RU2723894C1 - Способ получения препарата для диагностики новообразований методом магнитно-резонансной томографии - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и касается способа получения контрастного препарата для диагностики новообразований методом магнитно-резонансной томографии (МРТ), выполненного на основе магнитных модифицированных наночастиц (МНЧ) оксида железа FeO. Для этого путем нагрева при перемешивании раствора ацетилацетоната железа (III) в бензиловом спирте и его выдерживания при достигнутой температуре, проводимыми в атмосфере инертного газа, с последующим охлаждением полученной смеси с получением суспензии наночастиц оксида железа, добавлением в суспензию водорастворимого полярного органического растворителя, отделением наночастиц, их ресуспендированием в водном растворе щелочи, смешением полученной суспензии с водным щелочным раствором человеческого сывороточного альбумина, инкубированием смеси и ее очисткой, добавлением в суспензию водного раствора глутарового альдегида, инкубированием смеси, добавлением в смесь раствора боргидрида натрия, инкубированием смеси и ее очисткой, используют раствор ацетилацетоната железа (III) с концентрацией 48-70 г/л, нагрев проводят в течение 5-12 ч до температуры 160-205°С, выдерживание при достигнутой температуре осуществляют в течение 1-60 мин, а охлаждение полученной смеси проводят в присутствии кислорода с получением суспензии наночастиц FeO. Изобретение позволяет в 2 раза повысить продолжительность хранения препарата как в виде суспензии, так и в виде лиофилизата. 4 ил., 4 пр.

Description

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и касается способа получения контрастного препарата для диагностики новообразований методом магнитно-резонансной томографии (МРТ), выполненного на основе магнитных модифицированных наночастиц (МНЧ) оксида железа Fe₂O₃.

Известен способ получения препарата для диагностики новообразований методом МРТ путем растворения человеческого сывороточного альбумина (ЧСА) в воде, содержащий суспензию МНЧ магнетита (Fe₃O₄) последовательных добавлений в смесь вначале водного раствора NaOH до достижения рН смеси 8,4, затем этанола, после чего раствора глутарового альдегида, выдерживания полученной смеси в течение 24 ч, очистки полученных МРИ путем трехкратного центрифугирования и повторного ресуспендирования в воде под действием ультразвука (УЗ) (заявка на изобретение US 20080206146 A1, A61K 49/18 от 09.11.2007).

Данный способ содержит признаки, совпадающие с существенными признаками предлагаемого технического решения, такие как использование при получении препарата МНЧ оксида железа и их последовательная обработка раствором ЧСА, затем раствором глутарового альдегида, и очистка препарата.

Известен способ получения препарата для диагностики новообразований методом МРТ путем нагрева в токе инертного газа раствора ацетилацетоната железа (III) в бензиловом спирте при постоянном перемешивании до 110°С, выдерживания смеси при данной температуре в течение 1 ч, повторного нагрева смеси со скоростью 25°С/ч до 200°С, выдерживания смеси при данной температуре в течение 40 ч, медленного охлаждения смеси до комнатной температуры, добавления в смесь безводного ацетона, отделения МНЧ центрифугированием, промывки осадка МНЧ ацетоном, удаления ацетона на роторном испарителе, смешения МНЧ с дистиллированной водой, добавления в смесь раствора NaOH до достижения значения рН смеси, равного 11, диспергирования МНЧ в смеси под действием УЗ, добавления в полученную дисперсию водного раствора бычьего сывороточного альбумина, инкубирования смеси при постоянном перемешивании, очистки смеси диализом против воды, добавления в очищенную смесь вначале раствора NaOH, затем по каплям при перемешивании водного раствора глутарового альдегида, инкубирования смеси при перемешивании в течение 15 мин, добавления вначале водного раствора глицина с рН 9,2, затем водного раствора боргидрида натрия, инкубирования полученной смеси в течение 60 мин, очистки модифицированных МНЧ с использованием центрифужных фильтров с диаметров пор 100 килодальтон (кДа) и получения конъюгатов модифицированных МНЧ с моноклональными антителами к фактору роста эндотелия сосудов (патент RU 2530762 от 14.12.2012, А61В 5/055 (2006.01).

Данный способ содержит признаки, совпадающие с существенными признаками предлагаемого технического решения, такие как использование при получении препарата МНЧ оксида железа, полученных путем нагрева в токе инертного газа раствора ацетилацетоната железа (III) в бензиловом спирте, выдерживания при достигнутой температуре с последующим охлаждением смеси с получением суспензии наночастиц оксида железа, добавления в суспензию водорастворимого полярного органического растворителя, отделения МНЧ, их ресуспендирования в водном растворе щелочи, смешения полученной суспензии с водным щелочным раствором сывороточного альбумина, инкубирования полученной смеси и ее очистки, добавления в очищенную смесь водного раствора глутарового альдегида, инкубирования смеси, добавления в смесь водного раствора боргидрида натрия, инкубирования смеси и ее очистки.

Наиболее близким к заявляемому является известный способ получения препарата для диагностики новообразований методом МРТ путем нагрева при перемешивании раствора ацетилацетоната железа (III) в бензиловом спирте до температуры кипения бензилового спирта (205,5°С), выдерживания смеси при достигнутой температуре и ее охлаждения до комнатной температуры, проводимыми в атмосфере инертного газа, с получением суспензии МНЧ оксида железа Fe₃O₄, добавления в суспензию водорастворимого полярного органического растворителя, отделения наночастиц методом центрифугирования, их ресуспендирования в водной растворе щелочи, смешения полученной суспензии с водным щелочным раствором ЧСА, инкубирования полученной смеси и ее очистки диализом против воды с последующими добавлением водного щелочного раствора глутарового альдегида, инкубированием смеси, добавлением в смесь водного щелочного раствора глицина, инкубированием смеси, добавлением раствора боргидрида натрия в фосфатно-солевом буфере, инкубированием смеси и ее очисткой методом ультрафильтрации с использованием центрифужных фильтров (патент RU 2659949 С1, 2017, А61В 5/055 (2006.01) - прототип, см. описание).

