RU2720801C1

RU2720801C1 - RADIONUCLIDE DIAGNOSTIC TECHNIQUE FOR BREAST CANCER WITH Her2/neu HYPEREXPRESSION

Info

Publication number: RU2720801C1
Application number: RU2019103792A
Authority: RU
Inventors: Ольга Дмитриевна Брагина; Владимир Иванович Чернов; Роман Владимирович Зельчан; Анна Александровна Медведева; Иван Геннадьевич Синилкин; Владимир Максимилианович Толмачев; Анжелика Григорьевна Воробьева; Сергей Михайлович Деев; Наталья Анатольевна Тарабановская; Юлия Леонидовна Кокорина; Екатерина Александровна Дудникова; Василиса Андреевна Шаталова; Елена Михайловна Слонимская; Виктор Евгеньевич Гольдберг
Priority date: 2019-02-11
Filing date: 2019-02-11
Publication date: 2020-05-13

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: invention refers to medicine, oncology, particularly to radionuclide diagnostics, and can be used for diagnosing breast cancer with hyperexpression of Her2/neu. Patients are introduced with a radiopharmaceutical based on technetium-99m labeled recombinant address molecules DARPinG3, prepared immediately before administration, for this purpose in aseptic conditions 500 mcl of eluate ^99mTcO^4- 4 GBq by means of syringe is added to set for preparation of tricarbonyl technetium and incubated at temperature 100 °C for 30 minutes, after incubation 1 ml of tricarbonyl technetium is added to 1,200 mcg of DARPinG3 solution and incubated at temperature 40 °C for 60 minutes, further purifying the obtained compound from protein impurities and non-technetium-bound DARPinG3 molecules using purification columns NAP5, preparation obtained after cleansing preparation with activity of 400–500 MBq is diluted in 10 ml of normal saline, taken through sterilizing filter and slowly introduced to patient, then 2 hours after administration of the preparation, the patient is subjected to single photon emission computed tomography on a two-detector gamma camera and the obtained results are evaluated, and the malignant tumor is diagnosed when visualizing the RPH fixation in the mammary glands and the regional lymph nodes.

EFFECT: higher specificity, information value, accessibility with reduced complications.

1 cl, 2 ex, 3 dwg

Description

Изобретение относится к области медицины, онкологии и может быть использовано для радионуклидной диагностики рака молочной железы с гиперэкспрессией Her2/neu.The invention relates to medicine, oncology and can be used for radionuclide diagnosis of breast cancer with overexpression of Her2 / neu.

В настоящее время для диагностики злокачественных образований все большее распространение получают таргетные радионуклидные методы, обладающие высокой специфичностью к различным молекулярным мишеням, расположенным на поверхности мембран опухолевых клеток и позволяющим визуализировать очаги различных размеров (основной опухолевый узел и метастатические очаги) [Чернов В.И., Медведева А.А., Синилкин И.Т., и соавторы. Ядерная медицина в диагностике и адресной терапии злокачественных новообразований. Бюллетень сибирской медицины. 2018; 17(1):220-231]. До недавнего времени в качестве основного компонента радиоиммуноконъюгата использовались моноклональные антитела (мкАТ) [Tolmachev V., Orlova A., Andersson K. Methods for radiolabelling of monoclonal antibodies. Methods Mol Biol. 2014; 1060: 309-30], однако результаты исследований с применением мкАТ не оправдали возложенных на них ожиданий и выявили ряд особенностей, существенно ограничивающих их применение в клинической практике. При тщательном изучении оказалось, что мкАТ обладают значительно сниженной эффективностью взаимодействия с антигеном, неоптимальными фармакологическими свойствами, медленным распределением в организме, плохим проникновением в ткани и выведением почками (из-за высокой молекулярной массы 150 кДа) и высокой иммуногенностью [Azhar A., Ahmad Е., Zia Q., et. al. Recent advances in the development of novel protein scaffolds based therapeutics. International Journal of Biological Macromolecules. 2017; 102: 630-641].Currently, targeted radionuclide methods are used for the diagnosis of malignant tumors, which are highly specific for various molecular targets located on the surface of tumor cell membranes and allow visualization of foci of various sizes (the main tumor node and metastatic foci) [Chernov V.I., Medvedeva A.A., Sinilkin I.T., and co-authors. Nuclear medicine in the diagnosis and targeted therapy of malignant neoplasms. Bulletin of Siberian medicine. 2018; 17 (1): 220-231]. Until recently, monoclonal antibodies (mAbs) were used as the main component of the radioimmunoconjugate [Tolmachev V., Orlova A., Andersson K. Methods for radiolabelling of monoclonal antibodies. Methods Mol Biol. 2014; 1060: 309-30], however, the results of studies using μAB did not meet their expectations and revealed a number of features that significantly limit their use in clinical practice. A thorough study showed that mAbs have significantly reduced efficiency of interaction with antigen, non-optimal pharmacological properties, slow distribution in the body, poor penetration into tissues and excretion by the kidneys (due to the high molecular weight of 150 kDa) and high immunogenicity [Azhar A., Ahmad E., Zia Q., et. al. Recent advances in the development of novel protein scaffolds based therapeutics. International Journal of Biological Macromolecules. 2017; 102: 630-641].

