RU2757686C1

RU2757686C1 - Method for controlled dna fragmentation

Info

Publication number: RU2757686C1
Application number: RU2020136105A
Authority: RU
Inventors: Андрей Андреевич Кечин; Дарья Сергеевна Болдырева; Максим Леонидович Филипенко
Priority date: 2020-11-03
Filing date: 2020-11-03
Publication date: 2021-10-20

Abstract

FIELD: molecular biology; biotechnology.

SUBSTANCE: method for controlled DNA fragmentation is proposed. Glass beads of 100-600 mcm in size are added to a DNA solution in the amount of 60-75% (g/ml) by weight of the DNA solution. The resulting mixture is processed with ultrasound at a frequency of 20-40 kHz for 10-600 seconds in an ultrasonic bath with water cooled to a temperature of 5-10°C.

EFFECT: invention simplifies the procedure of DNA fragmentation, expands the range of obtained average fragment lengths from 50 to 1500 bp, allows obtaining the required average length of fragments at a given processing time.

1 cl, 1 dwg, 4 ex

Description

Изобретение относится к области молекулярной биологии и биотехнологии и может быть использовано для получения фрагментов геномной ДНК заданной длины.The invention relates to the field of molecular biology and biotechnology and can be used to obtain fragments of genomic DNA of a given length.

Фрагментация геномной ДНК является одним из обязательных этапов при приготовлении NGS-библиотек для полногеномного секвенирования. От длины фрагментов и равномерности расщепления копий генома на короткие участки зависит качество и зачастую возможность последующего биоинформационного анализа. Так, при исследовании ранее неизвестных геномов или геномов с высокой нестабильностью (например, различные штаммы одного и того же вида бактерии) требуется проведение сборки генома из получаемых прочтений de novo, то есть без картирования на референсную последовательность. С одной стороны, чем больше длина фрагментов, тем больше повторяющихся участков генома удастся собрать в единую протяженную последовательность. С другой стороны, максимальная длина таких фрагментов также ограничена возможностями подходов, используемых при секвенировании. Ограничения накладывает и необходимость получения максимально узкого диапазона распределения длин, поскольку более широкое распределение будет приводить к перепредставленности коротких фрагментов и недопредставленности - более длинных. Таким образом, фрагментация ДНК является неотъемлемой частью полногеномного секвенирования, от которого зависит качество получаемых сырых данных.Fragmentation of genomic DNA is one of the mandatory steps in the preparation of NGS libraries for full genome sequencing. The quality and often the possibility of subsequent bioinformatics analysis depends on the length of the fragments and the uniformity of splitting the genome copies into short sections. Thus, when studying previously unknown genomes or genomes with high instability (for example, different strains of the same bacterial species), it is required to assemble the genome from the obtained readings de novo, that is, without mapping to a reference sequence. On the one hand, the longer the fragments are, the more repetitive regions of the genome can be assembled into a single extended sequence. On the other hand, the maximum length of such fragments is also limited by the capabilities of the approaches used in sequencing. Limitations are also imposed by the need to obtain the narrowest possible range of length distributions, since a wider distribution will lead to overrepresentation of short fragments and underrepresentation of longer ones. Thus, DNA fragmentation is an integral part of whole genome sequencing, on which the quality of the resulting raw data depends.

Сегодня разработаны различные подходы к фрагментации ДНК: физическими методами [1-9] и с применением ферментов [10-13]. Наиболее распространенным методом физического разрыва молекул ДНК является обработка ультразвуком. Такая обработка может осуществляться как с добавлением физических объектов, концентрирующих передаваемую энергию ультразвука, так и без них. Однако, как указано в большинстве из приведенных патентов, такое добавление улучшает эффективность фрагментации.Today, various approaches to DNA fragmentation have been developed: by physical methods [1-9] and using enzymes [10-13]. The most common method of physically breaking DNA molecules is sonication. Such processing can be carried out both with the addition of physical objects that concentrate the transmitted ultrasound energy, and without them. However, as indicated in most of the cited patents, this addition improves fragmentation efficiency.