Прототип имеет признаки, совпадающие с существенными признаками предлагаемого технического решения, такие как нагрев при перемешивании раствора ацетилацетоната железа (III) в бензиловом спирте и его выдерживание при достигнутой температуре, проводимые в атмосфере инертного газа, охлаждение полученной смеси с получением суспензии наночастиц оксида железа, добавление в смесь водорастворимого полярного органического растворителя, отделение наночастиц, их ресуспендирование в водном растворе щелочи, смешение полученной суспензии с водным щелочным раствором ЧСА, инкубирование полученной смеси и ее очистка с последующим добавлением водного раствора глутарового альдегида, инкубированием смеси, добавлением в смесь раствора боргидрида натрия, инкубированием смеси и ее очисткой.

Из прототипа известно, что описанные в нем МНЧ с гидродинамическим размером до и после модификации до 20 нм и до 50 нм, соответственно, могут быть получены в форме их коллоидного раствора или в форме лиофилизата частиц. В прототипе также указано, что продолжительность хранения лиофилизата полученных МНЧ равна 1 году. Однако, для МРТ-диагностики может быть использован лишь коллоидный раствор (суспензия) МНЧ, приготовление которого из лиофилизата является нетривиальной задачей и требует ресуспендирования лиофилизата в водосодержащей среде (воде, буфере или буферно-солевом растворе) и обязательной стерилизации полученного коллоидного раствора перед внутривенным введением суспензии препарата с использованием специальных фильтров, не всегда имеющихся в наличии. Продолжительность хранения такого раствора в прототипе не указана, однако, проведенный контрольный опыт (пример 4) показал, что она относительна невелика и составляет 1 мес. Таким образом, недостатком известного препарата является относительно небольшая продолжительность его хранения как в виде коллоидного раствора, так и в виде лиофилизата.

Техническая проблема изобретения заключается в разработке способа получения препарата для диагностики новообразований методом МРТ, лишенного вышеуказанного недостатка.

Технический результат изобретения состоит в повышении продолжительности хранения препарата.

Предварительно были проведены эксперименты с различными способами получения препаратов, выполненными на основе МНЧ оксида железа, которые показали, что указанный технический результат достигается в том случае, когда в способе получения препарата для диагностики новообразований методом МРТ путем нагрева раствора ацетилацетоната железа (III) в бензиловом спирте при перемешивании и его выдерживания при достигнутой температуре, проводимыми в атмосфере инертного газа, с последующим охлаждением полученной смеси с получением суспензии наночастиц оксида железа, добавлением в суспензию водорастворимого полярного органического растворителя, отделением наночастиц, их ресуспендированием в водном растворе щелочи, смешением полученной суспензии с водным щелочным раствором ЧСА, инкубированием смеси и ее очисткой, добавлением в суспензию водного раствора глутарового альдегида, инкубированием смеси, добавлением в смесь раствора боргидрида натрия, инкубированием смеси и ее очисткой, используют раствор ацетилацетоната железа (III) с концентрацией 48-70 г/л, нагрев проводят в течение 5-12 ч до температуры 160-205°С, выдерживание при достигнутой температуре осуществляют в течение 1-60 мин, а охлаждение полученной смеси проводят в присутствии кислорода с получением суспензии наночастиц Fe₂O₃.

Предлагаемый способ получения препарата является новым и не описан в патентной и научно-технической литературе.

Все использованные при получении предлагаемого препарата реагенты и расходные материалы (мембраны) коммерчески доступны.

Оптимальные значения исходной концентрации раствора ацетилацетоната трехвалентного железа в бензиловом спирте 48-70 г/л, продолжительность нагрева данного раствора 5-12 ч, температура до которой необходимо нагревать исходный раствор 160-205°С и продолжительность выдерживания нагретого раствора при достигнутой температуре 1-60 мин были установлены экспериментально. Указанные стадии синтеза так же, как и в прототипе, проводят в атмосфере инертного газа, в качестве которого можно использовать, например, азот, аргон, криптон и т.д. Так же, как и в прототипе, после выдерживания смеси при достигнутой температуре ее охлаждают до комнатной температуры. Однако, в отличие от прототипа, охлаждение проводят не в инертной атмосфере, а в присутствии кислорода. Для этого перед началом охлаждения перестают подавать в реакционный сосуд инертный газ, а подают либо кислород, либо воздух, ток которых вытесняет инертный газ. Также возможно прекращение подачи относительно легкого инертного газа, например, такого как азот, и извлечение из горла реакционного сосуда холодильника с последующим самопроизвольным поступлением в систему воздуха.

При этом экспериментально было обнаружено, что в данных условиях после охлаждение реакционной смеси (до комнатной температуры) в ней образуется суспензия наночастиц оксида железа Fe₂O₃, тогда как в прототипе описано образование наночастиц только Fe₃O₄. Образование в данных условиях именно Fe₂O₃ было экспериментально доказано методом Мессбауэровской спектроскопии (см. пример 1).