В связи с поиском новых эффективных агентов, способных нацеливаться на специфические мишени, началось интенсивное изучение молекулярных конструкций, альтернативных связывающим доменам антител и имеющих ряд обязательных характеристик, таких как, связывание исключительно с «таргетным» антигеном для специфической локализации, отсутствие иммуногенности, стабильность и возможность быстрой химической модификации для проведения процессов мечения [Nicholes N., Date A., Beaujean P., et. al. Modular protein switches derived from antibody mimetic proteins. Protein Engineering, Design and Selection. 2016; 29: 77-85]. Помимо этого оптимальной функцией для радионуклидной визуализации является скорость связывания препарата с мишенью и быстрое удаление несвязавшихся молекул из организма пациента для достижения высокого качества визуализации опухоли и сокращения временного промежутка между инъекцией и началом исследования [Stumpp М., Binz H., Amstutz P. DARPins: A new generation of protein therapeutics. Drug Discovery Today. 2008; 13 (15): 695-701].In connection with the search for new effective agents capable of targeting specific targets, an intensive study of molecular constructs, alternative to the binding domains of antibodies and having a number of mandatory characteristics, began, such as binding exclusively to the “targeted” antigen for specific localization, lack of immunogenicity, stability and ability rapid chemical modification for labeling [Nicholes N., Date A., Beaujean P., et. al. Modular protein switches derived from antibody mimetic proteins. Protein Engineering, Design and Selection. 2016; 29: 77-85]. In addition, the optimal function for radionuclide imaging is the rate of binding of the drug to the target and the rapid removal of unbound molecules from the patient's body to achieve high quality imaging of the tumor and to shorten the time between injection and the start of the study [Stumpp M., Binz H., Amstutz P. DARPins: A new generation of protein therapeutics. Drug Discovery Today. 2008; 13 (15): 695-701].

В течение последнего десятилетия большую популярность приобретает новый класс таргетных молекул, получивших название «альтернативные каркасные белки» (АКБ) или «скаффолды» (scaffolds) и отвечающих всем требованиям для оптимальной доставки радионуклида к опухолевым клеткам [

A. Designed ankyrin repeat proteins (DARPins): binding proteins for research, diagnostics, and therapy. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 2015; 55: 489-511]. Одними из представителей рекомбинантных адресных молекул являются дарпины (DARPin, Design Ankyrin Repeat Protein), представляющие собой естественные анкириновые повторы пептида, состоящего из повторяющихся доменов длиной 33 а.о. и обладающего стабильной структурой из β-поворота и двух

. Обычно белки представлены 4-6 модулями с суммарной молекулярной массой от 14 до 21 кДа (молекулярная масса каждого 3,5 кДа) [Hanenberg М., McAfoose J., Kulic L. Amyloid-β peptide-specific DARPins as a novel class of potential therapeutics for Alzheimer disease. J Biol Chem. 2014; 26: 27080-27089]. Основными преимуществами данных молекул являются небольшой размер, стабильная структура, высокая специфичность и аффинность к антигену, а также значительно более низкая стоимость производства, обусловленная их экспрессией в бактериальных средах [Kramer L., Renko М.,

J., et.al Non-invasive in vivo imaging of tumour-associated cathepsin В by a highly selective inhibitory DARPin. Theranostics. 2017; 8: 2806-2821].Over the past decade, a new class of targeted molecules has become very popular, called “alternative framework proteins” (ACBs) or “scaffolds” that meet all the requirements for optimal delivery of a radionuclide to tumor cells [

A. Designed ankyrin repeat proteins (DARPins): binding proteins for research, diagnostics, and therapy. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 2015; 55: 489-511]. One of the representatives of recombinant targeted molecules are darpins (DARPin, Design Ankyrin Repeat Protein), which are natural ankyrin repeats of a peptide consisting of repeating domains 33 aa long. and having a stable structure of β-turn and two

. Typically, proteins are represented by 4-6 modules with a total molecular weight of 14 to 21 kDa (each molecular weight is 3.5 kDa) [Hanenberg M., McAfoose J., Kulic L. Amyloid-β peptide-specific DARPins as a novel class of potential therapeutics for Alzheimer disease. J Biol Chem. 2014; 26: 27080-27089]. The main advantages of these molecules are small size, stable structure, high specificity and affinity for the antigen, as well as significantly lower production costs due to their expression in bacterial environments [Kramer L., M. Renko,

J., et.al Non-invasive in vivo imaging of tumor-associated cathepsin B by a highly selective inhibitory DARPin. Theranostics. 2017; 8: 2806-2821].