Известен способ контролируемой фрагментации ДНК, заключающийся в том, что через раствор ДНК прокачивается газ под определенным давлением от 0.01 до 10 Мпа в зависимости от желаемой длины фрагментов [3]. Недостатком такого способа является необходимость использования газа под давлением, требующего нестандартного оборудования.The known method of controlled fragmentation of DNA, which consists in the fact that through the DNA solution gas is pumped under a certain pressure from 0.01 to 10 MPa, depending on the desired length of the fragments [3]. The disadvantage of this method is the need to use pressurized gas, which requires non-standard equipment.

Известен способ контролируемой фрагментации ДНК, заключающийся в том, что для фрагментации ДНК используется пневматическая установка, которая вызывает формирование пузырьков в растворе ДНК, что и разрезает молекулы ДНК на фрагменты [4]. Недостатком такого способа является применение специфического оборудования, требующего создания определенного давления.There is a known method of controlled DNA fragmentation, which consists in the fact that for DNA fragmentation a pneumatic installation is used, which causes the formation of bubbles in the DNA solution, which cuts the DNA molecules into fragments [4]. The disadvantage of this method is the use of specific equipment that requires the creation of a certain pressure.

Известен способ контролируемой фрагментации ДНК, заключающийся в том, что фрагментируемая ДНК длиной не менее 10000 п.о. фрагментируется при помощи ультразвука до длины 1300 п.о. (или до 50-400 п.о. при определенных условиях), при этом частота ультразвука составляет от 28 до 80 кГц [7]. Недостатками такого способа является ограничения по получаемым длинам фрагментов и использование ультразвука с ограниченным диапазонов частот.The known method of controlled fragmentation of DNA, which consists in the fact that the fragmented DNA with a length of at least 10,000 p. fragmented by ultrasound to a length of 1300 bp. (or up to 50-400 bp under certain conditions), while the ultrasound frequency is from 28 to 80 kHz [7]. The disadvantages of this method are the limitations on the obtained fragment lengths and the use of ultrasound with limited frequency ranges.

Известен способ контролируемой фрагментации ДНК, заключающийся в том, что для фрагментации ДНК используется небулайзер, который и описан в изобретении [8]. Недостатками такого способа является использование специфического оборудования, описанного в патенте.The known method of controlled fragmentation of DNA, which consists in the fact that for fragmentation of DNA, a nebulizer is used, which is described in the invention [8]. The disadvantages of this method is the use of specific equipment described in the patent.

Известен способ контролируемой фрагментации ДНК, заключающийся в том, что в ДНК вносятся случайным образом расположенные модификации, после чего эндонуклеазы, чувствительные к таким модификациям разрезают молекулы ДНК на фрагменты [10]. Недостатком такого способа является применение дополнительной стадии модификации и ферментов, что может приводить к неслучайной фрагментации ДНК, а также высокой чувствительности к различным ингибиторам.There is a known method of controlled fragmentation of DNA, which consists in the fact that randomly located modifications are introduced into DNA, after which endonucleases sensitive to such modifications cut the DNA molecules into fragments [10]. The disadvantage of this method is the use of an additional stage of modification and enzymes, which can lead to non-random DNA fragmentation, as well as high sensitivity to various inhibitors.

Известен способ контролируемой фрагментации ДНК, заключающийся в том, что на подложке закрепляются молекулы различных транспозаз с улучшенными свойствами и соответствующие им олигонуклеотиды, после чего проводится случайная фрагментация ДНК транспозазами с одновременным включением адаптерных последовательностей [11, 14]. Недостатком такого способа является необходимость использования специфических ферментов, а также неравномерное распределение сайтов узнавания транспозазой в целевой ДНК. Кроме того, такие ферменты могут добавлять инсерции и делеции в исследуемую последовательность и имеют высокую чувствительность к GC-составу последовательностей [15, 16].The known method of controlled DNA fragmentation, which consists in the fact that molecules of various transposases with improved properties and their corresponding oligonucleotides are fixed on the substrate, after which random fragmentation of DNA with transposases is carried out with the simultaneous inclusion of adapter sequences [11, 14]. The disadvantage of this method is the need to use specific enzymes, as well as the uneven distribution of transposase recognition sites in the target DNA. In addition, such enzymes can add insertions and deletions to the studied sequence and are highly sensitive to the GC composition of the sequences [15, 16].

