RU2748901C1 - Способ высокочувствительного иммунохроматографического анализа с двойной конкуренцией - Google Patents
Способ высокочувствительного иммунохроматографического анализа с двойной конкуренцией Download PDFInfo
- Publication number
- RU2748901C1 RU2748901C1 RU2020132257A RU2020132257A RU2748901C1 RU 2748901 C1 RU2748901 C1 RU 2748901C1 RU 2020132257 A RU2020132257 A RU 2020132257A RU 2020132257 A RU2020132257 A RU 2020132257A RU 2748901 C1 RU2748901 C1 RU 2748901C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- test zone
- immunochromatographic
- conjugate
- marker particles
- compound
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 15
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 title claims abstract description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 19
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 12
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 claims abstract description 9
- 239000012491 analyte Substances 0.000 claims abstract description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims abstract description 6
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 4
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 3
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 9
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 9
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 9
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 8
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 238000003317 immunochromatography Methods 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N alumane Chemical class [AlH3] AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000012482 calibration solution Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- 239000002274 desiccant Substances 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/5306—Improving reaction conditions, e.g. reduction of non-specific binding, promotion of specific binding
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Изобретение относится к иммунологии и аналитической биохимии и представляет собой способ иммунохроматографического анализа. Способ иммунохроматографического конкурентного анализа включает иммобилизацию специфических антител против определяемого соединения на поверхности маркерных частиц и в тестовой зоне рабочей мембраны, при этом образование окрашенного комплекса в тестовой зоне происходит при добавлении конъюгата белка-носителя с несколькими молекулами аналита за счет поливалентного взаимодействия, а в случае наличия в пробе определяемого соединения его молекулы блокируют активные центры антител как на маркерных частицах, так и в тестовой зоне. Техническим результатом является повышение чувствительности метода. 3 ил.
Description
Изобретение относится к иммунологии и аналитической биохимии и представляет собой способ иммунохроматографического анализа, предназначенный для высокочувствительного выявления в пробах низкомолекулярных аналитов.
Иммунохроматографический анализ для определения различных антигенов может быть реализован в нескольких различных форматах. В аналитических системах с моновалентными антигенами комплексообразование антиген-антитело не регистрируется напрямую. В них реализуются конкурентные схемы анализа. Наиболее распространенным способом реализации конкурентной иммунохроматографии является схема, которая заключается в следующем:
На пористой мембране (как правило, нитроцеллюлозной) иммобилизуют конъюгат антигена с белком-носителем. Участок с нанесенным конъюгатом антигена с белком-носителем называют тестовой или аналитической зоной. На другой участок тест-полоски наносят конъюгат специфических антител с маркером (как правило, коллоидным золотом). Жидкость движется под действием капиллярных сил и смывает коллоидный конъюгат. Меченые антитела начинают с ее фронтом перемещаться по мембране. Если определяемый антиген в пробе отсутствует, то меченые антитела, дойдя до зоны с иммобилизованным антигеном, концентрируются там, образуя окрашенную полосу (Рис. 1, схема А). Присутствующие в пробе антигены блокируют активные центры антител, что делает невозможным их связывание с антигеном в аналитической зоне. Таким образом, отсутствие в тестовой зоне окрашенной полосы свидетельствует о положительном результате анализа (выявлении антигена в концентрации не ниже порогового уровня), тогда как формирование окрашенной полосы означает, что содержание антигена ниже детектируемого уровня. Такой способ конкурентной иммунохроматографии, например, был использован Зверевой и соавт. для определения антибиотика – хлорамфеникола [Zvereva E. A. et al. Cut-off on demand: adjustment of the threshold level of an immunochromatographic assay for chloramphenicol //Analytical Methods. – 2015. – Т. 7. – №. 15. – С. 6378-6384.]. Описанный в статье способ рассматривается в настоящей заявке как прототип.
