RU2729403C1 - Рекомбинантная плазмида pET32-Trex Vic, обеспечивающая синтез химерного белка прохимозина Vicugna pacos, и штамм Escherichia coli BL21(DE3)pLysE pET32-Trx Vic-продуцент химерного белка прохимозина Vicugna pacos - Google Patents
Рекомбинантная плазмида pET32-Trex Vic, обеспечивающая синтез химерного белка прохимозина Vicugna pacos, и штамм Escherichia coli BL21(DE3)pLysE pET32-Trx Vic-продуцент химерного белка прохимозина Vicugna pacos Download PDFInfo
- Publication number
- RU2729403C1 RU2729403C1 RU2019117249A RU2019117249A RU2729403C1 RU 2729403 C1 RU2729403 C1 RU 2729403C1 RU 2019117249 A RU2019117249 A RU 2019117249A RU 2019117249 A RU2019117249 A RU 2019117249A RU 2729403 C1 RU2729403 C1 RU 2729403C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- prochymosin
- recombinant
- vicugna pacos
- protein
- pet32
- Prior art date
Links
- 108010064037 prorennin Proteins 0.000 title claims abstract description 75
- 241001416177 Vicugna pacos Species 0.000 title claims abstract description 46
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims abstract description 34
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 22
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 21
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 title claims abstract description 14
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title claims abstract description 14
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 title claims abstract description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 41
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 26
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 24
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 21
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 19
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 18
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 16
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 108060008226 thioredoxin Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims abstract description 10
- 102000002933 Thioredoxin Human genes 0.000 claims abstract description 9
- 229940094937 thioredoxin Drugs 0.000 claims abstract description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 7
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 claims abstract description 4
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims abstract description 4
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 claims abstract description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 7
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 6
- 241000701867 Enterobacteria phage T7 Species 0.000 claims description 5
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 3
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 claims description 2
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 claims description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 11
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 abstract description 4
- 241000701832 Enterobacteria phage T3 Species 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 108090000746 Chymosin Proteins 0.000 description 41
- 229940080701 chymosin Drugs 0.000 description 30
- GNOLWGAJQVLBSM-UHFFFAOYSA-N n,n,5,7-tetramethyl-1,2,3,4-tetrahydronaphthalen-1-amine Chemical compound C1=C(C)C=C2C(N(C)C)CCCC2=C1C GNOLWGAJQVLBSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 19
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 18
- 241000282836 Camelus dromedarius Species 0.000 description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 description 16
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 15
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 14
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 14
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 13
- 108010058314 rennet Proteins 0.000 description 11
- 229940108461 rennet Drugs 0.000 description 11
- 238000001994 activation Methods 0.000 description 9
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 9
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 9
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 9
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 7
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 108010062466 Enzyme Precursors Proteins 0.000 description 6
- 102000010911 Enzyme Precursors Human genes 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 6
- 244000309466 calf Species 0.000 description 6
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 6
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 5
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 5
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 5
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 5
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 5
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 5
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 5
- 101000914103 Bos taurus Chymosin Proteins 0.000 description 4
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 4
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 4
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 4
- 108010005090 rennin-like enzyme (Aspergillus ochraceus) Proteins 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 3
- 241001416153 Bos grunniens Species 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 3
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 239000000701 coagulant Substances 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 2
- 102000011632 Caseins Human genes 0.000 description 2
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 235000019687 Lamb Nutrition 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 240000002129 Malva sylvestris Species 0.000 description 2
- 235000006770 Malva sylvestris Nutrition 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 description 2
- 241000283011 Rangifer Species 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 102100036407 Thioredoxin Human genes 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 2
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 2
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OJHZNMVJJKMFGX-RNWHKREASA-N (4r,4ar,7ar,12bs)-9-methoxy-3-methyl-1,2,4,4a,5,6,7a,13-octahydro-4,12-methanobenzofuro[3,2-e]isoquinoline-7-one;2,3-dihydroxybutanedioic acid Chemical compound OC(=O)C(O)C(O)C(O)=O.O=C([C@@H]1O2)CC[C@H]3[C@]4([H])N(C)CC[C@]13C1=C2C(OC)=CC=C1C4 OJHZNMVJJKMFGX-RNWHKREASA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100036826 Aldehyde oxidase Human genes 0.000 description 1
- 108010017640 Aspartic Acid Proteases Proteins 0.000 description 1
- 102000004580 Aspartic Acid Proteases Human genes 0.000 description 1
- 240000006439 Aspergillus oryzae Species 0.000 description 1
- 235000002247 Aspergillus oryzae Nutrition 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 108010059378 Endopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000005593 Endopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 description 1
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 101000928314 Homo sapiens Aldehyde oxidase Proteins 0.000 description 1
- 241001138401 Kluyveromyces lactis Species 0.000 description 1
- 241001099157 Komagataella Species 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 101100412856 Mus musculus Rhod gene Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 108010014475 Pepsinogens Proteins 0.000 description 1
- 102000023022 Pepsinogens Human genes 0.000 description 1
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 102000006010 Protein Disulfide-Isomerase Human genes 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 210000003165 abomasum Anatomy 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 1
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 1
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 1
- 235000020054 awamori Nutrition 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 235000014121 butter Nutrition 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000020248 camel milk Nutrition 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- 230000001112 coagulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000001687 destabilization Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 125000002228 disulfide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000006916 nutrient agar Substances 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 238000005192 partition Methods 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 108020003519 protein disulfide isomerase Proteins 0.000 description 1
- 230000012846 protein folding Effects 0.000 description 1
- 230000030788 protein refolding Effects 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000001953 sensory effect Effects 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
- 235000021246 κ-casein Nutrition 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/64—General methods for preparing the vector, for introducing it into the cell or for selecting the vector-containing host
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6478—Aspartic endopeptidases (3.4.23)
- C12N9/6483—Chymosin (3.4.23.4), i.e. rennin
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Группа изобретений относится к рекомбинантной плазмиде pET32-TrexVic, обеспечивающей синтез химерного белка прохимозина Vicugna pacos, а также рекомбинантному штамму Escherichia coli, продуцирующему указанный белок. Рекомбинантная плазмида pET32-TrexVic имеет размер 6826 пар оснований (п.о.) и обеспечивает синтез химерного белка прохимозина Vicugna pacos размером 52 кДа в клетках Escherichia coli BL21(DE3)pLysE. Плазмида содержит следующие существенные для ее функционирования и экспрессии целевого белка структурные элементы: промотор бактериофага Т7, рекомбинантный ген прохимозина Vicugna pacos, кодирующий целевой химерный белок, терминатор РНК-полимеразы фага Т7, последовательность тиоредоксина, добавленную в состав нуклеотидной последовательности гена прохимозина Vicugna pacos на N-конец, последовательность bla (AmpR), кодирующую белок бета-лактамазу, последовательность ColE1 (ori), обеспечивающую репликацию плазмиды в штаммах Е. coli. При этом рекомбинантный ген белка прохимозина Vicugna pacos имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1 от нуклеотида в положении 5209 п.о. до нуклеотида в положении 6649 п.о., кодирующий целевой химерный белок прохимозин Vicugna pacos с полной аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2, встроенный по сайтам рестрикции FauND I и HindIII в область полилинкера вектора рЕТ32а, содержащего промотор и терминатор РНК-полимеразы фага Т7. Предложен также штамм Escherichia coli BL21(DE3)pLysE/pET32-TrxVic, продуцирующий химерный белок прохимозина Vicugna pacos и полученный трансформацией рекомбинантной плазмидой pET32-TrexVic. Группа изобретений обеспечивает высокую скорость рефолдинга целевого фермента. 2 н.п. ф-лы, 5 ил., 2 табл., 5 пр.
