RU2718802C1 - Способ получения нибомицина - Google Patents
Способ получения нибомицина Download PDFInfo
- Publication number
- RU2718802C1 RU2718802C1 RU2018143480A RU2018143480A RU2718802C1 RU 2718802 C1 RU2718802 C1 RU 2718802C1 RU 2018143480 A RU2018143480 A RU 2018143480A RU 2018143480 A RU2018143480 A RU 2018143480A RU 2718802 C1 RU2718802 C1 RU 2718802C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- nibomycin
- strain
- antibiotic
- nybomycin
- asparagine
- Prior art date
Links
- HKMUGCUFXWTNSP-UHFFFAOYSA-N nybomycin Chemical compound OCC1=CC(=O)N(C)C2=C1C=C1C3=C2OCN3C(=O)C=C1C HKMUGCUFXWTNSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 title abstract 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 2
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 24
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims abstract description 24
- 241000970981 Streptomyces iakyrus Species 0.000 claims abstract description 18
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 18
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims abstract description 15
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims abstract description 13
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims abstract description 13
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 10
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims abstract description 10
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 claims abstract description 10
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims abstract description 9
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 claims abstract description 9
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims abstract description 8
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 8
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims abstract description 4
- 238000003795 desorption Methods 0.000 claims abstract description 4
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims abstract description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 25
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 13
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 10
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 8
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 6
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 4
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 claims description 3
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 3
- 235000001727 glucose Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 claims description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 claims description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 abstract description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 239000013078 crystal Substances 0.000 abstract description 2
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 18
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 8
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 8
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 7
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 7
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 6
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- LISFMEBWQUVKPJ-UHFFFAOYSA-N quinolin-2-ol Chemical compound C1=CC=C2NC(=O)C=CC2=C1 LISFMEBWQUVKPJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 1,2-Divinylbenzene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1C=C MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 4
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 4
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 description 4
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 4
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 4
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 4
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 4
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- DKPFZGUDAPQIHT-UHFFFAOYSA-N Butyl acetate Natural products CCCCOC(C)=O DKPFZGUDAPQIHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 3
- FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N hexanoic acid Chemical compound CCCCCC(O)=O FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 241001660142 Camponotus vagus Species 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 2
- RJQXTJLFIWVMTO-TYNCELHUSA-N Methicillin Chemical compound COC1=CC=CC(OC)=C1C(=O)N[C@@H]1C(=O)N2[C@@H](C(O)=O)C(C)(C)S[C@@H]21 RJQXTJLFIWVMTO-TYNCELHUSA-N 0.000 description 2
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 2
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 2
- 241001655322 Streptomycetales Species 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 108010059993 Vancomycin Proteins 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- SIHHLZPXQLFPMC-UHFFFAOYSA-N chloroform;methanol;hydrate Chemical compound O.OC.ClC(Cl)Cl SIHHLZPXQLFPMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 2
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 2
- 229960003085 meticillin Drugs 0.000 description 2
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 2
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 2
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 2
- 229960003165 vancomycin Drugs 0.000 description 2
- MYPYJXKWCTUITO-UHFFFAOYSA-N vancomycin Natural products O1C(C(=C2)Cl)=CC=C2C(O)C(C(NC(C2=CC(O)=CC(O)=C2C=2C(O)=CC=C3C=2)C(O)=O)=O)NC(=O)C3NC(=O)C2NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CC(C)C)NC)C(O)C(C=C3Cl)=CC=C3OC3=CC2=CC1=C3OC1OC(CO)C(O)C(O)C1OC1CC(C)(N)C(O)C(C)O1 MYPYJXKWCTUITO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-O vancomycin(1+) Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=C2C=C3C=C1OC1=CC=C(C=C1Cl)[C@@H](O)[C@H](C(N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H]3C(=O)N[C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](C3=CC(O)=CC(O)=C3C=3C(O)=CC=C1C=3)C([O-])=O)=O)[C@H](O)C1=CC=C(C(=C1)Cl)O2)=O)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)[NH2+]C)[C@H]1C[C@](C)([NH3+])[C@H](O)[C@H](C)O1 MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-O 0.000 description 2
- DCPWYLSPIAHJFU-YKRRISCLSA-N (2s,3s,4s)-4-amino-2,3-dihydroxy-n-[(1s)-1-[(3s)-8-hydroxy-1-oxo-3,4-dihydroisochromen-3-yl]-3-methylbutyl]hexanediamide Chemical compound C1=CC(O)=C2C(=O)O[C@H]([C@@H](NC(=O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](N)CC(N)=O)CC(C)C)CC2=C1 DCPWYLSPIAHJFU-YKRRISCLSA-N 0.000 description 1
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 241001156739 Actinobacteria <phylum> Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- DCPWYLSPIAHJFU-UHFFFAOYSA-N Amicoumacin A Natural products C1=CC(O)=C2C(=O)OC(C(NC(=O)C(O)C(O)C(N)CC(N)=O)CC(C)C)CC2=C1 DCPWYLSPIAHJFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000239290 Araneae Species 0.000 description 1
