropin Human genes 0.000 description 59
- 108010044208 calpastatin Proteins 0.000 description 57
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 54
- ZXJCOYBPXOBJMU-HSQGJUDPSA-N calpastatin peptide Ac 184-210 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(C)=O)[C@@H](C)O)C1=CC=C(O)C=C1 ZXJCOYBPXOBJMU-HSQGJUDPSA-N 0.000 description 53
- 102100035037 Calpastatin Human genes 0.000 description 52
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 27
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 21
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 18
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 10
- 230000034373 developmental growth involved in morphogenesis Effects 0.000 description 9
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 9
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 8
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 8
- 101150033217 CAST gene Proteins 0.000 description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 7
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 5
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 5
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 5
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 4
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 4
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 3
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 2
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 101001129912 Bos taurus Leptin Proteins 0.000 description 1
- 101150111062 C gene Proteins 0.000 description 1
- 101710155556 Calcium-dependent protease Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 1
- 101001059454 Homo sapiens Serine/threonine-protein kinase MARK2 Proteins 0.000 description 1
- 101150032906 LEP gene Proteins 0.000 description 1
- 102100030874 Leptin Human genes 0.000 description 1
- 241000283903 Ovis aries Species 0.000 description 1
- 102100028904 Serine/threonine-protein kinase MARK2 Human genes 0.000 description 1
- 101150050863 T gene Proteins 0.000 description 1
- 102000009618 Transforming Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010009583 Transforming Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 102000028848 arylesterase Human genes 0.000 description 1
- 108010009043 arylesterase Proteins 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000033077 cellular process Effects 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000021594 gamete generation Effects 0.000 description 1
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 1
- 230000002710 gonadal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000004731 jugular vein Anatomy 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000027758 ovulation cycle Effects 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000033458 reproduction Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000014639 sexual reproduction Effects 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Images
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии. Сущность предлагаемого способа оценки генетического потенциала овец породы манычский меринос на основе молекулярно-генетических маркеров заключается в следующем, производят выделение ДНК, амплификацию фрагмента генов GH, CAST и GDF9 методом ПЦР-ПДРФ (полиморфизм длин рестрикционных фрагментов) с использованием праймеров: GH - (F: 5'-GGA-GGC-AGG-AAG-GGA-TGA-А-3' и R: 5'-CCA-AGG-GAG-GGA-GAG-ACA-GA-3'); CAST - (F: 5'-TGG-GGC-CCA-ATG-ACG-CCA-TCG-ATG-3' и R: 5'-GGT-GGA-GCA-CTT-CTG-ATC-ACC-3'); GDF9 (F: 5'-GAA-GAC-TGG-TAT-GGG-GAA-ATG-3' и R: 5'-CCA-ATC-TGC-TCC-TAC-ACA-CCT-3'); рестрикцию амплифицированного фрагмента гена GH эндонуклеазой HaeIII, CAST эндонуклеазой MspI, гена GDF9 эндонуклеазой рестрикции BstHHl; выявление генотипов и отбор животных с желательными комплексными генотипами. Изобретение позволяет оценить генетический потенциал овец породы манычский меринос на основе молекулярно-генетических маркеров и может быть использовано для прижизненной оценки высокой мясной продуктивности овец породы манычский меринос на основе выявления генетических маркеров, ассоциированных с показателями роста. 9 ил.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу оценки генетического потенциала овец породы манычский меринос на основе молекулярно-генетических маркеров, и может быть использовано для прижизненной оценки высокой мясной продуктивности овец породы манычский меринос на основе выявления генетических маркеров, ассоциированных с показателями роста.
Уровень техники
Известен способ селекции овец романовской породы по адаптационной способности к промышленной технологии, включающий отбор и разведение "в себе" наиболее приспособленных овец, при этом у овец дополнительно определяют генетическую структуру по локусам арилэстеразы Es 1 и альбумина Аl и для воспроизводства отбирают животных-носителей аллелей Es 1B, АlА и АlС (см. пат. №2044482 МПК А01К 67/02, опубл. 27.09.1995 г.).
Недостатком данного способа является невысокое качество селекции, так как учитывается только продуктивность новорожденных ягнят на основе особенностей плаценты, а также то, что в качестве критерия оценки продуктивности молодняка используют только полиморфизм белков и ферментов сыворотки крови, что менее информативно по сравнению с полиморфизмом ДНК.
