RU2759413C1

RU2759413C1 - Method for detecting mycobacterium tuberculosis from resected lung tissue

Info

Publication number: RU2759413C1
Application number: RU2018135715A
Authority: RU
Inventors: Иван Александрович Доценко; Александр Кузьмич Чертков; Сергей Николаевич Скорняков; Игорь Давыдович Медвинский; Людмила Андреевна Голубева; Наталья Васильевна Раевская; Анна Викторовна Лещинкова; Камила Алиевна Гусейнова; Патимат Шамильевна Исабекова; Мария Юрьевна Измоденова; Роман Борисович Бердников
Priority date: 2018-10-08
Filing date: 2018-10-08
Publication date: 2021-11-12

Abstract

FIELD: medicine; microbiology.SUBSTANCE: invention relates to medicine, namely to microbiology; it can be used for laboratory diagnostics of tuberculosis. The essence of a method for detecting mycobacterium tuberculosis from resected lung tissue is that: test material is processed from accompanying microflora by placing test material for 45 min in a 0.9% ozonated NaCl solution heated to a temperature of 21°C, which is continuously saturated with an ozone-oxygen mixture with an ozone concentration of 10,000 mcg/l /min; after processing material, it is centrifuged at a speed of 3000 rpm for 15-20 min; supernatant liquid is drained, precipitation is sown equally in test tubes with nutrient media.EFFECT: claimed method allows one to increase the accuracy of laboratory diagnostics in the detection of mycobacterium tuberculosis while reducing the time of laboratory tests by preserving the viability and reducing quantitative losses of mycobacteria in test material.1 cl, 1 ex

Description

Изобретение относится медицине, а именно к микробиологии, и может быть использовано для лабораторной диагностики туберкулеза.The invention relates to medicine, namely to microbiology, and can be used for laboratory diagnosis of tuberculosis.

Большинство проб клинического материала, поступающего в микробиологическую лабораторию для культурального исследования на туберкулез, в различной степени загрязнены быстрорастущими бактериями, бурный рост которых на богатых питательных средах мешает развитию микобактерий и затрудняет их выделение. Поэтому перед посевом на питательную среду диагностический материал подвергают специальной обработке, обеспечивающей деконтаминацию (обеззараживание), то есть гибель сопутствующей микрофлоры. Все препараты, используемые в настоящее время для деконтаминации диагностического материала, обладают более или менее выраженной токсичностью в отношении микобактерий. Чтобы обеспечить выживание достаточной части микобактериальной популяции, необходимо использовать щадящие методы обработки, позволяющие, с одной стороны, подавить быстрорастущую Gr+/-микрофлору, грибы рода Candida, а с другой - максимально сохранить жизнеспособность присутствующих в материале микобактерий [Приказ МЗ РФ №109 от 21 марта 2003 года «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской федерации». Приложение 11 «Инструкция по унифицированным методам микробиологических исследований при выявлении, диагностике и лечении туберкулеза» IV. Культуральные методы исследования микобактерий комплекса М. Tuberkulosis 257-258].Most of the samples of clinical material supplied to the microbiological laboratory for culture research for tuberculosis are, to varying degrees, contaminated with fast-growing bacteria, the rapid growth of which on rich nutrient media interferes with the development of mycobacteria and makes it difficult to isolate them. Therefore, before sowing on a nutrient medium, the diagnostic material is subjected to a special treatment that ensures decontamination (disinfection), that is, the death of the accompanying microflora. All drugs currently used for decontamination of diagnostic material have more or less pronounced toxicity towards mycobacteria. To ensure the survival of a sufficient part of the mycobacterial population, it is necessary to use sparing methods of processing, allowing, on the one hand, to suppress the fast-growing Gr +/- microflora, fungi of the genus Candida, and on the other, to preserve the viability of the mycobacteria present in the material as much as possible [Order of the Ministry of Health of the Russian Federation No. 109 of 21 March 2003 "On the improvement of anti-tuberculosis measures in the Russian Federation." Appendix 11 "Instructions on unified methods of microbiological research in the detection, diagnosis and treatment of tuberculosis" IV. Cultural methods for the study of mycobacteria complex M. Tuberkulosis 257-258].