- 241000193755 Bacillus cereus Species 0.000 description 1
- WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N Benzyl alcohol Chemical compound OCC1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- SLHCMPVPVQSTBV-UHFFFAOYSA-N C1=CNC2=C3C=CN=C3C=CC2=C1 Chemical group C1=CNC2=C3C=CN=C3C=CC2=C1 SLHCMPVPVQSTBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010054814 DNA Gyrase Proteins 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N Hexa-Ac-myo-Inositol Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C1OC(C)=O SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N L-rhamnopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N L-rhamnose Natural products CC(O)C(O)C(O)C(O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 241000544912 Melanoides Species 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 238000002814 agar dilution Methods 0.000 description 1
- 150000003868 ammonium compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 1
- -1 asparagine amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 229960004217 benzyl alcohol Drugs 0.000 description 1
- 238000002815 broth microdilution Methods 0.000 description 1
- 239000002021 butanolic extract Substances 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- WORJEOGGNQDSOE-UHFFFAOYSA-N chloroform;methanol Chemical compound OC.ClC(Cl)Cl WORJEOGGNQDSOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- GVPFVAHMJGGAJG-UHFFFAOYSA-L cobalt dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Co+2] GVPFVAHMJGGAJG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- SBTFHJGTXHMDPR-UHFFFAOYSA-N deoxynybomycin Chemical compound CC1=CC(=O)N(C)C2=C1C=C1C3=C2OCN3C(=O)C=C1C SBTFHJGTXHMDPR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RSVQYHBAQSLWNX-UHFFFAOYSA-N deoxynybomycin Natural products CN1C(=O)C=C(CO)c2cc3C(=CCN4COc(c34)c12)C RSVQYHBAQSLWNX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N dimethyl 2-(3-ethyl-3-methylpentyl)propanedioate Chemical class CCC(C)(CC)CCC(C(=O)OC)C(=O)OC AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 1
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 238000002414 normal-phase solid-phase extraction Methods 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- VMPITZXILSNTON-UHFFFAOYSA-N o-anisidine Chemical compound COC1=CC=CC=C1N VMPITZXILSNTON-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 229940066779 peptones Drugs 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 150000007660 quinolones Chemical class 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 239000013076 target substance Substances 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 238000000870 ultraviolet spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
- A61K31/496—Non-condensed piperazines containing further heterocyclic rings, e.g. rifampin, thiothixene or sparfloxacin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
- C12N1/145—Fungal isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Public Health (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Mycology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Botany (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Oncology (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к производству антибиотика нибомицина. Осуществляют культивирование штамма-продуцента Streptomyces iakyrus ВКПМ Ас-2084. Штамм выращивают на питательной среде, содержащей глюкозу, аспарагин и гидроортофосфат калия и воду при заданном содержании компонентов. Осуществляют последовательную фильтрацию культуральной жидкости через бумажные, а затем мембранные фильтры. Отфильтрованную культуральную жидкость фракционируют на селективном сорбенте с последующей десорбцией 20±3%-ным водным раствором ацетонитрила при нейтральном рН и инкубированием элюата до выпадения кристаллов нибомицина. Изобретение позволяет повысить выход нибомицина. 3 з.п. ф-лы, 4 ил., 1 табл.,1 пр.
Description
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НИБОМИЦИНА
Область техники
Изобретение относится к микробной биотехнологии и фармацевтике, а именно к способу получения нибомицина - редкого природного антибиотика азолохинолиновой группы, обладающего активностью против грамположительных бактерий, и что особенно важно, против патогенов, обладающих множественной антибиотикорезистентностью (таких как метициллин- и ванкомицин-устойчивые штаммы Staphylococcus aureus (MRSA и VRSA), - и таким образом, представляющего значительные перспективы для клинического применения.
Уровень техники
Сведения о появлении антибиотико-устойчивых форм патогенов стали появляться вскоре после введения в клиническую практику пенициллина, еще в начале 1940-х. С тех пор преодоление данной проблемы основывалось на интенсификации поиска новых антибиотиков, обладающих иными механизмами действия или более высокой активностью. Однако приобретение бактериями устойчивости к вводимым в широкую практику препаратам тоже стремительно возрастало. В конце концов, это привело к распространению патогенов, обладающих множественной устойчивостью к основным группам лекарственных средств. Одним из наиболее значимых примеров являются метициллин-устойчивые штаммы Staphylococcus aureus (MRSA), впервые выделенные еще в 1961 году. В настоящее время штаммы MRSA обладают резистентностью практически ко всем используемым антибиотикам, включая ванкомицин (VRSA), которое долгое время считался препаратом резерва.
Поиск новых химиотерапевтических средств или стратегий имеют решающее значение для разрыва порочного круга между антибиотиками и антибиотикорезистентностью. Особый интерес в литературе приобретают так называемые "реверсные антибиотики", которые могут решить проблему борьбы с резистентными штаммами. Впервые эта способность была открыта у нибомицина - антибиотика, известного с 1955 года, однако, так и не введенного в клиническую практику. Было показано, что нибомицин и его производные способны подавлять рост хинолон-устойчивых стафиллококков (Hiramatsu et al., 2012). Установлено, что хинолон-устойчивые штаммы S.aureus имеют мутацию в гене, кодирующем синтез ДНК-гиразы. Молекулы нибомицина способны вызывать обратные изменения в данном гене, возвращая S. aureus восприимчивость к хинолоновым антибиотикам. За это нибомицин был назван "реверсным" или "обратным антибиотиком" (Hiramatsu et al., 2015). Таким образом, перспективным методом контроля над хинолон-устойчивыми бактериями, таким как MRSA и VRSA, является применение нибомицина и его производных совместно с хинолонами (Hiramatsu K. et al., 2015).
