RU2764807C1 - НАБОР ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ РАКА МОЧЕВОГО ПУЗЫРЯ С ПОМОЩЬЮ МУТАЦИЙ С228Т И C250T В ПРОМОТОРЕ ГЕНА hTERT И СПОСОБ ЕЕ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ - Google Patents
НАБОР ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ РАКА МОЧЕВОГО ПУЗЫРЯ С ПОМОЩЬЮ МУТАЦИЙ С228Т И C250T В ПРОМОТОРЕ ГЕНА hTERT И СПОСОБ ЕЕ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ Download PDFInfo
- Publication number
- RU2764807C1 RU2764807C1 RU2020132737A RU2020132737A RU2764807C1 RU 2764807 C1 RU2764807 C1 RU 2764807C1 RU 2020132737 A RU2020132737 A RU 2020132737A RU 2020132737 A RU2020132737 A RU 2020132737A RU 2764807 C1 RU2764807 C1 RU 2764807C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- gnus
- dna
- mutations
- tag
- solution
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 61
- 230000035772 mutation Effects 0.000 title claims abstract description 57
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 title claims abstract description 22
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 21
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 21
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 12
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 title claims abstract description 10
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 74
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 47
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 36
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 26
- 230000009946 DNA mutation Effects 0.000 claims abstract description 14
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims abstract description 12
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims abstract description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 68
- 238000004416 surface enhanced Raman spectroscopy Methods 0.000 claims description 42
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 24
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 238000001069 Raman spectroscopy Methods 0.000 claims description 16
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims description 14
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 13
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 12
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 claims description 12
- 239000004332 silver Substances 0.000 claims description 12
- 239000012491 analyte Substances 0.000 claims description 11
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 claims description 9
- 239000002082 metal nanoparticle Substances 0.000 claims description 9
- 229910000510 noble metal Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims description 8
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 7
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 5
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 4
- 239000013078 crystal Substances 0.000 claims description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 4
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 claims description 4
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M thionine Chemical compound [Cl-].C1=CC(N)=CC2=[S+]C3=CC(N)=CC=C3N=C21 ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- GJCOSYZMQJWQCA-UHFFFAOYSA-N 9H-xanthene Chemical compound C1=CC=C2CC3=CC=CC=C3OC2=C1 GJCOSYZMQJWQCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 125000000664 diazo group Chemical group [N-]=[N+]=[*] 0.000 claims description 3
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 3
- QDLAGTHXVHQKRE-UHFFFAOYSA-N lichenxanthone Natural products COC1=CC(O)=C2C(=O)C3=C(C)C=C(OC)C=C3OC2=C1 QDLAGTHXVHQKRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229960000907 methylthioninium chloride Drugs 0.000 claims description 3
- 230000005855 radiation Effects 0.000 claims description 3
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 claims description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 2
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000005368 silicate glass Substances 0.000 claims description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims 3
- RBTBFTRPCNLSDE-UHFFFAOYSA-N 3,7-bis(dimethylamino)phenothiazin-5-ium Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC2=[S+]C3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 RBTBFTRPCNLSDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 7
- 230000005748 tumor development Effects 0.000 abstract description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 44
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 38
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 36
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 29
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 26
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 26
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 24
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 22
- 238000000479 surface-enhanced Raman spectrum Methods 0.000 description 21
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 20
- VYXSBFYARXAAKO-WTKGSRSZSA-N chembl402140 Chemical compound Cl.C1=2C=C(C)C(NCC)=CC=2OC2=C\C(=N/CC)C(C)=CC2=C1C1=CC=CC=C1C(=O)OCC VYXSBFYARXAAKO-WTKGSRSZSA-N 0.000 description 20
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 20
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 17
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 16
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 15
- 101000655352 Homo sapiens Telomerase reverse transcriptase Proteins 0.000 description 14
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 14
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 14
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 13
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 13
- FOIXSVOLVBLSDH-UHFFFAOYSA-N Silver ion Chemical compound [Ag+] FOIXSVOLVBLSDH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 12
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- DLLXAZJTLIUPAI-UHFFFAOYSA-N [[5-(2-amino-4-oxo-1h-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-7-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] phosphono hydrogen phosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2C=CN1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 DLLXAZJTLIUPAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 108010017842 Telomerase Proteins 0.000 description 9
- 108090001097 Transcription Factor DP1 Proteins 0.000 description 9
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 9
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 9
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 9
- 102000004853 Transcription Factor DP1 Human genes 0.000 description 8
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 8
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 7
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 7
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 7
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 7
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- UAOMVDZJSHZZME-UHFFFAOYSA-N diisopropylamine Chemical compound CC(C)NC(C)C UAOMVDZJSHZZME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 5
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 5
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 5
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 5
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 5
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 5
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 4
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 4
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 description 4
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 230000000771 oncological effect Effects 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- NDVLTYZPCACLMA-UHFFFAOYSA-N silver oxide Chemical compound [O-2].[Ag+].[Ag+] NDVLTYZPCACLMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010069754 Acquired gene mutation Diseases 0.000 description 3
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 3
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100027103 Serine/threonine-protein kinase B-raf Human genes 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 101150061233 TFDP1 gene Proteins 0.000 description 3
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 3
- 102100032938 Telomerase reverse transcriptase Human genes 0.000 description 3
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 229940071106 ethylenediaminetetraacetate Drugs 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 3
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 3
- YAHRDLICUYEDAU-UHFFFAOYSA-N methylhexaneamine Chemical compound CCC(C)CC(C)N YAHRDLICUYEDAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 3
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 3
- 230000037439 somatic mutation Effects 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 3
- ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine Chemical compound C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C([O-])=O ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010044412 transitional cell carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- BYEAHWXPCBROCE-UHFFFAOYSA-N 1,1,1,3,3,3-hexafluoropropan-2-ol Chemical compound FC(F)(F)C(O)C(F)(F)F BYEAHWXPCBROCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonium chloride Substances [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091081406 G-quadruplex Proteins 0.000 description 2
- 101000984753 Homo sapiens Serine/threonine-protein kinase B-raf Proteins 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N Methylamine Chemical compound NC BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710183263 Serine/threonine-protein kinase B-raf Proteins 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 2
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 2
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 2
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 2
- 229940043279 diisopropylamine Drugs 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 2
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 238000007849 hot-start PCR Methods 0.000 description 2
- UOEFDXYUEPHESS-QMGXLNLGSA-N isopropyl beta-D-galactopyranoside Chemical compound CC(C)O[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O UOEFDXYUEPHESS-QMGXLNLGSA-N 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- CXKWCBBOMKCUKX-UHFFFAOYSA-M methylene blue Chemical compound [Cl-].C1=CC(N(C)C)=CC2=[S+]C3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 CXKWCBBOMKCUKX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000000197 pyrolysis Methods 0.000 description 2
- 150000003378 silver Chemical class 0.000 description 2
- 229910001923 silver oxide Inorganic materials 0.000 description 2
- SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N silver(1+) nitrate Chemical compound [Ag+].[O-]N(=O)=O SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NGBNXJUWQPLNGM-UHFFFAOYSA-N silver;azane Chemical compound N.[Ag+] NGBNXJUWQPLNGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- UEUXEKPTXMALOB-UHFFFAOYSA-J tetrasodium;2-[2-[bis(carboxylatomethyl)amino]ethyl-(carboxylatomethyl)amino]acetate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC([O-])=O)CC([O-])=O UEUXEKPTXMALOB-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 210000003932 urinary bladder Anatomy 0.000 description 2
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 2
- DZCRSVQAXDNLEY-UHFFFAOYSA-N 1-ethylsulfanyltetrazole Chemical compound CCSN1C=NN=N1 DZCRSVQAXDNLEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001731 2-cyanoethyl group Chemical group [H]C([H])(*)C([H])([H])C#N 0.000 description 1
- VKIGAWAEXPTIOL-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxyhexanenitrile Chemical compound CCCCC(O)C#N VKIGAWAEXPTIOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710143116 Actin, cytoplasmic Proteins 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- 206010001488 Aggression Diseases 0.000 description 1
- XFYFMYANJHBLFL-UHFFFAOYSA-N C(C1=CC=CC=C1)C1=C(N=NN1)N(C=1N=NNC=1CC1=CC=CC=C1)C=1N=NNC=1CC1=CC=CC=C1 Chemical compound C(C1=CC=CC=C1)C1=C(N=NN1)N(C=1N=NNC=1CC1=CC=CC=C1)C=1N=NNC=1CC1=CC=CC=C1 XFYFMYANJHBLFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 241000252506 Characiformes Species 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- -1 DMSO and glycerol Chemical class 0.000 description 1
- 230000005778 DNA damage Effects 0.000 description 1
- 231100000277 DNA damage Toxicity 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N Deoxyuridine 5'-triphosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N Ethylenediamine Chemical compound NCCN PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 208000032612 Glial tumor Diseases 0.000 description 1
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 1
- 229910013684 LiClO 4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 101500021084 Locusta migratoria 5 kDa peptide Proteins 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-CBQIKETKSA-N N-Acetyl-D-Galactosamine Chemical class CC(=O)N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-CBQIKETKSA-N 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108700020978 Proto-Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 102000052575 Proto-Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 238000001237 Raman spectrum Methods 0.000 description 1
- 101150047500 TERT gene Proteins 0.000 description 1
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N Thymine Natural products CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 1
- 238000003766 bioinformatics method Methods 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010411 cooking Methods 0.000 description 1
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000366 copper(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- DMSZORWOGDLWGN-UHFFFAOYSA-N ctk1a3526 Chemical compound NP(N)(N)=O DMSZORWOGDLWGN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- HPNMFZURTQLUMO-UHFFFAOYSA-N diethylamine Chemical compound CCNCC HPNMFZURTQLUMO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- UXGNZZKBCMGWAZ-UHFFFAOYSA-N dimethylformamide dmf Chemical compound CN(C)C=O.CN(C)C=O UXGNZZKBCMGWAZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CETRZFQIITUQQL-UHFFFAOYSA-N dmso dimethylsulfoxide Chemical compound CS(C)=O.CS(C)=O CETRZFQIITUQQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008995 epigenetic change Effects 0.000 description 1
- 238000005530 etching Methods 0.000 description 1
- VYXSBFYARXAAKO-UHFFFAOYSA-N ethyl 2-[3-(ethylamino)-6-ethylimino-2,7-dimethylxanthen-9-yl]benzoate;hydron;chloride Chemical compound [Cl-].C1=2C=C(C)C(NCC)=CC=2OC2=CC(=[NH+]CC)C(C)=CC2=C1C1=CC=CC=C1C(=O)OCC VYXSBFYARXAAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000002795 fluorescence method Methods 0.000 description 1
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 description 1
- CPBQJMYROZQQJC-UHFFFAOYSA-N helium neon Chemical compound [He].[Ne] CPBQJMYROZQQJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 description 1
- 238000011528 liquid biopsy Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- WVJKHCGMRZGIJH-UHFFFAOYSA-N methanetriamine Chemical compound NC(N)N WVJKHCGMRZGIJH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 229910021421 monocrystalline silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 108091006026 monomeric small GTPases Proteins 0.000 description 1
- 239000002103 nanocoating Substances 0.000 description 1
- 239000006199 nebulizer Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 1
- 238000000879 optical micrograph Methods 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 238000001782 photodegradation Methods 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000000092 prognostic biomarker Substances 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 102000016914 ras Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010014186 ras Proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 230000011514 reflex Effects 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 102200085641 rs121913273 Human genes 0.000 description 1
- 102200102928 rs148924904 Human genes 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000004626 scanning electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000009758 senescence Effects 0.000 description 1
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 1
- 230000001953 sensory effect Effects 0.000 description 1
- 229910001961 silver nitrate Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000030938 small GTPase Human genes 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 108010068698 spleen exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000011477 surgical intervention Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 108091035539 telomere Proteins 0.000 description 1
- 102000055501 telomere Human genes 0.000 description 1
- 210000003411 telomere Anatomy 0.000 description 1
- YBRBMKDOPFTVDT-UHFFFAOYSA-N tert-butylamine Chemical compound CC(C)(C)N YBRBMKDOPFTVDT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000013520 translational research Methods 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 1
- 208000023747 urothelial carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001845 vibrational spectrum Methods 0.000 description 1
- 235000012431 wafers Nutrition 0.000 description 1
- 238000007482 whole exome sequencing Methods 0.000 description 1
- 238000012070 whole genome sequencing analysis Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/65—Raman scattering
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Oncology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии. Предложены набор и способ для диагностики рака мочевого пузыря с помощью мутаций C228T и C250T в промоторе гена hTERT. Набор включает сенсор и растворы меченных красителем с пределом обнаружения не более 1 мкМ олигонуклетидов GnuS-C228T-метка и GnuS-C250T-метка. Способ включает забор биологического образца, где одну часть образца смешивают с раствором олигонуклеотида GnuS-C228T-метка, а другую часть с раствором GnuS-C250T-метка, проведение их гибридизации с последующим определением мутаций ДНК C228T и C250T. Изобретения обеспечивают достижение высокой точности проведения диагностики рака мочевого пузыря на ранних стадиях развития опухоли. 2 н. и 16 з.п. ф-лы, 16 ил., 2 табл., 2 пр.
