RU2710895C1

RU2710895C1 - Composition inhibiting expression of interleukin-4 and interleukin-13 genes for therapy of allergic rhinitis

Info

Publication number: RU2710895C1
Application number: RU2018141055A
Authority: RU
Inventors: Муса Рахимович Хаитов; Игорь Петрович Шиловский; Сергей Михайлович Андреев; Валерий Валерьевич Смирнов; Екатерина Драгановна Барвинская; Ксения Вадимовна Кожихова; Артем Владимирович Маерле; Илья Викторович Сергеев; Анастасия Витальевна Тимофеева
Priority date: 2018-11-21
Filing date: 2018-11-21
Publication date: 2020-01-14

Abstract

FIELD: medicine; pharmaceuticals.

SUBSTANCE: invention refers to pharmaceutical industry, namely to an intranasal composition for treating allergic rhinitis. What is presented is an intranasal composition for treating allergic rhinitis, containing an effective amount of a cationic dendrimer peptide of formula (Arg)8(Lys)4(Lys)2Lys-Ala-Cys-NH2, which is in the basic non-salt form (b-LTP), serving as carrier, and a mixture of siRNA molecules suppressing IL-13 and IL-4 gene expression, represented by sequences GGACCUGCUCUUACAUUUAtt and AAAGAUGUCUGUUACGGUCtt, respectively, wherein the weight ratio of b-LTP to the siRNA molecule mixture is equal to 12.5:1, and the number of siRNA molecules in the mixture is the same.

EFFECT: disclosed composition is effective in inhibiting expression of a target gene.

1 cl, 12 dwg, 4 tbl, 4 ex

Description

Изобретение относится к области генной инженерии и биохимии, а также к медицине и фармацевтике. Изобретение может быть использовано для лечения и профилактики аллергического ринита с использованием композиции, которая содержит комплекс молекул миРНК, подавляющих экспрессию генов IL-4 и IL-13 и пептида b-LTP в основной форме.The invention relates to the field of genetic engineering and biochemistry, as well as to medicine and pharmaceuticals. The invention can be used for the treatment and prevention of allergic rhinitis using a composition that contains a complex of siRNA molecules that suppress the expression of the IL-4 and IL-13 genes and the b-LTP peptide in basic form.

Аллергический ринит (АР) - в широком смысле определяется как воспаление слизистой оболочки носовой полости. АР проявляется следующими основными симптомами [Kakli, Riley, 2016]: ринорея, чихание, зуд, заложенность носа, характерное дыхание ртом, сопение, храп, изменение голоса, снижение обоняния (на поздних стадиях ринита) и т.д. Основными этиологическими факторами АР являются: пыльца растений, бытовые аллергены, эпидермальные, аллергены тараканов и споры плесневых грибов, обитающих внутри помещений, пищевые аллергены. АР - это достаточно распространенное заболевание, затрагивающее в разных странах до 40% населения. Распространенность аллергического ринита среди населения России в настоящее время оценивается в 10-30% [Hosoya и др., 2011]. АР является фактором риска развития бронхиальной астмы (БА). По данным АР наносит экономический ущерб экономикам стран мира. Европе прямые затраты, связанные с АР, ежегодно составляют 1-1,5 млрд. евро, а непрямые затраты - 1,5-2 млрд. евро. При оценке социально-экономического значения болезни необходимо учитывать ассоциации АР с другими заболеваниями, в том числе бронхиальной астмой, синуситами, средним отитом, инфекциями дыхательных путей [6].Allergic rhinitis (AR) is broadly defined as inflammation of the nasal mucosa. AR is manifested by the following main symptoms [Kakli, Riley, 2016]: rhinorrhea, sneezing, itching, nasal congestion, characteristic mouth breathing, sniffling, snoring, voice change, decreased sense of smell (in the late stages of rhinitis), etc. The main etiological factors of AR are: plant pollen, household allergens, epidermal, cockroach allergens and indoor mold spores, food allergens. AR is a fairly common disease affecting up to 40% of the population in different countries. The prevalence of allergic rhinitis among the Russian population is currently estimated at 10-30% [Hosoya et al., 2011]. AR is a risk factor for bronchial asthma (AD). According to Azerbaijan, it causes economic damage to the economies of the world. Europe, direct costs associated with Azerbaijan, annually amount to 1-1.5 billion euros, and indirect costs - 1.5-2 billion euros. When assessing the socio-economic significance of the disease, it is necessary to take into account the associations of AR with other diseases, including bronchial asthma, sinusitis, otitis media, and respiratory tract infections [6].

В последние годы стало очевидным, что в патогенезе АР ключевую роль играют Th2-клетки; они индуцируют и поддерживают аллергическое воспаление. Патофизиологические аспекты аллергических расстройств, таких, как продукция IgE-антител; рекрутирование и активация тучных клеток; базофилов и эозинофилов; гиперсекреция слизи; субэпителиальный фиброз; и ремоделирование тканей напрямую связаны с Th2-клетками, продуцирующими ряд провоспалительных цитокинов: IL-4, IL-5, IL-9 и IL-13 [9]. Эти цитокины опосредуют несколько эффекторных функций. В частности IL-4 и IL-13 инициируют дифференциацию В-клеток в IgE-продуцирующие плазматические клетки, осуществляют рекрутирование эозинофилов, способствуют гиперчувствительности дыхательных путей и гиперсекреции слизи [7, 8].In recent years, it has become apparent that Th2 cells play a key role in the pathogenesis of AR; they induce and support allergic inflammation. Pathophysiological aspects of allergic disorders, such as production of IgE antibodies; mast cell recruitment and activation; basophils and eosinophils; hypersecretion of mucus; subepithelial fibrosis; and tissue remodeling are directly related to Th2 cells producing a number of pro-inflammatory cytokines: IL-4, IL-5, IL-9, and IL-13 [9]. These cytokines mediate several effector functions. In particular, IL-4 and IL-13 initiate the differentiation of B cells into IgE-producing plasma cells, carry out the recruitment of eosinophils, and promote hypersensitivity of the respiratory tract and hypersecretion of mucus [7, 8].

Сходства биологических свойств IL-4 и IL-13 также обусловлены тем, что они имеют общую цепь в индивидуальных рецепторных комплексах. Мембраносвязанный IL-13Rα1 обладает низким сродством к IL-13, но при димеризации с IL-4Rα приобретает высокую аффинность к IL-13. Второй рецептор - IL-13Rα2 - обладает высоким сродством к IL-13 и легко с ним связывается, но механизм передачи сигнала до конца не выяснен. В противоположность этому, IL-4 связывается с двумя различными типами рецепторных комплексов: первый тип состоит из цепи IL-4Rα и γс-цепи, а второй - из цепей IL-4Rα и IL-13Rα1 [Gour, Wills-Karp, 2015; Ranasinghe и др., 2014]. Таким образом, продукция цитокинов IL-4 и IL-13 важна как при ранней, так и при поздней фазе аллергического ответа, что делает их перспективными мишенями для разработки новых способов лечения аллергических заболевания и АР в частности.The similarities in the biological properties of IL-4 and IL-13 are also due to the fact that they share a common chain in individual receptor complexes. Membrane-bound IL-13Rα1 has a low affinity for IL-13, but when dimerized with IL-4Rα, it acquires high affinity for IL-13. The second receptor, IL-13Rα2, has a high affinity for IL-13 and binds to it easily, but the signal transmission mechanism has not been fully understood. In contrast, IL-4 binds to two different types of receptor complexes: the first type consists of the IL-4Rα chain and the γc chain, and the second of IL-4Rα and IL-13Rα1 chains [Gour, Wills-Karp, 2015; Ranasinghe et al., 2014]. Thus, the production of the cytokines IL-4 and IL-13 is important both in the early and in the late phase of the allergic response, which makes them promising targets for the development of new methods of treating allergic diseases and AR in particular.

Подходы к терапии АР включают, в основном, мероприятия по элиминации причинно-значимого аллергена, фармакотерапию [Greiwe, Bernstein, 2016; Juel-Berg и др., 2017] и аллерген-специфическую иммунотерапию [Juel-Berg и др., 2017; Kim и др., 2014; Passalacqua, Canonica, Bagnasco, 2016]. В большинстве случаев полностью исключить контакт с аллергеном невозможно. АСИТ применяется для лечения респираторной аллергии с 1911 г [Ring, Gutermuth, 2011]. На современном этапе развития аллергологии, АСИТ признана лечением первой линии для пациентов с IgE-зависимыми атопическими [

и др., 2013]. По данным многочисленных исследований, положительный терапевтический эффект АСИТ достигается в 80-90% случаев и более [Bidad, Nicknam, Farid, 2011; Narkus и др., 2013]. Однако проведение АСИТ сопряжено с определенным риском развития побочных реакций. В ходе терапии в ответ на введение аллергена могут возникнуть нежелательные побочные эффекты в виде местных или системных реакций. В случае проведения инъекционных методов АСИТ местные реакции отмечаются у большинства больных (80%) [Focke-Tejkl, Valenta, 2012]. Фармакотерапия АР располагает в настоящее время несколькими группами противоаллергических лекарственных препаратов, которыми можно эффективно контролировать симптомы заболевания: антигистаминные препараты, интраназальные глюкокортикостероиды, стабилизаторы мембран тучных клеток (препараты кромоглициевой кислоты), сосудосуживающие препараты (деконгестанты), антихолинергические средства, антилейкотриеновые препараты [Melvin, Patel, 2011; Simoens, Laekeman, 2009]. Тем не менее вышеописанных способе лечение АР недостаточно, о чем свидетельствует продолжающийся рост заболеваемости.Approaches to AR therapy include, mainly, measures to eliminate the causative allergen, pharmacotherapy [Greiwe, Bernstein, 2016; Juel-Berg et al., 2017] and allergen-specific immunotherapy [Juel-Berg et al., 2017; Kim et al., 2014; Passalacqua, Canonica, Bagnasco, 2016]. In most cases, contact with the allergen cannot be completely ruled out. ASIT has been used to treat respiratory allergies since 1911 [Ring, Gutermuth, 2011]. At the present stage of development of allergology, ASIT is recognized as a first-line treatment for patients with IgE-dependent atopic [

et al., 2013]. According to numerous studies, a positive therapeutic effect of ASIT is achieved in 80-90% of cases or more [Bidad, Nicknam, Farid, 2011; Narkus et al., 2013]. However, ASIT is associated with a certain risk of adverse reactions. During therapy, unwanted side effects in the form of local or systemic reactions may occur in response to an allergen. In the case of injection methods ASIT local reactions are observed in most patients (80%) [Focke-Tejkl, Valenta, 2012]. Pharmacotherapy AR currently has several groups of antiallergic drugs that can effectively control the symptoms of the disease: antihistamines, intranasal glucocorticosteroids, mast cell membrane stabilizers (cromoglycic acid preparations), vasoconstrictor drugs (decongestants), anticholinergics, antileukotriene drugs [Melvin, Patel , 2011; Simoens, Laekeman, 2009]. Nevertheless, the above-described method of treatment of AR is not enough, as evidenced by the continuing increase in the incidence.