Известен способ получения нибомицина путем химического синтеза (Forbis, Rinehart, 1973) из о-анизидина: процесс протекает в 12 стадий и общий выход нибомицина составляет 0,16%. Очевидным недостатком получения нибомицина путем химического синтеза, несмотря на высокий выход целевого продукта, является потребность в специалистах высокой квалификации в области синтеза органических веществ, наличия соответствующего оборудования и необходимых реагентов.
Также известны способы получения нибомицина путем биосинтеза с помощью штамма-продуцента Streptomyces hyalinum АТСС® 29817™ (Naganawa Н, Wakashiro Т, Yagi A, Kondo S, Takita Т. Deoxynybomycin from a Streptomyces. J Antibiot (Tokyo) 1970; 23:365-8.). Способ получения антибиотика нибомицина заключается в культивировании продуцента Streptomyces hyalinum АТСС® 29817™ в глубинных аэробных условиях при температуре 30±1°С в жидкой питательной следующего состава (г/л): крахмал растворимый - 10±1, глюкоза - 10±1, мясной экстракт - 7,5±0,5, пептон основной - 7,5±0,5, NaCl - 3±0,1, MgSO4 - 1±0,05, вода - остальное. Максимум продукции в культуральной жидкости наблюдается на 4-5 сутки в условиях непрерывной аэрации. Антибиотик из профильтрованной культуральной жидкости экстрагируется бутилацетатом при pH=2. Экстракт концентрируют и наносят на колонку с силикагелем. После промывки колонки бензолом антибиотик элюируют смесью бензол-метанол (10:1). Очистку нибомицина производят хроматографически на колонке с силикагелем, используя хлороформ и хлороформ-метанол (10:1) как подвижную фазу. Минимальная ингибирующая концентрация (МИК) нибомицина, получаемого таким образом, составляла для Escherichia coli K-12 - более 20 мг/л, Bacillus cereus АТСС 10702 - 10 мг/л, Staphylococcus aureus FDA 209 Р - 10 мг/л. Данный способ получения антибиотика нибомицина обладает множеством недостатков: низкой антибиотической активностью продуцента, особенно в отношении стафилококка, поликомпонентным составом ферментационной среды и, соответственно, ее относительно высокой стоимостью, а также многостадийностью, трудоемкостью стадии выделения и химической очистки, большим количеством органических растворителей: бутилацетат, бензол, метанол, хлороформ. Необходимость сложной многостадийной очистки препарата обусловлена использованием на первой технологической стадии бутилацетата в качестве экстрагента.
Данный способ получения нибомицина был выбран нами за прототип.
Также известен способ культивирования Streptomyces hyalinum ATCC® 29817™ в жидкой среде (pH 7), содержащей (г/л): глицерин – 5, сахароза – 20, дрожжевой экстракт - 10, соевый гидролизат - 10, кукурузный экстракт - 5, хлорид кобальта десятиводный - 0,0001, вода - остальное. Конические колбы объемом 500 мл с 100 мл вышеописанной среды инкубируют на платформенном шейкере при непрерывном перемешивании (180 rpm) при 27°С в течение 120 часов (Патент US 2012/025898.0 A1). Полученную культуральную жидкость центрифугируют, фильтрат смешивают с бутанолом. Бутаноловый экстракт упаривают, добавляют гексан, центрифугируют, отделяют гексан-нерастворимую фракцию. Из полученной фракции производят экстракцию смесью хлороформ-метанол-вода (соотношение объемов 5:6:4) при тщательном перемешивании, отделяют самый нижний слой с последующим концентрированием его и сушкой под низким давлением. Полученный экстракт в дальнейшем подвергают дальнейшему многоэтапному разделению путем экстракции в системе жидкость-жидкость с применением смеси хлороформ-метанол-вода (соотношение объемов 5:6:4). В заключение производится финальная очистка полученных фракций с применением ВЭЖХ. Общий выход нибомицина при таком способе получения составляет 0,008%. Приведенный способ культивирования продуцента и получения антибиотика нибомицина, очень трудоемкий, длительный, затратный. Сложный состав ферментационной среды, многократные циклы экстракции органическими растворителями, многие из которых токсичны, финальные стадии хроматографической очистки - все это делает биосинтез нибомицина по данной методике - сложной и дорогостоящей процедурой. Данный способ получения нибомицина был выбран нами за прототип.
Раскрытие изобретения
Технической проблемой решаемой заявляемым изобретением является разработка простого способа получения нибомицина с высоким выходом продукта.