Description
Настоящее изобретение относится к области аналитических и биоорганических исследований, предназначено для диагностики агрессивности глиомы и первичного обнаружения и рецидивирования опухоли мочевого пузыря, а также при развитии области трансляционных исследований в будущем для других приложений путем обнаружения мутаций в промоторе гена теломеразной обратной транскриптазы человека. Представленное изобретение может быть использовано в гематологии и онкологической диагностике, в биохимических исследованиях для молекулярного узнавания, качественного и количественного обнаружения мутаций в промоторе гена каталитической субъединицы теломеразы человека с высокими чувствительностью, селективностью и экспрессностью.
Уровень техники
Теломеразная обратная транскриптаза человека (hTERT) - фермент, основной функцией которого является добавление особых повторяющихся последовательностей нуклеотидов на концы хромосом, которые укорачиваются из-за недорепликации ДНК. В норме теломераза активна в стволовых, половых и некоторых других клетках организма, которым необходимо постоянно делиться, однако в дифференцированных соматических клетках уровень экспрессии и активность теломеразы ограничены. Активация теломеразы в соматических клетках является критическим событием для их перерождения в опухолевые клетки и наблюдается в 85% случаев онкологических заболеваний [Shay J. W., Wright W. E. Senescence and immortalization: role of telomeres and telomerase // Carcinogenesis. 2005. V.26. P. 867-874]. Рак мочевого пузыря является наиболее частым онкологическим заболеванием мочевыделительной системы, и последние исследования показали, что мутации в промоторе hTERT являются самыми частыми мутациями на всех стадиях заболевания. [Allory Y. et al. Telomerase reverse transcriptase promoter mutations in bladder cancer: high frequency across stages, detection in urine, and lack of association with outcome // Eur. Urol. 2014. V. 65. P. 360-366]. Из уровня техники известны решения, позволяющие осуществлять молекулярную диагностику онкологических заболеваний. Одной из причин возникновения рака является появление соматических мутаций в клетке, которые нарушают ее нормальное функционирование. Некоторые генетические изменения являются характеристическими для определенного вида опухолевого поражения и могут служить маркерами заболевания. Обнаружение и определение поврежденных участков ДНК позволяет проводить прогнозирование и достоверную диагностику широкого класса заболеваний на ранних стадиях. Например, известно, что присутствие определенных соматических мутаций в онкогенах определяет скорость развития некоторых онкологических поражений. Например, при наличии соматических мутаций в онкогенах KRAS и BRAF колоректальный рак развивается в кратчайшие сроки, быстро метастазирует и трудно поддается химиотерапии. Наличие тех или иных маркеров позволяет определить точную область поражения и стадию заболевания, позволяет предсказать ответ на определенный вид терапий, а также обеспечивает возможность мониторинга течения болезни и рецидивирования. В настоящее время биопсия ткани является стандартной процедурой отбора биологического материала для анализа опухоли на наличие специфических маркеров, однако данный подход обладает рядом ограничений. Во-первых, для получения материала необходимо хирургическое вмешательство, что ограничивает частоту проведения данной процедуры. Во-вторых, пространственная гетерогенность опухоли может приводить к ненадежным результатам детектирования онкомаркеров, особенно при однократном тестировании. Наконец, возникает необходимость мониторинга течения болезни во времени и для этих целей частое проведение инвазивного вмешательства не представляется возможным. Также известно, что позднее диагностирование онкологического заболевания - одна из причин, которая уменьшает шансы пациента выжить. Острая необходимость в использовании более доступных биоматериалов для анализа, а также необходимость развития неинвазивных методов диагностики, привели к разработке диагностических подходов с использованием свободно циркулирующей ДНК (сцДНК), а точнее - циркулирующей опухолевой ДНК (цоДНК), присутствующей в физиологических жидкостях. Таким образом, исследование легко доступной сцДНК с помощью высокочувствительных методов открывает широкие возможности для диагностики пациентов, больных раком. Для ранней диагностики заболеваний и своевременного лечения требуется определение ДНК с поврежденными фрагментами с высокой чувствительностью и точностью, поскольку даже небольшое изменение качественного и количественного состава биологических жидкостей могут быть вызваны началом широкого набора серьезных заболеваний.
В настоящее время используемые методы основаны на идентификации последовательностей ДНК путем гибридизации комплементарных последовательностей с флуоресцентным методом обнаружения. В большинстве методов определения малых количеств нуклеиновых кислот, как правило, используется предварительная амплификация фрагментов ДНК в полимеразной цепной реакции (ПЦР). Известное из уровня техники решение, описанное в работе [S. Garczyk, N. Ortiz-
, U. Schneider, I. Lurje, K. Guricova, N.T.Gaisa, E. Lorsy, K. Lindemann-Docter, A. Heidenreich, R 
. Next-generation sequencing reveals potential predictive biomarkers and targets of therapy for urothelial carcinoma in situ of the urinary bladder. Pathology. 2020. V. 190. P. 323-332], основано на секвенировании нового поколения (СНП) и позволяет анализировать одновременно миллионы копий цоДНК. Промотор гена TERT был проверен на наличие двух известных повторяющихся мутаций: С124 и С146C. Частота вариативности аллеля была установлена в 5%. В качестве эталонного генома для дизайна панели использовали hg19; hg38 служил эталонным геномом для аннотации мутаций.
Однако предложенная стратегия, как полноэкзомное и полногеномное секвенирование, обычно позволяет сгенерировать от 30 до 100 фрагментов ДНК, что приводит к слишком низкой чувствительности для анализа редких мутации в цоДНК во всем объеме сцДНК. Процесс СНП сложен в плане постановки эксперимента, затратен по времени, обладает не очень высокой чувствительностью и требует сложного биоинформатического анализа.
Известное из уровня техники решение, описанное в работе [J. J. G. Pritchard, G. Hamilton, C. D.Hurst, S. Fraser, C. Orange, M. A.Knowles, R. J. Jones, H. Y. Leung, T. Iwata. Monitoring of urothelial cancer disease status after treatment by digital droplet PCR liquid biopsy assays. Urologic Oncology: Seminars and Original Investigations. 2020. doi: 10.1016/j.urolonc.2020.05.012], основано на Сэнгер-секвенировании и цкПЦР. Сэнгер-секвенирование позволило выявить точечные мутации у 70% пациентов, чьи биообразцы были проанализированы методом цкПЦР. Случаи ремиссии и рецидивов, отслеживаемые посредством анализа мутаций PIK3CA E542K и TP53 Y163C в плазме и моче, совпадали с клиническими наблюдениями в течение 48 месяцев от начала химиотерапии. Разработанная методика, основанная на цкПЦР, позволила детектировать мутацию промотора обратной транскриптазы (TERT) теломеразы (-124). Предложенный метод выявления этой мутации способен отличить мутант от аллелей дикого типа.
Однако для постановки цкПЦР необходимо знать заранее маркерные генетические и эпигенетические изменения, кроме того, цкПЦР обладает ограниченным потенциалом для мультиплексного анализа. Предел обнаружения ДНК, выделенных из опухолевых тканей, для таких подходов, как секвенирование по методу Сэнгера, не превышает 5% (пятипроцентное содержание мутантной аллели на фоне последовательностей дикого типа).
Известное из уровня техники решение, описанное в патенте РФ №2463354 от 10.10.2012 «Способ диагностики рака мочевого пузыря с помощью онкомаркера tfdp1 (варианты) и набор для его осуществления», состоит в получении биоматериала и выделении рибонуклеиновых кислот (РНК), синтезе комплементарных дезоксирибонуклеиновых кислот (кДНК) на матрице РНК, нормировании концентрации кДНК TFDP1 по контрольному гену, проведении количественной ПЦР-амплификации фрагмента гена TFDP1. Далее определяют количество амплифицированного фрагмента ДНК TFDP1 для образца биоматериала. При концентрации кДНК гена TFDP1 в физиологических жидкостях, превышающей 1.5% концентрации кДНК гена бета-актина АСТВ, диагностируют наличие переходноклеточного рака мочевого пузыря. В предложенное решение входит набор для осуществления описанного способа методом ПЦР, включающий два праймера с определенной последовательностью при молярном соотношении 1:1. Способ-вариант предусматривает проведение диагностики методом иммуноферментного анализа (ИФА). Получают образцы мочи и крови пациента, выделяют смесь белковых компонентов мочи и крови, проводят ИФА с моноклональными антителами, и/или поликлональными антителами, и/или их фрагментами против рекомбинантного белка TFDP1 и/или его уникальных фрагментов длиной свыше 8 аминокислот. Диагностируют рак мочевого пузыря при концентрации белка TFDP1 в исследуемых образцах, превышающей 5-кратную концентрацию белка TFDP1 в контроле. Способ (вариант) позволяет с достоверностью диагностировать рак мочевого пузыря, в том числе на ранней стадии прогрессии опухолевой трансформации.
Однако в предложенном решении диагностика рака мочевого пузыря проводится по содержанию в крови и моче матричных рибонуклеиновых кислот (мРНК) гена TFDP1 и/или белка TFDP1. Кроме того, для описанного решения характерны все ограничения, связанные с использованием ПЦР: (1) чувствительность напрямую зависит от эффективности амплификации ПЦР ДНК-фрагмента образца, резко снижающейся при наличии повреждений ДНК или ее фрагментации; (2) при необходимости определения нескольких молекул-мишеней мультиплексно и на фоне большого количества ДНК со схожей последовательностью, точность ПЦР становится неудовлетворительной для постановки диагноза при существенном снижении чувствительности анализа; (3) возрастающий предел обнаружения (ПО) мутаций приводит к повышению вероятности получения ложно-положительных результатов; (4) существенное фрагментирование ДНК будет зависеть от процедур пробоотбора и пробоподготовки; (5) для детектирования фрагментов длиной менее 50 нуклеотидов, выделение и специфическая гибридизация праймеров для амплификации практически невозможны; (6) идентификации последовательности ДНК ПЦР-методами препятствует образование неканонических структур ДНК-матрицей, например G(гуанин)-квадруплексов.
На данный момент спектроскопия гигантского комбинационного рассеяния (спектроскопия ГКР) является возможным эффективным аналитическим инструментом и обладает большим потенциалом в области исследования биомолекул, в частности нуклеиновых кислот. Основные преимущества метода спектроскопии ГКР применительно к анализу биомолекул, по сравнению с уже существующими методами, состоят в (1) высокой чувствительность метода, вплоть до детектирования единичных молекул; (2) сигналы ГКР содержат информацию о молекулярных отпечатках пальцев всех компонентов анализируемой биологической системы; (3) спектроскопия ГКР устойчива к фотодеградации и тушению по сравнению с флуоресцентными методами и подходит для длительного мониторинга; (4) ширина пиков в 10-100 раз меньше по сравнению с пиками спектров флуоресценции органических меток и квантовых точек, что обеспечивает возможность мультиплексного анализа при одной длине волны возбуждения; (5) ГКР-активные наносубстраты могут быть подобраны и сконструированы с различным покрытием, различной формы и размера в зависимости от аналитических целей. Во многих работах показана принципиальная возможность использования прямой ГКР-спектроскопии для обнаружения однонуклеотидных замен [Xu L.J., Lei Z.C., Li J., Zong C., Yang C. J., Ren, B. Label-Free Surface-Enhanced Raman Spectroscopy Detection of DNA with Single-Base Sensitivity // Journal of the American Chemical Society. 2015. V. 137. P. 5149-5154]. Однако ГКР-спектры ДНК без использования молекул репортеров были получены преимущественно с использованием синтетических олигонуклеотидов. Расшифровка спектров ГКР, полученных в результате анализа клинических образцов, все еще сопряжена с рядом трудностей, так как сигналы, соответствующие большому количеству нецелевого генетического материала, могут преобладать над слабыми сигналами молекул мишеней, содержащихся в низких концентрациях в исследуемом образце. Другой подход к детектированию анализируемого вещества - непрямая спектроскопия ГКР - заключается в использовании ГКР-активных молекул-репортеров и регистрации изменения сигнала, которое происходит в результате взаимодействия ГКР-активной молекулы с анализируемым веществом. Данный способ позволяет преодолеть трудности, которые часто возникают при регистрации собственных колебательных спектров нуклеиновых кислот, а именно сложность интерпретации результатов в присутствии большого количества нецелевых молекул или генетического материала, если говорить об анализе клинических образцов. С другой стороны, утрачивается информация о структурных перестройках и химических особенностях анализируемых молекул, которая содержится в собственных характеристических спектрах ГКР.