Наиболее часто используемым радионуклидом для проведения диагностических исследований как на территории Российской Федерации, так и в мире, остается короткоживущий (T_1/2=6,02 ч) технеций-99м (^99mTc), препараты которого изготавливаются в виде стандартных наборов реагентов (лиофилизатов) к генератору технеция-99м [Лыков А.В. Сублимационная сушка // В кн.: Теория сушки. - М., Энергия. - 1968. - С. 334-362].The most commonly used radionuclide for conducting diagnostic studies both in the Russian Federation and in the world is the short-lived (T _1/2 = 6.02 h) technetium-99m ( ^99m Tc), the preparations of which are manufactured in the form of standard sets of reagents (lyophilisates ) to the technetium-99m generator [Lykov A.V. Freeze-drying // In the book: Theory of drying. - M., Energy. - 1968. - S. 334-362].

Одной из наиболее изучаемых молекулярных мишеней по-прежнему остается рецептор эпидермального роста Her2/neu, наличие экспрессии которого выявляется на поверхности опухолевых клеток при раке легкого, яичников, желудка, простаты и пр. [Slamon D.J., Clark G.M., Wong S.G., et. al. Human breast cancer: correlation of relapse a survival with amplification of the Her-2/neu oncogenes. Science. 1987; 235: 177-182]. Особое место среди злокачественных новообразований занимает рак молочной железы (РМЖ), гиперэкспрессия и/или амплификация гена Her2 клетками при котором относится к одному из неблагоприятных прогностических факторов, обуславливающих агрессивное течение опухолевого процесса, а также низкие показатели общей и безрецидивной выживаемости [Romond Е.Н., Perez E.A., Bryant J., Suman V.J., et. al. Trastuzumab plus adjuvant chemotherapy for operable HER2-positive breast cancer. N. Engl. J. Med. 2005; 353: 1673-1684]. По данным различных исследований частота вновь выявленных случаев инвазивного РМЖ с гиперэкспрессией Her2/neu составляет 15-25%, и чаще всего этот показатель возрастает у пациенток с высокой степенью злокачественности и с метастатическим поражением регионарных лимфатических узлов.One of the most studied molecular targets remains the Her2 / neu epidermal growth receptor, the expression of which is detected on the surface of tumor cells in cancer of the lung, ovaries, stomach, prostate, etc. [Slamon D.J., Clark G.M., Wong S.G., et. al. Human breast cancer: correlation of relapse a survival with amplification of the Her-2 / neu oncogenes. Science. 1987; 235: 177-182]. A special place among malignant neoplasms is occupied by breast cancer (BC), overexpression and / or amplification of the Her2 gene by cells in which it belongs to one of the unfavorable prognostic factors that determine the aggressive course of the tumor process, as well as low rates of overall and disease-free survival [Romond E.N. ., Perez EA, Bryant J., Suman VJ, et. al. Trastuzumab plus adjuvant chemotherapy for operable HER2-positive breast cancer. N. Engl. J. Med. 2005; 353: 1673-1684]. According to various studies, the frequency of newly detected cases of invasive breast cancer with Her2 / neu overexpression is 15-25%, and most often this indicator increases in patients with a high degree of malignancy and with metastatic lesion of the regional lymph nodes.

В настоящее время для определения статуса Her2/neu активно применяют несколько методик: иммуногистохимическое исследование (ИГХ), флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) и хромогенная гибридизация in situ (CISH) [Zahid M., Khan S., Khan R. Detection of Her2/neu gene amplification by fluorescence in situ hybridization technique. Pathology. 2016; 48 (1): 163-170]. Однако при несомненных достоинствах используемых методов они имеют ряд существенных недостатков, к которым можно отнести невозможность проведения in vivo исследования для оценки распространенности опухолевого процесса (первичный опухолевый узел, состояние регионарных лимфатических узлов, оценка отдаленных органов и тканей) [Orlando L., Viale G, Bria E. et.al. Discordance in pathology report after central pathology review: Implications for breast cancer adjuvant treatment. Breast. 2016; 30: 151-155], гетерогенность опухоли, а также недоступность материально-технического оснащения в большинстве лабораторий на территории Российской Федерации [Telugu R.B., Chowhan А.K., Rukmangadha N., et. al. Human epidermal growth factor receptor 2/neu protein expression in meningiomas: An immunohistochemical study. J. Neurosci Rural Pract. 2016; 7 (4): 526-531].Currently, several methods are actively used to determine the status of Her2 / neu: immunohistochemical studies (IHC), fluorescence in situ hybridization (FISH) and chromogenic in situ hybridization (CISH) [Zahid M., Khan S., Khan R. Detection of Her2 / neu gene amplification by fluorescence in situ hybridization technique. Pathology. 2016; 48 (1): 163-170]. However, with the undoubted advantages of the methods used, they have a number of significant drawbacks, which include the inability to conduct in vivo studies to assess the prevalence of the tumor process (primary tumor node, the state of regional lymph nodes, evaluation of distant organs and tissues) [Orlando L., Viale G, Bria E. et.al. Discordance in pathology report after central pathology review: Implications for breast cancer adjuvant treatment. Breast. 2016; 30: 151-155], tumor heterogeneity, as well as inaccessibility of material and technical equipment in most laboratories in the Russian Federation [Telugu R.B., Chowhan A.K., Rukmangadha N., et. al. Human epidermal growth factor receptor 2 / neu protein expression in meningiomas: An immunohistochemical study. J. Neurosci Rural Pract. 2016; 7 (4): 526-531].