Методом просвечивающей электронной микроскопии было показано, что в предлагаемом техническом решении образуется МНЧ, имеющие размер (3-12)±1 нм. При этом после получения суспензии наночастиц Fe₂O₃ для их осаждения в нее добавляют водорастворимый полярный органический растворитель, в качестве которого можно использовать, например, ацетон, этанол, ацетонитрил и т.д. Можно также использовать смеси водорастворимых полярных органических растворителей. При этом соотношение объемов ранее использованного бензилового спирта и вводимого водорастворимого полярного органического растворителя может быть различным.

После этого проводят отделение полученных МНЧ путем их осаждения с использованием, например, центрифугирования или магнитной декантации, промывки осевших наночастиц Fe₂O₃ водорастворимым органическим растворителем и удаления растворителя, например, с использованием роторного испарителя. При использовании центрифугирования скорость вращения ротора центрифуги и продолжительность центрифугирования могут быть различными.

При осуществлении способа навеску полученных сухих МНЧ помещают в воду, добавляют в полученную смесь водный, например, 1М раствор щелочи до получения значений рН смеси, например, 10-11, затем ресуспендируют МНЧ перемешиванием или с использованием УЗ с получением суспензии, содержание Fe₂O₃ в которой может быть различно и составлять, например, 2-8 мг/мл. При этом можно использовать различные щелочи, например, NaOH, KOH, LiOH и т.д. После этого полученную суспензию смешивают с водным щелочным раствором ЧСА, концентрация которого может быть различна и составлять, например, 4-16 мг/мл. При этом преимущественно значения рН суспензии МНЧ и раствора ЧСА, а также соотношения объемов суспензии МНЧ и раствора ЧСА, должны быть одинаковыми или отличаться незначительно.

После смешения вышеуказанных растворов полученную смесь инкубируют (выдерживают) в течение определенного времени, например, в течение 10-20 мин. При этом для получения более однородных по размеру наночастиц выдержку целесообразно проводить при постоянном или периодическом перемешивании и для удобства ее целесообразно осуществлять при комнатной температуре. После этого проводят очистку полученной смеси от низкомолекулярных продуктов, например, диализом против воды и фильтрацией через шприцевой фильтр с диаметром пор 0,22-0,45 мкм для отделения нежелательных агрегатов МНЧ.

Очищенную суспензию смешивают с водным раствором глутарового альдегида, который для получения более однородного по строению продукта целесообразно добавлять по каплям при постоянном перемешивании. При этом известно [Migneault I. et al. Glutaraldehyde: behavior in aqueous solution, reaction with proteins, and application to enzyme crosslinking // Biotechniques. - 2004. - T. 37. - №.5. - C. 790-802], что глутаровый альдегид является неизбирательным сшивающим агентом первичных аминогрупп, содержащихся в ЧСА, с образованием основания Шиффа. В процессе такой обработки соотношение объемов суспензий МНЧ и раствора глутарового альдегида, а также концентрации раствора глутарового альдегида, могут быть различными.

После смешения вышеуказанных компонентов полученную смесь инкубируют, например, в течение 10-30 мин при постоянном или периодическим перемешивании, затем для восстановления неустойчивых двойных связей между углеродом и азотом в полученных основаниях Шиффа в смесь добавляют раствор восстанавливающего агента боргидрида натрия, концентрация которого и соотношение объемов смеси и раствора NaBH₄ могут быть различными. Для получения более однородного по составу продукта полученную смесь инкубируют в течение определенного времени, например, в течение 1-3 ч. Также возможно перед смешением суспензии обработанных глутаровым альдегидом МНЧ с раствором боргидрида натрия в суспензию дополнительно вводить водный щелочной раствор глицина.

На заключительном этапе синтеза проводят очистку полученной суспензии МНЧ, которую осуществляют методом ультрафильтрации на фильтрах с диаметром пор 100-300 кДа. Ультрафильтрацию проводят при добавлении новых порций воды либо буферного раствора, состав которого может быть различным. После этого получают контрастный препарат для диагностики новообразований методом МРТ, выполненный в виде суспензии модифицированных наночастиц Fe₂O₃. Также возможна лиофильная сушка полученной суспензии с получением лиофилизата, который перед использованием ресуспендируют в воде, буфере или водно-солевом растворе. В любом случае перед внутривенным введением суспензии препарата целесообразно проводить ее стерилизацию, например, путем фильтрации с использованием специальных фильтров.

Продолжительность хранения препарата определяют по отсутствию образования визуально обнаруживаемой взвеси в его суспензии или инструментально определяемому увеличению размеров наночастиц препарата в ней выше 60 нм.

Содержание железа в полученной суспензии препарата определяют традиционным методом атомно-эмиссионной спектроскопии с использованием индуктивно-связанной плазмы в качестве источника возбуждения. На первом этапе строят калибровочную кривую с использованием стандартных водных растворов различной концентрации железа в диапазоне от 500 до 2000 нг/мл. Затем готовят водный раствор образца с концентрацией железа в диапазоне от 500 до 2000 нг/мл, и исследуют на приборе. Полученное значение концентрации железа в водном растворе образца определяют с использованием полученной калибровочной кривой, после чего определяют концентрацию железа в исходном образце с учетом произведенных разбавлений.

Описанный в предложенном способе препарат малотоксичен и при внутривенном введении может быть использован для выявления новообразований (онкологических заболеваний) у животных и людей, поскольку он содержит ЧСА, раствор которого продается в аптечной сети и предназначен для внутривенных инъекций человеку.