Наиболее близким к заявляемому является способ измерения связанных с раком веществ, включая свободную ДНК, происходящую от раковых клеток, посредством спектроскопии КР (RU2723160, 09.06.2020). Предложенный способ определения ДНК в биологический жидкостях заключается в подготовке наночастиц благородных металлов, выступающих в роли ГКР-усилителя; гибридизации мишени с направленно выбранным ковалентно ГКР-меченным комплементарным олигонуклеотидом; нанесении пробы с исследуемым соединением на поверхность наночастиц жидкой пробы с исследуемым соединением с образованием направленно упорядоченной за счет нековалентных взаимодействий структуры, включающей определяемую ДНК, ГКР-метку и олигонуклеотид; детектировании полученного гибридизированного ГКР-меченного дуплекса методом спектроскопии гигантского комбинационного рассеяния, и о качественном и количественном содержании ДНК судят по положению и интенсивности полос на регистрируемых спектрах. Способ применим для определения малых количеств ДНК на фоне большого количества посторонних мешающих компонентов анализируемых реальных биологических жидкостей: крови, мочи, церебральной жидкости и др. Данный результат достигается за счет дополнительного селективного связывания фрагментов ДНК с направленно выбранными ковалентно ГКР-меченными олигонуклеотидами на поверхности наночастиц. Кроме того, за счет направленного структурирования и упорядочивания, а также контроля расстояния от ГКР-метки до поверхности наночастиц регистрируется воспроизводимый на всей сенсорной поверхности усиленный сигнал ГКР. Усиление сигнала комбинационного рассеяния в 103 - 1014 раз достигается за счет дополнительного оборачивания гибридизованного дуплекса ДНК вокруг металлических наночастиц, выступающих в качестве ГКР-усилителя, благодаря нековалентным взаимодействиям. Предлагаемый способ позволяет надежно количественно определять необходимые ДНК на уровне 10-14 М.
Однако в известном способе предложено определение мутантной последовательности ДНК, не позволяющей диагностировать рак мочевого пузыря. Для достоверного детектирования и определения мутаций C228T и C250T на уровне ультранизких концентраций, что позволит диагностирование заболевания на ранних стадиях (до ок. 6,000 поврежденных фрагментов в анализируемом образце), необходимо использование определенного рабочего расстояния от ГКР-метки до металлической наноструктуры. В отсутствии мутантной последовательности ДНК свободный зонд образует шпильку. В случае присутствия мутантного фрагмента ДНК определяемая последовательность взаимодействует с комплементарной последовательностью зонда, шпилька раскрывается, вследствие чего наблюдается резкий рост интенсивности сигнала ГКР по сравнению с ситуацией, когда метка находилась в составе шпильки. При этом использование комплементарной последовательностью зонда с любой длиной из диапазона 1-5 нм не приводит к возможности высокочувствительного определения мутаций C228T и C250T на уровне ультранизких концентраций. Более того, в изобретении описан способ анализа и его принцип без оптимизированной ГКР-платформы, позволяющего достоверно определять биомаркеры - мутантные последовательности ДНК C228T и C250T.
Технической проблемой является отсутствие наборов и простых способов диагностики рака мочевого пузыря на ранних стадиях развития опухоли.
Раскрытие изобретения
Техническим результатом заявляемой группы изобретений является разработка набора, позволяющего с высокой точностью проводить диагностику рака мочевого пузыря на ранних стадиях развития опухоли.
Заявляемая группа изобретений позволяет проводить идентификацию двух мутантных последовательностей ДНК C228T и C250T и их селективное определение в биологической пробе для выявления у пациентов рака мочевого пузыря (1) на ранних стадиях: начиная с I стадии (при начальных стадиях опухолевого процесса: стадия Т1 или более поверхностные опухоли), когда опухоль является неинвазивной; (2) с высокими чувствительностью (низким пределом обнаружения от концентрации 1⋅10-14 М, что составляет ок. 6,000 поврежденных фрагментов ДНК); (3) селективностью по отношению к иным фрагментам ДНК; и (4) экспрессностью (время пробоподготовки нескольких образцов одновременно - до 60 мин и самого анализа - 10 с).
Диагностика рака мочевого пузыря осуществляется за счет селективного узнавания и определения мутаций C228T и C250T в последовательности ДНК, что включает в себя использование набора из планарного наноструктурированного ГКР-сенсора и водных растворов, меченных красителем с пределом обнаружения не более 1 мкМ, например родамином 6Ж, олигонуклетидов: GnuS-C228T-R6G и GnuS-C250T-R6G (где Gnus - последовательность, состоящая из 15 - 20 аминокислот, из которых не менее 20% составляют цитозин (C) и гуанин (G), например последовательности SEQ ID №1 - №4). В качестве красителя с пределом обнаружения не более 1 мкМ используют родаминовые, цианиновые, ксантеновые и диазо-красители, метиленовый синий и кристаллический фиолетовый.
Способ заключается в заборе мочи пациента, последующем отборе 20 мкл жидкой пробы для гибридизации предположительно содержащихся там мутантных последовательностей ДНК C228T и C250T с комплементарными им олигонуклеотидами GnuS-C228T-метка или GnuS-C250T-метка, ковалентно модифицированным коммерчески доступной ГКР-меткой - например, родамином 6Ж (R6G). Далее 10 мкл полученной смеси наносят на планарную сенсорную поверхность. Иммобилизация зонда в настоящем изобретении основывается на специфическом электростатическом взаимодействии между якорной олигонуклеотидной последовательностью Gnus, входящей в состав зондов GnuS-C228T-метка и GnuS-C250T-метка и металлическими наночастицами. Благодаря высокой энергии связывания серебряных кластеров с цитозином (C) и гуанином (G), входящих в состав якорной последовательности, которая в несколько раз превышает энергию образования Уотсон-Криковских пар, серебряные частицы оказываются внутри якорной последовательности. Такое взаимодействие, в отличие от ковалентных сшивок, обеспечивает дополнительную структуризацию поверхности, что обеспечивает образование «горячих точек» (англ. “hot spots”) и усиление сигнала. Усиление сигнала комбинационного рассеяния в 102 - 108 раз достигается за счет создания дополнительных «горячих точек» на поверхности благодаря тому, что серебряные частицы оказываются внутри якорной последовательности. В составе индикаторной системы для детектирования мутаций C228Т и C250Т в промоторе гена hTERT использовали конструкцию, состоящую из дезоксиолигонуклеотида, обеспечивающего иммобилизацию зонда на последовательности наночастиц серебра (Gnus), с которым связана последовательность с ГКР-меткой (R6G), комплементарная последовательности аналита (Фиг. 11). Предложенный подход позволяет использовать метод спектроскопии ГКР с высокими коэффициентами чувствительности (до 105 -106 у.е.), низкими пределами обнаружения (ПО до 3 фМ), высоким соотношением сигнал/шум (отсутствие влияние матрицы реальных образцов на полезные сигналы), высокой селективностью (по отношению к неповрежденным фрагментам ДНК или мутациям иного происхождения), широким диапазоном определяемых концентраций (ДОК от 1⋅10-14 до 1·10-7 М), высокими воспроизводимостью и прецизионностью (коэффициенты корреляции градуировочных зависимостей составляет не менее 0.97, относительное стандартное отклонение при нижней определяемой концентрации не более 0.10) для качественного и количественного определения мутаций C228Т и C250Т в целях диагностики онкологических заболеваний. За счет направленного структурирования и упорядочивания, а также контроля расстояния от ГКР-метки до поверхности наночастиц регистрируется воспроизводимый на всей сенсорной поверхности усиленный сигнал ГКР. Предлагаемый способ определения ДНК демонстрирует отсутствие сигналов на спектрах гигантского комбинационного рассеяния для нормальных последовательностей ДНК и мутаций иного типа, что позволяет надежно селективно количественно определять характерные для рака мочевого пузыря мутации C228Т и C250Т с ПО до 10-15 М.
Технический результат достигается заявляемым набором, состоящим из (1) твердофазного планарного сенсора: диэлектрического химически инертного материала и наноструктурированного покрытия на основе наночастиц благородных металлов толщиной 0.1-10 мкм, и (2) 1 мкМ водных растворов, меченных красителем с пределом обнаружения не более 1 мкМ олигонуклеотидов: GnuS-C228T-метка и GnuS-C250T-метка (где Gnus - последовательность, состоящая из 15 - 20 аминокислот, из которых не менее 20% составляют цитозин (C) и гуанин (G), например последовательности SEQ ID №1 - №4) для детектирования и определения характерных для рака мочевого пузыря мутаций ДНК C228T и C250T в биологических пробах. Технический результат достигается способом детектирования и определения мутаций ДНК C228T и C250T, заключающимся в (1) нанесении на планарную сенсорную поверхность предварительно подготовленной жидкой пробы, полученной при гибридизации раствора анализируемой биологической жидкости пациента с комплементарным олигонуклеотидом GnuS-C228T-метка или GnuS-C250T-метка, ковалентно модифицированным коммерчески доступной ГКР-меткой; (2) облучении монохроматическим пучком лазера с длиной волны 485 - 785 нм и регистрации сигнала комбинационного рассеяния, при этом о качественном и количественном содержании мутаций ДНК C228T и C250T в изучаемом образце судят по положению и интенсивности полос на регистрируемых спектрах, характерных для метки-красителя.
При этом в качестве наночастиц благородных металлов используют серебро, золото, платину.
При этом наночастицы имеют размеры 20-90 нм и характеризуются полосой плазмонного резонанса 420-650 нм.
При этом в качестве материала-носителя для наночастиц используют силикатное стекло.
При этом используют 10-500 мкмоль благородного металла в расчете на 1 мм2 поверхности носителя с последующей сушкой.
При этом для нанесения пробы и однократного анализа используют поверхность площадью 4×4 мм2.
При этом количество ГКР-меченного олигонуклеотида используют в мольном соотношении от 1:1 к мутациям ДНК C228T и C250T.
При этом гибридизацию проводят путем нагрева и выдерживания в течение 5-10 мин при температуре 95°С, с последующим охлаждением до комнатной температуры.
При этом подготовленные жидкие пробы наносят путем накапывания на поверхность наночастиц.
При этом используют жидкие пробы объемом 10 мкл с концентрацией мутаций ДНК C228T и C250T 10-15 - 10-2 М.
При этом при проведении анализа используют монохроматическое лазерное излучение с длиной волны 514 нм и мощностью, не превышающей 25% от номинальной величины излучения, в течение до 10 - 60 с.
При этом о качественном и количественном содержании мутаций ДНК C228T и C250T в образце судят по положению и интенсивности полос при 1385, 1470 и 1590 см-1 с допустимой величиной погрешности не более 10 см-1.
При использовании родамина 6Ж в качестве метки-красителя о наличии и содержании мутаций ДНК C228T и C250T в образце судят по положению и интенсивности полос при 1385, 1470 и 1590 см-1 с допустимой величиной погрешности не более 10 см-1.
Для определения количественного содержания мутаций предварительно строят калибровочные кривые.
Представленный способ пригоден для работы с портативным, коммерчески доступным, серийным оборудованием вне лабораторных условий. Таким образом, с использованием заявляемого оптического планарного сенсора возможно высокочувствительное и селективное качественное и количественное определение присутствующих в образце мутаций ДНК C228T и C250T «у постели больного».
Таким образом, использование предлагаемого способа анализа позволяет узнавать о присутствии мутаций C228T и C250T и судить об их количественном содержании с высокой селективностью, широким диапазоном определяемых концентраций, высокой воспроизводимостью и прецизионностью.
Краткое описание чертежей
Изобретение поясняется чертежами.
На фиг. 1 представлены фрагменты клонируемых вставок. Подчеркнутые буквы - нуклеотиды, соответствующие дикому типу.
На фиг. 2 представлены А) подбор условий ПЦР-амплификации промотора гена hTERT с геномной ДНК человека (целевой продукт выделен рамкой); Б) продукты ПЦР-амплификации вставки с геномов клеточных линий HepG2 и A375.
На фиг. 3 представлена карта используемого вектора pUC19 с отмеченными сайтами клонирования HindIII и KpnI.