Известен способ диагностики злокачественных опухолей с гиперэкспрессией Her2/neu с использованием меченных индием-111 и йодом-125 альтернативных каркасных белков DARPinG3 (¹¹¹In-(HE)₃-G3 и ¹²⁵I-(HE)3-G3). Применяемый в известном способе радиофармацевтический препарат на этапе доклинических исследований продемонстрировал свою специфичность и фиксацию на поверхности мембран опухолевых клеток, экспрессирующих Her2/neu, что позволяет визуализировать как основной опухолевый узел, так и метастатические очаги [Goldstein R., Sosabowski J., Livanos M., et. al. Development of the designed ankyrin repeat protein (DARPin) G3 for HER2 molecular imaging. Eur J Nucl Med Mol Imaging (2015) 42:288-301]. Основным недостатком данного метода являются неоптимальные радиологические характеристики препаратов, связанные с длительным периодом полураспада (T_1/2=2,8 сут и Т_1/2=59,49 соответственно) и следовательно высокой дозой облучения на обследуемого, высокой стоимостью циклотронного производства, а также наличием в его спектре облучения высокоэнергетических гамма-квантов, препятствующих получению качественных сцинтиграфических изображений.A known method for the diagnosis of malignant tumors with overexpression of Her2 / neu using indium-111 and iodine-125-labeled alternative framework proteins DARPinG3 ( ¹¹¹ In- (HE) ₃ -G3 and ¹²⁵ I- (HE) 3-G3). Used in the known method, the radiopharmaceutical preparation at the preclinical stage of the study showed its specificity and fixation on the surface of the membrane of tumor cells expressing Her2 / neu, which allows visualization of both the main tumor node and metastatic foci [Goldstein R., Sosabowski J., Livanos M. , et. al. Development of the designed ankyrin repeat protein (DARPin) G3 for HER2 molecular imaging. Eur J Nucl Med Mol Imaging (2015) 42: 288-301]. The main disadvantage of this method is the non-optimal radiological characteristics of the preparations associated with a long half-life (T _1/2 = 2.8 days and T _1/2 = 59.49, respectively) and therefore a high dose of radiation for the subject, the high cost of cyclotron production, and also by the presence in its irradiation spectrum of high-energy gamma rays, which impede the acquisition of high-quality scintigraphic images.

Другим близким к предлагаемому способу является способ диагностики злокачественных опухолей с гиперэкспрессией Her2/neu с использованием меченных йодом-125 и технецием - 99m альтернативных каркасных белков DARPin9_29 ([¹²⁵I] I-DARPin 9_29 и ^99mTc]Tc(CO)₃-DARPin9_29) [Vorobyeva A., Bragina О., Altai М., et.al. Comparative Evaluation of Radioiodine and Technetium-Labeled DARPin 9 29 for Radionuclide Molecular Imaging of HER2 Expression in Malignant Tumors. Contrast Media & Molecular Imaging. 2018. 2018. 6930425].Another close to the proposed method is a method for the diagnosis of malignant tumors with overexpression of Her2 / neu using iodine-125 and technetium-labeled 99m alternative framework proteins DARPin9_29 ([ ¹²⁵ I] I-DARPin 9_29 and ^99m Tc] Tc (CO) ₃ -DARPin9_29) [Vorobyeva A., Bragina O., Altai M., et.al. Comparative Evaluation of Radioiodine and Technetium-Labeled DARPin 9 29 for Radionuclide Molecular Imaging of HER2 Expression in Malignant Tumors. Contrast Media & Molecular Imaging. 2018. 2018. 6930425].

Основным недостатком данного метода с использованием [¹²⁵I]I-DARPin9_29 являются неоптимальные радиологические характеристики препаратов, связанные с длительным периодом полураспада (Т_1/2=59,49 суток) и следовательно высокой дозой облучения на обследуемого, высокой стоимостью циклотронного производства, а также наличие в его спектре облучения высокоэнергетических гамма-квантов, препятствующих получению качественных сцинтиграфических изображений. Недостатком ^99mTc]Тс(СО)₃-DARPin9_29 является его высокая аккумуляция в печени, что делает практически невозможным выявление очагового поражения печени и проведения комплексного in vivo исследованияThe main disadvantage of this method using [ ¹²⁵ I] I-DARPin9_29 is the non-optimal radiological characteristics of the preparations associated with a long half-life (T _1/2 = 59.49 days) and, consequently, a high radiation dose per subject, high cost of cyclotron production, and the presence of high-energy gamma rays in its irradiation spectrum, which impede the acquisition of high-quality scintigraphic images. The disadvantage of ^99m Tc] Tc (CO) ₃ -DARPin9_29 is its high accumulation in the liver, which makes it almost impossible to identify focal liver damage and conduct a comprehensive in vivo study

Новый технический результат-повышение специфичности, информативности, доступности при снижении осложнений.A new technical result is an increase in specificity, information content, accessibility while reducing complications.