С учетом ведущей роль IL-4 и IL-13 в патогенезе АР появляются разработки т.н. таргетных препаратов, которые специфически блокируют активность выбранных биомишеней. Первоначально для подавления экспрессии IL-4 и IL-13 использовались моноклональные антитела, которые связываются с данными цитокинами и тем самым блокируют их активность, также используются т.н. мутеины (мутантные белки указанных цитокинов), которые связываются с рецептором, но не индуцирует передачу сигнала. Кроме того, используются растворимые рецепторы для IL-4 и IL-13, которые связываются со своими лигандами и предотвращют взаимодействие с полноценным рецептором на поверхности клетки. Все эти походы регулируют экспрессию IL-4 и IL-13 на белковом уровне, а большинство из них не оправдали ожиданий в клинических исследованиях.Given the leading role of IL-4 and IL-13 in the pathogenesis of AR, the development of the so-called targeted drugs that specifically block the activity of selected biological targets. Initially, monoclonal antibodies that bind to these cytokines and thereby block their activity were used to suppress the expression of IL-4 and IL-13, so-called muteins (mutant proteins of these cytokines) that bind to the receptor but do not induce signal transmission. In addition, soluble receptors for IL-4 and IL-13 are used, which bind to their ligands and prevent interaction with a complete receptor on the cell surface. All these trips regulate the expression of IL-4 and IL-13 at the protein level, and most of them fell short of expectations in clinical trials.

Альтернативой использованию моноклональных антител служит стратегия применения антисмысловых технологий. Под антисмысловыми технологиями понимают способы регуляции активности генов-мишеней на посттранскрипционном уровне. Недавнее открытие механизма РНК-интерференции (РНКи; RNAi) дало новые возможности для регуляции экспрессии генов, в том числе и генов, участвующих в патогенезе АР. РНКи - это РНК-зависимый механизм регуляции экспрессии генов, в котором двухцепочечные молекулы миРНК ингибируют экспрессию генов с комплементарной нуклеотидной последовательностью. Таким образом, введение в клетки и ткани искусственных миРНК необходимого размера (21 пн) и с необходимой последовательностью позволяет осуществить специфическое подавление экспрессии гена-мишени. При этом экспрессия других генов с иной нуклеотидной последовательностью остается неизменной [Joo и др., 2014].An alternative to the use of monoclonal antibodies is the antisense technology strategy. Antisense technologies mean methods for regulating the activity of target genes at the post-transcriptional level. The recent discovery of the mechanism of RNA interference (RNAi; RNAi) has provided new opportunities for the regulation of gene expression, including genes involved in the pathogenesis of AR. RNAi is an RNA-dependent mechanism of regulation of gene expression in which double-stranded siRNA molecules inhibit gene expression with a complementary nucleotide sequence. Thus, the introduction of artificial siRNA into cells and tissues of the required size (21 bp) and with the necessary sequence allows specific suppression of the expression of the target gene. Moreover, the expression of other genes with a different nucleotide sequence remains unchanged [Joo et al., 2014].

Одна из ключевых проблем, препятствующих внедрению метода РНК-интерференции в клиническую практику - эффективная доставка молекул миРНК в клетки. Из имеющихся способов, вирусные векторные системы являются наиболее эффективными транспортными средствами доставки нуклеиновых кислот. Однако, в этой сфере за последние 15 лет, реализация их в клинической практике осложняется, что связано с опасениями насчет возможности мутагенеза вирусного генома, активации онкогенов и высокой иммуногенности таких векторов.One of the key problems hindering the introduction of the RNA interference method in clinical practice is the efficient delivery of siRNA molecules to cells. Of the available methods, viral vector systems are the most effective nucleic acid delivery vehicles. However, in this area over the past 15 years, their implementation in clinical practice has been complicated, due to concerns about the possibility of mutagenesis of the viral genome, activation of oncogenes, and the high immunogenicity of such vectors.

В качестве альтернативных невирусных векторов предложено применять разнообразные поликатионные соединения, способные образовывать комплексы с отрицательно заряженными нуклеиновыми кислотами (НК) и конденсировать их в компактные наноструктуры. Комплексование, с одной стороны, обеспечивает защиту НК от.действия нуклеаз, а с другой, способствует их транслокации через клеточные мембраны, обычно, путем эндоцитоза. В качестве НК-связывающих агентов могут выступать катионные синтетические полимеры (например, полиэтиленимины), основные полиаминокислоты (полилизины, полиаргинины), хитозаны, катионные пептиды различного состава (например, пептид из белка ТАТ-ВИЧ), и липосомы. В настоящее время липосомы, используемые в качестве носителей для трансфекции клеток высоко токсичны и обладают плохой стабильностью, все это делает их малоприменимыми в практическом плане в медицине (in vivo). Всех этих недостатков лишены позитивно заряженные пептиды, которые также проявляют высокую транспортную активность, при этом малотоксичны и стабильны при хранении.As alternative non-viral vectors, it was proposed to use a variety of polycationic compounds capable of forming complexes with negatively charged nucleic acids (NKs) and condensing them into compact nanostructures. Complexing, on the one hand, protects the NK from the action of nucleases, and on the other hand, promotes their translocation through cell membranes, usually by endocytosis. NK-binding agents may include cationic synthetic polymers (e.g., polyethyleneimines), basic polyamino acids (polylysines, polyargins), chitosans, cationic peptides of various compositions (e.g., peptide from the TAT-HIV protein), and liposomes. Currently, liposomes used as carriers for transfection of cells are highly toxic and have poor stability; all this makes them inapplicable in practice in medicine (in vivo). All these disadvantages are deprived of positively charged peptides, which also exhibit high transport activity, while being low toxic and stable during storage.

Основываясь на знании о ведущей роли IL-4/IL-13 в запуске синтеза IgE и развитии аллергического воспаления при АР представляется целесообразным осуществить блокаду генов, ответственных за синтез этих интерлейкинов, с помощью новейшей методологии интерференции РНК. Была создана композиция для терапии аллергического ринита, которая в своем составе содержит комплекс катионного дендримерного пептида b-LTP в основной форме и молекул миРНК (siIL4-153 и siIL13-395) в массовом соотношении 12,5/1. Молекулы миРНК состава 5- AAAGAUGUCUGUUACGGUCtt -3 (для siIL4-153) и 5- GGACCUGCUCUUACAUUUAtt -3 (для siIL 13-395). Катионный дендримерный пептид b-LTP в основной форме, отвечающий химическому строению (Arg)8 (Lys)4 (Lys)2 Lys-Ala-Cys-NH2.Based on knowledge of the leading role of IL-4 / IL-13 in triggering IgE synthesis and the development of allergic inflammation in AR, it seems advisable to block the genes responsible for the synthesis of these interleukins using the latest RNA interference methodology. A composition was created for the treatment of allergic rhinitis, which in its composition contains a complex of the cationic dendrimer peptide b-LTP in the main form and siRNA molecules (siIL4-153 and siIL13-395) in a weight ratio of 12.5 / 1. MiRNA molecules of composition 5-AAAGAUGUCUGUUACGGUCtt -3 (for siIL4-153) and 5-GGACCUGCUCUUACAUUUUAtt -3 (for siIL 13-395). The cationic dendrimer peptide b-LTP in basic form, corresponding to the chemical structure of (Arg) 8 (Lys) 4 (Lys) 2 Lys-Ala-Cys-NH2.

В патенте № US 20160207995 A1 описаны антитела против IL-4 и биспецифические антитела и способы их использования. Использование антител против IL-4 уступает применению композиции для терапии аллергического ринита потому, что последний нацелен не только против IL-4, но и против IL-13 одновременно.Patent No. US20160207995 A1 describes antibodies against IL-4 and bispecific antibodies and methods for their use. The use of antibodies against IL-4 is inferior to the use of the composition for the treatment of allergic rhinitis because the latter is aimed not only against IL-4, but also against IL-13 at the same time.

В патенте № WO 2018011405 A1 описывается применение неагонистического полипептидного лиганда, специфически реагирующего на IL-13Ral, при лечении или профилактике состояния, выбранного из нейтропении, аллергического воспаления, бактериемии и сепсиса. Композиция выгодно отличается от пептидного лиганда первый направлен не на рецептор к данному интерлейкину, а на мРНК самого цитокина, т.е. на более ранний этап активации провоспалительного каскада.Patent No. WO 2018011405 A1 describes the use of a non-agonistic polypeptide ligand specifically responsive to IL-13Ral in the treatment or prevention of a condition selected from neutropenia, allergic inflammation, bacteremia and sepsis. The composition compares favorably with the peptide ligand; the first is directed not at the receptor for this interleukin, but at the mRNA of the cytokine itself, i.e. to an earlier stage of activation of the pro-inflammatory cascade.

В патенте № US 20160075777 A1 описаны биспецифические антитела против IL-4 / IL-13 и систему буферизации, в которой рН составляет около 7, с низкой концентрацией соли в составе, чтобы уменьшить ионную силу препарата. Авторы патента указывают, что препарат может использоваться для лечения различных заболеваний, в том числе и аллергической природы. В отличие от данного изобретения разрабатываемая композиция направлена не на белковые продукты IL-4 / IL-13, а на молекулы мРНК, кодирующие эти белки. Блокировка мРНК позволяет достигать более выраженного эффекта, поскольку с одной молекулы мРНК может синтезироваться до 100 белков.U.S. Patent No. 20160075777 A1 describes bispecific anti-IL-4 / IL-13 antibodies and a buffering system in which the pH is about 7 with a low salt concentration in the formulation to reduce the ionic strength of the formulation. The authors of the patent indicate that the drug can be used to treat various diseases, including allergic nature. In contrast to the present invention, the composition being developed is directed not to protein products of IL-4 / IL-13, but to mRNA molecules encoding these proteins. Blocking mRNA allows you to achieve a more pronounced effect, since up to 100 proteins can be synthesized from a single mRNA molecule.