Description
Изобретение относится к генетической конструкции (плазмиде), обеспечивающей синтез химерного белка - прохимозина (ПроХн) альпака (Vicugna pacos), который, после активации и превращения в активный фермент - химозин (Хн) - предназначен для коагуляции молока при изготовлении любых видов сычужных сыров и рекомбинантному штамму Е. coli - продуценту химерного белка ПроХн, который, после активации и превращения в Хн, может быть использован в биотехнологии и пищевой промышленности.
Традиционно, для производства сыров используется сычужный фермент (СФ), препарат, получаемый из сычугов телят-молокопоек, основным действующим агентом которого является аспартатная эндопептидаза - химозин (ЕС 3.4.23.4) [1]. Химозин (Хн) коровы гидролизуют ключевую пептидную связь - Phe105-Met106 - в молекуле каппа-казеина, что приводит к дестабилизации казеиновых мицелл и образованию сычужного сгустка. До недавнего времени, по совокупности технологических свойств, коровий химозин (Хн) считался эталонным молокосвертывающим ферментом (МФ) для сыроделия [1, 2].
Химозин коровы состоит из 323 аминокислотных остатков, с низким содержанием основных R-групп. В молекуле химозина имеются три дисульфидных мостика: Cys45-Cys50, Cys206-Cys210, Cys249-Cys282. [3]. В рибосомах фермент транслируется в виде неактивного предшественника (прекурсора) с молекулярной массой (ММ) ~43,0 кД, -препрохимозина. Пре-фрагмент или сигнальный пептид, состоит из 16 аминокислотных остатков. В процессе трансляции мРНК, сигнальный пептид, внедряется в мембрану эндоплазматического ретикулума (ЭПР) и "протаскивает" за собой молекулу препрохимозина. После проникновения во внутреннее пространство ЭПР сигнальный пептид элиминируется и прекурсор превращается в прохимозин. Прохимозин (ПроХн) - неактивный предшественник (зимоген) химозина, полипептид с ММ 40,8 кД, который состоит из 365 аминокислотных остатков. Про-фрагмент состоит из 42 аминокислотных остатков и блокирует активный центр фермента, что создает стерическое препятствие для контакта с молекулами субстрата и обеспечивает ферментативную неактивность зимогена. Кроме ингибирующего действия, про-фрагмент играет важную роль в процессе фолдинга и стабилизации третичной структуры ПроХн [4]. Образование активного фермента происходит по механизму аутокаталитической активации. При кислых значениях рН с N-терминального участка молекулы прохимозина элиминируется фрагмент из 42 аминокислот, что приводит к образованию химозина (ММ=35,6 кД) [5].
В связи с постоянным ростом производства сыров, начиная с середины 20 века, во всем мире ощущается острый дефицит СФ [2]. Проблема дефицита сырья для получения препаратов натурального Хн коровы инициировала поиски его заменителей. Было найдено несколько натуральных МФ (прежде всего, речь идет о Хн верблюда и северного оленя), способных составить конкуренцию Хн коровы, но их промышленное получение не было осуществлено из-за отсутствия достаточной сырьевой базы [6-10].
Современной альтернативой натуральному химозину коровы являются его генноинженерные аналоги [11-20]. Методы генной инженерии позволяют получать молокосвертывающие протеазы любых видов млекопитающих, не ограничиваясь только теми видами животных, которые широко используются в сельскохозяйственной практике человека.
Первое сообщение о получении рекомбинантного химозина (рХн) коровы в системе экспрессии Escherichia coli, появилось в 1980 году, в работе Uchiyama et al. [13]. В период с 1980 по 2019 год были получены рекомбинантные химозины коровы [12,13], овцы [14, 15], козы [16] одногорбого верблюда [17], яка [11], буйвола [18, 19], альпака [20]. Большинство этих ферментов, по совокупности технологических характеристик, не могут сравниться с химозином коровы. Исключением является рХн одногорбого верблюда, который по удельной молокосвертывающей активности (МА) и специфичности (соотношению МА и общей протеолитической активности (ПА)) превосходит Хн коровы, но уступает ему по термостабильности [17, 21]. На сегодняшний день, в сыроделии "эталонными" считаются два МФ - Хн коровы и Хн верблюда - причем, в коммерческом варианте оба выпускаются в виде генно-инженерных ферментов. Открытие и внедрение в сыродельную практику рХн верблюда позволяет предполагать, что в природе существуют и другие МФ, которые превосходят Хн коровы и одногорбого верблюда по технологическим свойствам. Этот факт является предпосылкой для поиска новых рекомбинантных коагулянтов молока не коровьего происхождения.
Последовавшие вслед за работой Uchiyama et al. [13] попытки синтеза коровьего прохимозина в Е. coli столкнулись с целым рядом трудностей, главными из которых были проблемы, связанные обеспечением эффективного рефолдинга целевого белка [22-24]. В системе экспрессии Е. coli рекомбинантый прохимозин (рПроХн) накапливается в виде внутриклеточных телец включения. Нерастворимая форма прохимозина предполагает его выделение и растворение в денатурирующих условиях (8 М мочевина), с последующей ренатурацией и получением зимогена с корректной конформацией, для проведения активации и получения Хн, обладающего МА [25]. Неэффективное восстановление "правильной" пространственной структуры рПроХн, приводит к снижению выхода активного Хн.
Проблема рефолдинга эукариотических белков, синтезированных в прокариотической системе экспрессии, не решена и в настоящее время. По-прежнему актуальной задачей является создание процедуры рефолдинга, обеспечивающей формирование корректной вторичной и третичной структуры рекомбинантных Cys-содержащих зимогенов и активных ферментов, в том числе рХн. [26, 27]. Для повышения эффективности рефолдинга рПроХн, получаемого из телец включения, предпринимались попытки использовать фермент дисульфидизомеразу и шаперон GroE [27, 28] которые не дали желаемого результата. Также была апробирована процедура окислительного восстановления [29] и, так называемые, "водные двухфазные системы" [30]. Однако и эти методические приемы привели лишь к частичному увеличению выхода активного химозина.
Одним из путей "обхода" проблемы рефолдинга гетерологичных белков, синтезируемых в прокаритотических системах экпрессии, является использование эукариотических продуцентов, например Aspergillus niger [12, 17]. В последние годы для получения экспериментальных препаратов рХн все чаще используются дрожжевые системы экспрессии на основе организмов рода Komagataella (ранее - Pichia) [11, 18, 19, 31]. Эти системы экспрессии работают под контролем мощного промотора АОХ1, но их существенным недостатком является необходимость использования метанола в качестве индуктора. Успех решения задачи производства рХн в эукаритах во многом зависит не только от выбора продуцента, но и "комплементарности" его системы экспрессии генетическому материалу целевого белка. Так, например, в Aspergillus oryzae, используя промотор альфа-амилазы продуцента, не удалось добиться продукции рХн больше 10 мг/л, тогда как протеаза Rhisomucor, в этой же системе, экспрессировалась на уровне 3000 мг/л [32].
Для большого сегмента научно-исследовательских и скриннинговых работ, использование хорошо изученных и простых прокариотических систем экспрессии предпочтительнее и намного выгоднее, чем получение стабильных эукариотических продуцентов, поэтому разработка методических подходов и приемов эффективного рефолдинга рекобинантных белков и, в частности, рПроХн, получаемого в системе E.coli, по-прежнему актуальна.
Известна заявка на изобретение (US 2002/0164696, A1, С12Р, 21/02, C12N, 5/06, опубл. 07.11.2002 г. ) [33] в котором описан способ получения химозина верблюда и других химозинов не коровьего происхождения. Для этого ген химозина верблюда был встроен в плазмиду pGAMpR, с последующей трансформацией Aspergillus niger var. Awamori штамм dgr246pyrG. Авторы заявляют, что использование рекомбинантного химозина верблюда позволяет получать молоксвертывающий фермент с улучшенными по сравнению с химозином коровы свойствами.