Для достижения нового технического результата в способе диагностики рака молочной железы с гиперэкспрессией Her2/neu, включающей введение радиофармацевтического препарата и проведение сцинтиграфического исследованиями этом вводят радиофармпрепарат основе меченных технецием-99m трекомбинантных адресных молекул DARPinG3, изготавливаемый непосредственно перед введением, для этого в асептических условиях 500 мкл элюата ^99mTcO^4- 4 ГБк с помощью шприца добавляют в набор для приготовления трикарбонильного технеция и инкубируют при температуре 100°С в течение 30 минут, после инкубации 500 мкл трикарбонильного технеция добавляют к 1200 мкг раствора DARPinG3 и инкубируют при температуре 40°С в течение 60 минут, в дальнейшем выполняют очистку полученного соединения от белковых примесей и несвязавшихся с технецием молекул DARPinG3 с использованием очистительных колонок NAP5, полученный после очищения препарат с активностью 400-500 МБк разбавляют в 10 мл физиологического раствора, забирают через стерилизующий фильтр и медленно вводят пациенту, далее через 2 часа после введения препарата пациенту выполняют однофотонную эмиссионную компьютерную томографию на двухдетекторной гамма-камере и оценивают полученные результаты и при визуализации участков гиперфиксации РФП в ткани молочных желез и регионарных лимфатических узлов диагностируют злокачественную опухоль.To achieve a new technical result in a method for the diagnosis of breast cancer with Her2 / neu overexpression, including the administration of a radiopharmaceutical and scintigraphic studies, a radiopharmaceutical based on technetium-99m labeled track-recombinant targeted molecules DARPinG3 manufactured immediately before administration is introduced, for this, under 500 aseptic conditions eluate ^99m TcO ^4- 4 GBq added via syringe to a kit for preparing technetium tricarbonyl and incubated at 100 ° C for 30 minutes, after incubation of 500 .mu.l tricarbonyl technetium added to 1200 g DARPinG3 solution and incubated at 40 ° C for 60 minutes, thereafter, the obtained compound is purified from protein impurities and DARPinG3 molecules not bound to technetium using NAP5 purification columns; after purification, a preparation with an activity of 400-500 MBq is diluted in 10 ml of physiological saline and taken through sterilizing filter and slowly injected into the patient, then 2 hours after the administration of the drug, the patient undergoes single-photon emission computed tomography on a two-detector gamma camera and evaluates the results obtained and, when visualizing areas of radiopharmaceutical hyperfixation in mammary gland tissue and regional lymph nodes, a malignant tumor is diagnosed.

Способ осуществляют следующим образом, радиофармацевтический препарат готовят непосредственно перед введением: в набор «CRS Isolink» (Center for Radiopharmaceutical Science, Paul Scherrer Institute, Villigen, Швейцария) для приготовления трикарбонильного технеция [^99mTc(СО)₃(H₂O)₃]⁺добавляют 500 мкл (4 ГБк) элюата ^99mTcO^4- и инкубируют в течение 30 минут при температуре 100°С. После инкубации 1 мл трикарбонильного технеция добавляют к 1200 мкг DARPinG3 и инкубируют при температуре 40°С в течение 60 минут (лабораторный регламент получения РФП ЛР-02069303-0217 от 03.02.2017 г). В дальнейшем выполняется очистка полученного соединения от белковых примесей и несвязавшихся с технецием молекул DARPinG3 с использованием очистительных колонок NAP-5 (GE Healthcare, Швеция). Радиохимические выход и чистоту определяют с помощью тонкослойной радиохроматографии (ТСРХ). Анализ хроматограмм проводят с использованием хроматографа Hitachi Chromaster HPLC systems с радиоактивным детектором. Полученный после очищения препарат в дозе 500 МБК разбавляют в 10 мл физраствора, забирают через стерилизующий фильтр и медленно вводят пациенту. Через 2 часа после введения пациенту выполняют однофотонную эмиссионную компьютерную томографию на двухдетекторной гамма-камере и оценивают полученные результаты.The method is as follows, the radiopharmaceutical preparation is prepared immediately before administration: to the CRS Isolink kit (Center for Radiopharmaceutical Science, Paul Scherrer Institute, Villigen, Switzerland) for the preparation of tricarbonyl technetium [ ^99m Tc (CO) ₃ (H ₂ O) ₃ ] ⁺ add 500 μl (4 GBq) of ^99m TcO ^{4 -} eluate and incubate for 30 minutes at 100 ° C. After incubation, 1 ml of tricarbonyl technetium is added to 1200 μg of DARPinG3 and incubated at 40 ° C for 60 minutes (laboratory procedure for obtaining radiopharmaceutical LR-02069303-0217 from 02/03/2017). Subsequently, the obtained compound is purified from protein impurities and DARPinG3 molecules not bound to technetium using NAP-5 purification columns (GE Healthcare, Sweden). The radiochemical yield and purity are determined using thin-layer radiochromatography (TLC). Chromatogram analysis is carried out using a Hitachi Chromaster HPLC systems chromatograph with a radioactive detector. The drug obtained after purification in a dose of 500 MBK is diluted in 10 ml of saline, taken through a sterilizing filter and slowly injected into the patient. 2 hours after administration, a single-photon emission computed tomography is performed on a two-detector gamma camera and the results are evaluated.