В ходе облучения пациента радиочастотным возбуждающим импульсом резонансной частоты во время проведения МРТ-исследования происходит переход части протонов с нижнего энергетического уровня на верхний. Также протоны, получившие новый импульс, начинают прецессию вокруг внешнего магнитного поля, находясь в первоначальный момент в одной фазе. Затем происходит возвращение протонов с верхнего уровня на нижний с испусканием энергии. Данные процесс называется спин-решеточной или Т1 релаксацией. Одновременно происходит расфазировка спинов протонов, изначально находившихся в когерентном состоянии. При расфазировке интенсивность сигнала падает, и данный процесс называется спин-спиновой или Т2 релаксацией. На скорость расфазировки спинов влияют такие параметры, как негомогенность внешнего магнитного поля, а также присутствие магнитных материалов, неоднородно изменяющих окружение протонов воды. Именно за счет своих магнитных свойств наночастицы оксида железа искажают изначально гомогенное магнитное поле внутри томографа, способствуют расфазировке протонов и приводят к уменьшению времени Т2 релаксации протонов, которое в свою очередь приводит к уменьшению интенсивности сигнала в области накопления наночастиц. Таким образом, магнитные наночастицы являются негативными контрастными агентами, уменьшая яркость (интенсивность) на МРТ-снимке. Однако, важно заметить, что среди большого разнообразия магнитно-резонансных последовательностей существуют такие, которые более чувствительны именно к изменениям Т2 времени релаксации ткани, в частности Т2 и Т2* взвешенные последовательности. Как правило Т2* последовательности гораздо более чувствительны к локальному изменению магнитного поля, в том числе вызываемого частицами, однако именно в силу высокой чувствительности к неоднородностям магнитного поля эти режимы склонны к образованию артефактов при получении МРТ-снимков.

Как было сказано ранее, Т2 контрастные агенты в первую очередь ускоряют Т2* и Т2 время релаксации, поэтому их оценка производится с помощью специальных импульсных последовательностей, отличных от используемых с Т1 контрастными агентами. Чаще всего используют импульсную последовательность «градиентное эхо» с получением Т2* взвешенных изображений (Т2*ВИ). Однако со временем была разработана и вошла в широкую практику импульсная последовательность, обеспечивающая еще большую чувствительность к изменениям в Т2* времени релаксации ткани - Susceptibility Weighted Imaging (SWI). SWI был разработан Mark Haacke и коллегами [E. Mark Haacke et al. Susceptibility weighted imaging (SWI) // Magnetic Resonance in Medicine. - 2004. - T. 52. - C. 612-618], и с 2007 года стал широко применяться в клинической практике. Это специальная импульсная последовательность в МРТ, обладающая сильной взвешенностью по магнитной восприимчивости, что позволяет визуализировать на получаемых изображениях венозную кровь (следовательно, вены), кровоизлияния на различных стадиях биодеградации гемоглобина и депо (места скопления) железа. Благодаря высокой чувствительности к изменениям Т2* времени релаксации ткани по сравнению с градиентными Т2*ВИ, режим SWI лучше подходит для визуализации и изучения Т2 контрастных агентов. SWI основан на импульсной последовательности «градиентное эхо» с подавлением потока по трем направлениям, с использованием очищающих градиентов и длинного времени эха (ТЕ), обеспечивающего Т2* взвешенность. Помимо амплитуды получаемого МРТ-сигнала для построения изображений, также используют его фазовую составляющую, что обеспечивает чувствительность SWT к изменениям в магнитной восприимчивости ткани.

Фазовые изображения позволяют выявлять локальную разницу в магнитной восприимчивости между различными тканями. К фазовым изображениям, после их построения, применяют фильтр верхних частот для избавления от нежелательных низкочастотных артефактов, обусловленных общей неоднородностью магнитного поля томографа и затем нелинейный фильтр интенсивности, в результате чего получают фазовую маску. Затем полученную фазовую маску последовательным перемножением объединяют с изображениями, построенными по амплитуде МРТ-сигнала. МНЧ характеризуются суперпарамагнитными свойствами, в связи с чем их магнетизм индуцируется при приложении внешнего магнитного поля и исчезает после его удаления. Контрастный препарат на основе модифицированных магнитных наночастиц уменьшает значения Т2, Т2* и Т1 времен релаксации, особенно Т2* времени релаксации. Визуализируются наночастицы как зоны гипоинтенсивного сигнала на МРТ-снимках, и поэтому магнитные наночастицы оксида железа носят название негативного контрастного агента.

МРТ исследование опухолеобразования проводят с использованием 7Т магнитно-резонансного томографа (ClinScan, Bruker). Для получения Т2-ВИ в коронарной плоскости используют частотное подавление сигнала жировой ткани со следующими параметрами последовательности Turbo Spin Echo (TSE): TPv/TE=4000/43 мс, толщиной среза 0,5 мм, матрицей 288×320, FOV=40 мм. Для Т2-ВИ в трансверсальной плоскости: TR/TE=5110/57 мс, толщина среза 0,5 мм, матрица 288×320, FOV=40 мм. Для получения Т2*ВИ используют режим SWI со следующими параметрами: TE/TR=19/50 мс, толщина среза 0,5 мм, FOV=30 мм, разрешение 256/176. Для каждого животного получают серию изображений в Т2 взвешенных и SWI режимах до внутривенного введения препарата, полученного с помощью предлагаемого способа, в течение 30 мин после его внутривенного введения, а также через 2 и 24 ч после его введения.

Преимущества предлагаемого способа получения препарата иллюстрируют следующие примеры.

Пример 1.