Недостатком данного изобретения может быть то, что авторы для экспрессии гена химозина используют систему Aspergillus niger. Несмотря на известные достоинства этой системы для получения белков млекопитающих, в первую очередь наличия системы гликозилирования, до сих пор не описаны универсальные и «сильные» промоторы обеспечивающие стабильные и высокие выходы целевого белка. Авторы показывают динамику роста активности культуральной среды в ходе культивирования рекомбинантного штамма содержащего ген химозина верблюда. Поскольку в патенте не охарактеризован выход целевого продукта, невозможно понять: является ли этот рост отражением накопления активного фермента или он обусловлен процессом рефолдинга рХн, оценить это в данном изобретении не предоставляется возможным, т.к. не описан выход целевого продукта.
Еще одним недостатком генетической конструкции данного изобретения может быть то, что авторы используют природный ген Camelus dromedarius. Из-за отличий в механизмах транскрипции, трансляции и посттрансляционных модификаций (высших и низших эукариот), при переносе гетерологичного гена в систему экспрессии организма-реципиента выход продукта и его стабильность может значительно снизиться [34, 35]. В нашем изобретении проведена оптимизация последовательности гена для экспрессии в организме продуцента.
Наиболее близким аналогом (прототипом) является препарат рекомбинантного химозина и способ его получения (заявка США №20070166785, А1, МПК С12Р 21/06, С07Н 21/04, опубл. 19.07.2007 г.) [36]. В данном изобретении описывается получение рекомбинантного прохимозина Bos taurus в системе Escherichia coli, которое включает стадию амплификации природного гена прохимозина Bos taurus, его встройку в экспрессионный вектор pET21b, трансформацию полученной рекомбинантной плазмидой клеток Е. coli, культивирование рекомбинантного штамма Е. coli для получения прохимозина, превращение указанного прохимозина в химозин. В патенте представлены протоколы культивирования штамма-продуцента и методы очистки, ренатурации и активации прохимозина.
Недостатком конструкции и продуцента на основе Е. coli, является необходимость проведения процесса рефолдинга рекомбинантного химозина, обеспечивающего формирование активного фермента. Этот процесс, связанный с восстановление природной структуры белка, требует значительных временных затрат и существенно осложняет работу.
В заявляемом техническом решении проведен инжиниринг структуры прохимозина, в состав которого включен белок тиоредоксин. Этот белок обладает шаперонной активностью, а так же способен катализировать реакции дисульфидного обмена в белках. Благодаря этому удается увеличить эффективность процесса рефолдинга целевого белка.
Техническим результатом заявленного изобретения является создание химерной генетической конструкции "прохимозин-тиоредоксин", а на ее основе - рекомбинантного штамма Escherichia coli - продуцента прохимозина (Vicugna pacos), который обеспечивает высокую скорость рефолдинга целевого фермента.
Указанный технический результат достигается созданием рекомбинантной плазмиды pET32-TrxVic размером 6826 пар оснований (п.о.), характеризующейся физической и генетической картой, представленной на фиг. - 3, обеспечивающей синтез химерного белка прохимозина Vicugna pacos размером 52 кДа в клетках Escherichia coli BL21(DE3)pLysE, содержащей рекомбинантный ген химерного белка прохимозина Vicugna pacos, имеющей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1 от нуклеотида в положении 5209 п. о. до нуклеотида в положении 6649 п. о., кодирующей целевой химерный белок прохимозин Vicugna pacos с полной аминокислотной последовательностью SEQ ID N0:2, встроенный по сайтам рестрикции FauND I и HindIII в область полилинкера вектора рЕТ32а, содержащего промотор и терминатор РНК-полимеразы фага Т7.
Указанный технический результат достигается также созданием рекомбинантного штамма Escherichia coli BL21(DE3)pLysE/pET32-TrxVic - продуцента химерного белка прохимозина Vicugna pacos E.coli, полученного трансформацией рекомбинантной плазмидой pET32-TrexVic по п. 1.
Заявляемый штамм Escherichia coli BL21(DE3)pLys/pET32-TrxVic - продуцент рекомбинантного прохимозина Vicugna pacos, обеспечивающего (после активации и превращения в активный рХн) специфический гидролиз пептидной связи Phe105-Met106 в молекуле к-казеина и предназначенного для выработки любых сычужных сыров, получают следующим образом.
При разработке штамма продуцента рекомбинантного прохимозина, была выбрана последовательность Vicugna pacos. Выбор последовательности прохимозина, а не препрохимозина или химозина объяснятся следующим. Химозин синтезируется в организме животных в форме препрохимозина. Препрохимозин - белок, состоящий из 365 аминокислотных остатков, 16 из которых являются гидрофобной лидерной последовательностью, которая играет важную роль в секреции химозина через клеточную мембрану [4], для экспрессии в прокариотической системе она не требуется. В проведенных ранее исследованиях было установлено, что экспрессия зрелого химозина ведет к наработке продукта, не обладающего молокосвертывающей активностью (МА) [37].
Для обеспечения высокого и стабильного выхода целевого продукта была проведена оптимизация кодонного состава выбранной последовательности прохимозина Vicugna pacos для экспрессии в E.coli. В ходе теоретического дизайна проведена замена кодонов, используемых в клетках эукариот на кодоны, используемые прокариотами. В состав нуклеотидной последовательности гена на N-конец добавлена последовательность белка-шаперона тиоредоксина (фиг. 1). Оптимизированная последовательность была синтезирована.
В качестве вектора экспрессии выбрана плазмида рЕТ32а. После клонирования синтезированной последовательности в составе вектора, полученной рекомбинантной плазмидой была проведена трансформация бактериальных клеток Neb stable для наработки плазмидной ДНК.
В качестве продуцента выбран штамм E.coli BL21(DE3)pLysE. Выбор штамма-реципиента обусловлен тем, что он несет ген РНК-полимеразы фага Т7, которая необходима для обеспечения эффективной транскрипции целевых генов, находящихся в векторной конструкции под контролем промотора фага Т7, а также тем, что данный штамм дефектен по синтезу протеаз, что существенно повышает выход синтезируемых гетерологичных белков.
При культивировании штамм E.coli BL21(DE3)pLysE/pET32-TrxVic, обеспечивает синтез химерного прохимозина Vicugna pacos на уровне 40% от общего бактериального белка.
Благодаря добавлению последовательности тиоредоксина удается увеличить эффективность процесса рефолдинга прохимозина Vicugna pacos.
Изобретение иллюстрируется следующими графическими фигурами. На фиг. 1 приведена нуклеотидная последовательность гена химерного белка прохимозина TrxVic. На фиг. 2 представлена структура аминокислотной последовательности химерного белка тиоредоксин-прохимозина Vicugna pacos. На фиг. 3 изображена физическая и генетическая карта рекомбинантной плазмиды pET32-TrexVic, содержащая последовательность химерного белка прохимозина Vicugna pacos. На фиг. 5 представлена фотография электрофоретического разделения препарата химерного белка прохимозина Vicugna pacos в ПААГ. 1 - образец химерного рекомбинантного химозина Vicugna pacos включающего последовательность тиоредоксина (получен с использованием заявляемой плазмиды и штамма-продуцента), 2 - образец рекомбинантного прохимозина Vicugna pacos (без тиоредоксина), 3 - образец рекомбинантного прохимозина В Bos taurus, М -маркер молекулярной массы.