Способ основан на анализе результатов экспериментальных клинических исследований, для подтверждения, эффективности которого в выявлении злокачественных опухолей молочных желез с гиперэкспрессией Her2/neu были проведено изучение особенностей накопления радиофармацевтического препарата на основе меченных технецием-99 т рекомбинантных адресных молекул DARPinG3. С этой целью была сформирована группа из 10 пациенток с верифицированным диагнозом рака молочной железы T_1-4N_0-3M₀: исследуемую подгруппу составляли 7 пациенток с гиперэкспрессией Her2/neu, контрольную - 3 больных без экспрессии данного параметра. Всем пациенткам выполнялось гистологическое и иммуногистохимическое исследование биопсийного и операционного материалов. При значении Her2/neu 2+ проводился FISH анализ.The method is based on an analysis of the results of experimental clinical trials, to confirm the effectiveness of which in detecting malignant breast tumors with Her2 / neu overexpression, the peculiarities of the accumulation of a radiopharmaceutical based on technetium-99t-labeled recombinant targeted DARPinG3 molecules were studied. For this purpose, a group of 10 patients with a verified diagnosis of breast cancer T _1-4 N _0-3 M _{0 was formed} : the studied subgroup consisted of 7 patients with Her2 / neu overexpression, the control group consisted of 3 patients without expression of this parameter. All patients underwent histological and immunohistochemical examination of biopsy and surgical materials. At Her2 / neu 2+, a FISH analysis was performed.

Пациенткам внутривенно вводили радиофармацевтический препарат на основе меченных технецием-99m рекомбинантных адресных молекул DARPinG3 в дозе 500 МБк. Радиофармацевтический препарат готовили непосредственно перед введением согласно разработанному авторами лабораторному регламенту: в набор «CRS Isolink» (Center for Radiopharmaceutical Science, Paul Scherrer Institute, Villigen, Швейцария) для приготовления трикарбонильного технеция [^99mTc(СО)₃(H₂O)₃]⁺ добавляли 500 мкл (4 ГБк) элюата ^99mTcO^4- и инкубировали в течение 30 минут при температуре 100°С. После инкубации 1 мл трикарбонильного технеция добавляли к 1200 мкг DARPinG3 и инкубировали при температуре 40°С в течение 60 минут (лабораторный регламент получения РФП ЛР-02069303-0217 от 03.02.2017 г). В дальнейшем выполняли очистку полученного соединения от белковых примесей и несвязавшихся с технецием молекул DARPinG3 с использованием очистительных колонок NAP-5 (GE Healthcare, Швеция). Радиохимические выход и чистоту определяли с помощью тонкослойной радиохроматографии (ТСРХ). Анализ хроматограмм проводили с использованием хроматографа Hitachi Chromaster HPLC systems с радиоактивным детектором. Полученный после очищения препарат в дозе 500 МБК разбавляли в 10 мл физ. раствора, забирали через стерилизующий фильтр и медленно вводили пациенту.Patients were given an intravenous radiopharmaceutical based on technetium-99m-labeled recombinant targeted DARPinG3 molecules at a dose of 500 MBq. The radiopharmaceutical preparation was prepared immediately before administration according to the laboratory regulations developed by the authors: in the CRS Isolink kit (Center for Radiopharmaceutical Science, Paul Scherrer Institute, Villigen, Switzerland) for the preparation of tricarbonyl technetium [ ^99m Tc (CO) ₃ (H ₂ O) ₃ ] ⁺ 500 μl (4 GBq) of ^99m TcO ^4– eluate was added and incubated for 30 minutes at a temperature of 100 ° C. After incubation, 1 ml of tricarbonyl technetium was added to 1200 μg of DARPinG3 and incubated at 40 ° C for 60 minutes (laboratory procedure for obtaining radiopharmaceutical LR-02069303-0217 from 02/03/2017). Subsequently, the obtained compound was purified from protein impurities and technetically unbound DARPinG3 molecules using NAP-5 purification columns (GE Healthcare, Sweden). Radiochemical yield and purity were determined using thin-layer radiochromatography (TLC). Chromatogram analysis was performed using a Hitachi Chromaster HPLC systems chromatograph with a radioactive detector. Obtained after purification, the drug at a dose of 500 MBK was diluted in 10 ml of physical. solution, was taken through a sterilizing filter and slowly introduced to the patient.