Известен способ контролируемой фрагментации ДНК, заключающийся в том, что к раствору нуклеиновых кислот добавляют смесь различных комплексов транспозосом, состоящих из различных транспозаз, концевой последовательности первого транспозона и концевой последовательности второго транспозона. Причем обе концевые последовательности способны связываться с одной из транспозаз комплекса и содержат по крайней мере по одному нику, разрыву, апуриновому или апиримидиновому сайту [12]. Недостатками такого способа является также необходимость использования специфических ферментов, а также неравномерное распределение сайтов узнавания транспозазой в целевой ДНК и возможное добавление инсерций и делеций в исследуемую последовательность.The known method of controlled DNA fragmentation, which consists in the fact that to a solution of nucleic acids add a mixture of various complexes of transposomes, consisting of various transposases, the terminal sequence of the first transposon and the terminal sequence of the second transposon. Moreover, both terminal sequences are able to bind to one of the transposases of the complex and contain at least one nick, gap, apurinic or apyrimidinic site [12]. The disadvantages of this method are also the need to use specific enzymes, as well as the uneven distribution of transposase recognition sites in the target DNA and the possible addition of insertions and deletions to the studied sequence.

Наиболее близким к заявленному способу – прототипом - является способ контролируемой фрагментации ДНК, заключающийся в том, что к очищенному образцу ДНК в пробирке добавляют магнитные или немагнитные монодисперсные частицы (стеклянные, кварцевые, металлические, из боросиликатного стекла, из натриевого стекла, из мочевины, из оксида металла, керамические или керамические, покрытые металлом) размером 0,1-100 мкм в количестве 0,1-20% от используемого раствора очищенного образца ДНК по массе [5]. Суспензия частиц также содержит менее 85% глицерина. Полученную смесь подвергают обработке ультразвуком с частотой 1,1 МГц в течение менее, чем 5 минут, что приводит к физическому разрыву двуцепочечных молекул ДНК на фрагменты 60-90 п.о. The closest to the claimed method - the prototype - is a method of controlled fragmentation of DNA, which consists in the fact that magnetic or non-magnetic monodisperse particles (glass, quartz, metal, from borosilicate glass, from sodium glass, from urea, from metal oxide, ceramic or ceramic, coated with metal) with a size of 0.1-100 microns in an amount of 0.1-20% of the used solution of the purified DNA sample by weight [5]. The particle suspension also contains less than 85% glycerol. The resulting mixture is subjected to sonication at a frequency of 1.1 MHz for less than 5 minutes, which leads to the physical rupture of double-stranded DNA molecules into fragments of 60-90 bp.

Недостатками известного способа является необходимость использования оборудования, производящего ультразвук с частотой 1 МГц, неоптимальные размеры твердых частиц, составляющие 0,1-100 мкм и недостаточное их количество, добавляемое к раствору ДНК, составляющее 0,1-20% от используемого раствора образца ДНК по массе, что не позволяет провести контролируемую фрагментацию ДНК с получением широкого диапазона длин фрагментов ДНК.The disadvantages of this method is the need to use equipment that produces ultrasound with a frequency of 1 MHz, suboptimal sizes of solid particles, which are 0.1-100 microns and their insufficient amount added to the DNA solution, which is 0.1-20% of the used DNA sample solution according to mass, which does not allow controlled DNA fragmentation to obtain a wide range of DNA fragment lengths.

Задачей изобретения является разработка способа, обеспечивающего проведение контролируемой фрагментации ДНК с получением широкого диапазона длин фрагментов ДНК.The objective of the invention is to develop a method that provides controlled DNA fragmentation with obtaining a wide range of lengths of DNA fragments.

Технический результат: упрощение способа и расширение диапазона получаемых средних длин фрагментов, снижение себестоимости полногеномного секвенирования.EFFECT: simplifying the method and expanding the range of obtained average fragment lengths, reducing the cost of full genome sequencing.

Поставленная задача достигается предлагаемым способом, заключающимся в следующем.The task is achieved by the proposed method, which is as follows.