Предметом изобретения является способ конкурентного иммунохроматографического анализа, в котором специфические антитела против определяемого соединения иммобилизуются и на поверхности маркерных частиц (Ab*) и в тестовой зоне рабочей мембраны (Abi), а конъюгат белка-носителя с несколькими молекулами антигена иммобилизуется на начальном участке теста (PAg). При попадании жидкой пробы на тест-полоску она смешивается сначала с компонентом PAg, затем – с Ab*, в результате чего происходит реакция с образованием комплекса PAg-Ab*. Под действием капиллярных сил компоненты жидкой пробы мигрируют вдоль тест-полоски и в тестовой зоне происходит взаимодействие иммобилизованных антител (Abi) с комплексом PAg-Ab* за счет наличия у PAg нескольких валентностей. В результате этого взаимодействия в тестовой зоне образуется тройной окрашенный комплекс Abi-PAg-Ab*. Образование этого комплекса может происходить и альтернативным путем: Abi вначале взаимодействует с непрореагировавшим PAg, а затем образовавшийся комплекс Abi-PAg вступает в реакцию со свободным конъюгатом Ab*. В случае наличия в пробе определяемого соединения оно взаимодействует с Ab*, блокируя возможность связывания Ab* как с PAg. После достижения фронтом жидкости тестовой зоны аналит также блокирует Abi, дополнительно снижая вероятность образования окрашенного комплекса Abi-PAg-Ab* (Рис. 1, схема Б). Таким образом, в отличие от прототипных методик, в предложенном способе конкурентной иммунохроматографии аналит блокирует не один, а два связывающих реагента, что повышает эффективность конкуренции и снижает предел детекции аналита.
Пример. Иммунохроматографическое конкурентное определение антибиотика – хлорамфеникола
Для изготовления иммунохроматографических тест-систем использовали набор mdi Easypack («Advanced Microdevices», Индия), включающий в себя рабочие нитроцеллюлозные мембраны CNPH90 с размером пор 15 мкм, подложку под конъюгат PT-R5, мембрану для нанесения образца FR1(0.6) и конечную адсорбирующую мембрану AP045.
Конъюгат коллоидного золота с моноклональными антителами против хлорамфеникола (клон B10) наносили на мембраны из раствора с OD520 = 2,0 в количестве 16 мкл на см полосы.
В стандартной схеме конкурентной иммунохроматографии аналитическая зона была образована конъюгатом хлорамфеникола с бычьим сывороточным альбумином (10:1 моль/моль). На 1 см полосы наносили 2 мкл препарата (1,0 мг/мл в 50 мМ фосфатно-солевом буфере pH 7,4).
В альтернативной схеме, которая является предметом разработки, в аналитической зоне иммобилизовали антитела B10 в концентрации 1 мг/мл. На 1 см полосы наносили 2 мкл препарата (1,0 мг/мл в 50 мМ фосфатно-солевом буфере pH 7,4). Конъюгат хлорамфеникола с бычьим сывороточным альбумином наносили на мембрану для нанесения образца из раствора с концентрацией 0,2 мкг/мл и высушивали в течение ночи при комнатной температуре.
После сборки мембранных компонентов их разрезали на полоски шириной 3,5 мм. Каждую полоску упаковывали в ламинированную алюминиевую фольгу с помощью мини-конвейера, используя 0,5 г расфасованного силикагеля в качестве осушителя. Нарезка и упаковка производились при 20–22 ° C в специальной комнате с относительной влажностью не более 30%.
Полученные результаты иммунохроматографического тестирования градуировочных растворов, содержащих известные концентрации хлорамфеникола, представлены на рис. 2 (для прототипного способа) и рис. 3 (для предложенного альтернативного способа). Как видно из представленных данных, предел детекции хлорамфеникола предложенным способом иммунохроматографии (1 нг/мл) на порядок ниже, чем прототипным способом (10 нг/мл), что подтверждает эффективность предложенного подхода.