Техническая проблема решается способом получения антибиотика нибомицина путем культивирования продуцента Streptomyces iakyrus ВКПМ Ас-2084 в питательной среде, содержащей глюкозу, аспарагин, гидрофосфат калия при температуре 28±1°С с последующим выделением целевого продукта, при этом для культивирования используют питательную среду с рН 6,8-7,0 следующего состава (г/л):
глюкоза 10,0±2;
аспарагин 0,5±0,1;
гидроортофосфат калия 0,5±0,1;
вода - остальное,
а культивирование продуцента осуществляют без перемешивания или при перемешивании со скоростью не более 50 об/мин. в течение 10-14 суток. Выделение нибомицина осуществляют путем последовательной фильтрации через бумажные, а затем мембранные фильтры, после чего фракционируют на устойчивом и пригодном к многократному использованию селективном к антибиотику нибомицина сорбенте, полученную фракцию инкубируют до выпадения осадка, который отделяют центрифугированием, промывают дистиллированной водой для избавления от надосадочной жидкости с последующей сушкой в вакуумном концентраторе до постоянного веса. Предпочтительно в качестве селективного сорбента использовать сильносшитый полистирольный гидрофилизированный сорбент с диаметром 50-1000 
, десорбцией 20±3 об.% водным раствором ацетонитрила при нейтральном рН (5,5-8,5), в качестве мембранного фильтра - фильтр с диаметром пор не более 0,65 мкм, а в качестве бумажного фильтра - фильтр «белая лента». При этом инкубацию фракции проводят при +4±1°С в течении 12-24 часов.
За счет оптимизации условий культивирования штамма Streptomyces iakyrus ВКПМ Ас-2084 - продуцента редкого и перспективного антибиотика нибомицина, и разработки новой методики выделения из культуральной жидкости антибиотика получают нибомицин высокой степени чистоты 99%, а именно:
1. подбор питательных сред и оптимальных условий культивирования, позволяет получить культуральную жидкость с содержанием нибомицина 15-25 мг/л (величины того же порядка, что и при способе биосинтеза выбранного нами за прототип), при минимальном количестве иных сопутствующих метаболитов (в частности, пигментов) (не более 1%);
2. разработка новой простой и экономически выгодной технологии выделения и очистки нибомицина с целью получения продукта высокой степени чистоты - 99%;
3. способ мониторинга и контроля за накоплением нибомицина в ферментационной среде при помощи спектрофотометрического исследования спектров поглощения культуральной жидкости в УФ-области.
Краткое описание чертежей
Изобретение поясняется следующими чертежами.
На фиг. 1 представлены спектры поглощения культуральной жидкости Streptomyces iakyrus ВКПМ Ас-2084 при росте в глюкозо-аспарагиновой среде: 0-ые (исходная 
) и 9-ые сутки культивирования (
).
На фиг. 2 показан спектр поглощения нибомицина в УФ-диапазоне: ось ординат - поглощение, ось абсцисс - длина волны (нм).
На фиг. 3 показана временная динамика накопления нибомицина по спектрам поглощения ферментационной среды (
- исходная, 
- 4 сутки, 
- 9 сутки, 
- 14 сутки, 
- 44 сутки).
На фиг. 4 представлены результаты ВЭЖХ-анализа нибомицина, получаемого предлагаемым нами методом осаждения, в сочетании со спектром поглощения антибиотика в УФ-области.
Осуществление изобретения
В предлагаемом способе получения нибомицина культивируют продуцент Streptomyces iakyrus ВКПМ Ас-2084, выделенный из природных условий и хранящийся в Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУП ГосНИИгенетика (ВКПМ, Москва, 1-й Дорожный пр., д. 1).
Штамм Streptomyces iakyrus Реб ВКПМ Ас-2084 был выделен при поверхностном посеве на среду, содержащую крахмал и нитрат (минеральный агар Гаузе 1), из гомогенизата рабочих особей муравьев Camponotus vagus. Образцы гнездового материала и живые особи муравьев-древоточцев Camponotus vagus были отобраны в Брянской области (государственный природный биосферный заповедник "Брянский лес", 52.440009 N, 34.126288 Е) в июле 2014 года.
Идентификация штамма Streptomyces iakyrus Ре6 ВКПМ Ас-2084 основывалась на анализе данных секвенирования нуклеотидной последовательности гена 16s рРНК и сопоставления этих данных с последовательностями, депонированными в базу GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank). Данный подход в настоящее время считается безусловно надежным для идентификации мицелиальных актинобактерий на уровне рода.
Штамм Streptomyces iakyrus ВКПМ Ре6 Ас-2084 характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками:
Культурально-морфологические признаки
Штамм ВКПМ Ас-2084 при росте на спектре твердых питательных сред, рекомендуемых для фенотипического описания стрептомицетов (Гаузе Г.Ф., Преображенская Т.П., Свешникова М.А., Терехова Л.П., Максимова Т.С. Определитель актиномицетов: роды Streptomyces, Streptoverticillium, Chainia. М.: Наука. 1983. 248 с.) образует:
хорошо развитый воздушный мицелий светло-серого, серого, желтовато-серого или белого цвета;
спороносцы спиральные (S), споры с гладкой оболочкой;
зрелые спороносцы содержат 10-50 спор в цепочке;
субстратный мицелий буроватый, бурый, коричневый, темно-коричневый;
растворимый пигмент бурый, коричневый, темно-коричневый;
меланоидные пигменты образует.