В патенте № US 20150225479 A1 описаны стабильные фармацевтические композиции антител, включая жидкие составы и лиофилизированные препараты, в частности биспецифические анти-IL-4 / анти-IL-13 антитела, полиаминокислоту, состоящую из глутаминовой кислоты, аспарагиновой кислоты или обеих кислот сразу, с добавлением витамина Е. также, в составе имеется криопротектор и буферизующая система, в которой рН композиции составляет около 7, с концентрацией соли 50 мМ или менее. Данный патент, также, включает способы получения таких композиций. По предположению заявителя эти пептиды могут быть использованы в медицине в качестве антагонистов для IL-4/IL-13 при терапии аллергопатологий. Как и в предыдущем изобретении биспецифические анти-IL-4 / анти-IL-13 антитела уступают композиции, так как молекулы миРНК (присутствующие в составе МРК-4-13) инициируют деградацию мРНК генов-мишеней, а не нейтрализуют их белковые продукты. Кроме того, синтетические молекул миРНК дешевле в получении, чем антитела, которые продуцируются гибрид омами.Patent No. US20150225479 A1 describes stable pharmaceutical antibody compositions, including liquid formulations and lyophilized preparations, in particular bispecific anti-IL-4 / anti-IL-13 antibodies, a polyamino acid consisting of glutamic acid, aspartic acid, or both acids at once, with addition of vitamin E. also, the composition has a cryoprotectant and a buffering system in which the composition has a pH of about 7, with a salt concentration of 50 mM or less. This patent also includes methods for preparing such compositions. According to the applicant, these peptides can be used in medicine as antagonists for IL-4 / IL-13 in the treatment of allergic pathologies. As in the previous invention, the bispecific anti-IL-4 / anti-IL-13 antibodies are inferior to the composition, since siRNA molecules (present in MRK-4-13) initiate the degradation of the mRNA of the target genes rather than neutralizing their protein products. In addition, synthetic siRNA molecules are cheaper to obtain than antibodies that are produced by Ohms hybrid.

В патенте № US 20170218376 A1 представлены асимметричные комплексы РНК, такие как asiRNAs и проникающие в клетку asiRNAs, которые ингибируют экспрессию IL4Rα, TRPA1 и/или F2RL1. Заявители патента утверждают о возможности применять данные препараты для лечения заболеваний аллергической природы, приводя в пример атопический дерматит и астму.Patent No. US 20170218376 A1 discloses asymmetric RNA complexes, such as asiRNAs and cell-penetrating asiRNAs, which inhibit the expression of IL4Rα, TRPA1 and / or F2RL1. Applicants claim that these drugs can be used to treat allergic diseases, citing atopic dermatitis and asthma as an example.

В патенте № WO 2005085443 A2 описаны композиции, содержащие один или несколько агентов RNAi (например, siRNAs, shRNAs или RNAi-векторы) для лечения состояний и заболеваний с IgE-опосредованной гиперчувствительностью, а также систем для определения эффективных агентов RNAi. Композиции подходят для лечения аллергического ринита и/или астмы. Агент RNAi нацелен на транскрипт, который кодирует белок, выбранный из: FC, RIα, цепи FC & epsiv; RIβ, c-Kit, Lyn, Syk, ICOS, OX40L, CD40, CD80, CD86, RelA, RelB, лиганд 4-IBB, TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, CD83, SLAM, обычную цепь F и COX-2. Некоторые варианты запатентованного препарата, содержащие агент RNAi, доставляются аэрозольным путем.Patent No. WO2005085443 A2 describes compositions containing one or more RNAi agents (eg, siRNAs, shRNAs or RNAi vectors) for the treatment of conditions and diseases with IgE-mediated hypersensitivity, as well as systems for determining effective RNAi agents. The compositions are suitable for the treatment of allergic rhinitis and / or asthma. The RNAi agent targets a transcript that encodes a protein selected from: FC, RIα, FC strands? RIβ, c-Kit, Lyn, Syk, ICOS, OX40L, CD40, CD80, CD86, RelA, RelB, ligand 4-IBB, TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, CD83, SLAM , conventional chain F and COX-2. Some patented drug variants containing an RNAi agent are delivered by aerosol.

Композиции, содержащие агенты RNAi, указанные в патентах № US 20170218376 A1 и № WO 2005085443 A2 уступают заявленному препарату МРК-4-13 по причинам: а) вводящие в состав композиции молекулы миРНК имеют иную, уникальную нуклеотидную последовательность, позволяющую подавлять активность целевых генов до 80%; б) в составе композиции помимо молекул миРНК присутствует носитель -катионный дендримерный пептид b-LTP, способствующий проникновению молекул миРНК внутрь клеток-мишеней, что усиливает эффект in vivo.Compositions containing RNAi agents indicated in patents No. US 20170218376 A1 and No. WO 2005085443 A2 are inferior to the claimed MRK-4-13 preparation for the following reasons: a) the miRNA molecules that make up the composition have a different, unique nucleotide sequence that inhibits the activity of target genes up to 80% b) in the composition of the composition, in addition to siRNA molecules, there is a carrier-cationic dendrimer peptide b-LTP, which facilitates the penetration of siRNA molecules into target cells, which enhances the in vivo effect.

В патенте № US 15335408 представлен блочный сополимер хитозана и полиэтиленгликоля, модифицированный транс-активатором транскриптазы ВИЧ 1 («Тат»); предполагается, что сформированные из этого материала наночастицы могут выступать в качестве невирусной системы доставки нуклеиновых кислот в клетки. Перечисленные в данном изобретении высокомолекулярные системы доставки уступают носителю b-LTP (используемый в составе композиции) в сложности изготовления: включают стадию N-ацилирования хитозана в среде ДМФА, что, однако, требует дополнительных процедур (растворение хитозана в кислоте, смешение с ДМФА, удаление кислоты); ацилирование ангидридом в присутствии органического основания может затрагивать гидроксильные группы хитозана, что также отрицательно сказывается на стандартности полуфабриката - блочного сополимера хитозана и ПЭГ. Высокая молекулярная масса и результирующая нестандартность модифицированного пептидами сополимера очевидным образом затрудняет его дозирование при приготовлении растворов комплексов переносчика с нуклеиновыми кислотами. Носитель b-LTP лишен этих недостатков по причинам: а) обладает постоянной относительно низкой молекулярной массой (2 338 у.е.); б) в получении используется меньшее число стадий, химическая модификация аминокислот или результирующего пептида в нем отсутствуют.US Pat. No. 1,533,5408 provides a block copolymer of chitosan and polyethylene glycol modified with a trans-activator of HIV 1 transcriptase (“Tat”); it is assumed that nanoparticles formed from this material can act as a non-viral system for the delivery of nucleic acids to cells. The high molecular weight delivery systems listed in this invention are inferior to the b-LTP carrier (used in the composition) in manufacturing complexity: they include the step of N-acylation of chitosan in DMF, which, however, requires additional procedures (dissolution of chitosan in acid, mixing with DMF, removal acids); Acylation with anhydride in the presence of an organic base can affect the hydroxyl groups of chitosan, which also negatively affects the standardization of the semi-finished product - a block copolymer of chitosan and PEG. The high molecular weight and the resulting non-standardity of the peptide-modified copolymer obviously complicates its dosing in the preparation of solutions of carrier complexes with nucleic acids. The b-LTP carrier is devoid of these disadvantages for the following reasons: a) has a constant relatively low molecular weight (2,338 cu); b) fewer steps are used in the preparation; there are no chemical modifications of amino acids or the resulting peptide.

В патенте № US 15840933 описаны липиды, которые могут содержать варьирующее число лекарственных молекул. В частности, в изобретении представлен комплекс нуклеиновая кислота-липиды. Предполагается, что такие частицы могут выступать в качестве системы доставки нуклеиновых кислот. Перечисленные в данном изобретении липиды уступают b-LTP, так как: а) если из сложных эфиров ВЖК получают везикулы, то стабильность такой системы доставки будет значительно ниже, чем у b-LTP, который не формирует везикулярных структур при смешивании с миРНК; б) если сложные эфиры ВЖК используются для получения мицелл, связывание с нуклеиновой кислотой будет затрудненным по сравнению с b-LTP, а ее доступность также будет снижена.In patent No. US 15840933 described lipids, which may contain a varying number of drug molecules. In particular, the invention provides a nucleic acid-lipid complex. It is contemplated that such particles can act as a nucleic acid delivery system. The lipids listed in this invention are inferior to b-LTP, since: a) if vesicles are obtained from high-fatty acid esters, the stability of such a delivery system will be significantly lower than that of b-LTP, which does not form vesicular structures when mixed with siRNA; b) if the esters of high fatty acids are used to produce micelles, binding to nucleic acid will be difficult compared to b-LTP, and its availability will also be reduced.

В патенте № WO 2010142660 А2 представлены микрочастицы, которые содержат PLGA и катионный липид. Липид выступает в роли эмульгатора. Предполагается, что такие микрочастицы могут выступать в качестве системы доставки миРНК и использоваться для лечения заболеваний легких. Указанные микрочастицы уступают Ь-LTP, так как: а) высвобождение действующего вещества из микрокапсул будет происходить медленнее, чем из комплексов нуклеотида с b-LTP, в связи с чем терапевтический эффект изобретения будет развиваться дольше; б) в получении b-LTP используется меньшее число стадий, технологическая схема не предполагает получения эмульсий и малостабильных при хранении веществ, как PLGA (разрушается в водной среде); в) использование органических растворителей (хлористый метилен) для растворения PLGA повышает риск развития токсического действия, несмотря на стадию упаривания органического растворителя.In patent No. WO 2010142660 A2 microparticles are presented which contain PLGA and a cationic lipid. Lipid acts as an emulsifier. It is believed that such microparticles can act as a siRNA delivery system and be used to treat lung diseases. These microparticles are inferior to L-LTP, because: a) the release of the active substance from microcapsules will be slower than from complexes of the nucleotide with b-LTP, and therefore the therapeutic effect of the invention will develop longer; b) fewer steps are used in the preparation of b-LTP, the technological scheme does not imply the production of emulsions and substances that are unstable during storage, like PLGA (breaks down in an aqueous medium); c) the use of organic solvents (methylene chloride) to dissolve PLGA increases the risk of toxic effects, despite the stage of evaporation of the organic solvent.

