RU2745187C1 - Способ получения комплекса для тераностики опухолей на основе антистоксовых нанофосфоров и белковых молекул - Google Patents

Способ получения комплекса для тераностики опухолей на основе антистоксовых нанофосфоров и белковых молекул Download PDF

Info

Publication number
RU2745187C1
RU2745187C1 RU2020106668A RU2020106668A RU2745187C1 RU 2745187 C1 RU2745187 C1 RU 2745187C1 RU 2020106668 A RU2020106668 A RU 2020106668A RU 2020106668 A RU2020106668 A RU 2020106668A RU 2745187 C1 RU2745187 C1 RU 2745187C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
nanophosphors
nta
paa
protein
stokes
Prior art date
Application number
RU2020106668A
Other languages
English (en)
Inventor
Евгений Леонидович Гурьев
Евгения Александровна Соколова
Андрей Васильевич Звягин
Original Assignee
Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Национальный исследовательский Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Национальный исследовательский Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского" filed Critical Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Национальный исследовательский Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского"
Priority to RU2020106668A priority Critical patent/RU2745187C1/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2745187C1 publication Critical patent/RU2745187C1/ru

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82B—NANOSTRUCTURES FORMED BY MANIPULATION OF INDIVIDUAL ATOMS, MOLECULES, OR LIMITED COLLECTIONS OF ATOMS OR MOLECULES AS DISCRETE UNITS; MANUFACTURE OR TREATMENT THEREOF
    • B82B3/00—Manufacture or treatment of nanostructures by manipulation of individual atoms or molecules, or limited collections of atoms or molecules as discrete units
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y40/00—Manufacture or treatment of nanostructures
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Manufacturing & Machinery (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Condensed Matter Physics & Semiconductors (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области биомедицины, касается способа получения комплекса для тераностики опухолей на основе антистоксовых нанофосфоров состава NaYF4:Yb,Er/NaYF4и белковых молекул, которой может найти применение при диагностике и терапии опухолей. Способ получения комплекса для тераностики опухолей на основе антистоксовых нанофосфоров конфигурации ядро/оболочка состава NaYF4:Yb,Er/NaYF4и белковых молекул, имеющих остатки гистидина на С-конце молекулы включает модифицикацию полиакриловой кислоты (РАА) нитрилоуксусной кислотой (NTA) путем добавления к РАА крослинкера EDC и NTA-L-lysine с получением продукта PAA-NTA, удаление остатков олеиновой кислоты, имеющихся на поверхности нанофосфоров, с помощью тетрафторбората нитрозила (NOBF4), добавление PAA-NTA с получением нанофосфоров, покрытых PAA-NTA. Затем покрытые PAA-NTA нанофосфоры ресуспендируют в деионизированной воде, к суспензии добавляют раствор хлорида никеля, обрабатывают реакционную смесь ультразвуком и перемешивают. Осаждают нанофосфоры и отмывают деионизированной водой. Ресуспендируют нанофосфоры в растворе рекомбинантного белка, имеющего остатки гистидина на С-конце молекулы, с получением комплексов антистоксовых нанофосфоров с рекомбинантным белком, имеющим остатки гистидина на С-конце молекулы, за счет нековалентного металл-аффинного взаимодействия между ионами никеля и остатками гистидина. Техническим результатом от использования изобретения является повышение контроля сайта присоединения белковой молекулы к поверхности нанофосфора, обеспечивающего сохранение функциональных свойств белка и эффективность итогового комплекса. 2 ил.