Известен способ оценки генетического потенциала овец в раннем возрасте, включающий подбор овцематок с учетом степени их генетической совместимости с бараном-производителем по величине индекса антигенного сходства и весовых показателей плаценты, при этом дополнительно определяют плодно-плацентарный индекс с учетом соотношения весовых показателей плаценты и новорожденного с уровнем органометрических показателей пуповины в зависимости от степени генетических различий родительской пары, при этом плодно-плацентарный индекс определяют в граммах путем деления массы новорожденного на массу плаценты, уровень органометрических показателей пуповины определяют по следующим показателям:
- средний диаметр пуповины (СДП d CM)=d1+d2+d3+…d5:n;
- объем (V см3)=π×r2×L (см3);
- единица объемной массы (ЕОМ г/см3)=М:V (г/см3);
- единица линейной массы (ЕЛМ г/см)=М:Л (г/см);
- показатель стандартной массы (ПСМ г)=ЕЛМ×50 см (г),
а подбор овцематок с учетом степени их генетической совместимости с бараном-производителем производят по величине индекса антигенного сходства в пределах от 0,31 до 0,60 (см. пат. №2528857 МПК А01К 67/02, опубл. 20. 09. 2014 г.).
Недостатком данного способа оценки генетического потенциала овец в раннем возрасте является то, что в качестве критерия оценки используют только биохимические и генетические параметры диаметра пуповины, единицы объемной и линейной массы.
Известен способ определения мясной продуктивности коров крупного рогатого скота по полиморфизму в гене LEP 528 С/Т, включающий выделение ДНК из крови с дальнейшим генотипированием коров с помощью полимеразной цепной реакции с использованием праймеров на основе SNP в позиции 528 экзона 2 промотора бычьего лептина и отбор животных гетерозиготных С/Т матерей по гену LEP, при этом используют
- AGGTGCCCAGGGACTCA - прямой праймер;
- CAACAAAGGCCGTGTGACA - обратный праймер;
- FAM-CAAGCTCTAGAGCCTGTGT-BHQ1 - Зонд 1;
- HEX-AAGCTCTAGAGCCTATGT-BHQ1 - Зонд 2 (см. пат. №2734964 МПК А01К 67/02, опубл. 26.10.2020 г.).
Недостатком данного способа оценки мясной продуктивности крупного рогатого скота является невысокое качество определения, так как используют только молекулярно-генетический маркер, направленный на изучение мясной продуктивности у крупного рогатого скота, а точных данных по влиянию данного маркера на продуктивность овец не имеется.
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому положительному эффекту и принятый авторами за прототип является способ оценки высокой мясной продуктивности овец сальской породы, включающий выделение ДНК, амплификацию фрагмента гена GH с использованием праймеров 5'-GGAGGCAGGAAGGGATGAA-3' и 5'-ССAAGGGAGGGAGAGACAGА-3', рестрикцию амплифицированного фрагмента гена GH эндонуклеазой НаеIII, определение генотипов и отбор животных с генотипом AB/GH (см. пат. №2662679 МПК А01К 67/02, С12 1/68, С12 1/6844, С07Н 21/04, опубл. 26.07.2018 г.).
Недостатком данного способа является то, что оценка мясной продуктивности овец производится лишь по результатам молекулярно-генетических тестов на основании одного белка соматотропина (GH), хотя оценка комбинированных полиморфных вариантов ДНК в генах, ассоциированных с высокой продуктивностью, может быть более информативной.
Раскрытие изобретения
Задачей предлагаемого изобретения является разработка и создание эффективного способа оценки генетического потенциала овец селекционной перспективности генетической структуры популяции овец породы манычский меринос на основе молекулярно - генетических маркеров по комплексу генов GH, CAST и GDF9, а также изучение взаимосвязи полиморфизма исследованной комбинации генов с показателями роста и развития при помощи выявленных селекционно-значимых аллелей генов GH, CAST и GDF9 для разведения и селекции, направленной на увеличение мясной продуктивности.
Технический результат, который может быть достигнут с помощью предлагаемого изобретения сводится к эффективной оценке селекционной перспективности генетической структуры популяции овец породы манычский меринос по комплексу генов GH, CAST и GDF9 и развитию породы при помощи выявленных селекционно-значимых аллелей генов GH, CAST и GDF9 для разведения и селекции, направленной на увеличение мясной продуктивности.
Технический результат достигается с помощью способа оценки генетического потенциала овец породы манычский меринос на основе молекулярно-генетических маркеров, включающего выделение ДНК, амплификацию фрагмента гена GH с использованием праймеров 5'-GGAGGCAAGGGAAGGGATGAA-3' и R: 5'-CCAAGGGAGGGAGAGACAGA-3', при этом дополнительно определяют CAST и GDF9 с помощью полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПЦР-ПДРФ) путем использования праймеров: CAST-F: 5'-TGG-GGC-CCA-ATG-ACG-CCA-TCG-ATG-3' и R: 5'-GGT-GGA-GCA-CTT-CTG-ATC-ACC-3', GDF- F: 5'-GAA-GAC-TGG-TAT-GGG-GAA-ATG-3' и R: 5'-CCA-ATC-TGC-TCC-TAC-ACA-ССТ-3', рестрикцию амплифицированного фрагмента гена GH эндонуклеазой НаеIII, CAST эндонуклеазой MspI, гена GDF9 эндонуклеазой рестрикции BstHHl, выявление генотипов и отбор животных с желательными комплексными генотипами.