В патенте № US 20140134260 A1 представлены композиции на основе катионного липида и частиц нуклеиновая кислота/липиды, которые могут инкапсулировать нуклеиновые кислоты. Предполагается, что такие частицы могут выступать в качестве системы доставки нуклеиновых кислот. Описанные здесь липиды уступают b-LTP, так как: а) если из сложных эфиров ВЖК получают везикулы, стабильность такой системы доставки будет значительно ниже, чем у b-LTP; б) если сложные эфиры ВЖК используются для получения мицелл, связывание с нуклеиновой кислотой будет затрудненным по сравнению с b-LTP, а ее доступность также будет снижена.U.S. Patent No. 20140134260 A1 provides compositions based on cationic lipid and nucleic acid / lipid particles that can encapsulate nucleic acids. It is contemplated that such particles can act as a nucleic acid delivery system. The lipids described here are inferior to b-LTP, because: a) if vesicles are obtained from high-fatty acid esters, the stability of such a delivery system will be significantly lower than that of b-LTP; b) if the esters of high fatty acids are used to produce micelles, binding to nucleic acid will be difficult compared to b-LTP, and its availability will also be reduced.

В патенте № US 20130281658 A1 представлены композиции для направленной доставки нуклеиновых кислот. В качестве системы доставки используются пептиды, способные к проникновению в клетки. Предполагается, что пептиды, описанные в изобретении № US 20130281658 A1 могут выступать в качестве системы доставки нуклеиновых кислот. Перечисленные в изобретении № US 20130281658 А1 липиды уступают b-LTP, так как: а) линейные пептиды являются биодеградируемыми, обладают коротким периодом полураспада, вследствие чего такая структура может распасться, не достигнув органа-мишени, комплекс b-LTP обладает повышенной устойчивостью к ферментативному гидролизу, т.к. он не является линейным, а имеет разветвленную структуру.US Pat. No. 20130281658 A1 discloses compositions for targeted delivery of nucleic acids. Peptides capable of penetrating into cells are used as a delivery system. It is contemplated that the peptides described in invention No. US20130281658 A1 may act as a nucleic acid delivery system. The lipids listed in the invention No. US20130281658 A1 are inferior to b-LTP, since: a) the linear peptides are biodegradable, have a short half-life, as a result of which such a structure can decompose without reaching the target organ, the b-LTP complex has increased resistance to enzymatic hydrolysis, because it is not linear, but has a branched structure.

В патенте № US 7879813 B2 представлены линейный полиаргининовый клеточно-проникающий пептид. Предполагается, что этот пептид может выступать в качестве системы доставки нуклеиновых кислот.Однако описанный пептид уступают b-LTP, так как: а) линейные пептиды в целом являются легко биодеградируемыми, обладают коротким периодом полураспада, вследствие чего такая структура может распасться, не достигнув органа-мишени, в то же время b-LTP обладает повышенной устойчивостью к ферментативному гидролизу за счет разветвленной структуры; б) линейные пептиды обладают повышенной токсичностью по сравнению с разветвленным b-LTP.US Pat. No. 7,879,813 B2 discloses a linear polyarginine cell-penetrating peptide. It is assumed that this peptide can act as a nucleic acid delivery system. However, the described peptide is inferior to b-LTP, since: a) linear peptides are generally biodegradable, have a short half-life, as a result of which this structure can decay before reaching the organ - targets, at the same time b-LTP has increased resistance to enzymatic hydrolysis due to the branched structure; b) linear peptides have increased toxicity compared to branched b-LTP.

В изобретении RU 2609857 C1 представлена композиция катионного дендримерного пептида (LTP) и молекул миРНК, где структурная формула дендримерного пептида соответствует b-LTP. Предполагается, что комплекс LTP-миРНК может быть использован для лечения респираторных инфекций. Описанная композиция уступает пептиду b-LTP т.к.: а) массовое соотношение комплекса LTP/миРНК составляет 25/1, в то время как массовое соотношение комплекса b-LTP/миРНК составляет 12,5/1, что является экономически более целесообразным; б) пептид LTP является солью трифторуксусной кислоты, что может увеличивать риск развития токсического действия, в то же время b-LTP является основанием и не содержит потенциально токсичных противоионов.In the invention RU 2609857 C1, a composition of a cationic dendrimer peptide (LTP) and siRNA molecules is provided, where the structural formula of the dendrimer peptide corresponds to b-LTP. It is believed that the LTP-miRNA complex can be used to treat respiratory infections. The described composition is inferior to the b-LTP peptide because: a) the mass ratio of the LTP / siRNA complex is 25/1, while the mass ratio of the b-LTP / siRNA complex is 12.5 / 1, which is economically more appropriate; b) the LTP peptide is a salt of trifluoroacetic acid, which may increase the risk of toxic effects, while b-LTP is the base and does not contain potentially toxic counterions.

В изобретении RU 2572575 C1 представлен катионный дендримерный пептид (LTP), структурная формула которого соответствует b-LTP. Предполагается, что катионный дендримерный пептид LTP может выступать в качестве системы доставки нуклеиновых кислот в клетки млекопитающих. Описанный пептид LTP уступает b-LTP, т.к. первый является солью трифторуксусной кислоты, что может увеличивать риск развития токсического действия, в то же время b-LTP является основанием и не содержит потенциально токсичных противоионов.In the invention RU 2572575 C1 presents a cationic dendrimer peptide (LTP), the structural formula of which corresponds to b-LTP. It is contemplated that the cationic dendrimer peptide LTP can act as a system for delivering nucleic acids to mammalian cells. The described LTP peptide is inferior to b-LTP, because the first is a salt of trifluoroacetic acid, which can increase the risk of toxic effects, while b-LTP is the base and does not contain potentially toxic counterions.

В изобретении RU 2563989 C1 представлена композиция, состоящая из катионного дендримерного пептида LTP с двумя молекулами РНК. LTP в солевой форме выступает в качестве носителя РНК, где структурная формула пептида соответствует b-LTP в щелочной форме. Предполагается использование данной композиции для подавления экспрессии гена интерлейкина-4.In the invention RU 2563989 C1 presents a composition consisting of a cationic dendrimer peptide LTP with two RNA molecules. LTP in salt form acts as an RNA carrier, where the structural formula of the peptide corresponds to b-LTP in alkaline form. It is intended that this composition be used to suppress the expression of the interleukin-4 gene.

Поэтому задачей данного изобретения является разработка композиции для лечения аллергического ринита на основе малых интерферирующий РНК (миРНК), подавляющих одновременно экспрессию гена IL-13 и гена IL-4, и катионного дендримерного пептида, находящегося в основной не солевой форме (b-LTP) с последовательностью (Arg)8(Lys)4(Lys)2Lys-Ala-Cys-NH2, выступающего в качестве носителя.Therefore, the objective of the present invention is to develop a composition for the treatment of allergic rhinitis based on small interfering RNAs (siRNAs), which simultaneously suppress the expression of the IL-13 gene and IL-4 gene, and the cationic dendrimer peptide in the basic non-salt form (b-LTP) with the sequence (Arg) 8 (Lys) 4 (Lys) 2 Lys-Ala-Cys-NH2, acting as a carrier.

Для решения данной задачи были разработаны молекулы миРНК, подавляющие экспрессию гена IL-13 и гена IL-4, а также разработано средство, содержащее эффективное количество указанной смеси миРНК в сочетании с носителем для внутриклеточной доставки нуклеиновых кислот b-LTP и его использование на мышиной модели аллергического ринита.To solve this problem, siRNA molecules that suppress the expression of the IL-13 gene and IL-4 gene were developed, and a tool containing an effective amount of this miRNA mixture in combination with a carrier for intracellular delivery of b-LTP nucleic acids and its use in a mouse model was developed allergic rhinitis.

Интраназальная композиция для лечения аллергического ринита содержит эффективное количество катионного дендримерного пептида с формулой (Arg)8(Lys)4(Lys)2Lys-Ala-Cys-NH2, находящегося в основной не солевой форме (b-LTP), выступающего в качестве носителя, и смесь молекул миРНК, подавляющих экспрессию гена IL-13 и IL-4, представленных последовательностями GGACCUGCUCUUACAUUUAtt и AAAGAUGUCUGUUACGGUCtt, соотвественно.The intranasal composition for treating allergic rhinitis contains an effective amount of a cationic dendrimer peptide of the formula (Arg) 8 (Lys) 4 (Lys) 2Lys-Ala-Cys-NH2, which is in the basic non-salt form (b-LTP), acting as a carrier, and a mixture of siRNA molecules that suppress IL-13 and IL-4 gene expression represented by the sequences GGACCUGCUCUUACAUUUAtt and AAAGAUGUCUGUUACGGUCtt, respectively.

Техническими результатами предлагаемого способа является получение интраназальной композиции для лечения аллергического ринита на основе молекул миРНК, представленных последовательностями AAAGAUGUCUGUUACGGUCtt и GGACCUGCUCUUACAUUUAtt, что обеспечивает одновременное воздействие на два провоспалительных цитокина IL-4 и IL-13. Полученное массовое соотношение комплекса b-LTP/миРНК 12,5/1 в заявленной композиции является более целесообразным, поскольку необходимо в 2 раза меньше белка-носителя для равной по эффективности доставки одинакового количества молекул миРНК по сравнению с известным соотношением LTP/миРНК составляющим 25/1. Кроме того, использование катионного дендримерного пептида b-LTP в основной не солевой форме не содержит потенциально токсичных противоионов, что снижает риск токсического действия.The technical results of the proposed method is to obtain an intranasal composition for the treatment of allergic rhinitis based on siRNA molecules represented by the sequences AAAGAUGUCUGUUACGGUCtt and GGACCUGCUCUUACAUUUUtt, which provides simultaneous effects on two pro-inflammatory cytokines IL-4 and IL-13. The resulting mass ratio of the b-LTP / siRNA complex 12.5 / 1 in the claimed composition is more appropriate, since it is necessary to have 2 times less carrier protein for equal delivery efficiency of the same number of siRNA molecules compared to the known LTP / siRNA ratio of 25 / 1. In addition, the use of the cationic dendrimer peptide b-LTP in the basic non-salt form does not contain potentially toxic counterions, which reduces the risk of toxic effects.