Физиолого-биохимические признаки
Штамм растет в аэробных условиях в диапазоне температур от +18 до +40°С, с оптимумом роста при 28±2°С.
Растет в диапазоне рН 6,0-9,0, оптимальная величина рН всех используемых сред составляет 7,2-7,7.
В качестве источника углерода утилизирует глюкозу, фруктозу, рамнозу, инозит, сахарозу, глицерин. Не использует арабинозу, лактозу, ксилозу, маннит, сорбит, целлюлозу. Крахмал гидролизует.
В качестве источника азота использует нитратные, аммонийные соединения, гидролизаты белков, аминокислоты. Обладает протеолитической активностью. Желатину разжижает, молоко пептонизирует.
Образует антибиотик нибомицин, активный в отношении грамположительных бактерий. Штамм ВКПМ Ас-2084 не патогенен.
Таким образом, на основании филогенетического родства и фенотипических признаков выделенный штамм Ре6 был отнесен к виду Streptomyces iakyrus и депонирован в коллекцию ВКПМ под номером Ас-2084.
Хранение и поддержание жизнеспособности штамма
Штамм можно хранить при +4°С и поддерживать путем пересева раз в 2-3 недели на плотные питательные среды, например, следующего состава: овсяная мука - 20 г, агар - 20 г, раствор микроэлементов - 1 мл, агар - 20 г, вода дистиллированная - 1 л (Гаузе и др., 1983).
Длительное хранение штамма при температуре от -20 до -70°С может быть обеспечено культивированием в жидкой питательной среде, содержащей глюкозу, гидролизат белков, дрожжевой экстракт, минеральные соли в течение 3-7 дней, разлив культуральной жидкости в специальные емкости для хранения при низких температурах с добавлением веществ-криопротекторов, соблюдая условия стерильности.
Пример. Штамм Streptomyces iakyrus ВКПМ Ре6 Ас-2084 культивируют в жидкой питательной среде следующего состава: глюкоза - 10 г, пептон - 10 г, гидролизат казеина - 2 г, дрожжевой экстракт - 2 г, NaCl - 6 г, вода - 1 л, при 28°С. Затем в 3-5 суточную культуральную жидкость в качестве криопротектора асептически вводят стерильный раствор 50% глицерола в объемном соотношении 1:1. Полученную смесь раскапывают по криопробиркам и помещают на хранение при температуре ниже -20°С.
В процессе роста на питательной среде, содержащей в качестве источника азота пептон, триптон или иные ферментативные белковые гидролизаты, многие стрептомицеты, в том числе Streptomyces iakyrus ВКПМ Ас-2084, образуют темноокрашенные пигменты - меланины, которые требуют дополнительных стадий очистки и использования органических растворителей. Кроме того, в средах, содержащих ферментативные гидролизаты, исходно содержится много пептидов, которые также затрудняют очистку и, кроме того, делают невозможным мониторинг накопления нибомицина в среде по спектрам поглощения в УФ-области.
Поэтому, предложено использование питательной среды, в которой источником азота служит аминокислота аспарагин, источником углерода - глюкоза. Данные ингредиенты позволяют получить бесцветную и прозрачную питательную среду, с минимальным поглощением в УФ-области (фиг. 1). В процессе роста в данной среде штамма Streptomyces iakyrus ВКПМ Ас-2084 с течением времени происходит накопление нибомицина, который можно идентифицировать в образцах культуральной жидкости по характерным пикам поглощения в УФ-области (фиг. 2). Это позволяет вести экспресс-мониторинг за накоплением целевого продукта в ферментационных сосудах (фиг. 3).
Процесс биосинтеза осуществляют в глубинных условиях при 28±2°С в течение не менее 240 ч в жидкой питательной среде с pH 6,5-6,7 следующего состава г/л: глюкоза 10,0±2; аспарагин 0,5±0,1; гидроортофосфат калия 0,5±0,1; вода - остальное.
Существенными преимуществами данной питательной среды являются:
во-первых, ее относительно низкая удельная стоимость, что делает ее более экономически выгодной по сравнению со средами, в состав которых входят ферментативные гидролизаты белков, растворимый крахмал и другие компоненты;
а, во-вторых, использование в качестве источника азота - аминокислоты аспарагина. При росте на данной среде штамм Streptomyces iakyrus ВКПМ Ас-2084 не образует темноокрашенных пигментов, осложняющих последующее выделения антибиотика, ферментационная среда в процессе роста не окрашивается и не мутнеет, что делает возможным наблюдать за накоплением нибомицина по спектрам поглощения культуральной жидкости в УФ-области.
Культивирование продуцента в вышеуказанной среде производят либо в статичных условиях (без перемешивания), либо при слабом встряхивании (не более 50 об/мин), которое не препятствует формированию биопленок продуцента на стенках ферментационных сосудов. Продуктивность штамма-продуцента, культивируемого в форме биопленок, в 2-4 раза выше, чем при образовании этим штаммом отдельных сферических микроколоний (табл. 1).