Известен способ выявления микобактерий туберкулеза из мокроты, получаемой от больных, включающий гомогенизацию исследуемого материала путем встряхивания его с равным количеством 10%-ного раствора трехзамещенного фосфорнокислого натрия с амплитудой 0,5-2,5 мм и частотой 40-60 Гц в течение 10-20 мин, инкубацию исследуемого материала в течение 18-20 ч, выделение осадка, нейтрализацию его карбоновой кислотой до достижения 6,8>рН>7,0 с последующим повторным выделением осадка и его посев на питательную среду (патент RU 2069698, 3.07.09.1993, оп. 27.11.1996).A known method for detecting mycobacterium tuberculosis from sputum obtained from patients, including homogenization of the test material by shaking it with an equal amount of a 10% solution of trisubstituted sodium phosphate with an amplitude of 0.5-2.5 mm and a frequency of 40-60 Hz for 10- 20 min, incubation of the test material for 18-20 h, precipitation, neutralizing it with carboxylic acid until reaching 6.8> pH> 7.0, followed by re-isolation of the precipitate and sowing it on a nutrient medium (patent RU 2069698, 03.07.09.1993 , op. 27.11.1996).

Нейтрализация осадка карбоновой кислотой является более щадящей обработкой по сравнению с нейтрализацией более сильными кислотами. Однако она приводит лишь к изменению рН исследуемого материала и тем самым сохраняет жизнеспособность микобактерий. Высокая концентрация фосфорнокислого натрия трехзамещенного обусловлена видом исходного материала - мокротой, являющейся по своей структуре раствором, снижающим при гомогенизации его концентрацию.Neutralization of sludge with carboxylic acid is a gentler treatment than neutralization with stronger acids. However, it only leads to a change in the pH of the test material and thereby preserves the viability of mycobacteria. The high concentration of sodium phosphate trisubstituted is due to the type of starting material - sputum, which is in its structure a solution that reduces its concentration during homogenization.

Наиболее близким аналогом, принятым за прототип, является способ выявления микобактерий туберкулеза из резецированной ткани легкого, при котором обрабатывают исследуемый материал от посторонней микрофлоры раствором тринатрий фосфата, который берут в концентрации 4-4,7%. Получают осадок, нейтрализуют его кислотой и делают посев на питательную среду. В качестве кислоты берут раствор аминоуксусной кислоты в концентрации 0,8±0,2%. При этом раствор тринатрий фосфата и кислоту берут в соотношении 1:1 (патент RU 2415944, з. 11.06.2009, оп. 10.04.2011).The closest analogue taken as a prototype is a method for detecting mycobacterium tuberculosis from resected lung tissue, in which the test material is treated from extraneous microflora with a solution of trisodium phosphate, which is taken at a concentration of 4-4.7%. Get a sediment, neutralize it with acid and sow on a nutrient medium. The acid is taken as a solution of aminoacetic acid at a concentration of 0.8 ± 0.2%. In this case, a solution of trisodium phosphate and acid are taken in a ratio of 1: 1 (patent RU 2415944, z. 11.06.2009, op. 10.04.2011).

Недостатком способа является длительность процесса деконтаминации биологического материала, низкая выживаемость микобактерий туберкулеза, токсичность используемых реагентов.The disadvantage of this method is the duration of the process of decontamination of biological material, low survival rate of mycobacterium tuberculosis, toxicity of the reagents used.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является повышение точности микробиологической диагностики, сокращение сроков лабораторных исследований и снижение затрат.The task to be solved by the claimed invention is to improve the accuracy of microbiological diagnostics, reduce the time of laboratory tests and reduce costs.