Description

Предлагаемое изобретение относится к области биомедицины, касается способа получения комплекса для тераностики опухолей на основе антистоксовых нанофосфоров и белковых молекул, которой может найти применение при диагностике и терапии опухолей.
На сегодняшний день разработка новых методов и подходов для диагностики и терапии патологий, в частности, злокачественных новообразований - одна из наиболее актуальных и активно развивающихся областей биомедицины. При этом стратегическими направлениями в этой области признаны: (1) персонализированный подход, основанный на определении индивидуального молекулярного профиля заболевания каждого конкретного пациента и выборе оптимального метода лечения с учетом полученной информации, 2) интегральный подход к терапии с привлечением различных механизмов воздействия на патологические клетки, 3) тщательный мониторинг проводимого лечения. Данные подходы позволяют существенно повысить эффективность лечения при значительном снижении побочных эффектов, при необходимости следить за ходом лечения и корректировать его.
В последнее десятилетие в рамках персонализированного подхода ключевую роль все больше играет «тераностика» - новое направление, подразумевающее создание мультифункциональных агентов, сочетающих в себе диагностические и терапевтические свойства [McCarthy J.R. The future of theranostic nanoagents // Nanomedicine (Lond). 2009. V.4. 1.7. P. 693-5]. Использование таких агентов позволяет одновременно проводить молекулярную диагностику патологии и специфически направленно воздействовать на опухолевые клетки, а также визуализировать распределение терапевтического агента в организме и оценивать терапевтический эффект. Таким образом, разработка подходов к конструированию соединений для тераностики полностью отвечает современным стратегическим подходам к диагностике и терапии опухолей.
Наиболее перспективной платформой для создания соединений для тераностики представляются наночастицы различной природы, обладающие уникальным набором свойств, привлекательным для получения мультифункциональных биосовместимых комплексов с определенной избирательностью действия. К таким свойствам наночастиц относятся: (1) программируемость физических и химических характеристик в зависимости от размеров, состава и способов получения; (2) наличие химически-активных функциональных групп на поверхности, позволяющие легко модифицировать частицы, оптимизируя их для конкретной задачи; (3) большая площадь поверхности, позволяющая присоединять значительное количество модулей с различными функциями, в том числе направляющих/нацеливающих, терапевтических, визуализирующих; (4) оптимальный размер, определяющий преимущественное накопление наночастиц в опухолевой ткани за счет ее морфологических особенностей (так называемый EPR-эффект [Maeda Н. Tumor-selective delivery of macromolecular drugs via the EPR effect: background and future prospects // Bioconjug Chem. 2010. V.21. 1.5. P. 797-802]). Использование люминесцентных материалов для получения наночастиц открыло возможность создания комплексов с принципиально новыми оптическими свойствами, что дало толчок к развитию методов молекулярного имиджинга - неинвазивного исследования процессов в живых клетках и тканях, в том числе, на уровне целого организма. Ключевой особенностью этих люминесцентных наночастиц являются их фотофизические свойства, обеспечивающие яркую визуализацию маркированных ими структур на фоне сильного рассеяния и собственной аутофлуоресценции биологической ткани [Nadort A. et al. Quantitative imaging of single upconversion nanoparticles in biological tissue // PLoS ONE. 2013. V.8. 1.5. P. е63292]. Среди люминесцентных наночастиц особенно перспективными представляются ап-конверсионные, или антистоксовые, нанофосфоры - неорганические кристаллы NaYF4, легированные ионами иттербия (Yb3+) и солегированный ионами эрбия (Er3+) или тулия (Tm3+). Одной из ключевых особенностей
Figure 00000001
является способность к ап-конверсии - процессу, при котором поглощение фотона с большей длиной волны ведет к эмиссии фотона с меньшей длиной волны (т.е. большей энергией). Это уникальное фотофизическое свойство обеспечивает перспективность применения антистоксовых
Figure 00000001
в биомедицинских приложениях. Спектрально выгодное положение света источника накачки (975 нм) и люминесцентного отклика в окне прозрачности биологической ткани обеспечивают глубокое проникновение света с минимальным поглощением и рассеиванием в живой ткани. При этом возбуждение
Figure 00000001
в инфракрасном спектральном диапазоне сопровождается незначительной автофлуоресценцией биологической ткани. Другой важной отличительной чертой
Figure 00000001
считается продолжительное время жизни люминесценции, измеряемое в миллисекундах, что позволяет реализовать простые оптические схемы отложенной регистрации, способные нивелировать фон автофлуоресценции.
Для придания нанофосфорам специфичности по отношению к конкретной клетке-мишени (направленности действия), а также потенциальной специфической токсичности, необходимо присоединить к наночастице узнающие и токсические молекулы, наиболее перспективными среди которых являются антитела, их фрагменты или альтернативные узнающие белки, и высокоэффективные природные белковые токсины.