Краткое описание чертежейBrief Description of the Drawings

Фиг. 1. Подавление активности IL-4 и IL-13 молекулами siIL4-153 и siIL 13-395.FIG. 1. Suppression of the activity of IL-4 and IL-13 molecules siIL4-153 and siIL 13-395.

Фиг. 2. Определение оптимального массового соотношения bLTP и нуклеиновых кислот.FIG. 2. Determination of the optimal mass ratio of bLTP and nucleic acids.

Фиг. 3. Структура катионного дендримерного пептида LTP в двух видах: А - аминокислоты представлены в трех-буквенном обозначении, Б - аминокислоты представлены в одно-буквенном обозначении, где А - аланин, К - лизин, R - аргинин, С - цистеин.FIG. 3. The structure of the cationic dendrimer peptide LTP in two forms: A - amino acids are presented in a three-letter designation, B - amino acids are presented in a single-letter designation, where A is alanine, K is lysine, R is arginine, and C is cysteine.

Фиг. 4. Продукция IL-4 клетками подчелюстных лимфоузлов.FIG. 4. Production of IL-4 cells of the submandibular lymph nodes.

Фиг. 5. Продукция IL-13 клетками подчелюстных лимфоузлов.FIG. 5. Production of IL-13 cells of the submandibular lymph nodes.

Фиг. 6. Уровни специфических IgE в сыворотке крови мышей. Фиг. 7. Уровни специфических IgG1 в сыворотке крови мышей.FIG. 6. The levels of specific IgE in the blood serum of mice. FIG. 7. The levels of specific IgG1 in the blood serum of mice.

Фиг. 8. Уровни специфических IgG2a в сыворотке крови мышей. Фиг. 9. Соотношение уровней специфических IgE/IgG2a.FIG. 8. The levels of specific IgG2a in the blood serum of mice. FIG. 9. The ratio of the levels of specific IgE / IgG2a.

Фиг. 10. Соотношение уровней специфических IgGl/IgG2a.FIG. 10. The ratio of the levels of specific IgGl / IgG2a.

Фиг. 11. Частота чиханий мышей в разных группах в течение 5 минут после введения аллергена.FIG. 11. The frequency of sneezing mice in different groups within 5 minutes after the introduction of the allergen.

Фиг. 12. Количество эозинофилов в слизистой оболочке носа мышей разных групп.FIG. 12. The number of eosinophils in the nasal mucosa of mice of different groups.

Список сокращенийList of abbreviations

АР - аллергический ринитAR - Allergic Rhinitis

АСИТ - аллерген-специфическая иммунная терапияASIT - allergen-specific immune therapy

АП - антигистаминные препаратыAP - antihistamines

БА - бронхиальная астмаBA - bronchial asthma

БАЛ - бронхо-альвеолярный лаважBAL - broncho-alveolar lavage

ВЖК - высшие жирные кислотыHigh fatty acids - higher fatty acids

ГКС - глюкокортикостероиды / препараты на основе глюкокортикостероидовGCS - glucocorticosteroids / glucocorticosteroid-based drugs

ДМФА - N,N-ДиметилформамидDMF - N, N-Dimethylformamide

ЛУ - лимфоузлыLU - lymph nodes

миРНК - малые интерферирующие РНКsiRNA - small interfering RNA

НК - нуклеиновые кислотыNK - nucleic acids

ПЭГ - полиэтиленгликольPEG - Polyethylene Glycol

РНК - рибонуклеиновая кислотаRNA - ribonucleic acid

РНКи (RNAi) - РНК-интерференцияRNAi (RNAi) - RNA interference

ТД - терапевтическая дозаTD - therapeutic dose

AGO-белок - белок Аргонавт, каталитический компонент RISCAGO protein - Argonaut protein, catalytic component of RISC

ARIA - Allergic Rhinitis and its Impact on Asthma - международный согласительныйARIA - Allergic Rhinitis and its Impact on Asthma - International Conciliation

CysLT1-рецепторы- лейкотриеновые рецепторы 1 типаCysLT1 receptors - type 1 leukotriene receptors

c-Kit - белковая тирозинкиназаc-Kit - protein tyrosine kinase

СОХ-2 - циклооксигеназа 2COX-2 - cyclooxygenase 2

ICOS - индуцибельные костимулирующие рецепторыICOS - inducible co-stimulating receptors

IgG1 - иммуноглобулин класса G, подкласс G1IgG1 - class G immunoglobulin, subclass G1

IgG2a - иммуноглобулин класса G, подкласс G2aIgG2a - class G immunoglobulin, subclass G2a

IgE - иммуноглобулин класса ЕIgE - Class E immunoglobulin

GM-CSF - гранулоцитарный-макрофагальный колониестимулирующий факторGM-CSF - granulocyte-macrophage colony stimulating factor

IL (4, 5, 6, 9, 10, 11, 13) - интерлейкиныIL (4, 5, 6, 9, 10, 11, 13) - interleukins

IL-4Rα - рецептор к IL-4IL-4Rα - receptor for IL-4

IL-13Rα (1, 2) - рецепторы к IL-13IL-13Rα (1, 2) - receptors for IL-13

Lyn - тирозиновая протеинкиназа человекаLyn - human tyrosine protein kinase

MDC - цитокины макрофагального происхожденияMDC - Macrophage-Based Cytokines

NK-клетки - натуральные киллерыNK cells - natural killers

OX40L - цитокин семейства факторов некроза опухоли, лиганд рецептора CD 134OX40L - cytokine of the tumor necrosis factor family, CD 134 receptor ligand

OVA - овальбуминOVA - Ovalbumin

PLGA - поли альфа-гидроксикислотаPLGA - Poly Alpha Hydroxy Acid

Rel (А, В) - транскрипционные факторыRel (A, B) - transcription factors

REM фаза - фаза сна, характеризующаяся быстрым движением глазREM phase - a phase of sleep characterized by rapid eye movement

RISC - RNA-induced silencing complex - сайленсинговый комплекс, индуцируемый молекулами РНКRISC - RNA-induced silencing complex - silencing complex induced by RNA molecules

RIβ - субъединица АМФ-зависимой протеинкиназыRIβ - subunit of AMP-dependent protein kinase

siGFP - миРНК против гена GFPsiGFP - siRNA against the GFP gene

SLAM - сигнальнаямолекула активации лимфоцитовSLAM - a signal molecule of lymphocyte activation

STAT6 - сигнальный трансдуктер и активатор транскрипции 6 документ «Аллергический ринит и его влияние на астму»STAT6 - signal transducer and transcription activator 6 document “Allergic rhinitis and its effect on asthma”

Syk - тирозиновая киназа человекаSyk - human tyrosine kinase

Th1 - Т-хелперы 1 типаTh1 - T-helpers of type 1

Th2 - Т-хелперы 2 типаTh2 - T-helpers of type 2

TLR (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9) - Toll-подобные рецепторыTLR (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9) - Toll-like receptors

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Пример 1. Молекулы миРНК подавляют экспрессию IL-4 и IL-13 человека.Example 1. The siRNA molecules inhibit the expression of human IL-4 and IL-13.

Проектирование молекул миРНК было осуществлено с помощью специального программного обеспечения OligoWalk, которое рассчитывает термодинамические параметры гибридизации РНК-олигонуклеотидов, предсказывает их свободную энергию связывания с мРНК-мишенью. С использованием программы OligoWalk было спрогнозировано более 50 различных вариантов молекул миРНК, из которых были выбраны наиболее оптимальные варианты миРНК. Выбор осуществлялся в соответствии со следующими критериями: положение участка отжига на мРНК гена-мишени (не должен находиться ближе 50 пн относительно Start-кодона гена, т.к. в данном участке мРНК-мишени инициируется трансляция, которая сопряжена с привлечением различных инициирующих белковых факторов, что снижает пространственную доступность данного участка для молекул миРНК, и как следствие понижает их активность. Кроме того, следовало избегать повторяющихся более 4 раз нуклеотидов таких как «АААА» и «GGGG». Последовательность миРНК не должна быть идентичной последовательностям других генов в геноме человека. В итоге были спроектированы следующие варианты миРНК против гена IL-4 (siIL4-153 состава SEQUENCE 1: AAAGAUGUCUGUUACGGUCtt) и IL-13 (siIL13-395 состава SEQUENCE 2: GGACCUGCUCUUACAUUUAtt).The design of siRNA molecules was carried out using special OligoWalk software, which calculates the thermodynamic parameters of hybridization of RNA oligonucleotides and predicts their free binding energy to the target mRNA. Using the OligoWalk program, more than 50 different variants of siRNA molecules were predicted, from which the most optimal siRNA variants were selected. The selection was carried out in accordance with the following criteria: the position of the annealing site on the mRNA of the target gene (should not be closer than 50 bp relative to the Start codon of the gene, because translation is initiated in this segment of the mRNA target, which is associated with the involvement of various initiating protein factors , which reduces the spatial availability of this site for siRNA molecules, and as a result lowers their activity. In addition, nucleotides such as AAAA and GGGG, repeated more than 4 times, should be avoided. The siRNA sequence is not . Lzhna be identical to the sequences of other genes in the human genome a result, the following variants were designed siRNA against IL-4 gene (siIL4-153 composition SEQUENCE 1: AAAGAUGUCUGUUACGGUCtt) and IL-13 (siIL13-395 composition SEQUENCE 2: GGACCUGCUCUUACAUUUAtt).