В трехгорлую круглодонную стеклянную колбу со шлифами, расположенную над электрической плиткой с функцией магнитного перемешивания и регулируемой мощностью нагрева, снабженную обратным холодильником, термометром и трубкой с краном для подачи газа, помещают 220 мл раствора ацетилацетоната железа (III) в бензиловом спирте с концентрацией 48 г/л. После этого в колбу подают ток аргона, включают плитку и мешалку, и нагревают содержимое колбы в течение 12 ч до 205°С, после чего выдерживают при достигнутой температуре 205°С в течение 1 мин. Затем убирают плитку и охлаждают содержимое колбы до комнатной температуры на воздухе, осуществляя охлаждение при подаче в колбу тока кислорода. Получают суспензию наночастиц оксида железа, для отделения которых суспензию переносят в химический стакан, в который затем добавляют 176 мл водорастворимого полярного органического растворителя - ацетона, содержимое стакана вначале перемешивают, затем переносят в центрифужную пробирку и проводят отделение наночастиц центрифугированием при 900 g в течение 10 мин.

Осевшие наночастицы трижды промывают порциями по 20 мл ацетона с последующим центрифугированием суспензии, осуществляя указанные стадии очистки наночастиц в течение трех раз. После этого к осадку добавляют 25 мл ацетона, смесь перемешивают, переносят в круглодонную колбу, которую для удаления ацетона присоединяют к роторному испарителю и проводят сушку до постоянной массы осадка. Получают 2200 мг наночастиц оксида железа.

Методом просвечивающей электронной микроскопии было показано, что в примере образуются наночастицы с формой, близкой к сферической, со средним диаметром 3 нм. Методом Месбауэровской спектроскопии было показано, что в примере образуются наночастицы Fe₂O₃, а образование наночастиц Fe₃O₄ не происходит.

На Фиг. 1 приведен мессбауэровский спектр МНЧ, полученных в примере 1, записанный при температуре 10K. По оси абсцисс указана скорость в мм/с, по оси ординат указана интенсивность сигнала в относительных единицах. Спектр представляет собой хорошо разрешенный секстет со следующими сверхтонкими параметрами: изомерный сдвиг δ=0,39(1) мм/с, квадрупольное смещение ε=0,00 мм/с, значение магнитного сверхтонкого поля в точке максимума H_max=51,2(2) Т для ионов Fe³⁺, занимающих тетраэдрические пустоты в кристаллической структуре шпинели и изомерный сдвиг δ=0,50(1) мм/с, квадрупольное смещение ε=0,00 мм/с, значение магнитного сверхтонкого поля в точке максимума H_max=52,3(2) Т для ионов Fe³⁺, занимающих октаэдрические пустоты. Обозначенные на Фиг. цифрами 1 и 2 секстеты относятся к ионам железа в тетраэдрических и октаэдрических пустотах кристаллической структуры шпинели, соответственно. Полученные значения соответствуют справочному высокоспиновому состоянию ионов железа Fe³⁺ в маггемите γ-Fe₂O₃. Компонент, соответствующий ионам Fe²⁺ в Fe₃O₄, не был обнаружен, следовательно, в МНЧ доминирует фаза γ-Fe₂O₃.

20 мг полученных наночастиц смешивают с 10 мл дистиллированной воды, затем в полученную смесь добавляют 1М раствор NaOH до получения рН смеси, равного 10,0, и наночастицы ресуспендируют в щелочном растворе под действием УЗ с получением суспензии, содержащей наночастицы в концентрации 2 мг/мл. Полученную суспензию смешивают с 10 мл водного раствора NaOH с рН=10,0, содержащего растворенный ЧСА в концентрации 4 мг/мл, и полученную смесь инкубируют (выдерживают) в течение 10 мин при постоянном перемешивании, затем смесь очищают от крупных агрегатов частиц путем фильтрования на шприцевом фильтре. Получают 20 мл очищенной суспензии наночастиц, содержащей ЧСА и Fe₂O₃ в концентрациях 2 мг/мл и 1 мг/мл, соответственно, в которую для получения более однородного продукта по каплям добавляют 1,150 мл 5%-ного водного раствора глутарового альдегида, и полученную смесь инкубируют в течение 10 мин при постоянном перемешивании. Затем в полученную смесь добавляют 0,664 мл свежеприготовленного водного раствора NaBH₄ с концентрацией 5 мг/мл, смесь инкубируют в течение 1 ч и очищают трехкратной промывкой на центрифужном фильтре с пределом пропускания 100 кДа с введением после каждого центрифугирования 40 мл буферного раствора, имеющего состав 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na₂HPO₄ и 1,76 мМ KH₂PO₄. На заключительном этапе суспензию наночастиц стерилизуют путем фильтрования на шприцевом фильтре с мембраной с диаметром пор 0,2 мкм.

Получают суспензию модифицированных наночастиц Fe₂O₃, содержащую железо в концентрации 12,5 мг/мл. Методом динамического светорассеяния было показано, что гидродинамический диаметр полученных частиц составляет 42 нм. Полученная суспензия способна храниться без изменения диаметра наночастиц в течение не менее 2 мес.

Препарат, полученный описанным в примере способом, был использован для диагностики онкологического заболевания. В опыте использовали подопытных животных - крыс с привитой опухолью головного мозга - глиобластомой (клеточная линия С6). Диагностику проводят путем внутривенного введения полученной в примере суспензии модифицированных наночастиц Fe₂O₃, содержащей ионы железа в дозе 10 мг/кг тела подопытного животного, и серии МРТ исследований. МРТ исследования проводят с использованием 7Т томографа (ClinScan, Bruker). Для получения Т2-ВИ в коронарной плоскости использовали частотное подавление сигнала жировой ткани со следующими параметрами последовательности Turbo Spin Echo (TSE): TR/TE=4000/43 мс, толщина среза 0,5 мм, матрица - 288×320, FOV=40 мм. Для Т2-ВИ в трансверсальной плоскости: TR/TE=5110/57 мс, толщина среза 0,5 мм, матрица 288×320, FOV=40 мм. Для получения Т2*ВИ использовали режим SWI со следующими параметрами: TE/TR=19/50 мс, толщина среза 0,5 мм, FOV=30 мм, разрешение 256/176. Для животного с имплантированной опухолью получают серию МРТ-снимков в Т2 взвешенных и SWI режимах до внутривенного введения полученного в примере контрастного препарата, в течение 30 мин после его внутривенного введения, а также через 2 и 24 ч после его введения. Затем анализируют картину накопления негативного (Т2) контрастного препарата в опухоли, приводящего к возникновению гипоинтенсивных участков на МРТ-снимках изображениях, и делают вывод о наличии злокачественного новообразования у подопытного животного.