Таким образом, разработка методов получения комплексов антистоксовых
Figure 00000001
с белковыми молекулами, обеспечивающих создание высокоэффективных противоопухолевых тераностических агентов, представляется на сегодняшний день крайне актуальной задачей.
Так, из [Grebenik ЕА et al. Specific visualization of tumor cells using upconversion nanophosphors // Acta Naturae. 2014; 6(4): 48-53] известен способ получения комплексов для флуоресцентного маркирования опухолевых клеток на основе антистоксовых
Figure 00000001
и молекул противоопухолевого антитела с использованием системы адапторных белков барназа-барстар, известных своим высоким сродством друг к другу. Способ предполагает (1) покрытие наночастиц антистоксовых
Figure 00000001
сополимером малеинового ангидрида и 1-октадецена (РМАО) для придания частицам гидрофильности, (2) активацию поверхностных карбоксильных групп РМАО с помощью кросслинкеров 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимид гидрохлорида (EDC) и N-гидроксисульфосукцинимида (sulfo-NHS), (3) ковалентную конъюгацию антистоксовых
Figure 00000001
с белком барстаром за счет образования пептидной связи между активированными карбоксильными группами РМАО и аминогруппами в составе барстара, (4) предварительное объединение опухолеспецифичного одноцепочечного антитела 4D5scFv с белком барназой, предполагающее получение генно-инженерной конструкции, кодирующей эти два белка в виде единой полипептидный цепи; (4) сборку комплексов антистоксовых
Figure 00000001
с опухолеспецифичным антителом за счет взаимодействия барстара, конъюгированного с наночастицей, и барназы, объединенной с антителом 4D5scFv. Данный подход имеет ряд недостатков, среди которых необходимость предварительных трудоемких модификаций как исходных наночастиц, так и антитела и, в связи с этим, многостадийность и сложность протокола получения комплексов. Стоит отметить, что химические манипуляции с белками могут привести к потере их функциональных свойств. Кроме того, в данном способе не контролируется сайт присоединения барстара к наночастице, таким образом, белок присоединяется любой из аминогрупп в его составе и оказывается ориентированным в раствор случайным образом. Поскольку для последующего взаимодействия барстара с барназой необходима строго определенная ориентация этих двух белков относительно друг друга, эффективность итоговой сборки комплекса может быть неоптимальной. Наконец, данный способ не приводит к получению комплекса для тераностики опухолей, поскольку содержит только дигностический компонент (люминесцирующий
Figure 00000002
), но не содержит терапевтического (токсического) агента в своем составе.
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к предлагаемому изобретению является способ получения комплексов для тераностики опухолей на основе радиоактивных антистоксовых
Figure 00000001
и молекул противоопухолевого белка таргетного бактериального токсина, известный из [Guryev E.L. et al. Radioactive (90Y) upconversion nanoparticles conjugated with recombinant targeted toxin for synergistic nanotheranostics of cancer // Proc Natl Acad Sci USA. 2018; 115(39): 9690-9695], принятый за ближайший аналог (прототип).
Способ предполагает прямое ковалентное соединение наночастиц с белковыми молекулами и включает: (1) покрытие наночастиц антистоксовых
Figure 00000001
сополимером малеинового ангидрида и 1-октадецена (РМАО) для придания частицам гидрофильности, (2) активацию поверхностных карбоксильных групп РМАО с помощью кросслинкеров 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимид гидрохлорида (EDC) и N-гидроксисульфосукцинимида (sulfo-NHS), (3) ковалентную конъюгацию антистоксовых
Figure 00000001
с белком таргетным бактериальным токсином DARPin-PE40 за счет образования пептидной связи между активированными карбоксильными группами РМАО и аминогруппами в составе DARPin-PE40.
Основным недостатком способа по прототипу является отсутствие контроля сайта присоединения белковой молекулы таргетного токсина DARPin-PE40 к
Figure 00000003
таким образом, белок присоединяется к
Figure 00000003
любой из имеющихся в его составе аминогрупп и оказывается ориентированным в раствор случайным образом. Это может нарушить его функциональные свойства, а именно, эффективное связывание с опухолевой клеткой за счет направляющего модуля DARPin и токсический эффект за счет бактериального токсина РЕ40.
В задачу изобретения положена разработка нового способа получения комплекса для тераностики опухолей на основе антистоксовых
Figure 00000004
и белковых молекул.
Техническим результатом от использования изобретения является повышение контроля сайта присоединения белковой молекулы к поверхности
Figure 00000005
обеспечивающего сохранение функциональных свойств белка и эффективность итогового комплекса.
Поставленная задача достигается тем, что способ получения комплекса для тераностики опухолей на основе антистоксовых
Figure 00000004
и белковых молекул включает покрытие антистоксовых
Figure 00000001