Для тестирования спроектированных молекул миРНК, в экспериментах in vitro была создана экзогенная модель экспрессии этого гена в хорошо трансфецируемых клетках 293Т. Эффективность спроектированных молекул миРНК была оценена с использованием данной модели различными методами. Для этого 1×10⁵ клеток 293Т трансфецировали смесью, состоящей из 0,5 мкг плазмиды pUCHR IL13 IRES GFP или pUCHR IL4 IRES GFP, экспрессирующей IL-13 или IL-4 и 1 мкг соответствующей миРНК. В качестве отрицательного контроля ко-трасфецировали неспецифическую молекулу миРНК (siP4), не имеющую сходства с генами IL-4 и IL-13. Сутки после ко-трансфекции методом ИФА определяли концентрацию IL-4 и IL-13 супернатантах. Концентрацию IL-4 и IL-13 в супернатантах клеток, трасфецированных siP4 принимали за 100% и относительно этого значения выражали активность IL-4 и IL-13. Как оказалось, созданные варианты приводили к заметному активности IL-4 и IL-13 (Фиг. 1).To test the designed siRNA molecules, an exogenous model of expression of this gene in well-transfected 293T cells was created in in vitro experiments. The efficiency of the designed miRNA molecules was evaluated using this model using various methods. For this, 1 × 10 ⁵ 293T cells were transfected with a mixture of 0.5 μg of the plasmid pUCHR IL13 IRES GFP or pUCHR IL4 IRES GFP expressing IL-13 or IL-4 and 1 μg of the corresponding siRNA. As a negative control, the nonspecific siRNA molecule (siP4) was cotransfected, which did not have similarities with the IL-4 and IL-13 genes. The day after co-transfection by ELISA determined the concentration of IL-4 and IL-13 supernatants. The concentration of IL-4 and IL-13 in the supernatants of cells transfected with siP4 was taken as 100% and the activity of IL-4 and IL-13 was expressed relative to this value. As it turned out, the created variants led to a noticeable activity of IL-4 and IL-13 (Fig. 1).

Пример 2. Обоснование состава композиции.Example 2. The rationale for the composition.

В качестве носителя для молекул миРНК был использован пептид b-LTP со структурной формулой (Arg)₈(Lys)₄(Lys)₂LysAlaCys-NH₂. Для установления оптимального количества b-LTP в составе композиции проведены исследования. Для этого культуру клеток HEK293T засевали в 48-луночный плейт в полной среде DMEM, которая содержит 10% эмбриональной телячий сыворотки (ЭТС), 300 мг/л Глутамина-L и 60 мг/мл Гентамицина в количестве 80 тыс.клеток на лунку в объеме 300 мкл полной среды DMEM и культивируют при 37С в 5% атмосфере СО2 до образования монослоя 75% конфлуентности (1 сутки).The b-LTP peptide with the structural formula (Arg) ₈ (Lys) ₄ (Lys) ₂ LysAlaCys-NH ₂ was used as a carrier for siRNA molecules. Studies were conducted to determine the optimal amount of b-LTP in the composition. For this, a HEK293T cell culture was seeded in a 48-well plate in complete DMEM medium, which contains 10% fetal calf serum (ETS), 300 mg / L Glutamine-L and 60 mg / ml Gentamicin in an amount of 80 thousand cells per well in volume 300 μl of complete DMEM medium and cultured at 37 ° C in 5% CO2 atmosphere until a monolayer of 75% confluence was formed (1 day).

Комплекс pGL3 (несет репортерный ген люциферазы) и b-LTP готовился среде optiMEM (Gibco) не содержащей ЭТС и антибиотиков. Для этого b-LTP в различных массовый соотношениях по отношению к плазмиде pGL3 смешивали в 80 мкл optiMEM, смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 25-30 минут и вносили к клеткам в лунки 48-луночного плейта по каплям и инкубировали при 37С в 5% атмосфере CO2 в течение 2 суток. После инкубации клеток с комплексом надосадочную среду удаляли из лунок плейта, а монослой клеток лизировали в 60 мкл специального буфера Luciferase Cell Culture Lysis Reagent (Promega). Лизат клеток переносили в отдельные пробирки на 1,5 мл и центрифугировали, и осуществляли цикл замораживания оттаивания для лучшего лизиса клеток; замораживание проводили в течение ночи при -70С, а оттаивание в течение 10-15 мин при 37С в твердотельном термостате/ Далее лизаты клеток вортексировали и центрифугировали при 10000 об/мин при 4С в течение 2 минут для удаления клеточного дебриза. Надосадок переносили в отдельные пробирки на 1,5 мл и проводили измерение люциферазной активности каждого образца путем смешивания 50 мкл лизата с 50 мкл люциферина - субстрата для люфиферазы. При наличии в образце фермента люциферазы происходит излучение света, интенсивность которого детектировалось люминометром (Promega). Оптимальное соотношение Rm (массовое соотношение b-LTP и плазмиды pGL3) при трансфекции клеток HEK293T составило 12,5/1 по массе (Фиг. 2 Условные обозначения рисунка: Rm - массовое соотношение b-LTP и плазмиды pGL3; pGL3 - плазмида кодирующая ген люциферазы luc; RLU - относительные световые единицы (relative light units)).The pGL3 complex (carries the luciferase reporter gene) and b-LTP was prepared with optiMEM (Gibco) medium containing no ETS and antibiotics. For this, b-LTP in various weight ratios with respect to the pGL3 plasmid was mixed in 80 μl of optiMEM, the mixture was incubated at room temperature for 25-30 minutes and added dropwise to the cells in the wells of a 48-well plate and incubated at 37 ° C in 5% CO2 atmosphere for 2 days. After incubation of the cells with the complex, the supernatant was removed from the plate wells, and the cell monolayer was lysed in 60 μl of a special Luciferase Cell Culture Lysis Reagent (Promega) buffer. The cell lysate was transferred to separate 1.5 ml tubes and centrifuged, and a thaw freezing cycle was performed to better cell lysis; freezing was carried out overnight at -70 ° C, and thawing for 10-15 min at 37 ° C in a solid state thermostat. Next, cell lysates were vortexed and centrifuged at 10,000 rpm at 4 ° C for 2 minutes to remove cell debris. The supernatant was transferred to separate 1.5 ml tubes and the luciferase activity of each sample was measured by mixing 50 μl of lysate with 50 μl of luciferin, a substrate for luffiferase. If there is a luciferase enzyme in the sample, light is emitted, the intensity of which was detected by a luminometer (Promega). The optimal ratio of Rm (mass ratio of b-LTP and plasmid pGL3) during transfection of HEK293T cells was 12.5 / 1 by mass (Fig. 2 Legend of the figure: Rm is the mass ratio of b-LTP and plasmid pGL3; pGL3 is the plasmid encoding the luciferase gene luc; RLU - relative light units (relative light units)).

Таким образом, оптимальная композиция для подавление экспрессии генов IL-4 и IL-13 состоит из двух компонентов: 1) молекулы малых интерферирующих РНК (миРНК), направленных против генов IL-4 и IL-13 (siIL4-153 и siIL13-395); 2) Средство для внутриклеточной доставки нуклеиновых кислот в клетки млекопитающих - катионный дендримерный пептид b-LTP в основной (не солевой) форме, при этом он содержит 8 остатков аргинина, 7 остатков лизина, аланин и цистеин со структурной формулой (Arg)₈(Lys)₄(Lys)₂LysAlaCys-NH₂. (Фиг. 3 Условные обозначения рисунка: А - аланин, К - лизин, R - аргинин, С - цистеин). Массовое соотношение b-LTP/миРНК (смесь из siIL4-153 и siIL13-395)=12,5/1 (0,5 siIL4-153 и 0,5 siIL13-395, соответственно). Растворы обоих компонентов приготовлены в фосфатно-солевом буфере (1 мг/мл).Thus, the optimal composition for suppressing the expression of IL-4 and IL-13 genes consists of two components: 1) small interfering RNA (siRNA) molecules directed against the IL-4 and IL-13 genes (siIL4-153 and siIL13-395) ; 2) The means for the intracellular delivery of nucleic acids to mammalian cells is the cationic dendrimer peptide b-LTP in the basic (non-salt) form, while it contains 8 residues of arginine, 7 residues of lysine, alanine and cysteine with the structural formula (Arg) ₈ (Lys ) ₄ (Lys) ₂ LysAlaCys-NH ₂ . (Fig. 3 Legend of the figure: A - alanine, K - lysine, R - arginine, C - cysteine). The mass ratio of b-LTP / siRNA (mixture of siIL4-153 and siIL13-395) = 12.5 / 1 (0.5 siIL4-153 and 0.5 siIL13-395, respectively). Solutions of both components were prepared in phosphate-buffered saline (1 mg / ml).

Пример 3. Композиция из пептида b-LTP и миРНК против IL-4 и IL-13 является малотоксичным соединениемExample 3. The composition of the peptide b-LTP and siRNA against IL-4 and IL-13 is a low toxicity compound

В данном исследовании в качестве тест-системы были использованы мыши (CBA*C57B1)F1, которые являются стандартным объектом для исследований токсичности лекарственных средств. Композиция из пептида и миРНК против IL-4 и IL-13 вводилась мышам внутрибрюшинно в трех дозах: 250, 125 и 62,5 мг/кг, т.е. 5, 2,5 и 1,25 мг/мышь. Композицию вводили внутрибрюшинно мышам, т.к. данный способ обеспечивает максимальную биодоступность. Максимальная доза (5 мг/мышь) лимитирована растворимостью тестируемого объекта (10 мг/мл) и максимально допустимым объемом для подкожного введения мышам (0,5 мл/особь). Тестируемый препарат и носитель в заданных дозах были введены животным внутрибрюшинно однократно в соответствии со схемой эксперимента, представленной в таблице 1 (* - с учетом коэффициента пересчета доз). Период наблюдения после введения препарата составлял 14 суток. Некропсия и патоморфологический анализ проводились на 15-е сутки. В дни 0, 1, 2, 3, 4, 7 и 14 оценивали массу животных.In this study, (CBA * C57B1) F1 mice were used as a test system, which are a standard target for drug toxicity studies. The composition of the peptide and siRNA against IL-4 and IL-13 was administered intraperitoneally to mice in three doses: 250, 125 and 62.5 mg / kg, i.e. 5, 2.5 and 1.25 mg / mouse. The composition was administered intraperitoneally to mice, as this method provides maximum bioavailability. The maximum dose (5 mg / mouse) is limited by the solubility of the test object (10 mg / ml) and the maximum allowable volume for subcutaneous administration to mice (0.5 ml / individual). The test drug and the carrier in predetermined doses were administered to the animals intraperitoneally once in accordance with the experimental design shown in table 1 (* - taking into account the dose conversion factor). The observation period after drug administration was 14 days. Necropsy and pathomorphological analysis were performed on the 15th day. On days 0, 1, 2, 3, 4, 7, and 14, the weight of the animals was evaluated.