На Фиг. 2 приведены МРТ-снимки участка тела крысы с имплантированной опухолью глиобластомой С6 до а) и после б) введения суспензии модифицированных наночастиц Fe₂O₃. Стрелкой указано расположение новообразования у подопытного животного.

Из примера видно, что предлагаемый препарат позволяет диагностировать новообразование у подопытного животного.

Пример 2

В трехгорлую круглодонную стеклянную колбу со шлифами, расположенную над электрической плиткой с функцией магнитного перемешивания и регулируемой мощностью нагрева, снабженную обратным холодильником, термометром и трубкой с краном для подачи газа, помещают 55 мл раствора ацетилацетоната железа (III) в бензиловом спирте с концентрацией 60 г/л. После этого в колбу подают ток азота, включают плитку и мешалку, и нагревают содержимое колбы в течение 5 ч до 160°С, после чего выдерживают при достигнутой температуре 160°С в течение 60 мин. Затем убирают плитку и охлаждают содержимое колбы до комнатной температуры на воздухе, осуществляя охлаждение при подаче в колбу тока воздуха. Получают суспензию наночастиц оксида железа, для отделения которых суспензию переносят в химический стакан, в который затем добавляют 45 мл водорастворимого полярного органического растворителя - этанола, содержимое стакана вначале перемешивают, затем переносят в центрифужную пробирку и проводят отделение наночастиц центрифугированием при 800 g в течение 12 мин.

В пробирку с осевшими наночастицами добавляют 25 мл этанола, содержимое пробирки перемешивают, затем проводят повторное центрифугирование, после чего проводят еще 2 вышеописанные стадии очистки наночастиц. После последнего центрифугирования к осевшим наночастицам добавляют 15 мл этанола, содержимое пробирки перемешивают, затем переносят в круглодонную колбу, соединяют ее с роторным испарителем, включают испаритель и сушат наночастицы до постоянной массы осадка на стенках колбы. Получают 690 мг наночастиц оксида железа.

Методом просвечивающей электронной микроскопии было показано, что в примере образуются наночастицы с формой, близкой к сферической, со средним диаметром 8 нм. Методом Месбауэровской спектроскопии аналогично примеру 1 было показано, что в примере образуются только наночастицы Fe₂O₃, а образование наночастиц Fe₂O₄ не происходит.

80 мг полученных наночастиц смешивают с 20 мл дистиллированной воды, затем в полученную смесь добавляют 1М раствор KOH до получения рН смеси, равного 10,4, и наночастицы ресуспендируют в щелочном растворе под действием УЗ с получением суспензии, содержащей наночастицы в концентрации 4 мг/мл. Полученную суспензию смешивают с 20 мл водного раствора KOH с рН=10,4, содержащего растворенный ЧСА в концентрации 8 мг/мл, и полученную смесь инкубируют в течение 15 мин при постоянном перемешивании, затем смесь очищают от крупных агрегатов частиц путем фильтрования на шприцевом фильтре. Получают 40 мл очищенной суспензии наночастиц, содержащей ЧСА и железо в концентрациях 4 мг/мл и 2 мг/мл, соответственно, в которую для получения более однородного продукта по каплям добавляют 0,92 мл 25%-ного водного раствора глутарового альдегида, и полученную смесь инкубируют в течение 15 мин при постоянном перемешивании. Затем в полученную смесь добавляют 1,33 мл свежеприготовленного водного раствора NaBH₄ с концентрацией 10 мг/мл, смесь инкубируют в течение 2 ч и очищают трехкратной промывкой на центрифужном фильтре с пределом пропускания 30 кДа с введением после каждого центрифугирования 80 мл буферного раствора, имеющего состав 10 мМ Na₂HPO₄ и 1,76 мМ KH₂PO₄. На заключительном этапе суспензию наночастиц стерилизуют путем фильтрования на шприцевом фильтре с мембраной с диаметром пор 0,2 мкм.

Получают суспензию модифицированных наночастиц Fe₂O₃, содержащую железо в концентрации 20 мг/мл. Методом динамического светорассеяния было показано, что гидродинамический диаметр полученных частиц составляет 36 нм. Полученная суспензия способна храниться без изменения диаметра наночастиц в течение не менее 2 мес.