Техническим результатом является повышение жизнеспособности и снижение количественных потерь микобактерий в исследуемом материале при лабораторной диагностике туберкулеза.The technical result is to increase the viability and reduce the quantitative loss of mycobacteria in the test material in laboratory diagnosis of tuberculosis.

Для решения поставленной задачи в способе выявления микобактерий туберкулеза из резецированной ткани легкого, включающем обработку исследуемого материала от посторонней микрофлоры, согласно изобретению обработку исследуемого материала от сопутствующей микрофлоры производят путем помещения исследуемого материала на 45 минут в 0,9%-й озонированный раствор NaCl, нагретый до температуры 21°С, который непрерывно насыщают озоно-кислородной смесью с концентрацией озона 10000 мкг/л/мин, после обработки материала его центрифугируют при скорости 3000 об/мин в течение 15-20 мин, надосадочную жидкость сливают, осадок засевают поровну в пробирки с питательными средами.To solve the problem in the method for detecting mycobacterium tuberculosis from resected lung tissue, including the treatment of the test material from foreign microflora, according to the invention, the treatment of the test material from the accompanying microflora is carried out by placing the test material for 45 minutes in a 0.9% ozonated NaCl solution, heated to a temperature of 21 ° C, which is continuously saturated with an ozone-oxygen mixture with an ozone concentration of 10,000 μg / l / min, after processing the material, it is centrifuged at a speed of 3000 rpm for 15-20 minutes, the supernatant is drained, the sediment is inoculated equally into test tubes with nutrient media.

Выбранная методика обработки исследуемого материала обусловлена следующими факторами. Для эффективного абациллирования, вызванного Gr+/- микрофлорой, грибами рода Candida, раствором хлорида натрия, насыщенного озоно-кислородной смесью, требуется обработка раневой полости в течение не менее 45 минут.Автором произведены измерения окислительно-восстановительного потенциала, который является главным показателем активности раствора, в результате которых выявлено: необходимый уровень окислительно - восстановительного потенциала озонированного физиологического раствора хлорида натрия - не ниже 600 мВ - сохраняется при температуре 21°С не более 1 минуты после прекращения насыщения озоно-кислородной смесью.The chosen method of processing the material under study is due to the following factors. For effective abacillation caused by Gr +/- microflora, fungi of the genus Candida, a solution of sodium chloride saturated with an ozone-oxygen mixture, the wound cavity must be treated for at least 45 minutes. The author measured the redox potential, which is the main indicator of the activity of the solution, as a result of which it was revealed: the required level of the redox potential of the ozonized physiological sodium chloride solution - not less than 600 mV - is maintained at a temperature of 21 ° С for no more than 1 minute after the saturation with the ozone-oxygen mixture stops.

В связи с этим, обеспечение непрерывного насыщения раствора хлорида натрия озоно-кислородной смесью позволяет поддерживать требуемую концентрацию раствора в течение всего времени обработки исследуемого материала, что обеспечивает достоверный бактерицидный эффект, вызывает гибель Gr+/- микрофлоры и грибов рода Candida.In this regard, ensuring continuous saturation of the sodium chloride solution with an ozone-oxygen mixture allows maintaining the required concentration of the solution during the entire processing time of the test material, which provides a reliable bactericidal effect, causes the death of Gr +/- microflora and fungi of the genus Candida.

Использование озоно-кислородной смеси позволяет подавить быстрорастущую Gr+/- микрофлору, грибы рода Candida, максимально сохранив жизнеспособность присутствующих в материале микобактерий туберкулеза.The use of an ozone-oxygen mixture allows to suppress the fast-growing Gr +/- microflora, fungi of the genus Candida, while maximizing the viability of the tuberculosis mycobacteria present in the material.

Способ осуществляют следующим образом.The method is carried out as follows.