В первые часы после введения композиции у мышей наблюдалось снижение активности, взъерошенность шерстного покрова, но при этом гибели животных не было. В течение первых суток отмечена гибель 5-ти из 6-ти животных в группе с максимальной дозой у самцов и по 2 и 1 животному в группах 125 и 250 мг/кг (табл. 2). С учетом полученных данных о выживаемости, максимальной переносимой дозой для самцов является 125 мг/кг, а для самок 62,5 мкг/кг. Посчитаны летальные дозы; для самцов ЛД₈₃ составила 250 мг/кг, а для самок ЛД₃₄ составила 150 мг/кг.In the first hours after the introduction of the composition, the mice showed a decrease in activity, a tousled coat, but there was no death of animals. During the first day, the death of 5 out of 6 animals in the group with a maximum dose in males and 2 and 1 animals in the groups of 125 and 250 mg / kg was observed (Table 2). Based on the obtained survival data, the maximum tolerated dose for males is 125 mg / kg, and for females 62.5 μg / kg. Lethal doses are calculated; for males, LD ₈₃ was 250 mg / kg, and for females LD ₃₄ was 150 mg / kg.

Изучена динамика относительной массы тела у экспериментальных животных. Масса тела мышей в день 0 принята за 100%. Мыши, получавшие буфер, демонстрировали прирост массы тела на 3-10%. Было выявлено статистически значимое снижение относительной массы тела у самцов и самок, в группе получавшей 250 мг/кг в 1-й и 3-й дни эксперимента (таб. 3 * - статистически значимо отличается от группы животных, получавших буфер). В последующие дни наблюдений (с 4 по 14 дни) масса тела подопытных животных, получавших ЛС, восстанавливалась до значений сопоставимых с мышами, получавшими буфер (таб. 3). Это свидетельствует о процессе интоксикации первые 4 дня после введения препарата и об обратимости этой интоксикации. В группе самцов, получавших максимальную дозу, происходила гибель 5-ти мышей из 6-ти, ввиду чего статистический анализ был невозможен; стоит отметить, что выжившее животное к дню 4 потеряло до 20% массы тела, а к дню 14 произошло восстановление массы тела на 9%, что свидетельствует о интоксикации организма. Животные, получавшие минимальную дозу, не демонстрировали статистически значимых изменений массы тела. При этом животные, получавшие композицию в дозе 125 мг/кг, демонстрировали признаки интоксикации в первые 3 дня после введения композиции, которые были обратимы.The dynamics of relative body weight in experimental animals was studied. The body weight of mice on day 0 is taken as 100%. Mice treated with the buffer showed an increase in body weight of 3-10%. A statistically significant decrease in relative body weight was found in males and females in the group receiving 250 mg / kg on the 1st and 3rd days of the experiment (tab. 3 * - statistically significantly different from the group of animals receiving the buffer). In the following days of observation (from 4 to 14 days), the body weight of experimental animals treated with drugs was restored to values comparable to mice that received the buffer (tab. 3). This indicates the process of intoxication the first 4 days after administration of the drug and the reversibility of this intoxication. In the group of males receiving the maximum dose, 5 out of 6 mice died, which made statistical analysis impossible; It should be noted that the surviving animal lost up to 20% of body weight by day 4, and by day 14 there was a restoration of body weight by 9%, which indicates intoxication of the body. Animals receiving the minimum dose did not show statistically significant changes in body weight. Moreover, animals treated with the composition at a dose of 125 mg / kg showed signs of intoxication in the first 3 days after administration of the composition, which were reversible.

Таким образом, установлено, что максимальной переносимой дозой для самцов является 125 мг/кг, для самок - 62,5 мкг/кг, а значения ЛД₅₀ препарата для мышей (CBA*C57B1)F1 обоего пола находится в диапазоне доз 125 мг/кг - 250 мг/кг; для самцов ЛД₈₃ составила 250 мг/кг, а для самок ЛД₃₄ составила 150 мг/кг, что позволяет отнести композицию, состоящую из пептида b-LTP и миРНК против IL-4 и IL-13 к классу малотоксичных веществ (классификация по К.К. Сидорову 1977). У мышей (как самок, так и самцов), получавших композицию в минимальной дозе 62,5 мг/кг, не отмечалось признаков интоксикации, выражавшихся в падении массы тела.Thus, it was found that the maximum tolerated dose for males is 125 mg / kg, for females - 62.5 μg / kg, and the LD ₅₀ values of the drug for mice (CBA * C57B1) F1 of both sexes are in the dose range of 125 mg / kg - 250 mg / kg; for males, LD ₈₃ was 250 mg / kg, and for females LD ₃₄ was 150 mg / kg, which makes it possible to classify the composition consisting of b-LTP peptide and siRNA against IL-4 and IL-13 as a class of low-toxic substances (K classification .K. Sidorov 1977). In mice (both females and males), receiving the composition in a minimum dose of 62.5 mg / kg, there were no signs of intoxication, expressed in a decrease in body weight.

Пример 4. Композиция подавляет признаки аллергического ринита у мышейExample 4. The composition suppresses the signs of allergic rhinitis in mice.

Для изучения биологической активности композиции использовали модель АР у мышей-самок линии BALB/c, которых трехкратно подкожно сенсибилизировали OVA 20 мкг/мышь, 0,2 мл/мышь на 0, 14 и 28 дни после начала эксперимента. Далее произвели (начиная с 42 дня с начала эксперимента) недельную провокацию OVA 25 мкг/мышь, 10 мг/мл для проявления признаков развившейся у мышей патологии. Затем в течение недели проводили терапию композицией по следующей схеме: двукратно интраназально (и.н.) вводили препарат за 0,5-1 час до и после и.н. введения аллергена (25 мкл из р-ра 50 мг/мл OVA). В качестве отрицательного контроля использовали комплекс неспецифических молекул миРНК (siGFP) и носителя - b-LTP. В качестве положительного контроля использовали коммерческий препарат Тафен Назаль на основе глюкокортикостеройдов. Дозы и режимы введения представлены в таблице 4.To study the biological activity of the composition, the AP model was used in female BALB / c mice, which were sensitized three times subcutaneously with OVA 20 μg / mouse, 0.2 ml / mouse at 0, 14, and 28 days after the start of the experiment. Then, a weekly OVA provocation of 25 μg / mouse, 10 mg / ml was performed (starting from 42 days from the beginning of the experiment) to show signs of pathology that developed in mice. Then, within a week, therapy with the composition was carried out according to the following scheme: the drug was administered twice intranasally (in.) 0.5-1 hour before and after in. introduction of an allergen (25 μl from solution of 50 mg / ml OVA). A complex of nonspecific siRNA molecules (siGFP) and a carrier, b-LTP, were used as a negative control. As a positive control, the commercial drug Tafen Nazal based on glucocorticosteroids was used. Doses and modes of administration are presented in table 4.

Поскольку композиция направлена против генов IL-4 и IL-13 было исследовано изменение продукции данных цитокинов клетками подчелюстных ЛУ, стимулированных OVA. Композиция оказывала эффект снижения уровней IL-4 и IL-13, сопоставимо эффекту Тафен Назаль (Фиг. 4, 5).Since the composition is directed against the IL-4 and IL-13 genes, the change in the production of these cytokines by submandibular LU cells stimulated by OVA was investigated. The composition had the effect of lowering the levels of IL-4 and IL-13, comparable to the effect of Tafen Nazal (Fig. 4, 5).

По данным научной литературы известно, что IL-4 и -13 ответственны за синтез IgE и IgG1, которые являются проаллергическими иммуноглобулинами, a IgG2a -протективным субклассом, поэтому были проанализированы уровни специфических иммуноглобулинов в сыворотке крови мышей после курса терапии. Композиция статистически значимо снижала IgE и IgG1-ответ по сравнению с группой, отрицательного контроля при этом не влияя на IgG2a. (Фиг. 6, 7, 8) Расчет индекса показал, что он снижался, а это говорит о профилировании ответа в сторону Th-1-типа после курса терапии композицией (Фиг. 9, 10).According to the scientific literature, it is known that IL-4 and -13 are responsible for the synthesis of IgE and IgG1, which are pro-allergic immunoglobulins, and IgG2a, a protective subclass, therefore, the levels of specific immunoglobulins in the blood serum of mice were analyzed after a course of therapy. The composition statistically significantly reduced the IgE and IgG1 response compared to the group, while the negative control did not affect IgG2a. (Fig. 6, 7, 8) Calculation of the index showed that it decreased, and this indicates the profiling of the response in the direction of the Th-1 type after a course of therapy with the composition (Fig. 9, 10).

Полученные нами данные говорят, что частота чиханий в группе, которой вводили композицию, в 3 раза ниже, чем в группе с АР, и в 2 раза ниже, чем в группе, получавшей неспецифические миРНК. Значения для группы «Композиция» сопоставимы с таковыми в положительном контроле (Тафен Назаль) (Фиг. И).Our data indicate that the frequency of sneezing in the group to which the composition was administered is 3 times lower than in the group with AR and 2 times lower than in the group receiving non-specific siRNAs. The values for the Composition group are comparable to those in the positive control (Tafen Nazal) (Fig. I).

В результате терапии сенсибилизированных мышей происходила инфильтрация слизистой оболочки носа эозинофилами. Количество данных иммунных клеток в псевдо-леченой группе сопоставимо с количеством их в группе с АР. В группах, получавших терапию композицией и Тафен Назалем, количество эозинофилов снижалось в среднем на 30%. При этом степень инфильтрации эозинофилов у мышей после курса композиции и Тафен Назаль была сопоставима (Фиг. 12).As a result of therapy with sensitized mice, infiltration of the nasal mucosa by eosinophils occurred. The number of these immune cells in the pseudo-treated group is comparable to their number in the AR group. In the groups receiving therapy with the composition and Tafen Nazal, the number of eosinophils decreased on average by 30%. Moreover, the degree of eosinophil infiltration in mice after the course of the composition and Tafen Nazal was comparable (Fig. 12).