конфигурации ядро/оболочка состава NaYF4:Yb,Er/NaYF4 полиакриловой кислотой, модифицированной нитрилоуксусной кислотой, загрузку поверхности антистоксовых
Figure 00000001
ионами никеля Ni2+ за счет комплексообразования Ni2+ с нитрилоуксусной кислотой, получение комплексов модифицированных таким образом антистоксовых
Figure 00000001
с рекомбинантным белком, имеющим остатки гистидина на С-конце молекулы, за счет нековалентного металл-аффинного взаимодействия между ионами никеля и остатками гистидина.
На фиг. 1 представлена схема процедуры получения комплекса для тераностики опухолей на основе антистоксовых
Figure 00000001
и белковых молекул с использованием нековалентного металл-аффинного взаимодействия между иммобилизованными на поверхности
Figure 00000005
ионами никеля и остатками гистидина на С-конце молекулы белка; (а) - этап модификации полиакриловой кислоты (РАА) нитрилоуксусной кислотой (NTA) с использованием кросслинкера 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимид гидрохлорида (EDC); (б) - этап загрузки ионов никеля (Ni2+) на поверхность антистоксовых
Figure 00000001
(UCNP); (в) - этап получения итоговых комплексов антистоксовых
Figure 00000001
(UCNP-NTA-Ni) с рекомбинантным белком, имеющим остатки гистидина на С-конце молекулы (His-tag).
На фиг. 2 представлены спектры излучения комплексов для тераностики опухолей на основе антистоксовых
Figure 00000001
и молекул флуоресцентного белка KillerRed (а) или mCherry (б), полученных с использованием различных способов сборки: нековалентного металл-аффинного взаимодействия между иммобилизованными на поверхности
Figure 00000005
ионами никеля и остатками гистидина на С-конце молекулы белка, составляющего задачу изобретения; физической адсорбции белка на поверхности
Figure 00000006
; химической ковалентной конъюгации белка с поверхностью
Figure 00000006
. Легенда на графике (а): черная кривая - нековалентное металл-аффинное взаимодействие; красная кривая - физическая адсорбция на частицы, покрытые PAA-NTA; синяя кривая - химическая конъюгация; розовая кривая - физическая адсорбция на частицы, покрытые РАА.
Легенда на графике (б): черная кривая - нековалентное металл-аффинное взаимодействие; красная кривая - физическая адсорбция на частицы, покрытые PAA-NTA; розовая кривая - химическая конъюгация; зеленая кривая - физическая адсорбция на частицы, покрытые РАА.
Реализацию предлагаемого изобретения осуществляли следующим образом.
Полиакриловую кислоту (РАА), модифицировал нитрилоуксусной кислотой (NTA) (фиг. 1а), для этого 216 мг РАА (3 ммоль) растворяли в 15 мл 0.1 М фосфатно-солевого буфера, рН доводили до 5.5 с помощью гидроксида натрия. Затем добавляли 95.85 мг кросслинкера EDC (0.5 ммоль) и 131.13 мг NTA-L-lysine (0.5 ммоль), рН доводили до 5.5. Реакцию проводили при перемешивании в течение 12 ч при комнатной температуре. Продукт реакции PAA-NTA очищали диализом (3500 кДа) против раствора хлорида натрия (рН 5.5) в течение двух суток, и далее против дистиллированной воды в течение трех суток.
В качестве наночастиц использовали антистоксовые нанофосфбры конфигурации ядро/оболочка состава NaYF4:Yb,Er/NaYF4. Поверхность
Figure 00000007
была модифицирована PAA-NTA (фиг. 1б), для этого остатки олеиновой кислоты, имеющиеся на поверхности
Figure 00000007
после завершения процедуры синтеза последних, были удалены с помощью тетрафторбората нитрозила (NOBF4), который впоследствии был замещен на PAA-NTA. Процедуру проводили следующим образом: 25 мг
Figure 00000007
ресуспендировали в 5 мл циклогексана; тетрафторборат нитрозила в количестве 5,84 мг растворяли в 5 мл дихлорметана и смешивали с 5 мл суспензии
Figure 00000007
; смесь инкубировали в течение 10 ч при перемешивании при комнатной температуре, затем
Figure 00000008
осаждали центрифугированием и ресуспендировали в диметилформамиде; к суспензии добавляли смесь толуена и циклогексана (1:1 о/о), что приводило к слипанию частиц; суспензию центрифугировали, ресуспендировали осадок наночастиц в 5 мл диметилформамида, к суспензии добавляли 150 мг PAA-NTA, растворенной в 5 мл диметилформамида, смесь инкубировали в течение 3 ч при 80°С при интенсивном перемешивании; полученную суспензию
Figure 00000009
, покрытых PAA-NTA, трижды отмывали этанолом и трижды денонсированной водой.
Далее загружали поверхность подготовленных таким образом
Figure 00000007
ионами Ni2+ (фиг. 1б). Для этого
Figure 00000008
, покрытые PAA-NTA, в количестве 0,5 мг ресуспендировали в 750 мкл деионизированной воды, к суспензии добавляли 300 мкл раствора хлорида никеля в концентрации 200 мМ, обрабатывали реакционную смесь ультразвуком в течение 10 минут, затем перемешивали в течение еще 50 минут; осаждали
Figure 00000008
центрифугированием и трижды отмывали деионизированной водой.
Затем получали итоговые комплексы антистоксовых
Figure 00000007
(UCNP-NTA-Ni) с рекомбинантным белком, имеющим остатки гистидина на С-конце молекулы (His-tag) (фиг. 1в), в качестве таких белков использовали флуоресцентный белок-фотосенсибилизатор KillerRed или флуоресцентный белок mCherry. Для этого ресуспендировали 0.5 мг подготовленных описанным выше способом
Figure 00000010