Таким образом, включение и выделение ДНК, проведение амплификации фрагмента генов GH, CAST и GDF9 с помощью ПЦР-ПДРФ (полиморфизм длин рестрикционных фрагментов) с использованием праймеров: GH - (F: 5'-GGA-GGC-AGG-AAG-GGA-TGA-A-3' и R: 5'-CCA-AGG-GAG-GGA-GAG-АСА-GA-3'); CAST - (F: 5'-TGG-GGC-CCA-ATG-ACG-CCA-TCG-ATG-3' и R: 5'-GGT-GGA-GCA-CTT-CTG-ATC-ACC-3'); GDF9 (F: 5'-GAA-GAC-TGG-TAT-GGG-GAA-ATG-3' и R: 5'-CCA-ATC-TGC-TCC-TAC-ACA-CCT-3'); рестрикцию амплифицированного фрагмента гена GH эндонуклеазой НаеIII, CAST эндонуклеазой MspI, гена GDF9 эндонуклеазой рестрикции BstHHl; выявление генотипов и отбор животных с желательными комплексными генотипами, позволяет достигнуть технического результата.
Сущность предлагаемого способа оценки генетического потенциала овец породы манычский меринос на основе молекулярно-генетических маркеров, заключается в следующем, производят выделение ДНК, амплификацию фрагмента генов GH, CAST и GDF9 методом ПЦР-ПДРФ (полиморфизм длин рестрикционных фрагментов) с использованием праймеров: GH - (F: 5'-GGA-GGC-AGG-AAG-GGA-TGA-A-3' и R: 5'-CCA-AGG-GAG-GGA-GAG-АСА-GA-3'); CAST - (F: 5'-TGG-GGC-CCA-ATG-ACG-CCA-TCG-ATG-3' и R: 5'-GGT-GGA-GCA-CTT-CTG-ATC-ACC-3'); GDF9 (F: 5'-GAA-GAC-TGG-TAT-GGG-GAA-ATG-3' и R: 5'-CCA-ATC-TGC-TCC-TAC-ACA-CCT-3'); рестрикцию амплифицированного фрагмента гена GH эндонуклеазой НаеIII, CAST эндонуклеазой MspI, гена GDF9 эндонуклеазой рестрикции BstHHl; выявление генотипов и отбор животных с желательными комплексными генотипами.
Краткое описание чертежей и иных материалов
На фиг. 1 - дан способ оценки генетического потенциала овец породы манычский меринос на основе молекулярно-генетических маркеров, рисунок 1 схема исследований по изучению полиморфизма генов GH, CAST, GDF9.
На фиг. 2, то же, дана таблица 1 - частота встречаемости аллелей и генотипов генов GH, CAST, GDF9 овец породы манычский меринос (n=211).
На фиг. 3, то же, дана таблица 2 - идентификация выявленных однонуклеотидных полиморфизмов в генах GH, CAST, GDF9.
На фиг. 4, то же, дана таблица 3 - показатели генетической структуры исследуемых животных породы манычский меринос (n=211).
На фиг. 5, то же, дана таблица 4 - динамика роста ярок породы манычский меринос (n=91) различных генотипов по генам GH, CAST, GDF9.
На фиг. 6, то же, дана таблица 5 - динамика роста баранчиков породы манычский меринос (n=120) различных генотипов по генам GH, CAST, GDF9.
На фиг. 7, то же, дан рисунок 2 - электрофореграмма результата ПЦР-ПДРФ гена гормона роста (GH) в 4% агарозном геле.
Обозначения:
1 - ДНК-маркер 50 bp (IsoGeneLab);
2, 3, 5, 8, 9 - генотип АА (277; 202; 110; 100; 94; 68; 49; 22; 8 и 4 п.н);
4, 6, 7, 10, 11 - генотип АВ (277; 256; 202; 110; 100; 94; 68; 49; 22; 8 и 4 п.н).
На фиг. 8, то же, дан рисунок 3 - электрофореграмма результата ПЦР-ПДРФ гена кальпастатин (CAST) в 1,8% агарозном геле.
Обозначения:
1 - ДНК-маркер 50 bp (IsoGeneLab);
4, 8, 9, 13,17 - генотип MN (622; 336; 286 п.н.)
2, 3, 5, 6, 7, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 18 - генотип ММ (336; 286 п.н.)
На фиг. 9, то же, дан рисунок 4 - электрофореграмма результата ПЦР-ПДРФ гена дифференциального фактора роста (GDF9) в 2% агарозном геле.
Обозначения:
1 - ДНК-маркер 50 bp (IsoGeneLab);
6, 9, 13 - генотип AG (462; 250; 220 п.н).
2, 3, 4, 5, 7, 8 10, 11, 12, 14, 15, 16, 17, 18 - генотип GG (250; 220 п.н.).
Осуществление изобретения
Примеры конкретного выполнения способа оценки генетического потенциала овец породы манычский меринос на основе молекулярно-генетических маркеров, осуществляют следующим образом.