Препарат, полученный описанным в примере способом, был использован для диагностики онкологического заболевания у подопытных животных - мышей с привитой опухолью молочной железы - аденокарциномой (клеточная линия 4Т1). Диагностику проводят путем внутривенного введения полученной в примере суспензии модифицированных наночастиц Fe₂O₃, содержащей ионы железа в дозе 10 мг/кг тела подопытного животного, и серии МРТ исследований. МРТ исследования проводят с использованием 7Т томографа (ClinScan, Bruker). Для получения Т2-ВИ в коронарной плоскости используют частотное подавление сигнала жировой ткани со следующими параметрами последовательности Turbo Spin Echo (TSE): TR/TE=4000/43 мс, толщина среза 0,5 мм, матрица 288×320, FOV=40 мм. Для Т2-ВИ в трансверсальной плоскости: TR/TE=5110/57 мс, толщина среза 0,5 мм, матрица 288×320, FOV=40 мм. Для получения Т2*ВИ используют режим SWI со следующими параметрами: TE/TR=19/50 мс, толщина среза 0,5 мм, FOV=30 мм, разрешение 256/176. Для животного с имплантированной опухолью получают серию МРТ-снимков в Т2 взвешенных и SWI режимах до внутривенного введения полученного в примере контрастного препарата, в течение 30 мин после его введения, а также через 2 и 24 ч после его введения. Затем анализируют картину накопления негативного (Т2) контрастного препарата в опухоли, приводящего к возникновению гипоинтенсивных участков на МРТ изображениях, и делают вывод о наличии злокачественного новообразования у подопытного животного.

На Фиг. 3 приведены МРТ-снимки участка тела мыши с имплантированной опухолью аденокарциномой молочной железы 4Т1 до а) и после б) введения суспензии предлагаемого препарата. Стрелкой указано расположение новообразования у подопытного животного.

Из примера видно, что предлагаемый препарат позволяет диагностировать новообразование у подопытного животного.

Пример 3

Опыт проводят аналогично примеру 1, однако, используют ПО мл раствора ацетилацетоната железа (III) в бензиловом спирте с концентрацией 70 г/л, в колбу подают ток криптона, нагрев содержимого колбы осуществляют в течение 10 ч до 190°С, содержимое колбы выдерживают при 190°С в течение 30 мин, после переноса охлажденной суспензии наночастиц в химический стакан туда добавляют 90 мл ацетонитрила, отделение наночастиц проводят методом магнитной декантации с использованием постоянного магнита с магнитным полем силой 300 мТл с последующими двумя циклами очистки, каждый из которых включает добавление к осевшим наночастицам 50 мл ацетонитрила, перемешивание полученной смеси и отделение наночастиц с помощью последующей магнитной декантации. Затем к осевшим наночастицам добавляют 20 мл ацетонитрила, содержимое пробирки перемешивают, затем переносят в круглодонную колбу, соединяют ее с роторным испарителем, включают испаритель и сушат наночастицы до постоянной массы осадка на стенках колбы. Получают 1430 мг наночастиц оксида железа.

Аналогично примеру 1 было показано, что в опыте образуются наночастиц Fe₂O₃ со средним диаметром 12 нм.

40 мг полученных наночастиц смешивают с 5 мл дистиллированной воды, затем в полученную смесь добавляют 1М раствор LiOH до получения рН смеси, равного 11,0, и наночастицы ресуспендируют в щелочном растворе под действием УЗ с получением суспензии, содержащей наночастицы в концентрации 8 мг/мл. Полученную суспензию смешивают с 5 мл водного раствора LiOH с рН=11,0, содержащего растворенный ЧСА в концентрации 16 мг/мл, и полученную смесь инкубируют в течение 20 мин при постоянном перемешивании, затем смесь очищают от крупных агрегатов частиц путем фильтрования на шприцевом фильтре. Получают 10 мл очищенной суспензии наночастиц, содержащей ЧСА и железо в концентрациях 8 мг/мл и 4 мг/мл, соответственно, в которую для получения более однородного продукта по каплям добавляют 0,33 мл 35%-ного водного раствора глутарового альдегида, и полученную смесь инкубируют в течение 30 мин при постоянном перемешивании. Затем в полученную смесь добавляют 0,44 мл свежеприготовленного водного раствора NaBH₄ с концентрацией 15 мг/мл, смесь инкубируют в течение 3 ч и очищают трехкратной промывкой на центрифужном фильтре с пределом пропускания 100 кДа с введением после каждого центрифугирования 50 мл дистиллированной воды. На следующем этапе суспензию наночастиц стерилизуют путем фильтрования на шприцевом фильтре с мембраной с диаметром пор 0,2 мкм. После этого суспензию лиофильно сушат.

Получают 43 мг лиофилизата. После ресуспендирования лиофилизата в воде методом динамического светорассеяния было показано, что гидродинамический диаметр полученных частиц после хранения лиофилизата в течение 2 лет не изменился и составляет 55 нм. При этом, полученная из лиофилизата суспензия способна храниться без изменения диаметра наночастиц в течение не менее 2 мес.

Препарат, полученный описанным в примере способом, был использован для диагностики онкологического заболевания у подопытных животны - мышей с привитой опухолью толстой кишки - карциномой (клеточная линия СТ26). Диагностику проводят путем внутривенного введения полученной в примере суспензии модифицированных наночастиц Fe₂O₃, содержащей ионы железа в дозе 10 мг/кг тела подопытного животного, и серии МРТ исследований. МРТ исследования проводят с использованием 7Т томографа (ClinScan, Bruker). Для получения Т2-ВИ в коронарной плоскости используют частотное подавление сигнала жировой ткани со следующими параметрами последовательности Turbo Spin Echo (TSE): TR/TE=4000/43 мс, толщина среза 0,5 мм, матрица 288×320, FOV=40 мм. Для Т2-ВИ в трансверсальной плоскости: TR/TE=5110/57 мс, толщина среза 0,5 мм, матрица 288×320, FOV=40 мм. Для получения Т2*ВИ используют режим Градиентного Эха со следующими параметрами: TE/TR=10/400 мс, толщина среза 0,5 мм, FOV=31×40 мм, разрешение 200/256. Для животного с имплантированной опухолью получают серию МРТ-снимков в Т2 взвешенных и SWI режимах до внутривенного введения полученного в примере контрастного препарата, в течение 30 мин после его введения, а также через 2 и 24 ч после его введения. Затем анализируют картину накопления негативного (Т2) контрастного препарата в опухоли, приводящего к возникновению гипоинтенсивных участков на МРТ изображениях, и делают вывод о наличии злокачественного новообразования у подопытного животного.