в 500 мкл раствора белка KillerRed с концентрацией 250 мкг/мл в фосфатно-солевом буфере или в 500 мкл раствора белка mCherry с концентрацией 250 мкг/мл в фосфатно-солевом буфере, соответственно.
Предлагаемое изобретение работает следующим образом.
Оценка флуоресцентных свойств комплексов антистоксовых
Figure 00000010
с флуоресцентным рекомбинантным белком KillerRed или mCherry, полученных различными способами сборки.
Для оценки эффективности сборки комплексов способом, составляющим задачу изобретения, провели его сравнение с другими известными способами - химической ковалентной конъюгацией белка с поверхностью
Figure 00000011
и физической адсорбцией белка на поверхности
Figure 00000011
.
Для химической ковалентной конъюгации белка KillerRed или mCherry использовали систему кросслинкеров EDC и sulfo-NHS для активации поверхностных карбоксильных групп РАА
Figure 00000010
. Процедуру проводили следующим образом: 0,4 мг EDC растворяли в 500 мкл деионизированной воды, рН доводили соляной кислотой до 5-6; 1,1 мг sulfo-NHS растворяли в 500 мкл деионизированной воды; 0,5 мг
Figure 00000010
, покрытых РАА как описано выше, ресуспендировали в 250 мкл EDC и 250 мкл NHS и инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре, после чего обрабатывали реакционную смесь ультразвуком при охлаждении;
Figure 00000012
затем осаждали центрифугированием и отмывали дважды деионизированной водой; ресуспендировали
Figure 00000012
в 500 мкл раствора белка KillerRed с концентрацией 250 мкг/мл в фосфатно-солевом буфере или в 500 мкл раствора белка mCherry с концентрацией 250 мкг/мл в фосфатно-солевом буфере; инкубировали при +4°С в течение ночи.
Для физической адсорбции белка KillerRed или mCherry ресуспендировали 0,5 мг
Figure 00000007
, покрытых РАА или PAA-NTA как описано выше, в 500 мкл раствора белка KillerRed с концентрацией 250 мкг/мл в фосфатно-солевом буфере или в 500 мкл раствора белка mCherry с концентрацией 250 мкг/мл в фосфатно-солевом буфере; инкубировали при +4°С в течение ночи.
Анализировали полученные тремя способами комплексы антистоксовых
Figure 00000007
с флуоресцентным рекомбинантным белком KillerRed или mCherry путем регистрации спектров излучения флуоресцентных белков KillerRed или mCherry (фиг. 2а и 2б, соответственно). Флуоресценцию данных белков возбуждали при длине волны 585 нм или 587 нм, соответственно; регистрацию сигнала флуоресценции проводили в диапазоне длин волн 590-750 нм или 600-750 нм, соответственно. На приведенных графиках (фиг. 2) видно, что комплексы, полученным способом нековалентного металл-аффинного взаимодействия между иммобилизованными на поверхности
Figure 00000011
ионами никеля и остатками гистидина на С-конце молекулы белка, составляющего задачу изобретения, демонстрируют значительно большую интенсивность флуоресценции белка KillerRed (фиг. 2а) или mCherry (фиг. 2б), по сравнению с комплексами, полученными способами физической адсорбции белка на поверхности
Figure 00000011
и химической ковалентной конъюгации белка с поверхностью
Figure 00000011
с использованием кросслинкеров, что свидетельствует о сохранении функциональным свойств присоединяемого к наночастице белка, в данном случае - флуоресценции.
Таким образом, способ получения комплексов антистоксовых
Figure 00000007
с белком на основе нековалентного металл-аффинного взаимодействия между иммобилизованными на поверхности
Figure 00000011
ионами никеля и остатками гистидина на С-конце молекулы белка, составляющий задачу изобретения, приводит к сохранению функциональной активности белка. Этот способ позволяет получать комплексы антистоксовых
Figure 00000007
с рекомбинантными белками различной функциональности, имеющими олигогистидиновую последовательность в заданном месте молекулы - направляющими (специфически связывающимися с определенными молекулами на поверхности опухолевой клетки и обеспечивающими адресование комплекса к целевым клеткам), флуоресцирующими (обеспечивающими визуализацию комплекса в клетках и органах) и токсическими (рекомбинантными токсинами различного происхождения и механизма действия, белковыми фотосенсибилизаторами, уничтожающими опухолевую клетку). Как известно, в состав многих рекомбинантных белков введена последовательность из шести остатков гистидина на С-конце молекулы (так называемый «гистидиновый хвост»), необходимая для процедуры выделения и очистки (получения) рекомбинантного белка. Таким образом, дополнительные модификации белковой молекулы для ее последующего присоединения к
Figure 00000013
с целью получения многофункционального комплекса для тераностики не требуются. Поскольку расположение «гистидинового хвоста» на С-конце молекулы белка строго задано, то его использование как места присоединения белка к поверхности антистокового
Figure 00000011
обеспечивает контроль сайта присоединения и строго определенную ориентацию присоединенного к частице белка в пространстве. Это, в свою очередь, обеспечивает сохранение функциональной активности присоединенного белка. Эффективность итогового комплекса определяется, в частности, функциональной активностью присоединенных к
Figure 00000013
белков, что лежит в основе создания многофункциональных агентов для тераностики опухолей.