Способ молекулярно-генетического анализа, основанный на полимеразной цепной реакции (ПЦР) позволил разработать новые маркерные системы, обеспечивающие определение генотипов животных непосредственно на уровне генетического материала клетки (на уровне ДНК) независимо от пола и возраста, в овцеводстве особое внимание принадлежит селекции, которая направлена на улучшение параметров мясной продуктивности, при этом ведущая роль отводится исследованию полиморфизма маркерных генов и генов-кандидатов, кодирующих гормоны, которые контролируют процессы роста и развития, предоставляют возможность выявлять генетические маркеры, оказывающие влияние на продуктивность и позволяют определить оценочные критерии для прогноза генетического потенциала животных, у экспериментальных животных из практических исследований обнаружено, что маркерная комплексная система, включающая в себя гены GH (соматотропин), CAST (кальпастатин) и GDF9 (дифференциальный фактор роста) являются перспективной для ассоциативных исследований, поскольку комбинация вышеупомянутых генов и выявленных желательных аллелей играют жизненно важную роль в процессе развития, контроле роста млекопитающих.
Найдена замена с. 255 G>A, расположенная в экзоне 3 гена GH (соматотропин, гормон роста), находящимся на хромосоме 11 и состоящим из 6945 п.н. Данный гормон выполняет в организме функцию регулирования обменных процессов, ускоряет синтез протеина, ДНК и РНК, гликогена. Экспрессия соматотропного белка способствует ускоренному развитию и росту организма животного.
Выявлена однонуклеотидная замена с. 767+200G>A, расположенная в области интрона белок-кодирующего гена CAST (кальпастатин), находящимся на хромосоме 5, состоящем из 29 экзонов и имеющим длину 89597 п.н. Является особого рода ингибитором кальций-зависимых протеаз, чем обуславливает нежность мяса и выраженность его структуры.
Мутация с. 397G>A (область 1 экзона) была найдена в структуре гена GDF9 (дифференциальный фактор роста), который находится на хромосоме 5, имеет длину 2940 п.н. и рекомендован к использованию в исследовательских работах как белок, участвующий в клеточных процессах, регулирующих половое размножение самок, генерацию гамет, развитие гонад и цикл овуляции, и модулирующий сигнальные пути рецептора трансформирующего фактора роста бета и трансмембранного рецепторного белка серин/треонин киназы.
Способ оценки генетического потенциала овец породы манычский меринос на основе молекулярно-генетических маркеров, осуществляют следующим образом. Молекулярно-генетическое тестирование животных проводят методом ПЦР-ПДРФ, в результате которого получены сведения о комплексных аллельных вариантах и генотипах. В качестве биоматериала для проведения ДНК-генотипирования у животных использовалась кровь, взятая из яремной вены. Для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) применяют наборы «GenePakPCRCore», (IsoGeneLab, Москва). Генотипирование овец осуществляют по комплексу генов GH, CAST и GDF9. На программируемом четырехканальном термоциклере «Терцик» фирмы «ДНК-технология» (Россия) проводят амплификацию фрагмента ДНК в объеме 20 мкл (17 мкл реакционная смесь +3 мкл ДНК; 15 мкл реакционная смесь +5 мкл ДНК) с использованием праймеров: GH (973 п.н.) - (F: 5'-GGA-GGC-AGG-AAG-GGA-TGA-A-3' и R: 5'-CCA-AGG-GAG-GGA-GAG-ACA-GA-3'); CAST (622 п.н.) - (F: 5'-TGG-GGC-CCA-ATG-ACG-CCA-TCG-ATG-3' и R: 5'-GGT-GGA-GCA-CTT-CTG-ATC-ACC-3'); GDF9 (462 п.н.) - (F: 5'-GAA-GAC-TGG-TAT-GGG-GAA-ATG-3' и R: 5'-CCA-ATC-TGC-TCC-TAC-ACA-CCT-3') - Рестрикционный анализ полученных амплификатов, проводят при помощи эндонуклеаз рестрикции НаеIII, MspI, BstHHl согласно протоколу производителя (ООО «СибЭнзим, г. Новосибирск»). После окончания электрофореза в 2-4,0% агарозном геле, окрашенным бромистым этидием, который помещают на фильтр трансиллюминатора, излучающего свет в ультрафиолетовом диапазоне, производят визуализацию числа и длин фрагментов рестрикции. В качестве маркера молекулярных масс используют стандартный набор М 50 «GenePakDNAMarkers» (IsoGeneLab) (Фиг. 2-4).