На фиг. 4 представлены хроматограммы, полученные с помощью секвенирования по Сэнгеру, для фрагментов вставок. Мутантные нуклеотиды выделены рамкой - 4б; нуклеотиды, соответствующие дикому типу, выделены рамкой - 4а.
На фиг. 5 представлена схема детектирования однонуклеотидных замен с помощью флуоресцентных TaqMan зондов. Зонды с меткой FAM комплементарны последовательностям мутантного типа, зонды с меткой R6G комплементарны последовательностям дикого типа.
На фиг. 6 представлены химические структуры используемых флуоресцентных меток и длины волн, соответствующие максимуму испускания флуоресценции.
На фиг. 7 представлена схема структуры фрагмента промоторной области гена hTERT, содержащей сайты -124 и -146 от ATG (отмечены кружками), в которых возможно возникновение мутаций C228T и С250Т [Zvereva M., Pisarev E., Hosen I., Kisil O., Matskeplishvili S., Kubareva E., Kamalov D., Tivtikyan A., Manel A., Vian E., Kamalov A., Ecke T., Calvez-Kelm F.L. Activating telomerase TERT promoter mutations and their application for the detection of bladder cancer. Int. J. Mol. Sci. 2020, 21(17), 6034]. Синим цветом обозначена G-цепь, красным С-цепь. Подчеркнуты участки, соответствующие праймерам, с помощью которых данный фрагмент был амплифицирован. Структура была получена с использованием программы “QGRS Mapper” при следующих параметрах: максимальная длина G - квадруплекса составила 30 нуклеотидов, минимальный размер нуклеотидной группы - 2 нуклеотида, размер петли - от 0 до 36 нуклеотидов.
На фиг. 8 представлены а) результат цкПЦР, приведенный в виде двумерного картирования сигнала по двум независимым каналам. Соотношение плазмид мутантного типа к плазмидам дикого типа в данном эксперименте pUC19_235_C228Т : pUC19_235_wt = 1:4; б) результат цкПЦР для системы со 100% содержанием плазмиды pUC19_235_wt. Выше пороговой линии капли, соответствующие мутантной плазмиде pUC19_235_C228Т, отсутствуют.
На фиг. 9 представлены уровни аналитической чувствительности метода на примере обнаружения мутантной плазмиды pUC19_235_C228Т на фоне большого содержания плазмиды дикого типа pUC19_235_wt. По оси абсцисс соотношение количества плазмид мутантного типа к плазмидам дикого типа. Концентрация плазмиды дикого типа во всех случаях составляет ~5000 копий в реакционной смеси. Раститровка по концентрациям плазмиды, содержащей мутацию С228Т, с исходной концентрацией ~2500 копий в реакционной смеси с шагом в 2 раза. Чувствительность обнаружения составила 2.03%.
На фиг. 10 представлены оптические микрофотографии поверхности наночастиц серебра при различных увеличениях объектива.
На фиг. 11 представлены а) схематичное изображение системы для детектирования фрагментов последовательности промотора гена hTERT, состоящей из иммобилизованного на поверхности наночастиц зонда с меткой R6G за счет якорной последовательности Gnus; б) сиквенсы последовательностей Gnus, GnuS-C250Т-R6G - зонда для детекции последовательности с мутацией С250Т и GnuS-C228Т-R6G - зонда для детекции последовательности с мутацией С228Т. Синим выделена последовательность, обеспечивающая иммобилизацию. Зеленым выделены участки, образующие дуплекс с аналитами.
На фиг. 12 представлены спектры ГКР, полученные с использованием λex = 514 нм для зонда GnuS-C228T-R6G, нанесенного в объеме 10 мкл и в концентрациях 10-8 - 10-14 М на планарную поверхность наночастиц серебра. Номера на подписи соответствуют отрицательному десятичному логарифму концентрации образца: 8 - 10-8 М, 10 - 10-10 М, 12 - 10-12 М, 14 - 10-14 М. Рамками выделены положения характеристических пиков.
На фиг. 13 представлены спектры ГКР, полученные с использованием λex = 514 нм для системы GnuS-C228T-R6G с A228, нанесенной в объеме 10 мкл и в концентрациях 10-8 - 10-14 М на планарную поверхность наночастиц серебра. Номера на подписи соответствуют отрицательному десятичному логарифму концентрации образца: 8 - 10-8 М, 10 - 10-10 М, 12 - 10-12 М, 14 - 10-14 М. Рамками выделены положения характеристических пиков.
На фиг. 14 представлены спектры ГКР, полученные с использованием λex = 514 нм для зонда GnuS-C250T-R6G, нанесенного в объеме 10 мкл и в концентрациях 10-8 - 10-14 М на планарную поверхность наночастиц серебра. Номера на подписи соответствуют отрицательному десятичному логарифму концентрации образца: 8 - 10-8 М, 9 - 10-9 М, 10 - 10-10 М, 11 - 10-11 М, 12 - 10-12 М, 13 - 10-13 М, 14 - 10-14 М. Голубыми рамками выделены положения характеристических пиков.
На фиг. 15 представлены спектры ГКР, полученные с использованием λex = 514 нм для системы GnuS-C250T-R6G с A250, нанесенной в объеме 10 мкл и в концентрациях 10-8 - 10-14 М на планарную поверхность наночастиц серебра. Номера на подписи соответствуют отрицательному десятичному логарифму концентрации образца: 8 - 10-8 М, 9 - 10-9 М, 10 - 10-10 М, 11 - 10-11 М, 12 - 10-12 М, 13 - 10-13 М, 14 - 10-14 М. Голубыми рамками выделены положения характеристических пиков.
На фиг. 16 представлены а) вторичные структуры, образованные последовательностью зонда GnuS-C228Т-R6G. Метка R6G находится на 3' - конце цепи; б) место наиболее вероятного образования G-квадруплекса.
Осуществление изобретения
В настоящем изобретении приняты следующие обозначения и термины:
ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография,
ГКР - гигантское комбинационное рассеяние,
Спектр ГКР - спектр комбинационного рассеяния с сигналами, усиленными за счет эффекта поверхностного плазмонного резонанса на наноструктурах благородных металлов,
ДМАА - диметиламиламин,
ДМСО - диметилсульфоксид,
ДМФА - диметилформамид,
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота,
ДОК - диапазон определяемых концентраций,
ИФА - иммуноферментный анализ,
кДНК - комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислота,
мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота,
НЧС - наночастицы серебра,
ОФ-ВЭЖХ - обращено-фазовая ВЭЖХ,
ПО - предел обнаружения,
Промотор - участок олигонуклеотидной последовательности, узнаваемый РНК-полимеразой как стартовая площадка для начала транскрипции,
ПЦР - полимеразная цепная реакция,
РНК - рибонуклеиновая кислота,
СНП - секвенирование нового поколения,
Спектр ГКР - спектр комбинационного рассеяния с сигналами, усиленными за счет эффекта поверхностного плазмонного резонанса на наноструктурах благородных металлов,
сцДНК - свободно циркулирующая ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота,
Трис-HCl - раствор трисаминометана с соляной кислотой,
цкПЦР - цифровая капельная полимеразная цепная реакция,
цоДНК - циркулирующая опухолевая дезоксирибонуклеиновая кислота,
ЭДТА - этилендиаминтетрацетат натрия,
A - аденин,
ACTB - англ. actin, cytoplasmic a - высококонсервативный белок, который полимеризуется с образованием нитей, которые образуют сшитые сети в цитоплазме клеток,
BRAF - Серин/треониновая протеинкиназа B-raf; англ. Serine/threonine-protein kinase B-raf; КФ:2.7.11.25,
C - цитозин,
ESI-MS - масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением,
FAM - флуоресцеин (3’,6’-дигидрокси-3H-спиро[2-бензофуран-1,9’-ксантен]-3-он),
G - гуанин,
hTERT - теломераза обратной транскриптазы,
KRAS - протоонкоген, представитель семейства белков Ras (это семейство генов, а также белки, которые они кодируют - малые G-белки),
PAGE - денатурирующий полиакриловый гель,
R6G - родамин 6Ж (этил-2-[3-(этиламино)-6-этилимино-2,7-диметилксантен-9-ил]бензоат гидрохлорид),
SERS - англ. surface enhanced Raman spectroscopy,
T - тимин,
TAMRA - раствор трет-бутиламин/вода, 1:3 об./об.,
TBTA - трис(бензилтриазолил)амин,
TFDP1 - англ. Transcription Factor Dp-1 - ген, кодирующим белок. Заболевания, связанные с TFDP1, включают колоректальный рак и гепатоцеллюлярную карциному.
Химические символы / сокращения имеют свои обычные значения: °С (градус (градусы) Цельсия), нм (нанометр (нанометры)), мкм (микрометр (микрометры)), см (сантиметр (сантиметр)), мин (минута (минуты)), с (секунда (секунды)), мкл (микролитр (микролитры)), мкг (микрограмм (микрограммы)), М (моль (моли) в литре), л (литр (литры)), мл (миллилитр (миллилитры)), мкл (микролитр (микролитры)), г (грамм (граммы)), мг (миллиграмм (миллиграммы)), моль (моли), ммоль (миллимоль (миллимоли)), масс. % (массовый процент (массовые проценты)), м.м. (молекулярная масса).
Представленные ниже примеры конкретного осуществления изобретения приведены для предоставления специалистам в данной области техники полного описания проведения и применения анализа по изобретению, но не ограничивают предполагаемый авторами изобретения объем изобретения.
Все приведенные ниже реагенты являются коммерчески доступными. Все процедуры, если не оговорено особо, осуществляли при комнатной температуре или температуре окружающей среды, то есть в диапазоне от 18 до 25°C. В ходе всех экспериментов для приготовления водных растворов и промывки суспензий использовали деионизированную воду высокой чистоты с удельным сопротивлением не менее 18.2 МОм⋅см, очищенную с использованием установки «Milli-Q», «Millipore». Спектры ГКР зарегистрированы при помощи микроскопа «InVia Reflex» («Renishaw», Великобритания) в конфокальном режиме с использованием Ar+ лазера (длина волны - 514.5 нм, 20 мВт). Пропускание широкополосного фильтра нейтральной плотности составляло 10% для спектров ГКР. Время накопления сигнала - 10 с. Юстировку прибора проводили с использованием монокристаллических пластин кремния в качестве стандарта. Фокусное расстояние используемого объектива 250 мм, максимальный размер пятна лазера на объекте - ок. 300 мкм. Все спектры были сняты с использованием 50×-го объектива «Leica».
Заявляемый тест-набор состоит из двух ключевых компонентов: планарного наноструктурированного ГКР-сенсора и растворов меченных красителем с пределом обнаружения не более 1 мкМ, например родамином 6Ж, олигонуклетидов: GnuS-C228T-метка и GnuS-C250T-метка (где Gnus - последовательность, состоящая из 15 - 20 аминокислот, из которых не менее 20% составляют цитозин (C) и гуанин (G), например последовательности SEQ ID №1 - №4). Использование предложенного набора заключается в нанесении на планарную сенсорную поверхность предварительно подготовленной жидкой пробы, полученной при гибридизации раствора анализируемой биологической жидкости пациента с комплементарным олигонуклеотидом GnuS-C228T-метка или GnuS-C250T-метка, ковалентно модифицированным коммерчески доступной ГКР-меткой; при этом о качественном и количественном содержании мутаций ДНК C228T и C250T в изучаемом образце судят по положению и интенсивности полос на регистрируемых спектрах ГКР.