Claims (1)

  1. Способ получения комплекса для тераностики опухолей на основе антистоксовых
    Figure 00000014
    конфигурации ядро/оболочка состава NaYF4:Yb,Er/NaYF4 и белковых молекул, имеющих остатки гистидина на С-конце молекулы, включает модификацию полиакриловой кислоты (РАА) нитрилоуксусной кислотой (NTA) путем добавления к РАА крослинкера EDC и NTA-L-lysine с получением продукта PAA-NTA, удаление остатков олеиновой кислоты, имеющихся на поверхности нанофосфоров, с помощью тетрафторбората нитрозила (NOBF4), добавление PAA-NTA с получением нанофосфоров, покрытых PAA-NTA, после чего покрытые PAA-NTA нанофосфоры ресуспендируют в деионизированной воде, к суспензии добавляют раствор хлорида никеля, обрабатывают реакционную смесь ультразвуком и перемешивают, осаждают нанофосфоры и отмывают деионизированной водой, ресуспендируют нанофосфоры в растворе рекомбинантного белка, имеющего остатки гистидина на С-конце молекулы, с получением комплексов антистоксовых нанофосфоров с рекомбинантным белком, имеющим остатки гистидина на С-конце молекулы, за счет нековалентного металл-аффинного взаимодействия между ионами никеля и остатками гистидина.
RU2020106668A 2020-02-11 2020-02-11 Способ получения комплекса для тераностики опухолей на основе антистоксовых нанофосфоров и белковых молекул RU2745187C1 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2020106668A RU2745187C1 (ru) 2020-02-11 2020-02-11 Способ получения комплекса для тераностики опухолей на основе антистоксовых нанофосфоров и белковых молекул