Идентификация обнаруженных однонуклеотидных полиморфизмов, отвечающих за мясную продуктивность, и выравнивание на референсный геном осуществлено в международной базе данных NCBI Genome. Для описания однонуклеотидных замен используют номенклатуру HGVS. По результатам молекулярно-генетического анализа устанавливают наличие и частоту аллелей и генотипов, а также комплексных генотипов. Влияние комплексных генотипов генов GH, CAST, GDF9 на скорость роста учитывают у молодняка овец (n=211) по следующим показателям: живая масса при рождении и в возрасте 4 месяца (кг), среднесуточный прирост от рождения до 4 месяцев (г) (Таб. 5). Все исследуемые животные были одного года рождения и содержались в одинаковых условиях. Согласно вышеуказанной таблице в гене GH аллель А является мутантным (генотип АА), В - референсным (диким) (генотип ВВ), то есть референсная последовательность - это ДНК в цифровом виде, составленная учеными как общий эталонный пример генома данного вида, в частности, у овец. В гене CAST аллель N - мутантный (NN - генотип), M - референсный (ММ - генотип). GDF9 имеет мутантный аллель А (соответственно генотип АА), и референсный аллель G (генотип GG). Для полноты исследования генетического разнообразия популяции молодняка овец породы манычский меринос был проведен генетико-статистический анализ, включающий в себя: анализ частоты аллелей, с использованием уравнения Харди-Вайнберга (HW). который рассчитывался следующим образом:
1=p2+2pq+q2,
где р и q - частота встречаемости различных аллелей
р2 - частота гомозиготного доминантного генотипа
q2 - частота гомозиготного рецессивного генотипа.
Ожидаемую гетерозиготность вычисляют по формуле Нех=1-Са,
где Са - коэффициент гомозиготности, ее определяют через коэффициент гомозиготности, используя формулу Робертсона Ca=∑pi2,
где pi2 - квадраты частот аллелей локуса.
Рассчитанный индекс фиксации Fis позволил установить связь между индивидами отдельной популяции и популяцией в целом. Поскольку данный показатель количественно отражает отклонение частот встречаемости гетерозиготных генотипов от теоретически ожидаемой по Харди-Вайнбергу доли гетерозигот при случайном спаривании внутри популяции, то он может рассматриваться в качестве одного из критериев инбредности популяции.
Fis=1-(Hobs/Hex)
где Hobs - наблюдаемая гетерозиготность, Hex - ожидаемая гетерозиготность.
Уровень полиморфности является важным интегральным показателем, характеризующим число активно действующих аллелей в популяции, поэтому данный параметр также принят во внимание. Уровень полиморфности - это величина, обратная коэффициенту гомозиготности Робертсона: Na=1/Ca,
где Са - степень гомозиготности, %.
Чем выше степень ожидаемой гомозиготности, тем меньше число эффективных аллелей в генотипах и тем значительнее уменьшается генетическое разнообразие в популяции.
ДНК-диагностикой с использованием ПЦР-ПДРФ выявлено наличие полиморфизма в локусах генов GH, CAST и GDF9 у молодняка овец породы манычский меринос (n=211) (Таб. 1), представленного аллелями А и В; М и N; А и G соответственно, при этом прослеживается существенная разница в частоте встречаемости аллелей А (0,83) и В (0,17) гена гормона роста, М (0,9) и N (0,1) гена кальпастатина, А (0,1) и G (0,9) гена дифференциального фактора роста. Выявленная закономерность отразилась в распределении частот гомозиготных и гетерозиготных генотипов в рассматриваемых генах. Так, по гену GH частота встречаемости генотипов АА и АВ составляет 0,67 и 0,32, тогда как гомозиготный генотип ВВ встречается довольно редко 0,01. Для гена CAST наиболее часто встречается гомозиготный генотип ММ (0,8), тогда как гетерозиготный вариант MN составил 0,19, в тоже время низкая встречаемость характерна для овец генотипа NN (0,005). По гену GDF9 наблюдается несколько иное распределение частот генотипов, где преобладающим был гомозиготный генотип GG, частота которого составляет 0,86, тогда как генотипы АА и AG были практически равны 0,06 и 0,08.
Проведенный генетико-статистический анализ полученных результатов, представлен в таблице 3. Наблюдаемая (observed) гетерозиготность (Hobs) по локусу GH составила 0,3, по CAST и GDF9 - 0,18 и 0,18 соответственно. Ожидаемая (expected) гетерозиготность (Hex) более чувствительна к размеру выборки и чаще используется при описании генетического разнообразия, поэтому был рассчитан данный показатель. Ожидаемая гетерозиготность по локусам генов соматотропина, кальпастатина и дифференциального фактора роста составляет 0,7, 0,81 и 0,92 соответственно.