Через 2 часа после введения препарата пациенту выполняли однофотонную эмиссионную компьютерную томографию на двухдетекторной гамма-камере Е.САМ фирмы SIEMENS в стандартном режиме. Производили запись 64 проекций в матрицу 64×64 пикселя с применением низкоэнергетических коллиматоров с энергией 140 КэВ. Окно дифференциального дискриминатора настроено на 20%, аппаратное увеличение не использовали. Полученные при исследовании изображения (сцинтиграммы) подвергали постпроцессинговой обработке с использованием фирменного пакета программ E.Soft (SIEMENS, Германия). Патологическими считались участки повышенной аккумуляции препарата в ткани молочной железы и регионарных лимфатических узлов (Фиг. 1, 2, 3). Кроме того, при постпроцессинговой обработке производили расчет индекса «опухоль/фон», отражающий соотношение накопления препарата в опухолевой ткани и в здоровой ткани молочной железы. Результаты исследования продемонстрировали 100% чувствительность способа в диагностике рака молочной железы с гиперэкспрессией Her2/neu, то есть с применением указанного радиофармпрепарата удалось выявить опухоль у всех 10 пациенток, включенных в исследование. Произведенные расчеты показали, что средние значения индекса «опухоль/фон» составили 6,73±0,08.2 hours after drug administration, a single-photon emission computed tomography was performed on a two-detector E.CAM gamma camera of SIEMENS company in standard mode. We recorded 64 projections into a 64 × 64 pixel matrix using low-energy collimators with an energy of 140 KeV. The differential discriminator window is set to 20%, the hardware magnification was not used. The images (scintigrams) obtained during the study were subjected to post-processing processing using the proprietary software package E.Soft (SIEMENS, Germany). Pathological areas were considered increased accumulation of the drug in the tissue of the mammary gland and regional lymph nodes (Fig. 1, 2, 3). In addition, during postprocessing, the tumor / background index was calculated, which reflects the ratio of drug accumulation in tumor tissue and in healthy breast tissue. The results of the study demonstrated 100% sensitivity of the method in the diagnosis of breast cancer with overexpression of Her2 / neu, that is, using the indicated radiopharmaceutical, it was possible to identify a tumor in all 10 patients included in the study. The performed calculations showed that the average values of the tumor / background index were 6.73 ± 0.08.

Клинический пример 1.Clinical example 1.

Пациентка С., 35 лет: Ds.: Рак правой молочной железы IIA стадия (T2N0M0), мультицентричный рост.Patient S., 35 years old: Ds .: Cancer of the right breast IIA stage (T2N0M0), multicentric growth.

Гистологическое и иммуногистохимическое исследование: Инвазивная карцинома неспецифического типа 2 степени злокачественности. РЭ+, РП+, Her2/neu +Histological and immunohistochemical examination: Invasive carcinoma of a nonspecific type 2 malignancy. RE +, RP +, Her2 / neu +

В плане обследования дополнительно выполнена однофотонная эмиссионная компьютерная томография и пленарная сцинтиграфия с РФП на основе меченных технецием-99m рекомбинантных адресных молекул DARPinG3 согласно предлагаемому способу.In terms of the survey, additional single-photon emission computed tomography and plenary scintigraphy with radiopharmaceuticals based on technetium-99m-labeled recombinant targeted DARPinG3 molecules according to the proposed method were additionally performed.

На фиг. 1 - ОФЭКТ планарная сцинтиграфия с РФП на основе меченных технецием-99m рекомбинантных адресных молекул DARPinG3 через 2 часа после введения у пациентки с диагнозом рак правой молочной железы, IIA стадия (T2N0M0), мультицентричный рост. Визуализируется биораспределение препарата с большим накоплением в проекции печени и почек.In FIG. 1 - SPECT planar scintigraphy with radiopharmaceuticals based on technetium-99m-labeled recombinant targeted DARPinG3 molecules 2 hours after the introduction of a patient with a diagnosis of right breast cancer, stage IIA (T2N0M0), multicentric growth. The biodistribution of the drug with a large accumulation in the projection of the liver and kidneys is visualized.