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2020106668A RU2745187C1 (ru) 2020-02-11 2020-02-11 Способ получения комплекса для тераностики опухолей на основе антистоксовых нанофосфоров и белковых молекул

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2745187C1 true RU2745187C1 (ru) 2021-03-22

Family

ID=75159133

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2020106668A RU2745187C1 (ru) 2020-02-11 2020-02-11 Способ получения комплекса для тераностики опухолей на основе антистоксовых нанофосфоров и белковых молекул

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2745187C1 (ru)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2544094C2 (ru) * 2012-12-29 2015-03-10 Общество с ограниченной ответственностью "Митрель-Люмитек" Способ интраоперационной визуализации патологических очагов
RU2611653C1 (ru) * 2015-12-23 2017-02-28 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Национальный исследовательский Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского" Композиция для визуализации и повреждения клеток-мишеней
US20180208688A1 (en) * 2017-01-20 2018-07-26 City University Of Hong Kong Method for surface modification of nanoparticles
RU2699071C1 (ru) * 2019-04-16 2019-09-03 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "МИРЭА - Российский технологический университет" Новый полиэтиленгликольсодержащий глицеролипид

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2544094C2 (ru) * 2012-12-29 2015-03-10 Общество с ограниченной ответственностью "Митрель-Люмитек" Способ интраоперационной визуализации патологических очагов
RU2611653C1 (ru) * 2015-12-23 2017-02-28 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Национальный исследовательский Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского" Композиция для визуализации и повреждения клеток-мишеней
US20180208688A1 (en) * 2017-01-20 2018-07-26 City University Of Hong Kong Method for surface modification of nanoparticles
RU2699071C1 (ru) * 2019-04-16 2019-09-03 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "МИРЭА - Российский технологический университет" Новый полиэтиленгликольсодержащий глицеролипид