Для лучшего понимания сущности предлагаемого изобретения ниже приведены примеры его осуществления. Все стандартные генно-инженерные и микробиологические манипуляции, а также амплификацию и секвенирование ДНК проводили по известным методикам [38].
Пример 1. Синтез, встройка и анализ фрагмента ДНК, включающего полную кодирующую последовательность гена прохимозина альпака слитого с последовательностью белка тиоредоксина (Trx).
Заявляемая плазмида содержит следующие, существенные для ее функционирования и экспрессии целевого белка, структурные элементы:
- нуклеотидную последовательность белка тиоредоксина (Trx) для коэкспрессии слитых белков
- промотор бактериофага Т7, обеспечивающий эффективную транскрипцию контролируемой мРНК; нетранслируемую область терминации транскрипции бактериального оперона, терминатор РНК-полимеразы фага Т7, обеспечивающий эффективное окончание транскрипции;
- бактериальный оперон bla (AmpR), кодирующий белок бета-лактамазу, являющуюся селективным маркером для трансформации штаммов Е. coli;
- бактериальный участок инициации репликации типа ColE1 (ori), обеспечивающий репликацию плазмиды в штаммах Е. coli.
Выбранная нуклеотидная последовательность гена прохимозина альпака ХР_006197500.1 была синтезирована на автоматическом синтезаторе ABI 3400 DNA/RNA Synthesizer. Синтезированный ген был клонирован в составе клонирующего вектора pGH («ДНК синтез», г. Москва). Для амплификации гена прохимозина альпака проводили ПЦР с использованием олигонуклеотидных праймеров, содержащих сайты гидролиза для последующей встройки продукта реакции в экспрессионный вектор: Trx_Vic_F (содержащий сайт Msp20I) и Trx_Vic_R (содержащий сайт HindIII) (таблица 1). Реакцию проводи с помощью PfuSE ДНК полимеразы (НПО "СибЭнзим", Россия) на ПЦР-амплификаторе «БИС» фирмы ООО "БИС-Н" (Россия). Реакционная смесь, объемом 50 мкл, содержащая 2 мкг ДНК (плазмиды pGH с геном химозина), 10 пкМ каждого праймера (pET21a+proChym-(S) и рЕТ21а+Chym(B), 67 мМ трис-HCl (рН 8,8), 15 мМ сульфата аммония, 2,5 мМ хлористого магния, 0,01% Твин-20, смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дАТФ, дЦТФ, дТТФ, дГТФ по 2,5 мМ) и 1 ед. PfuSE ДНК полимеразы (НПО "СибЭнзим", Россия); реакцию осуществляли при следующих параметрах: 50 с - 96°С, 30 с - 60°С, 1 мин - 72°С (30 циклов).
После завершения амплификации компоненты реакционной смесь разделяли методом электрофореза в 1% агарозном геле и выявляли продукт реакции - единичный фрагмент размером 1111 п. н. (Фиг 4). Фрагмент выделяли из геля с помощью набора «Gel Extraction Kit» фирмы Qiagen (Германия). Затем проводили гидролиз выделенного ПЦР-продукта и предварительно наработанного и очищенного вектора рЕТ32а(-) эндонуклеазами рестрикции Msp20I и HindIII («СибЭнзим», Россия) в условиях, рекомендованных производителем.
Плазмидную ДНК после ферментативного гидролиза фракционировали методом ЭФ в 1% геле агарозе. Рестрицированный вектор выделяли из агарозного геля с использованием набора «Gel Extraction Kit» фирмы Qiagen (Германия). Реакцию лигирования проводили с использованием ДНК-лигазы бактериофага Т4 («СибЭнзим», Россия). Реакция проводилась при +4°С в течение ночи. Полученной лигазной смесью трансформировали (как описано в примере 2) химически компетентные клетки Е. coli штамм NEB ("New England Biolabs", Великобритания).
После трансформации клоны отбирали на селективной агаризованнной среде LB с антибиотиком ампициллином (50 мг/мл). Наличие вставки гена прохимозина в рекомбинантной плазмиде проверяли при помощи анилитической ПЦР. Разделение продуктов амплификации проводили в 1%-м агарозном геле с последующим окрашиванием бромистым этидием (0,5 мкг/мл). Положительные колонии, вносили в 5 мл среды LB с ампициллином (50 мкг/мл) и растили в течение ночи на орбитальном шейкере при 37°С и 170 об/мин. Затем плазмидную ДНК выделяли из бактериальных клеток с помощью коммерческих наборов DNA mini kit фирмы «Qiagen» (Германия) согласно рекомендациям производителя. Нуклеотидную последовательность полученных плазмид подтверждали секвенированием методом Сэнгера в ЦКП «Геномика» СО РАН (Россия).
Секвенирование плазмидной ДНК положительных клонов в районе встройки гена прохимозина альпака позволило отобрать клоны с отсутствием дефектов встраиваемого гена (вставки, делеции, замены), после чего из отобранных клонов была наработана и выделена плазмидная ДНК.
Пример 2. Получение рекомбинантного штамма Escherichia coli BL21(DE3) pLysE/pET32-TrxVic
С целью получения штамма-продуцента рекомбинантного прохимозина Vicugna pacos была проведена трансформация клеток Е. coli BL21(DE3) pLysE сконструированной рекомбинантной плазмидой pET32-TrexVic (Фиг 3), с использованием хлористого кальция.
Культуру клеток подращивали до ODλ600=0.5 единиц оптической плотности (е.о.п.), 1,5 мл суспензии центрифугировали при 6000 об/мин в течение 2 мин на центрифуге "Eppendorf 5415 R". Осадок клеток суспензировали в 700 мкл 0,2М CaCl2, инкубировали при 4°С в течение 15 мин, затем клетки осаждали центрифугированием 4000 об/мин 3 мин. Осадок клеток суспендировали в 100 мкл 0,2М CaCl2. К суспензии клеток добавляли 50-70 нг плазмидной ДНК, инкубировали 30 мин при 4°С, затем в течение 5 мин при 37°С. К суспензии клеток добавляли 1 мл среды LB и инкубировали при 37°С в течение 1 часа. Отбирали 100 мкл культуры и рассевали ее на чашку Петри с агаризованной средой с добавлением ампициллина до концентрации 100 мкг/мл. Остаток культуры осаждали центрифугированием при 4000 об/мин в течение 3 мин, отбирали супернатант, суспендировали в 100 мкл LB и высевали на чашку с агаризованной средой LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина. Чашки инкубировали в термостате при 37°С в течении ночи. На следующий день идентифицировали отдельные колонии BL21(DE3) pLysE/pET32-TrxVic.
Штамм E.coli BL21 (DE3) pLysE, несущий рекомбинантную плазмиду рЕТ32-TrexVic, - продуцент рекомбинантного прохимозина Vicugna pacos характеризуется следующими признаками: высокой физиологической стабильностью (снижение активности продуцируемого фермента после 50 генераций не превышает 20%) и высоким выходом активного продукта.
Клетки хорошо растут на стандартных питательных средах. Время генерации около 30 мин в жидкой LB-среде. На 2-2,5% питательном агаре "Difco" образуются круглые, гладкие, желтоватые колонии с ровными краями. При выращивании на жидких LB- и YT-средах образуется интенсивная ровная мутность.
Физиолого-биохимические признаки
Оптимальная температура культивирования - от 16 до 42°С, оптимум рН - 7,6. Источником азота служат органические соединения (в виде триптона, дрожжевого экстракта).
Существенным при использовании данных штаммов является их чувствительность к канамицину (до 25 мкг/мл). Проявляют устойчивость к ампициллину (до 100 мкг/мл), обусловленную наличием плазмид pET32-TrexVic.