Наиболее высокий показатель уровня полиморфности Na (показатель числа эффективных аллелей) выявлен по локусу GH (1,39), средний показатель по локусам генов GDF9 и CAST, составивший 1,22. Аналогичная картина наблюдается по коэффициенту V (характеризует возможную степень реализации генетической изменчивости), более высокие показатели получены по локусу GH - 31%, против 20%) - по локусам CAST и GDF9. Тест гетерозиготно сти показывает фактическое преимущество количества гетерозигот по локусу гена GH (-0,4Ф>Т), незначительно меньшее количество их было обнаружено по локусу гена CAST (-0,62Ф>Т) и по локусу гена GDF9 их выявлено -0,74Ф>Т. Полученные результаты подтверждают и рассчитанный коэффициент эксцесса (Fis), свидетельствующий о недостатке или избытке фактически наблюдаемой гетерозиготности в сравнении с теоретической. Индекс фиксации оказался наименьшим в локусе гена соматотропина (+0,57), а наибольшим - в локусе гена дифференциального фактора роста (+0,8), в локусе гена кальпастатина индекс фиксации составил +0,78. Мера или величина информационного полиморфизма (polymorphism information content - PIC), определяется способностью генетического маркера устанавливать полиморфизм популяции в зависимости от числа обнаруживаемых аллелей и распределения их частот. Расчет значения PIC для исследуемых маркеров GH, CAST и GDF9 составил 0,28, 0,18 и 0,18 соответственно. Из 27 теоретически возможных комплексных генотипов у исследуемых животных выявлено 14 (Таб. 1). Оценка генетической структуры исследуемого поголовья показала, что среди исследованных животных наиболее часто встречаются овцы с комплексным генотипом GHAACASTMMGDF9GG (105 голов или 49,8%). На долю генотипа GHABCASTMMGDF9GG приходится 42 головы (19,9%). Равное количество особей имеет комплексные генотипы GHAACASTMMGDF9AA и GHABCASTMNGDF9GG - на их долю приходится по 8 голов (или по 3,8%). У 5 исследуемых животных (2,4%) выявлен комплексный генотип GHABCASTMMGDF9AG. По 1 особи (0,5%) приходится на генотипы GHAACASTMNGDF9AG, GHAACASTNNGDF9GG, GHBBCASTMNGDF9AA и GHBBCASTMNGDF9AG. Проведение дальнейших исследований позволило проанализировать взаимосвязь полиморфных вариантов генов GH, CAST, GDF9 с интенсивностью роста молодняка овец.
На основании проводимого эксперимента дана сравнительная характеристика протестированных животных. Среди исследуемых ярок (n=91) наибольшую живую массу при рождении имели особи с генотипами GHAB, САSTMN, GDF9AA при сравнении с животными других генотипов GHAA, CASTMM, GDF9AG и GDF9GG на 2,2-14,8%. Анализируя результаты взвешивания ярок в возрасте 4 месяцев, отмечается преимущество животных, имеющих генотипы GHAB, CASTMM, GDF9AA, составившее 1,1-5,7%. Среди баранчиков зафиксирована более высокая живая масса, как при рождении, так и при отъеме (4 месяца) у носителей генотипов GHAB, CASTMN, GDFF9AA, чем у молодняка с генотипами GHAA, CASTMM, GDF9GG на 6,2-14,2%, а также 0,7-3,5% соответственно.
Величина среднесуточного прироста исследуемых животных свидетельствует, что ярки с генотипами GHAB, GDF9AA отличающиеся наибольшей живой массой, характеризуются и высокими показателями прироста (таб. 4). Так, интенсивность роста у носителей генотипов GHAB, GDF9AA над ярками других исследуемых генотипов составляет в период от рождения до отъема 1,1-2,4%.
Таким образом, использование тестирования SNP-маркеров комплексной системы, включающей в себя гены GH, CAST, GDF9 позволяет проводить оценку генетического потенциала молодняка овец в раннем возрасте и отбирать высокопродуктивных животных с генетическим обоснованием перспективности селекции в дальнейшем для получения наиболее желательных генотипов мясной продуктивности.
Примеры конкретного выполнения ДНК-генотипирования для выявления полиморфизма генов, отвечающих за высокую мясную продуктивность у овец, разводимых на территории Российской Федерации.
Пример 1. Изучен, проанализирован и испытан полиморфизм генов гормона роста, кальпастатина, дифференциального фактора роста у молодняка овец сальской породы. Установлено, что наличие гетерозиготного генотипа GHAB у баранчиков этой породы оказывает положительное влияние на темпы роста. Выявлено, что живая масса при отъеме, в 9-месячном возрасте и среднесуточный прирост баранчиков с гетерозиготным генотипом GHAB превышали значения этих параметров на 0,92; 10,67 кг и 47,3 г, в сравнении с гомозиготным генотипом АА соответственно. Животные генотипа GHAB характеризовались лучшей мясной продуктивностью. Сравнение показателей роста и развития молодняка овец сальской породы в зависимости от генотипов гена CAST показало наличие влияния данного гена на хозяйственно-полезные признаки. Молодняк с гетерозиготным генотипом CASTMN имел живую массу при рождении 4,1 кг, что на 0,12 кг выше гомозиготного генотипа CASTMM (3,98 кг). Выявленные различия по величине живой массы между животными разных генотипов сохранились и в 6-месячном возрасте: овцы гетерозиготного генотипа CASTMN (33,12 кг) на 1,91 кг превышали гомозиготный вариант CASTMM (35,03 кг). Исследованиями полиморфизма гена GDF9 выявлено, что в возрасте 7 месяцев бараны с генотипом АА превосходили генотипы AG и GG по показателям мясной продуктивности в среднем на 7,01 кг.