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Миронова Кристина Евгеньевна "Иммунофотосенсибилизаторы на основе рибофлавина и апконвертирующих нанофосфоров для фотоиндуцированного разрушения раковых клеток", Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук, Москва, 2015. *
Миронова Кристина Евгеньевна "Иммунофотосенсибилизаторы на основе рибофлавина и апконвертирующих нанофосфоров для фотоиндуцированного разрушения раковых клеток", Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук, Москва, 2015. Смышляева А. С., Гурьев Е. Л и др. "Создание тераностических нанокомплексов на основе антистоксовых нанофосфоров и бифункциональных белков", Сборник тезисов 23-й Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых "БИОЛОГИЯ - НАУКА XXI ВЕКА" 15-19 апреля 2019, г. Пущино. *
Смышляева А. С., Гурьев Е. Л и др. "Создание тераностических нанокомплексов на основе антистоксовых нанофосфоров и бифункциональных белков", Сборник тезисов 23-й Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых "БИОЛОГИЯ - НАУКА XXI ВЕКА" 15-19 апреля 2019, г. Пущино. *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Liu et al. Recent advances of AIE light-up probes for photodynamic therapy
US20220296714A1 (en) Targeted nano-photomedicines for photodynamic therapy of cancer
Han et al. Upconversion nanoparticles/hyaluronate–rose bengal conjugate complex for noninvasive photochemical tissue bonding
Jeong et al. Photosensitizer-conjugated human serum albumin nanoparticles for effective photodynamic therapy
Cui et al. In vivo targeted deep-tissue photodynamic therapy based on near-infrared light triggered upconversion nanoconstruct
JP5815990B2 (ja) 複合粒子、光音響イメージング用造影剤、および前記複合粒子の製造方法
Mao et al. Biology-oriented design strategies of AIE theranostic probes
US8709383B2 (en) Persistent luminescence nanoparticles used in the form of a diagnosis agent for in vivo optical imaging
US10946109B2 (en) Polymer-type fluorescent molecule probe
Meng et al. Aggregation-induced emission photosensitizer-based photodynamic therapy in cancer: from chemical to clinical
US9095613B2 (en) Photosensitizer-metal nanoparticle charge complex and composition containing the complex for photodynamic therapy or diagnosis
Tian et al. Construction of lanthanide-doped upconversion nanoparticle-Uelx Europaeus Agglutinin-I bioconjugates with brightness red emission for ultrasensitive in vivo imaging of colorectal tumor
Zhang et al. Multimodal upconversion nanoplatform with a mitochondria-targeted property for improved photodynamic therapy of cancer cells
Fu et al. A tumor-targeting Ru/polysaccharide/protein supramolecular assembly with high photodynamic therapy ability
Alexander et al. Galactosyl human serum albumin-NMP1 conjugate: a near infrared (NIR)-activatable fluorescence imaging agent to detect peritoneal ovarian cancer metastases
KR101419254B1 (ko) 효소 반응성 그라핀 옥사이드/생체 고분자-광감각제 나노복합체 및 이를 포함하는 형광 영상 진단 또는 광역학/광열 치료용 조성물
Zhang et al. pH-driven targeting nanoprobe with dual-responsive drug release for persistent luminescence imaging and chemotherapy of tumor
KR102112269B1 (ko) 글루타치온―ｓ―전이효소 및 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질을 포함하는 융합 단백질 및 이의 용도
Yang et al. Magainin II modified polydiacetylene micelles for cancer therapy
Shipunova et al. Artificial scaffold polypeptides as an efficient tool for the targeted delivery of nanostructures in vitro and in vivo
Deyev et al. Targeted bifunctional proteins and hybrid nanoconstructs for cancer diagnostics and therapies
Deyev et al. Supramolecular agents for theranostics
RU2745187C1 (ru) Способ получения комплекса для тераностики опухолей на основе антистоксовых нанофосфоров и белковых молекул
JP2016179946A (ja) 近赤外色素結合トランスフェリン、前記近赤外色素結合トランスフェリンを有する光音響イメージング用造影剤
KR101093549B1 (ko) 질환의 진단을 위한 표적 펩타이드가 결합된 양친성 키토산나노입자 조영제

Legal Events

Date Code Title Description
QB4A Licence on use of patent

Free format text: LICENCE FORMERLY AGREED ON 20210713

Effective date: 20210713