Один из отобранных клонов обозначали как Escherichia coli BL21(DE3) pLysE/pET32-TrxVic, выращивали его в 5 мл жидкой среды LB, содержащей 100 мг/л ампиницилина до ODλ600=5,0 е.о.п., добавляли к культуре равный объем стерильного 30% глицерина, разливали по 500 мкл в стерильные 1.5 мл пробирки, замораживали и хранили при - 70°С.
Пример 3. Наработка биомассы BL21(DE3) pLysE/pET32-TrxVic и выделение рекомбинантного прохимозина Vicugna pacos
Индивидуальные колонии рекомбинантного штамма Е. coli, трансформированные плазмидой pET32-TrexVic, культивировали в течение ночи, на орбитальном шейкере, в среде LB, при 37°С и 180 об/мин. Инокулят, в соотношении 1:100, переносили в колбу Эрленмейера, содержащую среду LB и растили до оптической плотности (при λ=600 нм) равной 0,8. Добавляли индуктор (изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид), до конечной концентрации 0,1 мМ. Клетки дополнительно культивировали на шейкере в течение 12 часов при 25°С и 160 об/мин. Биомассу бактериальных клеток осаждали центрифугированием при 5000 G в течении 20 минут. Осадок растворяли, из расчета 20 мл на 1 грамм, в лизирующем буфере (8% сахароза, 50 мМ Трис, 20 мМ ЭДТА, 5% Triton Х100 рН=8,0) с использованием ультразвукового гомогенизатора Soniprep 150 Plus ("MSE", Китай). Осадок, содержащий тельца включения, отделяли центрифугированием (20000 G в течение 25 мин, 4°С) и растворяли в в базовом буфере (50 мМ KH2PO4, 150 мМ NaCl, рН=10,7), содержащем 8М мочевину.
После разделения все фракции были проанализированы в 12% ПААГ на наличие целевого белка. Результаты показали, что весь целевой белок находится в нерастворимой фракции и его процентное содержание от общего количества белков составляет порядка 40% (фиг 5).
Пример 4. Рефолдинг и активация рекомбинантного прохимозина Vicugna pacos
Рефолдинг целевого белка и его очистку от мочевины проводили диализом в две стадии. Раствор рекомбинантного прохимозина в 8 М мочевине, разбавляли базовым буфером до конечной концентрации белка 180 мкг/мл. Доводили рН раствора до 8,0±0,1 с помощью 1М HCl и диализовали против буфера А (20 mM Tris; 150 тМ NaCl) при 4°С, меняя раствор каждые 12 часов 3 раза.
Для подтверждения наличия молокосвертывающей активности профермент активировали.
Активацию прохимозина проводили путем ступенчатого понижения и повышения рН. Все операции выполняли в пластиковой посуде, при комнатной температуре. Для контроля исходной МА рекомбинантного прохимозина, отбирали аликвоту неактивированного фермента.
Для активации в образец рекомбинантного прохимозина, при постоянном перемешивании, вносили 2,0М HCl до рН 3,0. Останавливали перемешивание и инкубировали смесь при рН 3,0±0,1 в течение 2 часов. По истечении времени инкубации, доводили рН образца до 5,8±0,1, используя 0,5М NaOH. В активированном таким способом образце определяли МА.
Пример 5. Определение молокосвертывающей активности рекомбинантного химозина
Для определения МА использовали стандартизированный сухой молочный субстрат ("Субстрат СТ.3"), выпускаемый ВНИИМС (г. Углич). Для подготовки к работе 25,0 гр. субстрата растворяли в 230 мл 0,01N CaCl2 в течение 1 ч при комнатной температуре и постоянном перемешивании. Доводили рН полученной смеси до 6,5±0,1, используя 1,0М NaOH. Конечный объем раствора доводили до 250 мл 0,01 N CaCl2.
Активность исследуемых образцов определяли относительно отраслевого контрольного образца сычужного фермента (ОКО СФ), аттестованного по МА, выпускаемого ОАО "Московский завод сычужного фермента". Для подготовки к работе, к 1,0 г ОКО СФ добавляли 80 мл дистиллированной воды, перемешивали 30 минут при 20-25°С, доводили объем смеси до 100 мл и выдерживали на водяной бане при 35°С в течение 15 мин. Перед определением МА исследуемые образцы выдерживали 15 минут при 35°С.
Определение МА проводили при 35°С. В сухую стеклянную пробирку вносили 2,5 мл раствора стандартизированного субстрата и прогревали при 35°С в течение 5 минут. В пробирку с субстратом добавляли 0,25 мл исследуемого образца, включали секундомер, содержимое пробирки сразу же тщательно перемешивали. Продолжительность свертывания субстрата отмечали по секундомеру с момента внесения образца до появления первых хлопьев коагуляции субстрата. Появление хлопьев проверяли путем периодического нанесения стеклянной палочкой капли реакционной смеси на стенку пробирки.
Молокосвертывающую активность исследуемых образцов выражали в условных единицах на 1 мл препарата (усл. ед./мл) и рассчитывали по формуле:
где:
А - аттестованная молокосвертывающая активность ОКО СФ в условных единицах;
T1 - продолжительность свертывания субстрата с ОКО СФ;
Т2 - продолжительность свертывания субстрата с исследуемым образцом.
Для перевода условных единиц МА в международные молокосвертывающие единицы (IMCU) использовали понижающий коэффициент 129,1. Результаты исследования представлены в таблице 2.
Сравнительная ферментативная активность показала, что скорость рефолдинга химерного рекомбинатного прохимозин Vicugna pacos выше скорости рефолдинга рекомбинатного прохимозин Vicugna pacos.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ источников
1. Harboe М., Broe M.L., Qvist K.B. In: Technology of Cheesemaking. Law BA, Tamime AY, Eds., John Wiley & Sons., 2010, Ch. 3. The Production, Action and Application of Rennet and Coagulants.- P. 98-129.
2. Jacob, M. Recent advances in milk clotting enzymes / M. Jacob, D. Jaros, H. Rhom // Int. J. Dairy Technol.- 2011.- V. 64.- N. 1.- P. 14-33.
3. Gilliland, G. L. The three-dimensional structure of recombinant bovine chymosin at 2.3 A resolution / G.L. Gilliland, E. L. Winborne, J. Nachman, A. Wlodawer // Proteins.- 1990.- N 8.-P. 82-101.
4. Khan, A.R. Molecular mechanisms for the conversion of zymogens to active proteolytic enzymes. Review / A.R. Khan, M.N.G. James // Prot. Sci.- 1998.- V 7.- P. 815-836
5. Kageyama, T. Pepsinogens, progastricsins, and prochymosins: structure, function, evolution, and development / T. Kageyama // Cell. Mol. Life Sci.- 2002.-V 59(2).- P.288-306.
6. Wangoh, J. Extraction of camel rennet and its comparison with calf rennet extract / J. Wangoh, Z. Farah, Z. Puhan // Milchwissenschaft.- 1993.- N 48.- P. 322-325.
7. Suzzi, G. Influence of pig rennet on fatty acid composition, volatile molecule profile, texture and sensory properties of Pecorino di Farindola cheese / G. Suzzi, G. Sacchetti, F. Patrignani, A. Corsetti, R. Tofalo, M. Schirone, G. Fasoli, F. Gardini, G. Perpetuuini, R. Lanciotti // J. Sci. Food Agriculture.- 2014.- V. 95(11).- P. 2252-2263.
8. Ельчанинов, В.В. Практические аспекты использования молокосвертывающего фермента из сычугов северного оленя / В.В. Ельчанинов, А.Н. Белов, М.С. Уманский, А.Д Коваль, Е.А. Авданина, В.П. Вистовская, А.В. Кригер // Сыроделие и маслоделие. - 2006. - №5. - С. 5-7.