Очищенные высокомолекулярные фрагменты ДНК, длиной более 3000 п.о., объемом 10-100 мкл, смешивают со стеклянными шариками размером 100-600 мкм в закрывающейся пластиковой пробирке (например, фирмы Eppendord, Axygen или другие) объемом 0,5-0,6 мл (или другого объема, но с предварительным подбором оптимальных условий фрагментации для решаемой задачи) и помещают в ультразвуковую ванну (например, BANDELIN RK 514 H, SONOREX SUPER или любые другие аналогичные). Температуру воды доводят до 5-10°C. Далее проводят обработку полученной смеси ультразвуком в ультразвуковой ванне с частотой ультразвука от 20 кГц до 1,1 МГц в течение 10-600 секунд. Например, это может быть сделано путём добавления в ванну льда. Варьируя время обработки и количество добавленных шариков, получают фрагменты ДНК с длиной от 50 до 1500 п.о.Purified high molecular weight DNA fragments, more than 3000 bp in length, 10-100 μL in volume, are mixed with glass beads 100-600 μm in size in a closable plastic tube (for example, Eppendord, Axygen or others) with a volume of 0.5-0.6 ml (or another volume, but with a preliminary selection of the optimal fragmentation conditions for the problem being solved) and placed in an ultrasonic bath (for example, BANDELIN RK 514 H, SONOREX SUPER or any other similar). The water temperature is brought to 5-10 ° C. Next, the resulting mixture is treated with ultrasound in an ultrasonic bath with an ultrasound frequency from 20 kHz to 1.1 MHz for 10-600 seconds. For example, this can be done by adding ice to the bath. By varying the processing time and the number of added beads, DNA fragments with a length from 50 to 1500 bp are obtained.

Определяющими отличиями заявляемого способа, по сравнению с прототипом, являются:The defining differences of the proposed method in comparison with the prototype are:

- в качестве частиц используют стеклянные шарики размером 100-600 мкм в количестве от 1 до 75% по массе от раствора фрагментируемой ДНК, что позволяет получать при заданном времени обработки необходимую среднюю длину фрагментов без применения дорогостоящего оборудования;- glass beads with a size of 100-600 microns are used as particles in an amount of 1 to 75% by weight of the fragmented DNA solution, which makes it possible to obtain, at a given processing time, the required average length of fragments without the use of expensive equipment;

- обработку ультразвуком проводят с частотой от 20 кГц до 1,1 МГц, что позволяет получать фрагменты молекул ДНК с длиной от 50 до 1500 п.о., в зависимости от используемых условий.- treatment with ultrasound is carried out with a frequency of 20 kHz to 1.1 MHz, which makes it possible to obtain fragments of DNA molecules with a length of 50 to 1500 bp, depending on the conditions used.

Преимущественно время обработки раствора ДНК с частицами варьируют от 10 до 600 секунд, что позволяет получать различную среднюю длину фрагментов (от 50 до 1500 п.о.).Mostly, the processing time of a DNA solution with particles varies from 10 to 600 seconds, which allows one to obtain different average lengths of fragments (from 50 to 1500 bp).

Применимость заявляемого способа иллюстрируется следующими примерами:The applicability of the proposed method is illustrated by the following examples:

Пример 1. Приготовление библиотек для полногеномного секвенирования изолятов бактерий (например, Escherichia coli).Example 1. Preparation of libraries for whole genome sequencing of bacterial isolates (eg Escherichia coli).

Из чистой культуры бактерий или смеси бактерий, полученных, например, из образца почвы или клинического образца, выделяют ДНК с помощью набора ферментов, SDS, хлороформа, фенола и этанола [17] или специализированных коммерческих наборов или других аналогичных подходов к выделению ДНК из различных микроорганизмов. 100 мкл раствора выделенной ДНК в концентрации 1-50 нг/мкл помещают в пластиковую пробирку с крышкой объемом 0,6 мл, добавляют 0,06 г смесью стеклянных шариков диаметром 100-600 мкм, пробирку со смесью помещают в ультразвуковую ванну BANDELIN RK 514 H с заранее охлажденной до 5°C и проводят обработку ультразвуком с частотой 20 кГц в течение 50 секунд. Такая обработка позволяет получить фрагменты с нормальным распределением длин и средней величиной 1500 п.о. При фрагментации в течение 1 минуты и 30 секунд, средняя длина фрагментов составляет около 700 п.о. На фиг.1 представлено распределение длин фрагментов после фрагментации ДНК заявляемым способом.DNA is isolated from a pure culture of bacteria or a mixture of bacteria obtained, for example, from a soil sample or a clinical sample, using a set of enzymes, SDS, chloroform, phenol and ethanol [17] or specialized commercial kits or other similar approaches for the isolation of DNA from various microorganisms ... 100 μl of a solution of isolated DNA at a concentration of 1-50 ng / μl is placed in a plastic test tube with a lid of 0.6 ml, 0.06 g is added with a mixture of glass beads with a diameter of 100-600 μm, the test tube with the mixture is placed in an ultrasonic bath BANDELIN RK 514 H pre-cooled to 5 ° C and sonicated at a frequency of 20 kHz for 50 seconds. Such processing makes it possible to obtain fragments with a normal distribution of lengths and an average value of 1500 bp. With fragmentation within 1 minute and 30 seconds, the average fragment length is about 700 bp. Figure 1 shows the distribution of fragment lengths after DNA fragmentation by the claimed method.