Пример 1. Способ селективного детектирования мутаций C228T и C250T методом спектроскопии ГКР
Синтез наноструктурированной поверхности серебра. В качестве ГКР-усилителя использовали планарный оптический ГКР-сенсор, представляющий собой нанесенные на поверхность тонкой стеклянной пластинки наночастицы серебра толщиной 0.4 - 1.5 мкм. Получение наноструктурированной поверхности серебра осуществлялось пиролизом аэрозоля аммиачного комплекса. К 100 мл свежеприготовленного 0.17 М водного раствора нитрата серебра (2.93 г) по каплям со стеклянной палочки при постоянном перемешивании добавляли ~30 мл 0.1 М водного раствора гидроксида натрия до полного выпадения черно-коричневого осадка оксида серебра (I). Затем осадок Ag2O тщательно промывали деионизованной водой (трижды порциями по 100 мл воды), далее добавляли 100 мл воды и по каплям 7 мл концентрированного водного раствора аммиака при постоянном перемешивании для образования водного раствора аммиачного комплекса серебра. После полного растворения осадка дополнительно добавляли 25 мл концентрированного водного раствора аммиака для предотвращения выпадения оксида серебра (I) в процессе аэрозольного распыления аммиачного комплекса. Бóльшие количества аммиака существенно ухудшали микроструктуру образующихся в процессе пиролиза серебряных колец. Раствор разбавляли до 170 мл водой. Полученный прозрачный 0.1 М раствор комплекса серебра фильтровали через мембранный фильтр, затем разбавляли в 8 раз водой до концентрации [Ag(NH3)2]OH 12.5 мМ. В контейнер установки ультразвукового аэрозольного ингалятора переносили 50 мл конечного раствора. Два покровных стекла предварительно отмывали травильным раствором пиранья (H2SO4: H2O2 = 3 : 1) и нагревали на дне химического стакана до 290 - 320°С. На небулайзер устанавливали патрубок-переходник с диаметром ~1 см. Использовали параметры распыления: 7 на «УЗ» и 1 на «Воздух». Таким образом, серебро наносили на поверхность покровного стекла ультразвуковым серебряным дождем аммиачного комплекса серебра (I). Аэрозольные капли диаметром 1-5 мм служили микрореакторами и обеспечивали формирование кольцевых кластеров наночастиц серебра диаметром 90±5 нм (Фиг. 10). Морфология получаемых сенсорных наноструктурированных поверхностей контролировалась методом сканирующей электронной микроскопии с полевой эмиссией. Важное свойство предложенных серебряных сенсоров заключалось в реализации широкой полосы возбуждения плазмонного резонанса, которая покрывала весь видимый диапазон длин волн, начиная с 420 нм. Это позволило получить резонансно усиленный сигнал ГКР от широкого набора меток, включая родамин 6Ж (R6G), флуоресцеин (FAM) и цианин (Cy3, Cy5 и др.) (Фиг. 6). Для получения резонансно-усиленного сигнала ГКР необходимо, чтобы область частот возбуждения плазмонного резонанса перекрывалась с полосой поглощения ГКР-метки. Поскольку коммерчески доступные аргоновый и гелий-неоновый лазеры излучают в области видимого света с наиболее сильной интенсивностью при длинах волн 514.5 и 633 нм соответственно, в качестве наиболее подходящей ГКР-активной молекулы-репортера выбрали родамин 6G (λmax ≈ 524 нм).
В качестве планарного сенсорного элемента для усиления сигнала комбинационного рассеяния может быть использована любая шероховатая металлическая поверхность, характеризующаяся шероховатостью не менее 2 нм и обладающая эффектом поверхностного плазмонного резонанса, что было подтверждено на примере серебра и золота.
Наиболее перспективная стратегия создания систем детектирования последовательностей нуклеиновых кислот с помощью спектроскопии ГКР заключается в использовании разработанной аналитической системы, в которой регистрация целевой ДНК происходит за счет комплементарных взаимодействий мишени с ГКР-меченым зондом, иммобилизованном на поверхности наночастиц металла.
Синтез меченых последовательностей олигонуклеотидов. Для получения меченых последовательностей олигонуклеотидов использовали автоматизированную методику синтеза, ранее описанную и приведенную в работах авторов «Способ обнаружения и определения ДНК с заданной последовательностью методом спектроскопии гигантского комбинационного рассеяния» Патент РФ № 2723160 от 09.06.2020 г.; V. M. Farzan, E. A. Ulashchik, Y. V. Martynenko-Makaev, M. V. Kvach, I. O. Aparin, V. A. Brylev, T. A. Prikazchikova, S. Y. Maklakova, A. G. Majouga, A. V. Ustinov, G. A. Shipulin, V. V. Shmanai, V. A. Korshun and T. S. Zatsepin. Automated solid-phase click synthesis of oligonucleotide conjugates: From small molecules to diverse n‐acetylgalactosamine clusters. Bioconjug. Chem. 2017. V. 28. P. 2599-2607]. 5’-Алкин-модифицированные олигонуклеотиды получали в синтезаторах олигонуклеотидов ASM-2000 («Biosset») или MM-12 («Bioautomation») с использованием амидофосфитного метода. Защищенные 2’-дезоксирибонуклеозид-3'-фосфорамидиты, Unylinker-CPG (500 Å) и S-этилтио-1H-тетразол были приобретены у «ChemGenes». Раствор азида 6-R6G (100 мМ) и медного катализатора CuI⋅P(OEt)3 (100 мМ) в апротонном биполярном растворителе (диметилсулфоксиде (ДМСО), диметилфорамиде (ДМФА) или диметиламиламине (ДМАА), 100 мкл) добавляли к 5’-алкин-модифицированным олигонуклеотидам, связанным с твердой фазой в колонке (1 мкмоль) 5 раз каждые 30 мин. Через 3 ч твердый носитель тщательно промывали (10 × 150 мкл ДМСО, затем 3 × 150 мкл ацетонитрила) с последующим снятием защиты у цианоэтильных групп (2 × 10% диэтиламина в ацетонитриле (10 мин) и полное снятие защиты с использованием смеси TAMRA (трет-бутиламин/вода, 1:3 об./об.) при 55°С в течение ночи. Раствор выпаривали и аликвоту анализировали с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и масс-спектрометрии с электрораспылительной ионизацией (ESI-MS).
Полученные олигонуклеотиды дважды очищали денатурирующим полиакриловым гелем (PAGE), а затем методом обращенно-фазовой ВЭЖХ и (ОФ-ВЭЖХ). Гель-электрофорез денатурированных олигонуклеотидов проводили в 15% PAGE, содержащем 7 М мочевины в трис-боратном буфере (50 мМ Трис-HCl, 50 мМ борная кислота, 1 мМ этилендиаминтетрацетат натрия (ЭДТА), рН 8.3). Олигонуклеотиды извлекали из геля путем электроэлюции с помощью Elutrap (Whatman) в трис-боратном буфере (5 мМ Трис-HCl, 5 мМ борная кислота, 0.1 мМ ЭДТА, рН 8.3). Анализ методом ВЭЖХ и очистку олигонуклеотидов проводили с использованием хроматографической колонны 2.1×50 мм Jupiter С18 (5 мкм, «Phenomenex»), буфера А: 10 мМ диизопропиламин и 15 мМ 1,1,1,3,3,3-гексафторизопропанол и буфера Б: 10 мМ диизопропиламин, 15 мМ 1,1,1,3,3,3-гексафторизопропанол и 80% ацетонитрил. Соли промывали буфером А (4 цикла), а затем 100% буфера Б (2 цикла) при скорости потока 0.3 мл/мин и температуре 45°C. Структуру полученных олигонуклеотидов подтверждали методом ESI-MS с использованием системы Agilent 1260-Bruker Maxis Impact. Масс-спектрометрический анализ олигонуклеотидов проводился в отрицательном режиме (капиллярное напряжение 3500 В), и регистрируемые спектры пересчитывали методом максимальной энтропии.
Полученный 5’-алкин-модифицированных олигонуклеотид модифицировали малыми молекулами ГКР-индикаторов. Полученный олигонуклеотид готовили в твердой фазе и связывали с 5'-алкинфосфорамидитом. Клик-модификацию проводили на твердой фазе путем добавления 10 мМ раствора азида, 100 мМ CuI⋅P(OEt)3 4×100 мкл (азида 2 экв.) в течение 4 ч с последующим промыванием. В большинстве случаев олигонуклеотиды отщепляли от носителя и снимали защиту в синтезаторе, используя 1,2-этилендиамин/толуол, 1:1 об./об., в течение 2 ч при комнатной температуре с последующим промыванием (4×150 мкл ацетонитрила) и элюирование 50% ацетонитрилом в воде или снятие защиты с использованием раствора АМА (концентрированный водный аммиак и 40% водный метиламин, 1:1 об./об.) в течение 30 мин при 65°С. Для R6G-меченных олигонуклеотидов снятие защиты проводили с использованием раствора TAMRA при 55°C в течение ночи. Для FAM-меченных олигонуклеотидов использовали две схемы снятия защиты (концентрированный водный раствор аммиака при комнатной температуре в течение 2 и 18 ч). Для переключения фазы раствора 5'-алкин-модифицированный олигонуклеотид (2 нмоль) растворяли в 1 М ацетате триэтиламмония (30 мкл). Затем добавляли 20 мкл раствора медного катализатора в 60% ДМСО (15 мМ трис(бензилтриазолил)амин (TBTA) и 13 мМ сульфата меди (II)), а затем 4 мкл 10 мМ азида FAM в ДМСО и 140 мкл 80% ДМСО. Раствор дегазировали и дважды заполняли аргоном в вакуумном центрифужном концентраторе, а затем добавляли дегазированный раствор аскорбиновой кислоты (0.25 М, 6 мкл). Реакционную смесь оставляли на ночь при комнатной температуре, и олигонуклеотидный продукт осаждали 4% LiClO4 в ацетоне (1 мл). Очистку и анализ методом ВЭЖХ проводили, как описано выше.
Обычно для иммобилизации зонда на металлической поверхности используют ковалентные взаимодействия между модифицированным олигонуклеотидом и наночастицами металла. Иммобилизация зонда в настоящем изобретении основывалась на специфическом электростатическом взаимодействии между якорной олигонуклеотидной последовательностью Gnus, входящей в состав зонда и содержащей не менее 20% цитозиновых и гуаниновых нуклеотидов, и металлическими наночастицами. Благодаря высокой энергии связывания серебряных кластеров с цитозином (C) и гуанином (G), входящих в состав якорной последовательности, которая в несколько раз превышает энергию образования Уотсон-Криковских пар, серебряные частицы оказываются внутри якорной последовательности. Такое взаимодействие, в отличие от ковалентных сшивок, обеспечивает дополнительную структуризацию поверхности, что обеспечивает образование горячих точек и усиление сигнала [Bossert N., de Bruin D., 
et al. Fluorescence-tunable Ag-DNA biosensor with tailored cytotoxicity for live-cell applications // Sci. Rep. 2016. V. 6. P. 37897]. В приведенных примерах в качестве последовательности GnuS рассматривали 5’-TGCCTTTTGGGGACGGATA-3’. При этом при использовании иных последовательностей GnuS (5’-AATGATCTTAACCAAGTATA-3’, 5’-TCGGTTGGGGAGCCTAT-3’ и 5’-TGGCTAATCCCCTCGGATA-3’), т.е. при сохранении длины зонда от 15 до 20 нуклеиновых кислот и содержании цитозина и гуанина не менее 20% обеспечивались аналогичные чувствительность, селективность, экспрессность и достоверность анализа.
В качестве системы детектирования мутаций C228Т и C250Т в промоторе гена hTERT использовали конструкцию, состоящую из дезоксиолигонуклеотида, обеспечивающего иммобилизацию зонда на последовательности наночастиц серебра (Gnus), с которым связана последовательность с ГКР-меткой (R6G), комплементарная последовательности аналита (Фиг. 11). Аналитами являлись последовательности A-228 и A-250, содержащие фрагмент промотора гена hTERT, с однонуклеотидными заменами С228Т и С250Т соответственно.
Из стоковых водных растворов олигонуклеотидов GnuS-C228T-R6G, Gnus-С250Т-R6G, А-C250T и А-C228T с концентрациями 1 мM готовили рабочие водные растворы для каждого образца с концентрациями 10-8 - 10-14 М. В целях регистрации индивидуальных спектров ГКР для олигонуклеотидов GnuS-C228T-R6G и Gnus-С250Т-R6G рабочие растворы наносили на поверхность наночастиц серебра в объеме 10 мкл и регистрировали спектры ГКР после полного высыхания подложки при комнатной температуре. Для регистрации спектров систем GnuS-C228T-R6G + А-C228T и Gnus-С250Т-R6G + А-C250T (Таблица 1) предварительно смешивали компоненты до достижения итоговых концентраций растворов 10-8 - 10-14 М. После смешения выдерживали при T = 22°C ок. 10 мин, затем нагревали смесь при T = 95°C в течение 5 мин, после чего оставляли смесь охладиться до T = 22°C в течение ок. 60 мин. Затем полученный раствор наносили на поверхность наночастиц серебра в объеме 10 мкл и регистрировали спектры ГКР после полного высыхания подложки при комнатной температуре.
Полученные спектры ГКР для индивидуальных растворов зондов GnuS-C250Т-R6G и GnuS-C228Т-R6G, нанесенных в объеме 10 мкл с помощью дозатора на планарную поверхность наночастиц серебра при четырех различных концентрациях, а также спектры систем зонд + аналит: GnuS-C250Т-R6G + A250 и GnuS-C228Т-R6G + A228 продемонстрировали возможность селективного детектирования мутаций C250Т и C228Т (Фиг. 12 - 15). Перед нанесением системы зонд + аналит проводилось предварительное нагревание смеси при 94°С в течение 5 мин, а после - постепенное охлаждение до комнатной температуры.