На фиг. 2 - ОФЭКТ с РФП на основе меченных технецием-99m рекомбинантных адресных молекул DARPinG3 через 2 часа после введения у пациентки с диагнозом рак правой молочной железы, IIA стадия (T2N0M0), мультицентричный рост. Визуализируется метаболическая гиперфиксация препарата в проекции опухоли в центральных отделах правой молочной железы.In FIG. 2 - SPECT with radiopharmaceuticals based on technetium-99m-labeled recombinant targeted DARPinG3 molecules 2 hours after administration to a patient diagnosed with right breast cancer, stage IIA (T2N0M0), multicentric growth. The metabolic hyperfixation of the drug in the projection of the tumor in the central parts of the right breast is visualized.

Клинический пример 2.Clinical example 2.

Пациентка А., 37 лет: Ds.: Рак левой молочной железы I стадия (T1N0M0). Гистологическое исследование: Инвазивная карцинома неспецифического типа 2 степени злокачественности. РЭ+, РП+, Her2/neu -.Patient A., 37 years old: Ds .: Stage I left breast cancer (T1N0M0). Histological examination: Invasive carcinoma of a nonspecific type 2 malignancy. RE +, RP +, Her2 / neu -.

В плане обследования дополнительно выполнена однофотонная эмиссионная компьютерная томография с РФП на основе меченных технецием-99m рекомбинантных адресных молекул DARPinG3 согласно предлагаемому способу.In terms of examination, additional single-photon emission computed tomography with radiopharmaceuticals based on technetium-99m-labeled recombinant targeted DARPinG3 molecules according to the proposed method was additionally performed.

На фиг. 3 - ОФЭКТ с РФП на основе меченных технецием-99m рекомбинантных адресных молекул DARPinG3, через 2 часа после введения у пациентки с диагнозом рак левой молочной железы, I стадия (T1N0M0). Отмечается отсутствие метаболической гиперфиксации препарата в проекции опухоли.In FIG. 3 - SPECT with radiopharmaceuticals based on technetium-99m-labeled recombinant targeted DARPinG3 molecules, 2 hours after the introduction of a patient with a diagnosis of left breast cancer, stage I (T1N0M0). There is a lack of metabolic hyperfixation of the drug in the projection of the tumor.

Таким образом, предлагаемый способ диагностики рака молочной железы с гиперэкспрессией Her2/neu с применением радиофармацевтического препарата на основе меченных технецием-99m рекомбинантных адресных молекул DARPinG3, позволяет отчетливо визуализировать злокачественные опухоли молочных желез на метаболическом уровне, а степень аккумуляции представленного радиофармпрепарата в опухоли дает возможность получать сцинтиграфические изображения надлежащего качества. Таким образом, применение нового способа с использованием радиофармацевтического препарата на основе меченных технецием-99m рекомбинантных адресных молекул DARPinG3 позволит повысить эффективность, специфичность и доступность радионуклидной диагностики рака молочных желез с гиперэкспрессией Her2/neu. При этом, DARPinG3 характеризуется значительно лучшим биораспределением и более низким накоплением препарата в печени.Thus, the proposed method for the diagnosis of breast cancer with overexpression of Her2 / neu using a radiopharmaceutical based on technetium-99m labeled recombinant targeted molecules DARPinG3 allows you to clearly visualize malignant breast tumors at a metabolic level, and the degree of accumulation of the presented radiopharmaceutical in the tumor makes it possible to obtain scintigraphic images of proper quality. Thus, the use of a new method using a radiopharmaceutical based on technetium-99m-labeled recombinant target molecules DARPinG3 will increase the efficiency, specificity and availability of radionuclide diagnostics of breast cancer with Her2 / neu overexpression. At the same time, DARPinG3 is characterized by significantly better biodistribution and lower accumulation of the drug in the liver.

Claims

A method for diagnosing breast cancer with Her2 / neu overexpression, comprising administering a radiopharmaceutical and performing a scintigraphic study, characterized in that a radiopharmaceutical based on technetium-99m-labeled recombinant targeted DARPinG3 molecules produced immediately before administration is administered, for which, under aseptic conditions, 500 μl of eluate ^99m TcO ^4- 4 GBq added via syringe to a set «CRS Isolink» (Center for Radiopharmaceutical Science, Paul Scherrer Institute, Villigen, Switzerland) for preparing tricarbonyl technetium ^[99m Tc (CO) ₃ (H ₂ O) _3] ⁺ and incubated at a temperature of 100 ° C for 30 minutes, after incubation, 1 ml of tricarbonyl technetium is added to 1200 μg of DARPinG3 and incubated at 40 ° C for 60 minutes, then the obtained compound is purified from protein impurities and DARPinG3 molecules not bound to technetium with using purification columns NAP5, obtained after purification of the drug with an activity of 400-500 MBq, it is diluted in 10 ml of physiological saline, taken through a sterilizing filter and slowly administered to the patient, then 2 hours after the administration of the drug, the patient undergoes single-photon emission computed tomography on a two-detector gamma camera and the results are evaluated, and when visualizing hyperfixation sites RP in the tissue of the mammary glands and regional lymph nodes diagnose a malignant tumor.