Далее, у полученных фрагментов восстанавливают концы с помощью ДНК-полимеразы, добавляют на 3'-концы фрагментов аденозинмонофосфаты и присоединяют к ним с помощью лигазы адаптеры для секвенирования, содержащие 3'-выступающий dT. В случае использования петлевых адаптеров петлю разрезают с помощью смеси урацилгликозилазы и эндонуклеазы VIII. Далее полученную библиотеку ДНК амплифицируют и квантифицируют, после чего она может быть подвергнута высокопроизводительному секвенированию.Further, the ends of the obtained fragments are restored using DNA polymerase, adenosine monophosphates are added to the 3'-ends of the fragments and sequencing adapters containing a 3'-protruding dT are attached to them using ligase. If loop adapters are used, the loop is cut with a mixture of uracyl glycosylase and endonuclease VIII. Next, the resulting DNA library is amplified and quantified, after which it can be subjected to high-throughput sequencing.

Пример 2. Приготовление библиотек для полногеномного секвенирования образца ДНК человекаExample 2. Preparation of libraries for whole genome sequencing of a human DNA sample

Все процедуры проводят таким же образом, как и в Примере 1, за исключением того, что ДНК выделяют из клеток человека, используя подходящие лабораторные методы, добавляют 0,075 г смеси стеклянных шариков диаметром 100-600 мкм, пробирку со смесью помещают в ультразвуковую ванну SONOREX SUPER с заранее охлажденной до 10°C и проводят обработку ультразвуком с частотой 20 кГц в течение 5 минут. В этом случае средняя длина получаемых фрагментов составляет 50 п.о.All procedures are carried out in the same way as in Example 1, except that DNA is isolated from human cells using suitable laboratory methods, 0.075 g of a mixture of glass beads with a diameter of 100-600 μm is added, the test tube with the mixture is placed in a SONOREX SUPER ultrasonic bath pre-cooled to 10 ° C and sonicated at a frequency of 20 kHz for 5 minutes. In this case, the average length of the resulting fragments is 50 bp.

Пример 3. Приготовление библиотек для полногеномного секвенирования изолятов бактерий (например, Escherichia coli) с длиной вставки фрагмента 1500 п.о.Example 3. Preparation of libraries for genome-wide sequencing of bacterial isolates (eg, Escherichia coli) with a fragment insert length of 1500 bp.

Все процедуры проводят аналогично примеру 1, за исключением того, что добавляют 0,001 г смеси стеклянных шариков диаметром 100-600 мкм, пробирку со смесью помещают в ультразвуковую ванну SONOREX SUPER с заранее охлажденной до 10°C и проводят обработку ультразвуком с частотой 20 кГц в течение 50 секунд. ДНК фрагментируют в течение 1 минуты, используя ультразвуковую ванну. При этом получаемая средняя длина фрагментов составляет около 1500 п.о.All procedures are carried out analogously to example 1, except that 0.001 g of a mixture of glass beads with a diameter of 100-600 μm is added, the test tube with the mixture is placed in a SONOREX SUPER ultrasonic bath previously cooled to 10 ° C and sonicated at a frequency of 20 kHz for 50 seconds. DNA is fragmented for 1 minute using an ultrasonic bath. In this case, the resulting average length of fragments is about 1500 bp.

Пример 4. Приготовление библиотек для полногеномного секвенирования изолятов бактерий (например, Escherichia coli) с длиной вставки фрагмента 1000 п.о. с использованием прибора Covaris Example 4. Preparation of libraries for whole genome sequencing of bacterial isolates (for example, Escherichia coli) with a fragment insert length of 1000 bp. using the Covaris device

Все процедуры проводят аналогично примеру 1, за исключением того, что ДНК фрагментируют в течение 30 секунд на приборе Covaris с частотой 1,1 МГц. При этом получаемая средняя длина фрагментов составляет около 1000 п.о.All procedures are carried out analogously to example 1, except that the DNA is fragmented for 30 seconds on a Covaris instrument with a frequency of 1.1 MHz. In this case, the resulting average length of fragments is about 1000 bp.