В случае спектров ГКР, полученных отдельно для зондов GnuS-C250Т-R6G и GnuS-C228Т-R6G, характеристические пики либо отсутствуют, либо их интенсивность находится на уровне фона. В случае использования полных разработанных индикаторных систем GnuS-C250Т-R6G + A250 и GnuS-C228Т-R6G + A250 наблюдали интенсивные пики, характерные для ГКР-метки R6G при 1380, 1470 и 1590 см-1. Спектры ГКР для предложенных детектирующих систем GnuS-C250Т-R6G + A250 и GnuS-C228Т-R6G + A250 имели неизменное положение характеристических пиков: 1383, 1470 и 1590 см-1, вне зависимости от концентрации мутаций в анализируемом образце.
В отсутствии анализируемой молекулы свободный зонд образовывал шпильку (якорь GnuS не был вовлечен в образование шпильки), а метка находилась на близком расстоянии от поверхности. В зависимости от того, насколько близкое это расстояние и находится ли метка в горячей точке, сигнал мог как возникать, так и затухать [«Способ обнаружения и определения ДНК с заданной последовательностью методом спектроскопии гигантского комбинационного рассеяния» Патент РФ № 2723160 от 09.06.2020 г.]. При внесении аналита в систему он взаимодействовал с комплементарной последовательностью зонда, шпилька раскрывалась, вследствие чего и наблюдалось изменение интенсивности сигнала ГКР по сравнению с ситуацией, когда метка находилась в составе шпильки. Таким образом, при раскрытии шпильки ковалентная связь с меткой сохранялась, изменялась структура ДНК, что приводило к изменению взаиморасположения метки и поверхности. В отсутствии анализируемой молекулы зонд образовывал сложную вторничную структуру (шпильки, внутримолекулярные димеры, а также внутренние G-квадруплексы) (Фиг. 16). В образование этой вторичной структуры был вовлечен 5’-конец зонда, который отвечает за иммобилизацию на поверхности наночастицы. При попытке гибридизации определяемых поврежденных последовательностей ДНК с неподходящей по последовательности меченым олигонуклеотидом: GnuS-C250Т-R6G с A228 и GnuS-C228Т-R6G с A250 аналитический сигнал методом спектроскопии ГКР зарегистрировать не удалось. Этот факт дополнительно продемонстрировал, что без эффективной иммобилизации и образования структурированных агрегатов получить существенного усиления сигнала было невозможно, полное отсутствие или низкая интенсивность сигналов для прочих фрагментов ДНК свидетельствовала о достаточной для анализа селективности методики.
Исключительно в присутствии С228Т и С250Т мутантных фрагментов ДНК происходило взаимодействие зонда с аналитом с образованием дуплекса; и 5’-конец зонда, вовлеченный в образование вторичной структуры, высвобождался, и происходила эффективная иммобилизация системы {зонд + аналит} на поверхности наночастиц, что приводит к наблюдаемому увеличению интенсивности сигнала. Созданная система позволила детектировать мутации С228Т и С250Т в промоторе гена hTERT с помощью спектроскопии ГКР, выводы о количественном содержании определяемых фрагментов обеспечило аналит-зависимое усиление сигнала ГКР. В случае нанесения на поверхность зонда GnuS-C228Т-R6G в присутствии мутации С250 взаимодействия не происходило и аналитического сигнала на спектрах ГКР не наблюдали, как и в случае с GnuS-C250Т-R6G в присутствии мутации С228, что подтвердило кросс-селективность разработанной методики. Важно, что при использовании олигонуклеотидов, меченных ГКР-меткой, отличающейся от предложенной длины, достижение необходимой чувствительности определения мутантных фрагментов ДНК не было возможным, что было показано на олигонуклетидах с зондами RnuS и PnuS (Таблица 2). Согласно рассчитанным в соответствии с химическими структурами длинами, расстояние от наноструктурированной поверхности до ГКР-метки составил 4 нм для GnuS, 5 нм для RnuS и 3 нм для PnuS. Использование красителей-меток c последовательностью Gnus из ряда родаминовых, цианиновых, ксантеновых и диазо-красителей, метиленового синего и кристаллического фиолетового, обеспечивало достижение необходимого уровня чувствительности (Таблица 2). Пробоподготовка всех образцов (до количества, которое необходимо проанализировать), заключающаяся в гибридизации определяемого фрагмента ДНК с мечеными олигонуклеотидами, занимала около 60 мин. При этом никаких дополнительных манипуляций, кроме включения/выключения термостата, от лаборанта в этот момент не требуется, поэтому целесообразно проводить эту процедуру для нескольких проб одновременно. Общее время анализа занимало не более 1 мин с достаточным временем накопления спектра - 10 с.
Воспроизводимость аналитических сигналов составляла менее 5%. Полученный ПО для мутантных фрагментов ДНК - 10-14 М, что составляет ок. 6,000 поврежденных фрагментов в 1 мкл анализируемого образца. Достигнутый ПО позволяет диагностировать рак мочевого пузыря, начиная с I стадии (при начальных стадиях опухолевого процесса: стадия Т1 или более поверхностные опухоли), когда опухоль является неинвазивной. В случае использования метки-красителя R6G, вывод о качественном составе и количественном содержании осуществляли по наличию характеристических полос: 1383, 1470 и 1590 см-1, на спектрах ГКР и интенсивности полученных сигналов по градуировочным зависимостям соответственно.
Таблица 1. Определяемые последовательности нуклеиновых кислот, последовательности ГКР-меченных олигонуклеотидов и их краткие обозначения
Таблица 2. Метрологические характеристики (с количеством параллельных измерений n = 5 и доверительной вероятностью P = 0.95) определения мутантных последовательностей ДНК с ковалентно ГКР-меченными олигонуклеотидами комплементарных последовательностей различной длины (Параметры съемки спектров ГКР: длина волны возбуждения - 514 нм, мощность лазера - 10%, время экстинкции - 10 с)
| Уравнение градуировочной зависимости I = (a±Δa)lgc + (b±Δb)* |
ДОК, пМ | ПО, фМ | r | sr (при сн)** | |
| Определение мутантного фрагмента ДНК: А-С228Т c меткой R6G | |||||
| GnuS-pr-С228Т | I = (1.3 ± 0.2)×104lgc + (1.6 ± 0.1)×103 | 0.003 - 10 | 1 | 0.990 | 0.05 |
| RnuS-pr-С228Т | I = (2.9 ± 0.3)×101lgc + (7.6 ± 0.6) | 1 - 100 | 300 | 0.969 | 0.09 |
| PnuS-pr-С228Т | I = (4.0 ± 0.3)×101lgc + (4.4 ± 0.2) | 10 - 500 | 3000 | 0.981 | 0.15 |
| Определение мутантного фрагмента ДНК: А-С228Т c меткой Cy5 | |||||
| GnuS-pr-С228Т | I = (6.0 ± 0.5)×103lgc + (3.2 ± 0.2)×103 | 0.005 - 10 | 1.5 | 0.989 | 0.05 |
| Определение мутантного фрагмента ДНК: А-С250Т c меткой R6G | |||||
| GnuS-pr-C250T | I = (4.9 ± 0.6)×104lgc + (1.8 ± 0.3)×103 | 0.003 - 10 | 1 | 0.990 | 0.04 |
| RnuS-pr-C250T | I = (3.9 ± 0.4)×101lgc + (6.6 ± 0.3) | 1 - 1000 | 300 | 0.974 | 0.10 |
| PnuS-pr-C250T | I = (5.9 ± 0.3)×101lgc + (1.3 ± 0.1) | 20 - 100 | 600 | 0.980 | 0.13 |
| Определение мутантного фрагмента ДНК: А-С250Т c меткой кристаллический фиолетовый | |||||
| GnuS-pr-C250T | I = (5.2 ± 0.5)×104lgc + (2.4 ± 0.4)×103 | 0.003 - 10 | 1 | 0.988 | 0.05 |
* - вид зависимости интенсивности аналитического сигнала при характеристическом рамановском сдвиге от концентрации определяемой ДНК (моль/л);
** - стандартное относительное отклонение для измерений при минимальной концентрации (cн) из диапазона определяемых содержаний.
Пример 2. Валидация результатов определения мутаций C228T и C250T методом спектроскопии ГКР с помощью метода цкПЦР
Поскольку процедуры клинической диагностики заболеваний должны выполняться согласно определенным стандартам, необходимо проводить предварительную оценку диагностических методов: определять их аналитическую чувствительность и другие характеристики. Определение возможностей самого метода на клинических образцах или на клеточных линиях не дает в полной мере достоверных результатов, так как опухолевые образцы по своей природе неоднородны, а клеточные линии содержат не 100% мутантной аллельной фракции. Поэтому для внедрения цкПЦР или предложенной методики на основе ГКР-спектроскопии в клиническую практику необходимо создание единой стандартной аналитической системы для сравнения и валидации результатов, полученных различными лабораторными методами в различных лабораторных условиях.
В качестве доклинических испытаний, наиболее приближенным к клиническим, получили модельные референсные конструкции путем клонирования фрагментов генома человека и внесения определяемых мутаций: С228Т и С250Т.
Клонирование. Были получены четыре плазмиды, содержащие все необходимые вставки:
1. дикого типа (pUC19_235_wt),
2. с мутацией С228Т (pUC19_235_C228Т),
3. с мутацией С250Т(pUC19_235_С250Т),
4. одновременно с обеими мутациями С228Т и С250Т (pUC19_235_С228Т+С250Т).
Для получения вставок дикого типа в качестве матрицы для ПЦР использовали Human Genomic DNA 11691112001 Roche, а для вставок с мутацией С228T в положении -146 использовали ДНК клеточной линии HepG2 (содержание мутантной ДНК 70%), для вставок с мутацией С250Т в положении -126 использовали ДНК клеточной линии А375. (Фиг. 1). Клонируемые вставки представляли собой GC-богатые фрагменты (77% GC для фрагмента 235 п.о.), поэтому их амплификация была затруднена из-за сложной вторичной структуры (предположительно образование G-квадруплексов). Для амплификации фрагмента дикого типа с геномной ДНК человека в реакционную смесь добавляли 7-деаза-2’-дезоксигуанозин-5’-трифосфат (7-deaza-dGTP) до финальной концентрации 200 мкМ (Фиг. 2, А). Продукт ПЦР нужной длины очищали с помощью разделения методом гель-электрофореза и выделения из агарозного геля.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Для амплификации фрагментов дикого типа и фрагмента с мутацией С228Т составляли следующую ПЦР-смесь:
| 2x Maxima Hot Start PCR Master mix | 25 мкл |
| Матричная ДНК (геномная) | 1 мкг |
| TERT_235_fw_KpnI | 0.5 мкМ |
| TERT_235_rev_HindIII | 0.5 мкМ |
| 7-deaza-dGTP | 0.05 мкМ |
| H2О | до общего объема 50 мкл |
Тщательно перемешивали и помещали в прибор для проведения ПЦР T100 PCR Thermal Cycler фирмы Bio Rad. Параметры амплификации: 95°C в течение 4 мин - 1 цикл; 95°C - 30 с, 58°C - 20 c, 72°C - 30 c - 39 циклов; 72°C в тчение 5 мин - 1 цикл.
Амплификация фрагмента c генома клеточных линий HepG2 и A375 проходила с использованием Q5 ДНК-полимеразы (New England Biolabs). Состав реакционных смесей:
| 5x Q5 GC-буфер | 10 мкл |
| Смесь dNTP | по 0.2 мМ каждого |
| TERT_235_fw_KpnI | 0.5 мкМ |
| TERT_235_rev_HindIII | 0.5 мкМ |
| Матричная ДНК (А375 или HepG2) | 0.2 мкг |
| Q5 полимераза (2ед./мкл) | 0.5 мкл |
| 5x Q5 GC-энхансер | 10 мкл |
| H2О | до общего объема 50 мкл |
Параметры амплификации: 98°C в течение 30 с - 1 цикл; 98°C - 7 с, 68°C - 15 c, 72°C - 10 c - 35 циклов; 72°C в течение 2 мин - 1 цикл.
В случае использования в качестве матриц для амплификации клонируемого фрагмента ДНК клеточных линий HepG2 и A375 подход с добавлением 7-deaza-dGTP не был успешен и не удавалось получить количественно ПЦР-продукт даже в случае проведения двухэтапного ПЦР. Для решения этой задачи была использована Q5 полимераза, точность которой более чем в 100 раз выше, чем у с Taq полимеразы, в буфере для амплификации GC-богатой матрицы с добавлением энхансера. Обычно в состав GC-энхансеров входят такие соединения, как ДМСО и глицерин, которые способствуют нарушению сложной вторичной структуры и увеличивают эффективность амплификации (Фиг. 2, Б).