В качестве исследуемого материала используют резецированную ткань легкого. Резецированный материал гомогенизируют и растирают со стеклянными бусами или битым стеклом. Производят обработку исследуемого материала от сопутствующей микрофлоры. Для этого исследуемый материал помещают на 45 минут в объем 0,9% озонированного раствора NaCl, нагретого до температуры 21°С, который непрерывно насыщают озоно-кислородной смесью с концентрацией озона 10000 мкг/л/мин.Resected lung tissue is used as the test material. The resected material is homogenized and triturated with glass beads or broken glass. The test material is processed from the accompanying microflora. For this, the test material is placed for 45 minutes in a volume of 0.9% ozonized NaCl solution heated to a temperature of 21 ° C, which is continuously saturated with an ozone-oxygen mixture with an ozone concentration of 10,000 μg / l / min.

После материал центрифугируют при скорости 3000 об/мин в течение 15-20 мин, надосадочную жидкость сливают, осадок засевают поровну в пробирки с питательными средами (например, со средами Левенштейна-Иенсена и "Новая").After the material is centrifuged at a speed of 3000 rpm for 15-20 minutes, the supernatant is decanted, the sediment is inoculated equally into tubes with nutrient media (for example, with Levenshtein-Jensen and "New" media).

Заявляемый способ позволяет повысить точность лабораторной диагностики при выявлении микобактерий туберкулеза при одновременном сокращении времени лабораторных исследований за счет сохранения жизнеспособности и снижения количественных потерь микобактерий в исследуемом материале.The inventive method makes it possible to increase the accuracy of laboratory diagnostics in the detection of mycobacterium tuberculosis while reducing the time of laboratory research by maintaining the viability and reducing the quantitative loss of mycobacteria in the test material.

Клинический пример.Clinical example.

Больной П. 38 лет. Поступил на лечение с диагнозом инфильтративный туберкулез в\доли правого легкого. Выполнено хирургическое лечение -торакотомия слева, резекция в\доли правого легкого. Резецированный материал гомогенизирован в условиях лаборатории. Произведена обработка исследуемого материала от сопутствующей микрофлоры. Исследуемый материал помещен на 45 минут в объем 0,9% озонированного раствора NaCl, нагретого до температуры 21°С, который непрерывно насыщают озоно-кислородной смесью с концентрацией озона 10000 мкг/л/мин.Patient P. 38 years old. Was admitted for treatment with a diagnosis of infiltrative tuberculosis in the lobe of the right lung. Surgical treatment was performed - thoracotomy on the left, resection in the lobe of the right lung. The resected material is homogenized under laboratory conditions. The study material was processed from the accompanying microflora. The test material is placed for 45 minutes in a volume of 0.9% ozonized NaCl solution heated to a temperature of 21 ° C, which is continuously saturated with an ozone-oxygen mixture with an ozone concentration of 10,000 μg / l / min.

После материал центрифугирован при скорости 3000 об/мин в течение 20 мин, надосадочная жидкость слита, осадок засеян поровну в три пробирки с питательными средами "Новая". Получен рост микобактерий туберкулеза: в первой пробирке на 19-е сутки, во второй пробирке на 21-е сутки, в третьей пробирке на 20-е сутки. Признаков роста неспецифической микрофлоры не выявлено.After the material is centrifuged at a speed of 3000 rpm for 20 minutes, the supernatant is drained, the sediment is inoculated equally into three tubes with "New" culture media. The growth of mycobacterium tuberculosis was obtained: in the first test tube on the 19th day, in the second test tube on the 21st day, in the third test tube on the 20th day. There were no signs of growth of nonspecific microflora.

Claims

A method for detecting mycobacterium tuberculosis from resected lung tissue, including the processing of the test material from the accompanying microflora, characterized in that the processing of the test material from the accompanying microflora is carried out by placing the test material for 45 minutes in a 0.9% ozonated NaCl solution heated to a temperature of 21 ° C, which is continuously saturated with an ozone-oxygen mixture with an ozone concentration of 10,000 μg / l / min, after processing the material, it is centrifuged at a speed of 3000 rpm for 15-20 min, the supernatant is drained, the sediment is inoculated equally into test tubes with nutrient media ...