9. Feijoo-Siota L., Blasco L., Rodriguez-Rama J.L., 
J., De Miguel Т., 
A, Villa T.G. Recent patents on microbial proteases for the dairy industry. Recent Adv. in DNA and Gene Sequences.- 2014.- V.8.- N. 1.- P. 44-55.
10. Payie, K.G. Construction, expression and characterization of a chimaeric mammalian-plant aspartic proteinase. / K.G. Payie, T. Tanaka, S. Gal, R.Y. Yada // Biochem. J.- 2003. - V. 372. - P. 671-678.
11. 
F. Large-scale production of yak (Bos grunniens) chymosin A in Pichia pastoris / F. 
M. inan // Protein Expression and Purification.- 2019.- V. 154. - P. 126-133
12. Flamm, E.L. How FDA approved chymosin: a case history / E.L. Flamm // Bio/Technology.-1991.- V.9.- N. 4. - P. 349-351.
13. Uchiyama, H. Purification of prorennin mRNA and its translation in vitro / H. Uchiyama, T. Uozumi, T. Beppu, K. Arima // Agric. Biol. Chem.- 1980. - V 44. - P. 1373-1381.
14. 
J. Complete primary structure of lamb preprochymosin deduced from cDNA / J. Pungercar, B. Strukelj, F. Gubensjek, V. Turk, and I. Kregar // Nucleic Acids Res.- 1990.- N. 18. - P. 4602-4608.
15. Rogelj, I. Recombinant Lamb Chymosin as an Alternative Coagulating Enzyme in Cheese Production /I. Rogelj, B. Perko, A. Francky, V. Penca, J. Purgencar // J. Dairy Sci.- 2001. - N 84.- P. 1020-1026.
16. Vega-Hernandes, M.C. Molecular cloning and expression in yeast of caprine prochymosin / M.C. Vega-Hernandes, A. Gomes-Coello, J. Villar, F. Claverie-Martin // Journal of Biotechnology. - 2004.- N 1-2. - P.69-79.
17. Kappeler, S.R. Characterization of recombinant camel chymosin reveals superior properties for the coagulation of bovine and camel milk / S.R. Kappeler, H. (J.) M. van den Brink, H. Rahbek-Nielsen, Z. Farah, Z. Puhan, E.B. Hansen, E. Johansen // Biochemical and Biophysical Research Communications.- 2006. - V. 2. - N. 342. - P. 647-654.
18. Vallejo, J.A. Cloning and Expression of Buffalo Active Chymosin in Pichia pastoris / J.A. Vallejo, J.M. Ageitos, M. Poza, T.G. Villa // J. Agricultural and Food Chemistry.- 2008.- V. 56 (22).- P. 10606-10610.
19. Vallejo, J.A. Short communication: A comparative analysis of recombinant chymosins / J.A. Vallejo, J.M. Ageitos, M. Poza, T.G. Villa // Journal of Dairy Science.- 2012. - V. 95.- N. 2. - P. 609-613.
20. Беленькая, С.В. Некоторые биохимические свойства рекомбинантного химозина альпака (Vicugna pacos L.) / С.В. Беленькая, А.П. Рудометов, Д.Н. Щербаков, Д.В. Балабова, А.В. Кригер, А.Н. Белов, А.Д. Коваль, В.В. Ельчанинов // Прикладная биохимия и микробиология.- 2018.- Т. 54.- №6.- С.585-593.
21. Bansal, N. Suitability of recombinant camel (Camelus dromedarius) chymosinas as a coagulant for Cheddar cheese / N. Bansal, M.A. Drake, P. Piraino, M.L. Broe, M. Harboe, P.F. Fox, P.H.L. McSweeney // International Dairy Journal.- 2009.- V.19.- P. 510-517.
22. McCaman, M.T. Enzymatic properties and processing of bovine prochymosin synthesized in Escherichia coli / M.T. McCaman, W.H. Andrews, J.G. Files // J. Biotechnol.- 1985.- V 2.- P. 177-190.
23. Kawaguchi, Y. Production of chymosin in Escherichia coli cells and its enzymatic properties / Y. Kawaguchi, S. Kosugi, K. Sasaki, T. Uozumi, T. Beppu // Agric. Biol. Chem.- 1987.- V 51.-P. 1871-1877.
24. Kawaguchi, Y. Renaturation and activation of calf prochymosin produced in an insoluble form in Escherichia coli / Y. Kawaguchi, N. Shimizu, K. Nishimori, T. Uozumi, T. Beppu // J. Biotechnol.- 1984.- V 1.- P. 307-315.
25. Shoemaker, J.M. Examination of calf prochymosin accumulation in Escherichia coli: disulphide linkages are a structural component of prochymosin-containing inclusion bodies / M. Shoemaker, A.H. Brasnett, F.A.O. Marston // EMBO J.- 1985.- V 4.- P. 775-780.
26. Chen, H. Functional Implications of Disulfide Bond, Cys206-Cys210, in Recombinant Prochymosin (Chymosin) / H. Chen, G. Zhang, Y. Zhang, Y.Dong, K. Yang // Biochemistry.-2000.- V. 39.- P. 12140-12148.
27. Wei, C. Chaperone-mediated refolding of recombinant prochymosin / C. Wei, Y. Zhang, K. Yang // J. Prot. Chem.- 2000.- V. 19.- N. 6.- P. 449-456.
28. Wei, C. Oxidative refolding of recombinant prochymosin / C. Wei, B. Tang, Y. Zhang, K. Yang // Biochem. J.- 1999.- V. 340.- P. 345-351.
29. Menzella, H.G. High recovery of prochymosin from inclusion bodies using controlled air oxidation / H.G. Menzella, H.C. Gramajo, E.A. Ceccarelli // Prot. Expr. Purif.- 2002.- V. 25(2).-P. 248-255.
30. Reh, G. Partition features and renaturation enhancement of chymosin in aqueous two-phase systems / G. Reh, D. Spelzini, G. 
G. 
B. Farruggia // J. Chromatogr. В.- 2007.- V. 860(1).- P. 98-105.
31. Wang, N. Expression and characterization of camel chymosin in Pichia pastoris / N. Wang, K.Y. Wang, G. Li, W. Guo, D. Liu // Protein Expr. Purif.- 2015.- V. 111.- P. 75-81ю
32. Cheese Chemistry, Physics and Microbiology, Third edition, Volume I: General Aspects. Rennets: General and Molecular Aspects / M.J.C. Grabbe.; P.F.Fox, P.L.H. McSweeney, T.M. Cogan, T.P. Guinee, eds.- London, UK: Elsevier Academic Press, 2004.- P. 19-45.
33. Заявка США 2002/0164696, A1, C12P, 21/02, C12N, 5/06, опубл. 07.11.2002 г.
34. Feng Z. et al. Codon optimization of the calf prochymosin gene and its expression in Kluyveromyces lactis // World Journal of Microbiology and Biotechnology. - 2010. - T. 26. -№. 5.-P. 895-901.
35. Menzella H. G. Comparison of two codon optimization strategies to enhance recombinant protein production in Escherichia coli // Microbial cell factories. - 2011. - T. 10. - №. 1. - P. 15.
36. Заявка США №20070166785, A1, МПК C12P 21/06, C07H 21/04, опубл. 19.07.2007 г.
37. Рудометов А.П. Сравнение экспрессии нуклеотидной последовательности химозина и прохимозина теленка в Е. coli BL21 и оценка молокосвертывающей активности полученных рекомбинантных белков / А.П. Рудометов, С.В. Беленькая, Е.А. Колосова и др. // Международный научно-исследовательский журнал. - 2016. - №10 (52) Часть 4. - С.37-40.