Полученные ПЦР-продукты обработали эндонуклеазами рестрикции HindIII и KpnI, и легировали по липким концам с плазмидой pUC19 (Фиг. 3), линеаризованной с помощью тех же эндонуклеаз рестрикции. Полученную лигазную смесь трансформировали в компетентные клетки JM109 E.coli и высевали на чашку Петри с 5-бром-4-хлор-3-индолил-бета-D-галактопиранозидом (X-gal) и изопропил-бета-галактопиранозидом (ИПТГ) для бело-голубой селекции. На следующий день высевали ночные культуры из белых колоний. Из ночных культур выделяли плазмиду и после проведения рестриктного анализа с помощью эндонуклеазы рестрикции PvuII, подтверждавшего наличие вставки, секвенировали вставку методом Сэнгера (Фиг. 4).
Разделение фрагментов ДНК в агарозном геле, выделение с геля. После проведения ПЦР проводили очистку полученных ПЦР-продуктов в 1.2% агарозном геле. Для приготовления агарозного геля добавляли 1.0 г легкоплавкой агарозы к 100 мл раствора 1xTBE. Визуализацию полос обеспечивали за счет добавления в агарозу 2.5 мкл флуоресцентного красителя SybrGreen I (10000x). Напряжение составляло ~100 - 150 В. Разделение фрагментов ДНК контролировали с помощью камеры с ультрафиолетовой лампой.
Выделение ДНК из агарозного геля проводили с помощью набора реагентов «Cleanup mini» компании «Евроген». Из геля вырезали нужную полосу, визуализированную SybrGreen I, и помещали ее в пробирку. К гелю добавляли 3-хкратный объем «Связывающего буфера» (из расчета, что 100 мкг геля имеет объем 100 мкл), инкубировали при 55°C до полного растворения геля. Полученный раствор переносили в колонку для связывания ДНК, колонку ставили в собирательную пробирку. Собирательную пробирку с колонкой центрифугировали при максимальных оборотах в настольной центрифуге в течение 30 с (все дальнейшие центрифугирования проводили при максимальных оборотах). Проскок выливали, добавляли в колонку 700 мкл промывочного раствора и центрифугировали 30 с. Проскок выливали и центрифугировали колонку в течение 1 мин. После этого помещали колонку в новую пробирку, добавляли 30 мкл элюирующего буфера и центрифугировали 30 с. Полученную ДНК хранили при температуре -20°C.
Приготовление векторов и вставок. Перед легированием вектор и вставки обрабатывались эндонуклеазами рестрикции FastDigest KpnI и FastDigest HindIII, «Thermo Scientific».
| 10x FastDigest buffer | 2 мкл |
| плазмидная ДНК/ПЦР-фрагмент | 1 мкг/200нг |
| рестриктаза KpnI | 1 мкл |
| рестриктаза HindIII | 1 мкл |
| H2О | до общего объема 20 мкл |
Смешивали все необходимые компоненты реакции и инкубировали в течение 1 ч при 37°C. После этого ферменты инактивировали нагреванием при 80°C в течение 10 мин. После этого рестриктную смесь с плазмидной ДНК наносили на агарозный гель и выделяли нужный фрагмент с геля, описанным выше способом.
Лигирование. Лигирование проводили с помощью T4 DNA ligase («Thermo Scientific»). К 10-икратному T4 DNA ligase buffer добавляли 50 - 100 нг линеаризованной плазмиды и вставку в молярном соотношении с плазмидой 5:1, T4 ДНК лигазу до концентрации 0.05 ед./мкл, нужное количество воды. Лигазную смесь оставляли на ночь при температуре +4°C.
Получение компетентных клеток E.coli и их трансформация. 250 мл среды LB инокулировали свежей колонией клеток и растили культуру при 18°C и умеренном перемешивании до A600 ~0.4. Клетки охлаждали во льду и собирали центрифугированием при 5000 об/мин 10 мин при 4°C в роторе JA-14 (Beckman). После этого клетки дважды промывали буфером TB. Для этого осадок клеток ресуспендировали в 30 мл охлажденного TB буфера, инкубировали при слабом перемешивании во льду в течение 10 мин и центрифугировали при 5000 об/мин 10 мин при 4°C. После последнего центрифугирования клетки снова ресуспендировали в буфере TB, добавляли ДМСО до 3.5% и затем - до конечной концентрации 7% с 10-иминутным интервалом при 0°C при слабом перемешивании. Аликвоты суспензии клеток по 100 мкл замораживали в жидком азоте и хранили при температуре -80°C.
Для трансформации суспензию компетентных клеток размораживали на льду, добавляли 20 - 50 нг плазмиды или 5 - 10 мкл лигазной смеси, выдерживали на льду 20 мин. Смесь помещали в термостат, нагретый до 42°C, выдерживали в течение 40 - 50 с, после этого добавляли 300 мкл среды LB и инкубировали в течение 1 ч при 37°C. Половину клеток высевали на чашку Петри с твердой средой LB, содержавшей ампициллин. Инкубировали при 37°C в течение 16 ч. Выбор колоний со вставкой проводили с помощью бело-голубой селекции.
Выделение плазмидной ДНК. Плазмиды из ночной культуры выделяли с помощью набора реагентов Plasmid Miniprep фирмы Евроген из E. coli. Для этого растили 2 - 5 мл ночной культуры с одной колонии, клетки осаждали в течение 2 мин при 8000g в настольной микроцентрифуге. Отбирали среду, клетки ресуспендировали в 250 мкл «Ресуспендирующего раствора», добавляли 250 мкл «Лизирующего раствора» и осторожно перемешивали, пока лизат не становился прозрачным. Добавляли 350 мкл «Нейтрализующего раствора», перемешивали, инкубировали в течение 1 мин. От дебриса избавлялись центрифугированием при максимальных оборотах 10 мин в настольной микроцентрифуге (дальнейшие центрифугирования выполняли при максимальных оборотах). Супернатант перемещали в колонку в собирательной пробирке и центрифугировали в течение 30 с. Удаляли фильтрат из собирательной пробирки. Делали две промывки по 300 мкл «Промывочного раствора» с центрифугированием колонки по 30 с. После последней промывки центрифугировали пустую колонку в течение 1 мин. После этого колонку переносили в новую пробирку, добавляли 50 мкл «Элюирующего раствора», инкубировали при комнатной температуре в течение 1 мин и центрифугировали в течение 1 мин. Полученные плазмиды хранили при температуре -20°C.
Рестриктный анализ. Для подтверждения наличия вставки проводился рестриктный анализ плазмид с использованием рестриктазы FastDigest PvuII, «Thermo Scientific». Для рестрикции брали 200 нг плазмиды, 2 мкл 10× буфера FastDigest Green и 5 ед. активности фермента на 20 мкл реакции. Инкубировали при 37°C в течение 1 ч. Продукты анализировали в 1.2 масс.% агарозном геле.
Сайт-направленный мутагенез. Для направленного мутагенеза проводили ПЦР-амплификацию полученной плазмиды pUC19_235_C228Т с использованием полимераз Pfu DNA Polymerase и DreamTaq DNA Polymerase, «Thermo Scientific».
В пробирке емкостью 0.2 мл составляли следующую ПЦР-смесь:
| 10X Pfu буфер с MgSO4 | 2.5 мкл |
| Смесь dNTP | по 0.2 мМ каждого |
| праймер 1 | 20 пмоль |
| праймер 2 | 20 пмоль |
| плазмидная ДНК | 50 нг |
| полимеразы Taq:Pfu (5:1) (2.5 ед/мкл) | 1 мкл |
| DMSO 100% | 1.25 мкл |
| H2О | до общего объема 25 мкл |
Параметры амплификации: 95°C в течение 30 с - 1 цикл; 95°C - 50 с, 65°C - 50 c, 68°C - 4мин - 18 циклов; 68°C в течение 7 мин - 1 цикл.
После ПЦР в реакционную смесь вносили 0.5 мкл DpnI (10 U/μl, Thermo Scientific) и инкубировали при 37°C в течение 16 ч. Инактивировали фермент при 80°C 20 мин. Далее трансформировали компетентные клетки E.coli 10 мкл реакционной смеси и высевали на чашку Петри. Белые колонии пересевали в жидкую среду, выделяли из клеток плазмиды и проверяли наличие вставки с помощью секвенирования методом Сэнгера.
Определение первичной структуры плазмидной ДНК. Нуклеотидные последовательности при создании и использовании генно-инженерных конструкций определяли с помощью автоматического секвенатора ABI prism 3100-Avant genetic Analyzer (4-х капиллярный).
ПЦР в реальном времени. ПЦР в реальном времени проводилось с использованием Maxima hot start PCR Master mix, «Thermo Scientific». 2xPCR Master mix добавляли праймеры до концентрации 0.9 мкМ, 5 - 50 нг матрицы, 7-deaza-dGTP, флуоресцентные зонды до концентрации 250 нМ и доводили до нужного объема. Температура отжига и параметры амплификации варьировались в зависимости от эксперимента, время элонгации рассчитывали при условии, что Taq полимераза синтезирует ДНК со скоростью 1000 нуклеотидов в минуту.
Цифровая капельная ПЦР. Для постановки цкПЦР готовили следующую реакционную смесь, объемом 22 мкл:
| 2x ddPCR Supermix (no dUTP) | 11 мкл |
| проба 1 | 250 нМ |
| проба 2 | 250 нМ |
| праймер 1 | 900 нМ |
| праймер 2 | 900 нМ |
| матричная ДНК (плазмиды) | переменное кол-во |
| 7-deaza-dGTP | 2 мкМ |
| Н2О | до общего объема 22 мкл |
ПЦР-амплификация для обнаружения мутаций С228Т и С250Т происходила отдельно, параметры амплификации: 95°C в течение 10 мин; 40 циклов 94°C - 30 с, скорость изменения температуры 2.5°C/сек., 54°C для C228T (64°C для C250T) в течение 30 с; 98°C - 10 мин, затем хранение при температуре 12°C после завершения амплификации. До регистрации флуоресцентного сигнала плашку с ПЦР-продуктом хранили не более недели при температуре +4°C.
Генерация капель осуществлялась с помощью автоматического генератора QX200, Biorad. Интенсивность флуоресценции в каждой капле измеряли с помощью QX200 Droplet reader, Biorad. Анализ результатов проводили на программном обеспечении QuantaSoftTM Analysis Pro 1.0.596 software, Biorad.
Согласно принципиальной схеме обнаружения мутаций (Фиг. 5) для детектирования каждой из мутаций использовали 2 пары флуоресцентных зондов: одна пара зондов с меткой родамин 6Ж (R6G) (Фиг. 6) к смысловой и матричной цепи дикого типа (TERT_250_wt_prb1, TERT_250_wt_prb2 для дикого типа в положении С250Т, TERT_228_wt_prb1, TERT_228_wt_prb2 для дикого типа в положении С228Т), вторая пара зондов с меткой флуоресцеин (FAM) к смысловой и матричной цепи мутантного типа (TERT_250_mut_prb1 и TERT_250_mut_prb2 на мутацию С250Т и TERT_228_mut_prb1 и TERT_228_mut_prb2 на мутацию С228Т). Вначале ПЦР температуру увеличивали для того, чтобы двойная спираль ДНК денатурировала. В этот момент сигнал от флуоресцентного красителя на 5’-конце зонда гасился нефлуоресцентным гасителем, расположенным на 3’-конце пробы. На следующем этапе температура снижалась, позволяя праймерам и зондам образовывать дуплексы с целевой последовательностью. Taq-полимераза синтезировала комплементарную ДНК на денатурировавшей цепи. Когда полимераза достигала зонда, она расщепляла зонд за счет своей 5’ → 3’ экзонуклеазной активности, отделяя флуорофор от гасителя. С каждым циклом ПЦР высвобождалось все больше молекул флуорофора, что приводило к возрастанию интенсивности флуоресценции, пропорциональной количеству молекул синтезируемого ампликона. Использовали рекомендованный размер ампликона 60 - 200 п.о. (65 п.о. для С228Т и 92 п.о. для C250Т), выбирали участок для амплификации с 40-60% содержанием GC-пар и избегали регионов со сложной вторичной структурой. Поскольку содержание GC-пар в получаемых ампликонах 77-80% (Фиг. 7), для эффективной работы полимераз в реакционную смесь добавляли GC-энхансеров, нарушающие вторичную структуру и способствующие нормальному разделению цепей ДНК. Для этих целей использовали 7-deaza-dGTP, который может включаться в состав синтезируемой цепи ДНК-полимеразами. Поскольку в седьмом положении цикла в 7-deaza-dGTP отсутствует атом азота, включение 7-deaza-dGTP в состав ДНК препятствовало образованию G-квадруплексов в GC-богатых участках. На Фигуре 8 представлен результат анализа системы, состоящей из плазмиды pUC19_235_wt дикого типа в количестве 5000 копий на 20 мкл реакционной смеси, и плазмиды pUC19_235_C228Т в количестве 1250 копий на 20 мкл реакционной смеси. Анализ результатов эксперимента проводился с помощью программного обеспечения QuantaSoftTM analysis pro. Пороговое значение для канала 1 (мутантная проба С228Т), составило 4000. Для канала 2 (проба дикого типа С228Т) пороговое значение находилось на уровне 2500. Область с синими точками представляет собой капли с плазмидами мутантного типа, область с зелеными точками - капли с плазмидами дикого типа, область с оранжевыми точками - капли, содержащие плазмиды обоих типов (Фиг. 8).