Антибиотик из культуральной жидкости выделяют путем хроматографического разделения. Вначале культуральную жидкость освобождают от клеток продуцента путем фильтрации через бумажные фильтры в условиях свободной гравитации. Затем пропускают ее через мембранные фильтры с диаметром пор не превышающим 0,65 мкм с использованием вакуумного насоса.
Очищенную от клеток культуральную жидкость наносят на колонку с молекулярным сорбентом на основе сополимера дивинилбензола/ гидрофильного мономера. Десорбцию проводят 20%-ным (по объему) раствором ацетонитрила в воде (допускается использование растворов с концентрацией 17-23%) в нейтральных условиях. При инкубации собранных элюатов при температуре +4±1°С в течении 12-24 часов происходит самопроизвольное выпадение из раствора кристаллов нибомицина. Осадок собирают центрифугированием, достаточным для уплотнения осадка и его отделения, отбрасывая супернатант. Затем осадок промывают дистиллированной водой, снова центрифугируют, отбрасывают супернатант - так не менее трех раз. Окончательно высушивают осадок в центрифужном вакуумном концентраторе до достижения постоянного веса при комнатной температуре.
Осадок возможно растворить только в концентрированных растворах соляной или трифторуксусной кислоты, и только затем - растворить в ДМСО. Полученный раствор можно использовать для УФ-спектроскопического и масс-спектрометрического подтверждения, что выделенное вещество является нибомицином (фиг. 4). Данные высокоэффективной жидкостной хроматографии свидетельствуют, что нибомицин, получаемый таким образом, обладает высокой степенью чистоты - 99%.
Антагонистические признаки.
Оценка антагонистического действия нибомицина, вырабатываемого штаммом Streptomyces iakyrus ВКПМ Ас-2084 проводилась с помощью репортерной системы JW 5503 ΔtolC -pDualrep2 (Остерман и др., 2016).
Пример 1.
Культивирование продуцента. Штамм Streptomyces iakyrus ВКПМ Ас-2084 наращивали в культуральных флаконах (Eppendorf Cell Culture Flasks, T-175) с вентилируемыми крышками, заполненных 50 мл среды следующего состава (г/л): глюкоза - 10,0; аспарагин - 0,5; гидроортофосфат калия - 0,5; вода - остальное, после автоклавирования рН составляло 6,8. Флаконы инкубировали статично, при 28°С в течение 10 суток. За указанный период на стенках ферментационных сосудов сформировалась зрелая физиологически активная биомасса в форме биопленки, в то время как культуральная жидкость на основании визуальной оценки цветности и мутности (по ГОСТ Р 57164-2016) оставалась бесцветной и прозрачной.
Культуральную жидкость освобождали от клеток путем последовательной фильтрации сначала через бумажные фильтры (обеззоленные фильтры "белая лента", соответствующие ГОСТ 12026-76), а затем через мембранные фильтры с диаметром пор 0,45 мкм в условиях разрежения, создаваемого вакуумным насосом.
Подготовка хроматографической колонки. Сорбент LPS-500-H (сополимер дивинилбензола/ гидрофильного мономера) в количестве 1 мл помещали в колонку для твердофазной экстракции, промывали 10 мл 15% водного раствора ацетонитрила, затем трижды промывали дистиллированной водой порциями по 10 мл.
Выделение целевого вещества. Через подготовленную и уравновешенную колонку в режиме гравитационного потока пропускали по 200 мл культуральной жидкости Streptomyces iakyrus ВКПМ Ас-2084, после чего проводили элюцию 20% водным раствором ацетонитрила (допускается использовать растворы 17-23% по объему), а затем промывали колонку 50% раствором ацетонитрила.
Фракцию, элюированную 20% ацетонитрилом, в течение 12-24 часов выдерживали при температуре +4°С, в результате чего выпадает белый осадок, который легко отделяется центрифугированием при 13000 об/мин (Eppendorf 5810R). Супернатант отбрасывали, осадок промывали дистиллированной водой, вновь центрифугировали и, таким образом, повторяли процедуру 3-5 раз. Промытый осадок сушили в вакуумном центрифужном испарителе (Thermofisher SpeedVac) при комнатной температуре, доводя до постоянного веса.
Полученное вещество не растворимо в воде, но растворимо в концентрированном растворе соляной или трифторуксусной кислоты, в дальнейшем полученный раствор можно растворять в ДМСО и использовать для исследований.
Результаты УФ-спектроскопии и масс-спектрометрического анализа показывают, что данное вещество является нибомицином. Данные высокоэффективной жидкостной хроматографии подтверждают, что нибомицин, получаемый таким образом, обладает высокой степенью чистоты - 99% (фиг. 4).
Штамм Streptomyces iakyrus ВКПМ Ас-2084 наращивали на средах, включающих глюкозу, аспарагин, гидроортофосфат калия и воду в количествах заявленного диапазона, рН которой после автоклавирования составляло 6,8-7,0, при этом выделенный из культуральной жидкости антибиотик нибомицин обладал степенью чистоты 99%.
Определение минимальной ингибирующей концентрации (МИК) нибомицина.