38. Маниатис Т., Фрич Э, Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование, М.: Мир, 1984; Клонирование ДНК. Методы. Под ред. Д.Гловера, Пер. с англ., Москва, Мир, 1988; Saiki R.K., Gelfand D.H., Stoffel S., Sharf S.J., Higuehi R., Horn G.T., Mullis K.B., Eriich H.A. Science, 1988. V.239, №4839, p.487-491; Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1977, V. 74, p. 5463-5467.
Приложение
<110> АлтГУ
<120> Рекомбинантная плазмида pET32-TrexVic, обеспечивающая синтез химерного белка прохимозина В Bos taurus, и штамм Escherichia coli BL21(DE3)pLysE pET32- TrxVic – продуцент химерного белка прохимозина Vicugna pacos
<160> SEQ ID NO 2
<210> SEQ ID NO:1
<211> 1440
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Нуклеотидная последовательность гена TrxVic химерного белка прохимозина Vicugna pacos.
<400> 1
ATGAGCGATAAAATTATTCACCTGACTGACGACAGTTTTGACACGGATGTACTCAAAGCGGACGGGGCGATCCTCGTCGATTTCTGGGCAGAGTGGTGCGGTCCGTGCAAAATGATCGCCCCGATTCTGGATGAAATCGCTGACGAATATCAGGGCAAACTGACCGTTGCAAAACTGAACATCGATCAAAACCCTGGCACTGCGCCGAAATATGGCATCCGTGGTATCCCGACTCTGCTGCTGTTCAAAAACGGTGAAGTGGCGGCAACCAAAGTGGGTGCACTGTCTAAAGGTCAGTTGAAAGAGTTCCTCGACGCTAACCTGGCCGGTTCTGGTTCTGGCAGCGGTATTACCAGAATCCCACTTCACAAAGGCAAGACTCTGCGTAAAGCGTTGAAAGAGCATGGATTACTCGAGGACTTTCTTCAGCGGCAGCAGTACGCCGTGAGTTCAAAATATTCTTCACTTGGCAAAGTCGCTAGAGAACCATTGACTTCATATCTTGACTCACAATATTTCGGTAAAATCTATATAGGGACCCCGCCGCAAGAGTTCACAGTCGTGTTCGACACAGGATCCTCAGATCTCTGGGTCCCATCTATTTATTGTCGTTCCAACGTGTGTAAAAACCATCATCGCTTCGATCCAAGAAAATCCAGTACCTTCCGCAACCTCGGGAAGCCTCTGTCAATACATTATGGAACCGGCAGCATGGAAGGCTTTTTAGGCTATGACACTGTTACTGTATCCAACATTGTGGATCCAAATCAGACAGTAGGGCTTAGCACCGAACAGCCGGGCGAAGTTTTTACCTATAGTGAGTTTGATGGTATCCTGGGGTTGGCTTACCCTAGCTTGGCGTCAGAATATAGCGTTCCAGTCTTCGATAATATGATGGACCGGCACCTCGTCGCCCAAGATCTCTTCTCCGTGTATATGGATCGGAACGGTCAAGGGAGTATGCTGACCTTGGGCGCGATAGACCCAAGCTATTACACTGGATCATTGCACTGGGTGCCAGTGACCGTCCAGCAGTACTGGCAGTTTACAGTGGACTCAGTCACGATCAATGGCGTCGCGGTGGCTTGTGTTGGTGGCTGCCAGGCAATTTTGGATACGGGCACGAGTGTGCTGTTCGGACCGTCATCAGACATACTGAAGATCCAAAAAGCGATAGGGGCAACAGAGAACCGCTACGGTGAATTCGACGTTAATTGCGGTAGTCTGCGCAGTATGCCGACAGTTGTGTTCGAGATCAACGGACGGGACTACCCACTCAGCCCGTCAGCTTATACGTCAAAAGACCAGGGATTCTGTACGTCTGGTTTTCAGGGTGATAACAACAGTGAACTTTGGATACTTGGCGATGTATTTATCCGCGAGTATTACTCTGTTTTTGATCGGGCAAACAATCGTGTTGGGCTGGCCAAAGCCATTTAA (1440 нуклеотида)
<210> SEQ ID NO:2
<211> 479
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Аминокислотная последовательность химерного белка TrxVic прохимозина Vicugna pacos.
.
<400> 2
MSDKIIHLTDDSFDTDVLKADGAILVDFWAEWCGPCKMIAPILDEIADEYQGKLTVAKLNIDQNPGTAPKYGIRGIPTLLLFKNGEVAATKVGALSKGQLKEFLDANLAGSGSGSGITRIPLHKGKTLRKALKEHGLLEDFLQRQQYAVSSKYSSLGKVAREPLTSYLDSQYFGKIYIGTPPQEFTVVFDTGSSDLWVPSIYCRSNVCKNHHRFDPRKSSTFRNLGKPLSIHYGTGSMEGFLGYDTVTVSNIVDPNQTVGLSTEQPGEVFTYSEFDGILGLAYPSLASEYSVPVFDNMMDRHLVAQDLFSVYMDRNGQGSMLTLGAIDPSYYTGSLHWVPVTVQQYWQFTVDSVTINGVAVACVGGCQAILDTGTSVLFGPSSDILKIQKAIGATENRYGEFDVNCGSLRSMPTVVFEINGRDYPLSPSAYTSKDQGFCTSGFQGDNNSELWILGDVFIREYYSVFDRANNRVGLAKAI
(479 аминокислотных остатка)
Claims (2)
1. Рекомбинантная плазмида pET32-TrexVic размером 6826 пар оснований (п.о.), обеспечивающая синтез химерного белка прохимозина Vicugna pacos размером 52 кДа в клетках Escherichia coli BL21(DE3)pLysE и содержащая следующие существенные для ее функционирования и экспрессии целевого белка структурные элементы: промотор бактериофага Т7, обеспечивающий эффективную транскрипцию контролируемой мРНК; рекомбинантный ген прохимозина Vicugna pacos, кодирующий целевой химерный белок; нетранслируемую область терминации транскрипции бактериального оперона, терминатор РНК-полимеразы фага Т7, обеспечивающую эффективное окончание транскрипции; последовательность тиоредоксина, добавленную в состав нуклеотидной последовательности гена прохимозина Vicugna pacos на N-конец, для ускорения процесса рефолдинга целевого фермента; последовательность bla (AmpR), кодирующую белок бета-лактамазу, являющуюся селективным маркером для трансформации штаммов Е. coli; последовательность ColE1 (ori), обеспечивающую репликацию плазмиды в штаммах Е. coli, причем рекомбинантный ген белка прохимозина Vicugna pacos имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1 от нуклеотида в положении 5209 п.о. до нуклеотида в положении 6649 п.о., кодирующий целевой химерный белок прохимозин Vicugna pacos с полной аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2, встроенный по сайтам рестрикции FauND I и HindIII в область полилинкера вектора рЕТ32а, содержащего промотор и терминатор РНК-полимеразы фага Т7.