На Фиг. 4 приведены МРТ-снимки участка тела мыши с имплантированной опухолью карциномой толстой кишки СТ26 до а) и после б) введения суспензии предлагаемого препарата. Стрелкой указано расположение новообразования у подопытного животного.

Из примера видно, что предлагаемый препарат позволяет диагностировать новообразование у подопытного животного.

Пример 4 (контрольный, по прототипу)

В трехгорлую круглодонную стеклянную колбу со шлифами, расположенную над электрической плиткой с функцией магнитного перемешивания и регулируемой мощностью нагрева, снабженную обратным холодильником, термометром и трубкой с краном для подачи инертного газа, помещают 220 мл раствора ацетилацетоната железа (III) в бензиловом спирте с концентрацией 100 мг/л. После этого в колбу подают ток азота, включают плитку и мешалку и нагревают содержимое колбы в течение 5 ч до температуры кипения бензилового спирта 205,5°С, после чего выдерживают при этой температуре в течение 30 мин. Затем убирают плитку и охлаждают содержимое колбы на воздухе до комнатной температуры, прекращают подачу в колбу инертного газа, полученную суспензию наночастиц оксида железа Fe₃O₄ переносят в химический стакан и добавляют в суспензию 90 мл ацетона. Полученную смесь вначале перемешивают, затем переносят в центрифужную пробирку и наночастицы отделяют от жидкости центрифугированием при 900 g в течение 10 мин. В пробирку с осевшими наночастицами добавляют 250 мл ацетона, содержимое пробирки перемешивают, затем проводят повторное центрифугирование, после чего проводят еще 2 вышеописанные стадии очистки наночастиц. После последнего центрифугирования к осевшим наночастицам добавляют 50 мл ацетона, содержимое пробирки перемешивают, затем переносят в круглодонную колбу, соединяют ее с роторным испарителем, включают испаритель и сушат наночастицы до постоянной массы осадка наночастиц на стенках колбы. Получают 4700 мг наночастиц Fe₃O₄.

Методом просвечивающей электронной микроскопии было показано, что в данных условиях образуются наночастица со средним размером 10 нм.

20 мг полученных наночастиц смешивают с 10 мл дистиллированной воды, затем в полученную смесь добавляют 1М раствор NaOH до получения рН смеси, равного 10,0, и наночастицы ресуспендируют в полученном растворе под действием УЗ с получением суспензии, содержащей наночастицы в концентрации 2 мг/мл. Полученную суспензию смешивают с 10 мл водного раствора NaOH с рН=10,0, содержащего растворенный ЧСА в концентрации 4 мг/мл, и полученную смесь инкубируют в течение 10 мин при постоянном перемешивании, затем смесь очищают от крупных агрегатов частиц путем фильтрования на шприцевом фильтре. Получают 20 мл очищенной суспензии наночастиц, содержащей ЧСА и железо в концентрациях 2 мг/мл и 1 мг/мл, соответственно, в которую для получения более однородного продукта по каплям добавляют 1,15 мл 5%-ного водного раствора глутарового альдегида, и полученную смесь инкубируют в течение 10 мин при постоянном перемешивании. Затем в полученную смесь добавляют 0,665 мл свежеприготовленного водного раствора NaBH₄ с концентрацией 5 мг/мл, смесь инкубируют в течение 1 ч и очищают трехкратной промывкой на центрифужном фильтре с пределом пропускания 100 кДа с введением после каждого центрифугирования 40 мл буферного раствора, имеющего состав 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na₂HPO₄ и 1,76 мМ KH₂PO₄.

Получают суспензию модифицированных наночастиц Fe₃O₄, содержащую железо в концентрации 5,5 мг/мл. Методом динамического светорассеяния было показано, что гидродинамический диаметр полученных частиц составляет 48 нм. Полученная суспензия способна храниться без изменения диаметра наночастиц в течение 1 мес.

Таким образом, из приведенных примеров видно, что у предложенного препарата действительно в 2 раза повышается продолжительность его хранения как в виде суспензии, так и в виде лиофилизата.

Claims (1)

1. Способ получения препарата для диагностики новообразований методом магнитно-резонансной томографии путем нагрева при перемешивании раствора ацетилацетоната железа (III) в бензиловом спирте и его выдерживания при достигнутой температуре, проводимыми в атмосфере инертного газа, с последующим охлаждением полученной смеси с получением суспензии наночастиц оксида железа, добавлением в суспензию водорастворимого полярного органического растворителя, отделением наночастиц, их ресуспендированием в водном растворе щелочи, смешением полученной суспензии с водным щелочным раствором человеческого сывороточного альбумина, инкубированием смеси и ее очисткой, добавлением в суспензию водного раствора глутарового альдегида, инкубированием смеси, добавлением в смесь раствора боргидрида натрия, инкубированием смеси и ее очисткой, отличающийся тем, что используют раствор ацетилацетоната железа (III) с концентрацией 48-70 г/л, нагрев проводят в течение 5-12 ч до температуры 160-205°С, выдерживание при достигнутой температуре осуществляют в течение 1-60 мин, а охлаждение полученной смеси проводят в присутствии кислорода с получением суспензии наночастиц Fe₂O₃.

Images