При оптимизации системы обнаружения мутации С228Т, состоящей из плазмид pUC19_235_C228Т и pUC19_235_wt, максимальное разрешение между кластерами достигалось при температуре 54°С. При этой температуре при 100% содержании в системе лишь плазмиды дикого типа в количестве 2500 положительных капель не наблюдается ложноположительных результатов (капель) в FAM-канале. Таким образом, подобранные условия обеспечивают 100% селективность обнаружения при условии отсутствия контаминации анализируемой смеси последовательностями мутантного типа. Далее был проведен анализ систем, содержащих плазмиду с мутацией С228Т на фоне избытка плазмиды дикого типа, концентрация которой постоянна и составляет 5000 копий на 20 мкл реакционной смеси. (Фиг. 9). Делая поправку на специфичность и контрольный образец, чувствительность составила 2%.
Подобранные условия (температурный режим, концентрация 7-deaza-dGTP, флуоресцентные TaqMan зонды и праймеры) проведения цифровой капельной ПЦР, позволили достичь селективного обнаружения последовательности промотора гена hTERT с мутациями С228Т и C250T, что было необходимо для валидации результатов, полученных методом спектроскопии ГКР. Однако ГКР-спектроскопия позволяет достичь более низких пределов обнаружения и наиболее важно, что использование этого метода не требует предварительной энзиматической амплификации мишени.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение
высшего профессионального образования "Московский государственный
университет имени М.В.Ломоносова" (МГУ)
<120> Набор для диагностики рака мочевого пузыря с помощью мутаций С228Т
и C250T в промоторе гена HTERT и способ ее осуществления
<160> SEQ ID NО:1
<210> 1
<211> 19
<212> GnuS
<213> Artificial sequence
<400> 1
1 TGCCTTTTGG GGACGGATA
<160> SEQ ID NО:2
<210> 2
<211> 20
<212> GnuS
<213> Artificial sequence
<400> 2
1 AATGATCTTA ACCAAGTATA
<160> SEQ ID NО:3
<210> 3
<211> 17
<212> GnuS
<213> Artificial sequence
<400> 3
1 TCGGTTGGGG AGCCTAT
<160> SEQ ID NО:4
<210> 3
<211> 19
<212> GnuS
<213> Artificial sequence
<400> 4
1 TGGCTAATCC CCTCGGATA
<---
Claims (18)
1. Набор для диагностики рака мочевого пузыря с помощью мутаций C228T и C250T в промоторе гена hTERT с использованием спектроскопии гигантского комбинационного рассеяния (спектроскопия ГКР), включающий твердофазный планарный сенсор, выполненный из диэлектрического химически инертного материала и покрытия на основе наночастиц благородных металлов, толщиной 1-10 мкм; и растворы меченных красителем с пределом обнаружения не более 1 мкМ олигонуклетидов GnuS-C228T-метка и GnuS-C250T-метка, где Gnus – последовательность, состоящая из 15-20 аминокислот, из которых не менее 20% составляют цитозин (C) и гуанин (G).
2. Набор по п.1, характеризующийся тем, что Gnus представляет собой нуклеотидную последовательность SEQ ID №1 - №4.
3. Набор по п.1, характеризующийся тем, что покрытие имеет наноструктуру с шероховатостью не менее 2 нм.
4. Набор по п.1, характеризующийся тем, что краситель с пределом обнаружения не более 1 мкМ представляет собой родаминовый, цианиновый, ксантеновый и диазо-краситель, метиленовый синий, кристаллический фиолетовый.
5. Набор по п.1, характеризующийся тем, что наночастицы благородных металлов выполенены из серебра, платины, золота.
6. Набор по п.2, характеризующийся тем, что наночастицы имеют размеры 20-90 нм.
7. Набор по п.1, характеризующийся тем, что диэлектрический химически инертный материал для покрытия наночастицами представляет собой силикатное стекло.
8. Набор по п.1, характеризующийся тем, что концентрация GnuS-C228T-метка или GnuS-C250T-метка олигонуклеотида в растворе составляет от 10-6 до 10-10 М.
9. Способ диагностики рака мочевого пузыря с использованием набора по п.1, включающий забор биологического образца, одну часть которого смешивают с раствором олигонуклеотида GnuS-C228T-метка, а другую часть с раствором GnuS-C250T-метка, проводят их гибридизацию с последующим определением мутаций ДНК C228T и C250T, посредством нанесения полученных смесей на поверхность сенсора, облучением монохроматическим пучком лазера с длиной волны 485-785 нм, с регистрацией сигнала комбинационного рассеяния, при этом о качественном и количественном содержании мутаций ДНК C228T и C250T судят по положению и интенсивности полос, характерных для метки-красителя.
10. Способ по п.9, характеризующийся тем, что в качестве биологического образца используют мочу пациента.
11. Способ по п.9, характеризующийся тем, что количество ГКР-меченного олигонуклеотида используют в объемном соотношении от 1:5 до 5:1 к анализируемому образцу, содержащему мутации ДНК C228T и C250T.
12. Способ по п.9, характеризующийся тем, что проводят предварительную гибридизацию последовательностей нуклеиновых кислот с раствором, меченных красителем.
13. Способ по п.12, характеризующийся тем, что гибридизацию проводят путем смешения анализируемого и раствора, меченного красителем, их нагрева и выдерживания в течение 5-10 мин при температуре 95°С, с последующим охлаждением до комнатной температуры.
14. Способ по п.9, характеризующийся тем, что используют анализируемые биологические образцы, смешанные с раствором олигонуклеотида GnuS-C228T-метка или GnuS-C250T-метка путем их накапывания на поверхность наночастиц.
15. Способ по п.9, характеризующийся тем, что используют образцы объемом 10 мкл с концентрацией мутаций ДНК C228T и C250T 10-15 – 10-2 М.
16. Способ по п.9, характеризующийся тем, что используют монохроматическое лазерное излучение мощностью, не превышающей 200 мBт, в течение до 10-60 с.
17. Способ по п.10, характеризующийся тем, что о наличии и содержании мутаций ДНК C228T и C250T в образце судят по положению и интенсивности полос при 1385, 1470 и 1590 см-1 с допустимой величиной погрешности не более 10 см-1.
18. Способ по п.9, характеризующийся тем, что для определения количественного содержания мутаций предварительно строят калибровочные кривые.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2020132737A RU2764807C1 (ru) | 2020-10-05 | 2020-10-05 | НАБОР ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ РАКА МОЧЕВОГО ПУЗЫРЯ С ПОМОЩЬЮ МУТАЦИЙ С228Т И C250T В ПРОМОТОРЕ ГЕНА hTERT И СПОСОБ ЕЕ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2020132737A RU2764807C1 (ru) | 2020-10-05 | 2020-10-05 | НАБОР ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ РАКА МОЧЕВОГО ПУЗЫРЯ С ПОМОЩЬЮ МУТАЦИЙ С228Т И C250T В ПРОМОТОРЕ ГЕНА hTERT И СПОСОБ ЕЕ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2764807C1 true RU2764807C1 (ru) | 2022-01-21 |
Family
ID=80445228
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2020132737A RU2764807C1 (ru) | 2020-10-05 | 2020-10-05 | НАБОР ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ РАКА МОЧЕВОГО ПУЗЫРЯ С ПОМОЩЬЮ МУТАЦИЙ С228Т И C250T В ПРОМОТОРЕ ГЕНА hTERT И СПОСОБ ЕЕ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2764807C1 (ru) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20160040250A1 (en) * | 2013-03-27 | 2016-02-11 | The Johns Hopkins University | Tert promoter mutations in cancer |
| RU2723160C1 (ru) * | 2019-08-15 | 2020-06-09 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) | Способ обнаружения и определения днк с заданной последовательностью методом спектроскопии гигантского комбинационного рассеяния |
| WO2020145715A1 (ko) * | 2019-01-11 | 2020-07-16 | 주식회사 진캐스트 | Tert 돌연변이 검출을 위한 dna 중합효소 및 이를 포함하는 키트 |
-
2020
- 2020-10-05 RU RU2020132737A patent/RU2764807C1/ru active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20160040250A1 (en) * | 2013-03-27 | 2016-02-11 | The Johns Hopkins University | Tert promoter mutations in cancer |
| WO2020145715A1 (ko) * | 2019-01-11 | 2020-07-16 | 주식회사 진캐스트 | Tert 돌연변이 검출을 위한 dna 중합효소 및 이를 포함하는 키트 |
| RU2723160C1 (ru) * | 2019-08-15 | 2020-06-09 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) | Способ обнаружения и определения днк с заданной последовательностью методом спектроскопии гигантского комбинационного рассеяния |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5688643A (en) | Method of nucleic acid-differentiation and assay kit for nucleic acid differentiation | |
| EP1297179B1 (en) | Detection of nucleic acid hybridization by fluorescence polarization | |
| US9297047B2 (en) | Molecular beacon based assay for the detection of biomarkers for breast cancer metastasis | |
| US7767390B2 (en) | Methods for evaluating drug-resistance gene expression in the cancer patient | |
| JP2006517786A (ja) | 未増幅ｄｎａを用いた直接的ｓｎｐ検出 | |
| US9429575B2 (en) | DNA aptamer specifically binding to EN2 (engrailed-2) and use thereof | |
| JP3844996B2 (ja) | 反復性ｐｃｒ産物の融解曲線解析方法 | |
| CN102257163A (zh) | 在样品中检测目标核酸的方法 | |
| CN113201533A (zh) | 基于催化发夹自组装恒温扩增技术检测核酸的通用探针及其应用 | |
| CN115161384A (zh) | 在体外侦测样本中的变异的基因、信息核醣核酸或微核醣核酸的方法 | |
| Shandilya et al. | Gold based nano-photonic approach for point-of-care detection of circulating long non-coding RNAs | |
| Brouard et al. | PCR‐free blood group genotyping using a nanobiosensor | |
| JP4806150B2 (ja) | 腫瘍細胞検出のための核酸プライマー及びプローブ | |
| Zhang et al. | Co-freezing localized CRISPR-Cas12a system enables rapid and sensitive nucleic acid analysis | |
| CN111304298B (zh) | 半胱天冬酶生物传感器及应用、半胱天冬酶活性的检测方法 | |
| Cai et al. | Fabrication of on-bead functional nucleic acid nanowires based on cyclic ligation reaction-driven rolling circle amplification for label-free detection of long noncoding RNAs in breast and lung tissues | |
| RU2723160C1 (ru) | Способ обнаружения и определения днк с заданной последовательностью методом спектроскопии гигантского комбинационного рассеяния | |
| RU2764807C1 (ru) | НАБОР ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ РАКА МОЧЕВОГО ПУЗЫРЯ С ПОМОЩЬЮ МУТАЦИЙ С228Т И C250T В ПРОМОТОРЕ ГЕНА hTERT И СПОСОБ ЕЕ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ | |
| CN104726548A (zh) | 一种基于杂交链式反应的dna、rna或蛋白质检测探针、检测方法及试剂盒 | |
| CN104232618B (zh) | 检测小分子配体靶蛋白用rca产物及其检测方法 | |
| Zhang et al. | A site-specific DNA methylation biosensor for both visual and magnetic determination based on lateral flow assay | |
| Song et al. | Label-free visual detection of nucleic acids in biological samples with single-base mismatch detection capability | |
| EP2351851B1 (en) | Method for measuring cytokeratin-19 mrna | |
| US20110189662A1 (en) | METHOD FOR MEASURING SURVIVIN mRNA | |
| KR20190081363A (ko) | 금 나노입자 결합 핵산 나노구조체를 이용한 신호증폭 및 응용 방법 |