2. Рекомбинантный штамм Escherichia coli BL21(DE3)pLysE/pET32-TrxVic - продуцент химерного белка прохимозина Vicugna pacos, полученный трансформацией рекомбинантной плазмидой pET32-TrexVic по п. 1.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019117249A RU2729403C1 (ru) | 2019-05-31 | 2019-05-31 | Рекомбинантная плазмида pET32-Trex Vic, обеспечивающая синтез химерного белка прохимозина Vicugna pacos, и штамм Escherichia coli BL21(DE3)pLysE pET32-Trx Vic-продуцент химерного белка прохимозина Vicugna pacos |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019117249A RU2729403C1 (ru) | 2019-05-31 | 2019-05-31 | Рекомбинантная плазмида pET32-Trex Vic, обеспечивающая синтез химерного белка прохимозина Vicugna pacos, и штамм Escherichia coli BL21(DE3)pLysE pET32-Trx Vic-продуцент химерного белка прохимозина Vicugna pacos |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2729403C1 true RU2729403C1 (ru) | 2020-08-06 |
Family
ID=72085504
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2019117249A RU2729403C1 (ru) | 2019-05-31 | 2019-05-31 | Рекомбинантная плазмида pET32-Trex Vic, обеспечивающая синтез химерного белка прохимозина Vicugna pacos, и штамм Escherichia coli BL21(DE3)pLysE pET32-Trx Vic-продуцент химерного белка прохимозина Vicugna pacos |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2729403C1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2805486C1 (ru) * | 2022-12-22 | 2023-10-17 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр "Курчатовский институт" | Трансформант Komagataella phaffii - продуцент рекомбинантного химозина в активной форме |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20070166785A1 (en) * | 2004-03-30 | 2007-07-19 | Mule Veakata Madhusudhan R | Recombinant calf-chymosin and a process for producing the same |
| RU2670071C1 (ru) * | 2017-07-03 | 2018-10-17 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Рекомбинатная плазмида pET21a-ProChym, обеспечивающая синтез химерного белка прохимозина В Bos taurus, и штамм Escherichia coli BL21(DE3)pLysE pET21a-ProChym - продуцент химерного белка прохимозина В Bos Taurus |
-
2019
- 2019-05-31 RU RU2019117249A patent/RU2729403C1/ru active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20070166785A1 (en) * | 2004-03-30 | 2007-07-19 | Mule Veakata Madhusudhan R | Recombinant calf-chymosin and a process for producing the same |
| RU2670071C1 (ru) * | 2017-07-03 | 2018-10-17 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Рекомбинатная плазмида pET21a-ProChym, обеспечивающая синтез химерного белка прохимозина В Bos taurus, и штамм Escherichia coli BL21(DE3)pLysE pET21a-ProChym - продуцент химерного белка прохимозина В Bos Taurus |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| CESARENI G. ET AL. Control of ColEl DNA replication: The rop gene product negatively affects transcription from the replication primer promoter. Proc Natl Acad Sci U S A. 1982 Oct; 79(20): 6313-6317. * |
| EL-SOHAIMY S.A. ET AL. Cloning and In Vitro-Transcription of Chymosin Gene in E. coli. The Open Nutraceuticals Journal, 2010, 3, 63-68. * |
| БЕЛЕНЬКАЯ С.В. И ДР. Некоторые биохимические свойства рекомбинантного химозина альпака (Vicugna pacos L.). Прикладная биохимия и микробиология, 2018, том 54, N 6, с. 585-593. * |
| БЕЛЕНЬКАЯ С.В. И ДР. Некоторые биохимические свойства рекомбинантного химозина альпака (Vicugna pacos L.). Прикладная биохимия и микробиология, 2018, том 54, N 6, с. 585-593. EL-SOHAIMY S.A. ET AL. Cloning and In Vitro-Transcription of Chymosin Gene in E. coli. The Open Nutraceuticals Journal, 2010, 3, 63-68. CESARENI G. ET AL. Control of ColEl DNA replication: The rop gene product negatively affects transcription from the replication primer promoter. Proc Natl Acad Sci U S A. 1982 Oct; 79(20): 6313-6317. * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2805486C1 (ru) * | 2022-12-22 | 2023-10-17 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр "Курчатовский институт" | Трансформант Komagataella phaffii - продуцент рекомбинантного химозина в активной форме |
| RU2815882C1 (ru) * | 2022-12-22 | 2024-03-25 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр "Курчатовский институт" | Трансформант Ogataea haglerorum - продуцент рекомбинантного химозина в активной форме |
| RU2828277C1 (ru) * | 2023-11-01 | 2024-10-08 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр "Курчатовский институт" | Трансформант Komagataella phaffii, содержащий ген HAC1, продуцент рекомбинантного химозина Vicugna pacos в активной форме |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Mohanty et al. | Bovine chymosin: production by rDNA technology and application in cheese manufacture | |
| Yegin et al. | Progress in the field of aspartic proteinases in cheese manufacturing: structures, functions, catalytic mechanism, inhibition, and engineering | |
| EP2844750B1 (en) | Improved enzyme variants | |
| CN111434770A (zh) | 蛋白质谷氨酰胺酶酶原在枯草芽孢杆菌中的表达和自加工 | |
| JP2004517643A (ja) | 酵母におけるＴｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍａｌｂｕｍ由来の組換えプロテイナーゼＫの発現 | |
| EP0123928A2 (en) | Recombinant DNA coding for a polypeptide displaying milk clotting activity | |
| McCaman et al. | Enzymatic properties and processing of bovine prochymosin synthesized in Escherichia coli | |
| Feng et al. | Codon optimization of the calf prochymosin gene and its expression in Kluyveromyces lactis | |
| RU2670071C1 (ru) | Рекомбинатная плазмида pET21a-ProChym, обеспечивающая синтез химерного белка прохимозина В Bos taurus, и штамм Escherichia coli BL21(DE3)pLysE pET21a-ProChym - продуцент химерного белка прохимозина В Bos Taurus | |
| RU2729403C1 (ru) | Рекомбинантная плазмида pET32-Trex Vic, обеспечивающая синтез химерного белка прохимозина Vicugna pacos, и штамм Escherichia coli BL21(DE3)pLysE pET32-Trx Vic-продуцент химерного белка прохимозина Vicugna pacos | |
| CN111153968A (zh) | 一种提高外源碱性蛋白酶表达量的信号肽突变体及其构建方法与用途 | |
| US20220162619A1 (en) | Preparation of wheat cysteine protease triticain-alpha produced in soluble form and method of producing same | |
| JP6991423B2 (ja) | グルコースオキシダーゼＣｎＧＯＤＡ及びその遺伝子ならびに使用 | |
| CA2942785C (en) | Aspartic proteases | |
| US5082775A (en) | Efficient process for isolating insoluble heterologous protein using non-ionic detergents | |
| EP2216402A1 (en) | Use of active recombinant chymosin | |
| RU2779307C2 (ru) | Способ микробиологического синтеза прохимозина быка с использованием рекомбинантного штамма Pichia pastoris, содержащего синтетический ген варианта препрохимозина с модифицированной сигнальной последовательностью секреции | |
| RU2769175C1 (ru) | Способ микробиологической продукции химозина быка с использованием рекомбинантного штамма Pichia pastoris, содержащего синтетический ген варианта химозина с коэкспрессией фактора HAC1 | |
| JPS589687A (ja) | ポリペプチドの生産方法 | |
| RU2857682C1 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА pKLAC4_AoPAPC, ОБЕСПЕЧИВАЮЩАЯ СИНТЕЗ ПРОТЕАЗЫ FIBRINOLYTIC PROTEASE-ACTIVATOR OF PROTEIN C ИЗ Aspergillus ochraceus (AoPAPC) В КЛЕТКАХ Kluyveromyces lactis И РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ Kluyveromyces lactis GG799/GAL4::AoPAPC ВКПМ Y-5265 - ПРОДУЦЕНТ AoPAPC | |
| RU2805486C1 (ru) | Трансформант Komagataella phaffii - продуцент рекомбинантного химозина в активной форме | |
| RU2435863C2 (ru) | Способ продукции белка | |
| KR102613936B1 (ko) | 자가분해능이 저하된 켁신 효소 및 이의 생산 방법 | |
| EP1326890B1 (en) | Shrimp alkaline phosphatase | |
| CN100537754C (zh) | 一种s-腺苷甲硫氨酸生产菌株的构建及大规模发酵 |