Таким образом, полученная интраназальной композиции для лечения аллергического ринита на основе молекул миРНК, представленных последовательностями AAAGAUGUCUGUUACGGUCtt и GGACCUGCUCUUACAUUUAtt, обеспечивает одновременное воздействие на два провоспалительных цитокина IL-4 и IL-13. Полученное массовое соотношение комплекса b-LTP/миРНК 12,5/1 в заявленной композиции является более целесообразным, поскольку необходимо в 2 раза меньше белка-носителя для равной по эффективности доставки одинакового количества молекул миРНК по сравнению с известным соотношением LTP/миРНК составляющим 25/1. Кроме того, показано, что использование катионного дендримерного пептида b-LTP в основной не солевой форме не содержит потенциально токсичных противоионов, снижая риск токсического действия.Thus, the resulting intranasal composition for the treatment of allergic rhinitis based on siRNA molecules represented by the sequences AAAGAUGUCUGUUACGGUCtt and GGACCUGCUCUUACAUUUAtt provides a simultaneous effect on two pro-inflammatory cytokines IL-4 and IL-13. The resulting mass ratio of the b-LTP / siRNA complex 12.5 / 1 in the claimed composition is more appropriate, since it is necessary to have 2 times less carrier protein for equal delivery efficiency of the same number of siRNA molecules compared to the known LTP / siRNA ratio of 25 / 1. In addition, it was shown that the use of the cationic dendrimer peptide b-LTP in the main non-salt form does not contain potentially toxic counterions, reducing the risk of toxic effects.

Список литературыList of references

1.

М. и др. Allergen-specific immunotherapy: Update on immunological mechanisms // Allergol. Immunopathol. (Madr). 2013. T. 41. №4. C. 265-272.1.

M. et al. Allergen-specific immunotherapy: Update on immunological mechanisms // Allergol. Immunopathol. (Madr). 2013. T. 41. No. 4. C. 265-272.

2. Bidad K., Nicknam M.H., Farid R. A review of allergy and allergen specific immunotherapy // Iran. J. Allergy, Asthma Immunol. 2011. T. 10. №1. C. 1-9.2. Bidad K., Nicknam M.H., Farid R. A review of allergy and allergen specific immunotherapy // Iran. J. Allergy, Asthma Immunol. 2011. T. 10. No. 1. C. 1-9.

3. Focke-Tejkl M., Valenta R. Safety of engineered allergen-specific immunotherapy vaccines. // Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol. 2012. T. 12. №5. C. 555-63.3. Focke-Tejkl M., Valenta R. Safety of engineered allergen-specific immunotherapy vaccines. // Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol. 2012. T. 12. No. 5. C. 555-63.

4. Gour N., Wills-Karp M. IL-4 and IL-13 signaling in allergic airway disease // Cytokine. 2015. T. 75. №1. C. 68-78.4. Gour N., Wills-Karp M. IL-4 and IL-13 signaling in allergic airway disease // Cytokine. 2015. T. 75. No. 1. C. 68-78.

5. Greiwe J.C., Bernstein J.A. Combination therapy in allergic rhinitis: What works and what does not work // Am. J. Rhinol. Allergy. 2016. T. 30. №6. C. 391-396.5. Greiwe J.C., Bernstein J.A. Combination therapy in allergic rhinitis: What works and what does not work // Am. J. Rhinol. Allergy. 2016. T. 30. No. 6. C. 391-396.

6. Hosoya K. и др. Gene silencing of STAT6 with siRNA ameliorates contact hypersensitivity and allergic rhinitis. // Allergy. 2011. T. 66. №1. C. 124-31.6. Hosoya K. et al. Gene silencing of STAT6 with siRNA ameliorates contact hypersensitivity and allergic rhinitis. // Allergy. 2011. T. 66. No. 1. C. 124-31.

7. Joo M.K. и др. The potential and advances in RNAi therapy: Chemical and structural modifications of siRNA molecules and use of biocompatible nanocarriers // J. Control. Release. 2014. T. 193. C. 113-121.7. Joo M.K. et al. The potential and advances in RNAi therapy: Chemical and structural modifications of siRNA molecules and use of biocompatible nanocarriers // J. Control. Release 2014.T. 193. C. 113-121.

8. Juel-Berg N. и др. Intranasal corticosteroids compared with oral antihistamines in allergic rhinitis: A systematic review and metaanalysis // Am. J. Rhinol. Allergy. 2017. T. 31. №1. C. e19-e28.8. Juel-Berg N. et al. Intranasal corticosteroids compared with oral antihistamines in allergic rhinitis: A systematic review and metaanalysis // Am. J. Rhinol. Allergy. 2017. T. 31. No. 1. C. e19-e28.

9. Kakli H.A., Riley T.D. Allergic Rhinitis // Prim. Care - Clin. Off. Pract. 2016. T. 43. №3. C. 465-475.9. Kakli H.A., Riley T.D. Allergic Rhinitis // Prim. Care - Clin. Off. Pract. 2016. T. 43. No. 3. C. 465-475.

10. Kim S.H. и др. Long-term Effects of Specific Allergen Immunotherapy Against House Dust Mites in Polysensitized Patients With Allergic Rhinitis // Allergy Asthma Immunol Res. 2014. T. 6. №6. C. 535-540.10. Kim S.H. et al. Long-term Effects of Specific Allergen Immunotherapy Against House Dust Mites in Polysensitized Patients With Allergic Rhinitis // Allergy Asthma Immunol Res. 2014. T. 6. No. 6. C. 535-540.

11. Melvin T.A.N., Patel A.A. Pharmacotherapy for Allergic Rhinitis // Otolaryngol. Clin. North Am. 2011. T. 44. №3. C. 727-739.11. Melvin T.A.N., Patel A.A. Pharmacotherapy for Allergic Rhinitis // Otolaryngol. Clin. North am. 2011. T. 44. No. 3. C. 727-739.

12. Narkus А. и др. The placebo effect in allergen-specific immunotherapy trials. // Clin. Transl. Allergy. 2013. T. 3. №1. C. 42.12. Narkus A. et al. The placebo effect in allergen-specific immunotherapy trials. // Clin. Transl. Allergy. 2013. T. 3. No. 1. C. 42.

13. Passalacqua G., Canonica G.W., Bagnasco D. Benefit of SLIT and SCIT for Allergic Rhinitis and Asthma // Curr. Allergy Asthma Rep.2016. T. 16. №12.13. Passalacqua G., Canonica G.W., Bagnasco D. Benefit of SLIT and SCIT for Allergic Rhinitis and Asthma // Curr. Allergy Asthma Rep. 2016. T. 16. No. 12.

14. Protudjer J.L.P. и др. Household costs associated with objectively diagnosed allergy to staple foods in children and adolescents // J. Allergy Clin. Immunol. Pract. 2015. T. 3. №1. C. 68-75.14. Protudjer J.L.P. et al. Household costs associated with objectively diagnosed allergy to staple foods in children and adolescents // J. Allergy Clin. Immunol. Pract. 2015. T. 3. No. 1. C. 68-75.

15. Ranasinghe С. и др. Cytokine & Growth Factor Reviews IL-4 and IL-13 receptors: Roles in immunity and powerful vaccine adjuvants // Cytokine Growth Factor Rev. 2014. T. 25. №4. C. 437-442.15. Ranasinghe C. et al. Cytokine & Growth Factor Reviews IL-4 and IL-13 receptors: Roles in immunity and powerful vaccine adjuvants // Cytokine Growth Factor Rev. 2014. T. 25. No. 4. C. 437-442.

16. Ring J., Gutermuth J. 100 years of hyposensitization: History of allergen-specific immunotherapy (ASIT) // Allergy. 2011. T. 66. №6. C. 713-724.16. Ring J., Gutermuth J. 100 years of hyposensitization: History of allergen-specific immunotherapy (ASIT) // Allergy. 2011. T. 66. No. 6. C. 713-724.

17. Simoens S., Laekeman G. Pharmacotherapy of allergic rhinitis: A pharmaco-economic approach // Allergy Eur. J. Allergy Clin. Immunol. 2009. T. 64. №1. C. 85-95.17. Simoens S., Laekeman G. Pharmacotherapy of allergic rhinitis: A pharmaco-economic approach // Allergy Eur. J. Allergy Clin. Immunol. 2009. T. 64. No. 1. C. 85-95.

18. Stelmaszczyk-Emmel А. и др. Th1, Th2, Th17, and regulatory cytokines in children with different clinical forms of allergy // Adv. Exp. Med. Biol. 2013. T. 788. C. 321-328.18. Stelmaszczyk-Emmel A. et al. Th1, Th2, Th17, and regulatory cytokines in children with different clinical forms of allergy // Adv. Exp. Med. Biol. 2013.T. 788.P. 321-328.

19. Tjota M.Y., Sperling A.I. Distinct dendritic cell subsets actively induce Th2 polarization // Curr. Opin. Immunol. 2014. T. 31. C. 44-50.19. Tjota M.Y., Sperling A.I. Distinct dendritic cell subsets actively induce Th2 polarization // Curr. Opin. Immunol. 2014.T. 31.P. 44-50.

20. Хаитов M.P. Биобезопасность и интерференция РНК. Москва:, 2012. Вып. ОП ПИК "ВИ. 328 с.20. Khaitov M.P. Biosafety and RNA interference. Moscow :, 2012. Issue. OP PIC "VI. 328 s.

Claims

An intranasal composition for the treatment of allergic rhinitis containing an effective amount of a cationic dendrimer peptide of the formula (Arg) 8 (Lys) 4 (Lys) 2Lys-Ala-Cys-NH2, which is in the basic non-salt form (b-LTP), acting as a carrier and a mixture of siRNA molecules that suppress IL-13 and IL-4 gene expression represented by the sequences GGACCUGCUCUUACAUUUAtt and AAAGAUGUCUGUUACGGUCtt, respectively, where the mass ratio of b-LTP to the mixture of siRNA molecules is 12.5: 1 and the number of siRNA molecules in the mixture is the same .