Таким образом, разработанный новый способ позволяет упростить процедуру фрагментирования высокомолекулярной ДНК до заданной длины, поскольку не требует сложного, дорогостоящего, специфического оборудования и реактивов.Thus, the developed new method makes it possible to simplify the procedure for fragmentation of high-molecular-weight DNA to a given length, since it does not require complex, expensive, specific equipment and reagents.

Источники информацииSources of information

1. Laugharn JA, Khoja JH. Acoustic energy mediation of genetic fragmentation [Internet]. 2015. Available: https://patents.google.com/patent/US 201601023291. Laugharn JA, Khoja JH. Acoustic energy mediation of genetic fragmentation [Internet]. 2015. Available: https://patents.google.com/patent/US 20160102329

2. Pedregosa F, Varoquaux G, Gramfort A, Michel V, Thirion B, Grisel O, et al. Journal of machine learning research : JMLR. [Internet]. Journal of Machine Learning Research. MIT Press; 2000. Available: http://jmlr.csail.mit.edu/papers/v12/pedregosa11a.html2. Pedregosa F, Varoquaux G, Gramfort A, Michel V, Thirion B, Grisel O, et al. Journal of machine learning research: JMLR. [Internet]. Journal of Machine Learning Research. MIT Press; 2000. Available: http://jmlr.csail.mit.edu/papers/v12/pedregosa11a.html

3. Shui L, Li L, Peng Y, Jin M, Zhou G. Dna fragmentation method and device for implementing same [Internet]. 2016. Available: https://patents.google.com/patent/WO 2016177020 A13. Shui L, Li L, Peng Y, Jin M, Zhou G. Dna fragmentation method and device for implementing same [Internet]. 2016. Available: https://patents.google.com/patent/WO 2016177020 A1

4. Shui L, Li L, Peng Y, Jin M, Zhou G. DNA (Deoxyribose Nucleic Acid) fragmentation method and device for implementing same [Internet]. 2015. Available: https://patents.google.com/patent/CN 104862302 A4. Shui L, Li L, Peng Y, Jin M, Zhou G. DNA (Deoxyribose Nucleic Acid) fragmentation method and device for implementing same [Internet]. 2015. Available: https://patents.google.com/patent/CN 104862302 A

5. Bashkirov VI, Ulmanella U, Eason RG, Taft BJ. Methods and compositions for shearing of polymers by sonication [Internet]. 2009. Available: https://patents.google.com/patent/WO 2009103068 A15. Bashkirov VI, Ulmanella U, Eason RG, Taft BJ. Methods and compositions for shearing of polymers by sonication [Internet]. 2009. Available: https://patents.google.com/patent/WO 2009103068 A1

6. Bashkirov VI, Ulmanella U, Eason RG, Taft BJ. Methods and apparatuses for nucleic acid shearing by sonication [Internet]. 2009. Available: https://patents.google.com/patent/US 91273066. Bashkirov VI, Ulmanella U, Eason RG, Taft BJ. Methods and apparatuses for nucleic acid shearing by sonication [Internet]. 2009. Available: https://patents.google.com/patent/US 9127306

7. Poncelet D, Panteleeva I, Ito K, Allaer D. Method and apparatus for fragmenting dna sequences [Internet]. 2011. Available: https://patents.google.com/patent/US 201202642287. Poncelet D, Panteleeva I, Ito K, Allaer D. Method and apparatus for fragmenting dna sequences [Internet]. 2011. Available: https://patents.google.com/patent/US 20120264228

8. Surzycki SJ, Kityama M, Togasaki RK. Process and apparatus for fragmenting biomaterials [Internet]. 1991. Available: https://patents.google.com/patent/US 56100108. Surzycki SJ, Kityama M, Togasaki RK. Process and apparatus for fragmenting biomaterials [Internet]. 1991. Available: https://patents.google.com/patent/US 5610010