Определение минимальной действующей концентрации нибомицина было проведено в отношении двух штаммов E. coli: BW25513 (т.н. "дикий тип") и JW5503 ΔtolC (генетический конструкт). Штамм Е. coli ΔtolC является нокаутом по гену белка TolC, который ответственен за экспорт различных метаболитов из клетки, в том числе антибиотиков. Использование штамма ΔtolC позволяет снизить минимальную ингибирующую концентрацию и определять механизм действия антибиотиков, которые не действуют на обычный штамм Е. coli дикого типа (YS Polikanov, IA Osterman, Т. Szal, VN Tashlitsky, MV Serebryakova, P. Kusochek, D. Bulkley, IA Malanicheva, ТА Efimenko, OV Efremenkova, AL Konevega, KJ Shaw, AA Bogdanov, MV Rodnina, OA Dontsova, AS Mankin, ТА Steitz, and PV Sergiev. Amicoumacin A inhibits translation by stabilizing mRNA interaction with the ribosome. Molecular Cell, 2014. 10.1016/j.molcel.2014.09.020).
Установление минимальной действующей концентрации проводят методом предельных разведений в жидкой среде LB (г/л: триптон - 10, дрожжевой экстракт - 5, NaCl - 10) (Wiegand, I., Hilpert, K. and Hancock, R.E. (2008) Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances. Nat. Protoc, 3, 163-175.). Суспензии клеток тест-организмов с начальной концентрацией 5×105 кл/мл раскапывают по 200 мкл в лунки 96-местного микропланшета. Затем в те же лунки вносили нибомицин в виде серийных разведений в ДМСО. Микропланшеты в закрытом виде инкубировали при 37°С на платформенном шейкере в течение 16-20 часов. Оптическую плотность суспензии тест-организмов при 590 нм (OD590) в каждой лунке измеряли с помощью микропланшетного сканера, и самая низкая концентрация нибомицина, при которой наблюдается отсутствие роста тест-культур, принимается за минимальную ингибирующую концентрацию (МИК).
Для генетически модифицированного штамма E. coli ΔtolC - МИК нибомицина составила 0,4 мг/л, а для кишечной палочки "дикого типа" BW25513 потребовалось более чем 10 мг/л. Это согласуется с данными о том, что грамотрицательные бактерии слабо восприимчивы к действию нибомицина благодаря действию эффлюкс-систем (Richter М., Drown B.S., Riley А.Р., Garcia A., Tomohiro Shirai Т., Svec RL, Hergenrother P.J. Predictive compound accumulation rules yield a broad-spectrum antibiotic. doi:10.1038/nature22308).
Таким образом, заявляемым способом получают нибомицин с чистотой не менее 99% и обладающий активностью в отношении грамположительных бактерий, в том числе хинолон-устойчивых штаммов Staphylococcus aureus (MRSA и VRSA).
Claims (6)
1. Способ получения антибиотика нибомицина путем культивирования продуцента Streptomyces iakyrus ВКПМ Ас-2084 в питательной среде, содержащей глюкозу, аспарагин, гидрофосфат калия, при температуре 28±1°С с последующим выделением целевого продукта, отличающийся тем, что для культивирования используют питательную среду с рН 6,8-7,0 следующего состава (г/л):
культивирование продуцента осуществляют без перемешивания в течение 10-14 суток, а выделение нибомицина осуществляют путем последовательной фильтрации через бумажные, а затем мембранные фильтры, после чего фракционируют на селективном сорбенте, полученную фракцию инкубируют до выпадения осадка, который отделяют центрифугированием, промывают дистиллированной водой для избавления от надосадочной жидкости с последующей сушкой в вакуумном концентраторе до постоянного веса.
2. Способ по п. 2, отличающийся тем, что в качестве селективного сорбента используют сильносшитый полистирольный гидрофилизированный сорбент с диаметром пор 50-1000 Å, десорбцией 20±3 об.% водным раствором ацетонитрила при нейтральном рН.
3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что в качестве мембранного фильтра используют фильтр с диаметром пор не более 0,65 мкм.