Claims (1)
- Способ иммунохроматографического конкурентного анализа, отличающийся тем, что специфические антитела против определяемого соединения иммобилизуются и на поверхности маркерных частиц и в тестовой зоне рабочей мембраны; причем образование окрашенного комплекса в тестовой зоне происходит при добавлении конъюгата белка-ностителя с несколькими молекулами аналита за счет поливалентного взаимодействия; а в случае наличия в пробе определяемого соединения его молекулы блокируют активные центры антител как на маркерных частицах, так и в тестовой зоне.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2020132257A RU2748901C1 (ru) | 2020-09-30 | 2020-09-30 | Способ высокочувствительного иммунохроматографического анализа с двойной конкуренцией |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2020132257A RU2748901C1 (ru) | 2020-09-30 | 2020-09-30 | Способ высокочувствительного иммунохроматографического анализа с двойной конкуренцией |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2748901C1 true RU2748901C1 (ru) | 2021-06-01 |
Family
ID=76301273
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2020132257A RU2748901C1 (ru) | 2020-09-30 | 2020-09-30 | Способ высокочувствительного иммунохроматографического анализа с двойной конкуренцией |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2748901C1 (ru) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2853894A1 (en) * | 2013-09-30 | 2015-04-01 | Inmunologia Y Genetica Aplicada, S.A. | Diagnostic kits and immunoassay methods for diagnosis and differentiation of African Swine Fever Virus (ASFV) and Classical Swine Fever Virus (CSFV) |
| RU2016151622A (ru) * | 2016-12-27 | 2018-06-27 | Федеральный исследовательский центр "Фундаментальные основы биотехнологии" Российской академии наук | Способ повышения интенсивности окрашивания иммунохроматографической тест-полоски с использованием неспецифических иммуноглобулинов |
| US10281465B2 (en) * | 2011-11-21 | 2019-05-07 | Abaxis, Inc. | Signal amplification in lateral flow and related immunoassays |
-
2020
- 2020-09-30 RU RU2020132257A patent/RU2748901C1/ru active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10281465B2 (en) * | 2011-11-21 | 2019-05-07 | Abaxis, Inc. | Signal amplification in lateral flow and related immunoassays |
| EP2853894A1 (en) * | 2013-09-30 | 2015-04-01 | Inmunologia Y Genetica Aplicada, S.A. | Diagnostic kits and immunoassay methods for diagnosis and differentiation of African Swine Fever Virus (ASFV) and Classical Swine Fever Virus (CSFV) |
| RU2016151622A (ru) * | 2016-12-27 | 2018-06-27 | Федеральный исследовательский центр "Фундаментальные основы биотехнологии" Российской академии наук | Способ повышения интенсивности окрашивания иммунохроматографической тест-полоски с использованием неспецифических иммуноглобулинов |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ZVEREVA E. A. ET ALL "CUT-OFF ON DEMAND: ADJUSTMENT OF THE THRESHOLD LEVEL OF AN IMMUNOCHROMATOGRAPHIC ASSAY FOR CHLORAMPHENICOL", ANALYTICAL METHODS, V. 7, N 15, PP. 6378-6384, 2015. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2504923B2 (ja) | 免疫学的測定方法 | |
| US6509196B1 (en) | Compensation for non-specific signals in quantitative immunoassays | |
| AU2009264774B2 (en) | Porous solid phase for binding assay, and binding assay method using the same | |
| EP1493029B1 (en) | Sensitive immunochromatographic assay | |
| CN111164095B (zh) | 用于改进分析物检测的测定方法 | |
| EP2350671A1 (en) | System for the quantitative measurement of glycohemoglobin and a method for measuring the content of glycohemoglobin using the same | |
| CZ20002606A3 (cs) | Chromatografické zkušební zařízení pro detekci přítomnosti analyzované složky v krevním vzorku | |
| CA2493616A1 (en) | Rapid diagnostic device, assay and multifunctional buffer | |
| JP2011522228A (ja) | ヒトａｂｏ／ｒｈ／ｍｎ血液型を迅速に判定する方法及びキット | |
| WO2010137807A2 (ko) | 측방 유동 분석 시의 신호 증폭 방법 | |
| KR101157042B1 (ko) | 개선된 측면 이동 면역분석법과 이를 위한 디바이스 | |
| JP6533206B2 (ja) | マイコプラズマ・ニューモニエ検出用免疫クロマト分析装置 | |
| KR960016717B1 (ko) | 검체의 검출방법 및 시약 | |
| KR20120029549A (ko) | 신속한 결과 및 향상된 감도를 갖는 측방 유동 면역 분석 디바이스 | |
| US7067264B2 (en) | Test device for detecting human blood and method of use | |
| KR20110115681A (ko) | 페이퍼 크로마토그래피 및 화학발광법을 이용한 마이크로시스틴 검출방법 및 검출키트 | |
| US20070092978A1 (en) | Target ligand detection | |
| JPH11153600A (ja) | 免疫測定用試験片及び該試験片を用いる測定法 | |
| RU2748901C1 (ru) | Способ высокочувствительного иммунохроматографического анализа с двойной конкуренцией | |
| EP0902287A1 (en) | Formulation for reducing urea effect for immunochromatography assays using urine samples | |
| US7405084B1 (en) | Analytical method using particles and test kit for performing the method | |
| US9201065B2 (en) | Agglutination assay | |
| WO2005069002A1 (en) | Rapid test for antibodies against hiv in urine | |
| JP2000055919A (ja) | 被検物質の検査方法および検査試薬 | |
| WO2018181741A1 (ja) | イムノクロマト試験片およびキットおよび測定方法 |