9. Vivek V, Hadimioglu B, Sharma S, DEV K. Apparatus and method for using ultrasonic radiation for controlled fragmentation of chains of nucleic acids [Internet]. 2012. Available: https://patents.google.com/patent/EP 2766188 B19. Vivek V, Hadimioglu B, Sharma S, DEV K. Apparatus and method for using ultrasonic radiation for controlled fragmentation of chains of nucleic acids [Internet]. 2012. Available: https://patents.google.com/patent/EP 2766188 B1

10. COGAN NOI, Shinozuka H. Method of nucleic acid fragmentation [Internet]. 2014. Available: https://patents.google.com/patent/WO 2015024075 A110. COGAN NOI, Shinozuka H. Method of nucleic acid fragmentation [Internet]. 2014. Available: https://patents.google.com/patent/WO 2015024075 A1

11. Belyaev AS. Immobilized transposase complexes for dna fragmentation and tagging [Internet]. 2013. Available: https://patents.google.com/patent/US 2014009391611. Belyaev AS. Immobilized transposase complexes for dna fragmentation and tagging [Internet]. 2013. Available: https://patents.google.com/patent/US 20140093916

12. UKANIS M, Lubys A, TAMOSEVICIUS R, GAIDAMAUSKAS E. Method for controlled dna fragmentation [Internet]. 2014. Available: https://patents.google.com/patent/US 2016017735912. UKANIS M, Lubys A, TAMOSEVICIUS R, GAIDAMAUSKAS E. Method for controlled dna fragmentation [Internet]. 2014. Available: https://patents.google.com/patent/US 20160177359

13. Ukanis M, Rubis A, Tamosevichus R, Gadamauskas E. For the method through controlling DNA fragmentation [Internet]. 2014. Available: https://patents.google.com/patent/CN 106103713 A13. Ukanis M, Rubis A, Tamosevichus R, Gadamauskas E. For the method through controlling DNA fragmentation [Internet]. 2014. Available: https://patents.google.com/patent/CN 106103713 A

14. Belyaev A. Immobilized transposase complexes for DNA fragmentation and tagging [Internet]. 2013. Available: https://patents.google.com/patent/EP2712931 A114. Belyaev A. Immobilized transposase complexes for DNA fragmentation and tagging [Internet]. 2013. Available: https://patents.google.com/patent/EP2712931 A1

15. Knierim E, Lucke B, Schwarz JM, Schuelke M, Seelow D. Systematic comparison of three methods for fragmentation of long-range PCR products for next generation sequencing. PLoS One. 2011;6. doi:10.1371/journal.pone.002824015. Knierim E, Lucke B, Schwarz JM, Schuelke M, Seelow D. Systematic comparison of three methods for fragmentation of long-range PCR products for next generation sequencing. PLoS One. 2011; 6. doi: 10.1371 / journal.pone.0028240

16. Lan JH, Yin Y, Reed EF, Moua K, Thomas K, Zhang Q. Impact of three Illumina library construction methods on GC bias and HLA genotype calling. Hum Immunol. Hum Immunol; 2015;76: 166-75. doi:10.1016/j.humimm.2014.12.01616. Lan JH, Yin Y, Reed EF, Moua K, Thomas K, Zhang Q. Impact of three Illumina library construction methods on GC bias and HLA genotype calling. Hum Immunol. Hum Immunol; 2015; 76: 166-75. doi: 10.1016 / j.humimm.2014.12.016

17. Wright MH, Adelskov J, Greene AC. Bacterial DNA Extraction Using Individual Enzymes and Phenol/Chloroform Separation. J Microbiol Biol Educ. American Society for Microbiology (ASM); 2017;18. doi:10.1128/jmbe.v18i2.134817. Wright MH, Adelskov J, Greene AC. Bacterial DNA Extraction Using Individual Enzymes and Phenol / Chloroform Separation. J Microbiol Biol Educ. American Society for Microbiology (ASM); 2017; 18. doi: 10.1128 / jmbe.v18i2.1348

Claims

A method for controlled DNA fragmentation, including adding solid particles to a DNA solution and treating the resulting mixture with ultrasound, characterized in that glass beads with a size of 100-600 microns are used as solid particles in an amount of 60-75% (g / ml) by weight of the DNA solution , while the resulting mixture is treated with ultrasound at a frequency of 20-40 kHz for 10-600 seconds in an ultrasonic bath with water cooled to a temperature of 5-10 ° C.