Пример 2. Изучен, проанализирован и испытан полиморфизм генов гормона роста, кальпастатина у молодняка овец романовской породы. Оценка полиморфизма гена GH в популяции романовских овец показала наличие трех вариантов генотипов АА, АВ и ВВ, с частотой встречаемости аллелей А и В - 63 и 37% соответственно. При оценке полиморфизма гена CAST выявлено 3 генотипа MM, MN и NN с различной частотой встречаемости. Соотношение аллелей М и N в популяции составило 74 и 26% соответственно. По гену GH наибольшее достоверное превосходство по живой массе во все исследуемые возрастные периоды выявлено у особей с генотипом АВ, составляющее от 0,5 до 12,9%. Животные с генотипом ММ гена CAST превосходили животных с генотипами MN и NN в 5-месячном возрасте на 5,6 и 14,8%, в возрасте 10 месяцев - на 4,53 и 11,3% соответственно.
Пример 3. Изучен, проанализирован и испытан полиморфизм генов гормона роста, кальпастатина у молодняка овец ставропольской породы. Во все исследуемые возрастные периоды выявлено превосходство по величине живой массы и среднесуточных приростов у генотипов АВ, MN генов GH, CAST по сравнению с аналогами других генотипов. Преимущество по величине живой массы у животных, имеющих эти генотипы, составило: в 2-месячном возрасте - 4,4; 5,7%; в 8 месяцев - 3,7; 9,1% соответственно.
Установлены более высокие показатели среднесуточных приростов, превосходство которых составило: в 2-месячном возрасте - 4,3; 5,5%; в 8 месяцев - 3,6; 8,5%, в сравнении с животными других генотипов соответственно.
Пример 4. Изучен и проанализирован и испытан полиморфизм генов гормона роста, кальпастатина, дифференциального фактора роста у ярок породы манычский меринос. В 6-месячном возрасте выявлено превосходство по величине живой массы и среднесуточных приростов у генотипов АВ, MN и АА генов GH, CAST и GDF9 по сравнению с аналогами других генотипов. По величине живой массы преимущество в среднем составило: 4,37; 3,9; 5,1%, по величине среднесуточных приростов - 2,9; 1,6; 4,4% в сравнении с животными других генотипов соответственно.
Пример 5. Изучен и проанализирован и испытан полиморфизм генов гормона роста, кальпастатина, дифференциального фактора роста у баранчиков породы манычский меринос. В период проведения откорма в возрасте от 6 до 8 месяцев выявили, что баранчики носители АВ, MN генотипов генов GH, CAST при сравнении с аналогами других генотипов по интенсивности роста существенно превосходили этих животных. Результаты наблюдений показали, что у молодняка с генотипом АВ, MN к завершению откорма фиксировалась высокая живая масса в среднем на - 5,0; 3,8% при сопоставлении с показателями животных аналогичных генотипов. Лучшая способность овец носителей генотипов АВ, MN эффективно преобразовывать корм в продукцию обеспечила наибольший среднесуточный прирост, превышающий показатели животных других генотипов в среднем на 7,0; 5,6%.
Предлагаемое изобретение по сравнению с прототипом и другими известными техническими решениями имеет следующие преимущества:
- возможность оценки генетического потенциала молодняка овец в раннем возрасте;
- возможность отбирать высокопродуктивных животных;
- возможность отбирать животных с генетическим обоснованием перспективности селекции в дальнейшем для получения наиболее желательных генотипов мясной продуктивности.