4. Способ по п. 2, отличающийся тем, что инкубацию фракции проводят при +4±1°С в течение 12-24 часов.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018143480A RU2718802C1 (ru) | 2018-12-07 | 2018-12-07 | Способ получения нибомицина |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018143480A RU2718802C1 (ru) | 2018-12-07 | 2018-12-07 | Способ получения нибомицина |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2718802C1 true RU2718802C1 (ru) | 2020-04-15 |
Family
ID=70277736
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2018143480A RU2718802C1 (ru) | 2018-12-07 | 2018-12-07 | Способ получения нибомицина |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2718802C1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2813975C1 (ru) * | 2023-12-22 | 2024-02-20 | Автономная некоммерческая образовательная организация высшего образования "Научно-технологический университет "Сириус" | Штамм Streptomyces sp. YVZ013 - продуцент антибиотика поликетомицина |
-
2018
- 2018-12-07 RU RU2018143480A patent/RU2718802C1/ru active
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| ARAI M., KAMIYA K., et. al., Anti-dortmant mycobacterial activity and target analysis of nybomycin produced a marine- derived Streptomyces sp., Bioorg. Med. Chem., 2015; Jul 1;23(3), p. 3534-3541 * |
| HIROSHI NAGANAWA, TAKASHI WAKASHIRO et.al., Deoxynybomycin from a Streptomyces, J. Antibiot (Tokio), 1970 Jul; 23(7), p. 365-368. * |
| HIROSHI NAGANAWA, TAKASHI WAKASHIRO et.al., Deoxynybomycin from a Streptomyces, J. Antibiot (Tokio), 1970 Jul; 23(7), p. 365-368. JOSEPH A. POPE., et. al., Applications of thin layer chromatography, high performance liquid chromatography and mass spectrometry in the fermentation and isolation of the antibiotic nybomycin, Journal of Industrial Microbiology, 1990, 6, p. 61-69. ARAI M., KAMIYA K., et. al., Anti-dortmant mycobacterial activity and target analysis of nybomycin produced a marine- derived Streptomyces sp., Bioorg. Med. Chem., 2015; Jul 1;23(3), p. 3534-3541. РЕНИН А.С., Методология поиска новых антибиотиков. Состояние и перспективы., Антибиотики и химиотерапия, 2015, Т. 60, N 7-8, с. 34-36. * |
| JOSEPH A. POPE., et. al., Applications of thin layer chromatography, high performance liquid chromatography and mass spectrometry in the fermentation and isolation of the antibiotic nybomycin, Journal of Industrial * |
| РЕНИН А.С., Методология поиска новых антибиотиков. Состояние и перспективы., Антибиотики и химиотерапия, 2015, Т. 60, N 7-8, с. 34-36. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2813975C1 (ru) * | 2023-12-22 | 2024-02-20 | Автономная некоммерческая образовательная организация высшего образования "Научно-технологический университет "Сириус" | Штамм Streptomyces sp. YVZ013 - продуцент антибиотика поликетомицина |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Meng-Xi et al. | Antibacterial performance of a Streptomyces spectabilis strain producing metacycloprodigiosin | |
| US10301690B2 (en) | Streptomyces filamentosus variant and method for producing daptomycin using same | |
| RU2718802C1 (ru) | Способ получения нибомицина | |
| Nandhagopal et al. | Antimicrobial potential of secondary metabolites and DNA gyrase B blocking molecules produced by a halophilic bacterium Virgibacillus salarius (MML1918) | |
| Sah et al. | Fermentation and extraction of antibacterial metabolite using Streptomyces spp. isolated from Taplejung, Nepal | |
| Chawawisit et al. | Antimicrobial and cytotoxic activities of bioactive compounds produced by Streptomyces sp. KB1 | |
| RU2817695C1 (ru) | Штамм Streptomyces sp. YVZ014 - продуцент антибиотика лизолипина X | |
| Seratnahaei et al. | Antimicrobial activities of the secondary metabolite extracted from a Nocardia strain | |
| Imane et al. | Isolation and Characterization of Actinobacteria from Algerian Saline Soil Samples with Antimicrobial Activities Against Microbial Pathogens. | |
| RU2428470C1 (ru) | Штамм staphylococcus hominis klp-1 - продуцент низкомолекулярных пептидных соединений, ингибирующих развитие грамположительных бактерий | |
| RU2422511C1 (ru) | ШТАММ БАКТЕРИЙ Brevibacillus laterosporus, ПРОДУЦИРУЮЩИЙ ШИРОКИЙ СПЕКТР БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ | |
| RU2696029C1 (ru) | Штамм Streptomyces iakyrus Pe6 ВКПМ Ас-2084 - продуцент антибиотика нибомицина | |
| CN101475917A (zh) | 一种沙雷氏菌属昆虫病原线虫共生菌 | |
| RU2724537C1 (ru) | Штамм Amycolatopsis rifamycinica - продуцент антибиотика тетраценомицина Х | |
| RU2789838C1 (ru) | Новый штамм-продуцент рамопланина actinoplanes ramoplaninifer | |
| RU2802575C1 (ru) | Новый штамм-продуцент даптомицина streptomyces baarnensis | |
| CN114231462B (zh) | 一种抑制耐药型食源性致病菌的活性菌株及应用 | |
| RU2788348C1 (ru) | Новый штамм - продуцент ванкомицина amycolatopsis japonica | |
| RU2784815C1 (ru) | Штамм Streptomyces sp. KMM 9044 - продуцент соединений, обладающих антибактериальной активностью | |
| RU2722071C1 (ru) | Питательная среда для культивирования Bacillus subtilis ВКПМ В-12079 | |
| Ghojavand et al. | Antibacterial Activity of the Lipopeptide Biosurfactant Produced by Bacillus mojavensis PTCC 1696 | |
| RU2788347C1 (ru) | Новый штамм-продуцент хлорэремомицина kibdelosporangium aridum | |
| Al-Charrakh et al. | Screening for antibacterial activity of Streptomyces Spp. isolated in Babylon, Iraq | |
| RU2061376C1 (ru) | Штамм бактерий bacillus thuringiensis spp thuringiensis для производства экзотоксинсодержащих биоинсектицидов | |
| Biswas et al. | Isolation and characterization of Streptomyces sp. ANBS-15 and antimicrobial activities of its secondary metabolites |