Claims (1)
- Способ оценки высокой мясной продуктивности овец породы манычский меринос на основе молекулярно-генетических маркеров, включающий выделение ДНК, амплификацию фрагмента гена GH с использованием праймеров 5’-GGAGGCAAGGGAAGGGATGAA-3’ и R: 5’-CCAAGGGAGGGAGAGACAGA-3’, отличающийся тем, что дополнительно определяют CAST и GDF9 с помощью полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПЦР-ПДРФ) путем использования праймеров: CAST - F: 5’-TGG-GGC-CCA-ATG-ACG-CCA-TCG-ATG-3’ и R: 5’-GGT-GGA-GCA-CTT-CTG-ATC-ACC-3’, GDF9 - F: 5’-GAA-GAC-TGG-TAT-GGG-GAA-ATG-3’ и R: 5’-CCA-ATC-TGC-TCC-TAC-ACA-CCT-3’, рестрикцию амплифицированного фрагмента гена GH эндонуклеазой HaeIII, CAST эндонуклеазой MspI, гена GDF9 эндонуклеазой рестрикции BstHHl, выявление генотипов и отбор животных с желательными комплексными генотипами.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2776044C1 true RU2776044C1 (ru) | 2022-07-12 |
Family
ID=
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2835927C2 (ru) * | 2023-08-06 | 2025-03-06 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Северо-Кавказский федеральный научный аграрный центр" | Способ оценки генетического потенциала ягнят на основе исследования генов, влияющих на технологические параметры мяса |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2662679C1 (ru) * | 2016-07-19 | 2018-07-26 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Донской государственный аграрный университет" | Способ оценки высокой мясной продуктивности овец сальской породы |
| RU2734964C1 (ru) * | 2019-11-07 | 2020-10-26 | Федеральное Государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный научный центр биологических систем и агротехнологий российской академии наук" | Способ определения продуктивности коров крупного рогатого скота по полиморфизму в гене lep |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2662679C1 (ru) * | 2016-07-19 | 2018-07-26 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Донской государственный аграрный университет" | Способ оценки высокой мясной продуктивности овец сальской породы |
| RU2734964C1 (ru) * | 2019-11-07 | 2020-10-26 | Федеральное Государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный научный центр биологических систем и агротехнологий российской академии наук" | Способ определения продуктивности коров крупного рогатого скота по полиморфизму в гене lep |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| AYUK J et al. Growth hormone and its disorders. Postgraduate Medical Journal, 2006, 82:24-30. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2563724/pdf/24.pdf. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2835927C2 (ru) * | 2023-08-06 | 2025-03-06 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Северо-Кавказский федеральный научный аграрный центр" | Способ оценки генетического потенциала ягнят на основе исследования генов, влияющих на технологические параметры мяса |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Takasuga et al. | Identification of bovine QTL for growth and carcass traits in Japanese Black cattle by replication and identical-by-descent mapping | |
| US20200375156A1 (en) | Genetic markers and uses therefor | |
| Matika et al. | Balancing selection at a premature stop mutation in the myostatin gene underlies a recessive leg weakness syndrome in pigs | |
| US20090269741A1 (en) | Method for assessing traits selected from longissimus dorsi peak force, intramuscular fat, retail beef yield and net feed intake in bovine animals | |
| Evans et al. | Beyond the MHC: A canine model of dermatomyositis shows a complex pattern of genetic risk involving novel loci | |
| AU2003234372B2 (en) | Animal genotyping method | |
| Sartelet et al. | Genome-wide next-generation DNA and RNA sequencing reveals a mutation that perturbs splicing of the phosphatidylinositol glycan anchor biosynthesis class H gene (PIGH) and causes arthrogryposis in Belgian Blue cattle | |
| Raymond et al. | Forensic DNA phenotyping: Canis familiaris breed classification and skeletal phenotype prediction using functionally significant skeletal SNPs and indels | |
| MXPA06009452A (es) | Polimorfismos del promotor de leptin y sus usos. | |
| RU2776044C1 (ru) | Способ оценки генетического потенциала овец породы манычский меринос на основе молекулярно-генетических маркеров | |
| CN116590433A (zh) | 大白母猪繁殖性能的分子标记、引物、试剂盒、鉴定方法及应用 | |
| WO2007070965A1 (en) | Quantitative trait loci for bovine net feed intake | |
| Ali et al. | A novel intron variant in the prolactin gene associated with eggshell weight and thickness with putative alternative splicing patterns in chickens | |
| JP2002520070A (ja) | 変異体及び分子の同定法 | |
| Liu et al. | Novel variants in the HMGA2 gene are associated with withers height in Debao pony | |
| Lestari et al. | Identification of single nucleotide polymorphisms on cattle breeds in Indonesia using bovine 50K | |
| Aymaz et al. | Molecular characterization of fecundity-related gene regions in some of Türkiye’s native sheep breeds | |
| Atalay et al. | Identification of heat stress-associated the HSPA1A (HSP70) gene in Holstein and Turkish Grey cattle | |
| Shevchenko et al. | GENETIC CHARACTERISTICS OF POLTAVSKE SRIBLO RABBITS BY MYOSTATIN AND PROGESTERONE RECEPTOR GENE AND SELECTION INDICES | |
| SPĂTARU et al. | SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISMS (SNPs) ASSOCIATED WITH MORPHOLOGICAL TRAITS IN DAIRY COWS-REVIEW | |
| Agrawal | ASSOCIATION OF SHORT TANDEM REPEAT (STR) POLYMORPHS WITH ECONOMICALLY IMPORTANT TRAITS IN VRINDAVANI COWS | |
| Jiang et al. | PSIV-5 The effect of CD44 gene on triglyceride synthesis of bovine mammary epithelial cells | |
| Kim et al. | Analysis of runs of homozygosity in Yeonsan Ogye chickens using 600K SNP arrays | |
| Singh et al. | High resolution mapping of quantitative trait loci on ovine chromosome 3 and 20 affecting protein yield and lactation persistency | |
| Abe et al. | Genome-wide search for genes that modulate inflammatory arthritis caused by Ali18 mutation in mice |