RU2615463C1

RU2615463C1 - Method for allergic bronchial asthma treatment, based on cytokines il-4 and il-13 genes expression inhibition using sirna molecules

Info

Publication number: RU2615463C1
Application number: RU2016102819A
Authority: RU
Inventors: Сергей Михайлович Андреев; Игорь Петрович Шиловский; Мария Сергеевна Сундукова; Артем Владимирович Маерле; Илья Викторович Сергеев
Priority date: 2016-01-28
Filing date: 2016-01-28
Publication date: 2017-04-04

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: method comprises intranasal or inhalational administration of an effective amount of agent comprising a mixture of siRNA molecules that suppress gene IL-13 and IL-4 expression.

EFFECT: invention improves the efficiency of allergic asthma treatment.

2 cl, 11 dwg, 2 tbl, 4 ex

Description

Изобретение относится к области медицины, и может быть использовано для лечения и профилактики аллергической бронхиальной астмы с использованием средства, содержащего молекулы миРНК, подавляющего экспрессию гена IL-13. А также использовано средство, дополнительно содержащее молекулы миРНК, подавляющие экспрессию гена IL-4.The invention relates to medicine, and can be used for the treatment and prevention of allergic bronchial asthma using an agent containing siRNA molecules that suppresses the expression of the IL-13 gene. And also used a tool that additionally contains siRNA molecules that suppress the expression of the IL-4 gene.

Бронхиальная астма (БА) является едва ли не самым распространенным хроническим заболеванием дыхательный путей, от которого страдают как взрослые, так и дети. На фоне значительной распространенности БА среди разных слоев населения, высокого уровня смертности и существенных экономических потерь, разработка новых и безопасных способов лечения и профилактики данного заболевания продолжает оставаться актуальной задачей для здравоохранения во всем мире.Bronchial asthma (BA) is perhaps the most common chronic respiratory disease that affects both adults and children. Against the background of a significant prevalence of AD among different segments of the population, a high mortality rate and significant economic losses, the development of new and safe methods of treatment and prevention of this disease continues to be an urgent task for public health worldwide.

Патогенез бронхиальной астмы человека изучается на основе данных, полученных при исследовании биопсии бронхов, образцов бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ), мокроты, сыворотки крови, а также клеток крови пациентов. Молекулярно-клеточные механизмы патогенеза БА изучают с использованием так называемых экспериментальных моделей БА (в основном на мышах), имеющих схожее с человеком развитие Th2-иммунного ответа и ряда других признаков [1] [8] [9].The pathogenesis of human bronchial asthma is studied on the basis of data obtained in the study of a bronchial biopsy, samples of bronchoalveolar lavage (BAL), sputum, blood serum, as well as blood cells of patients. The molecular-cellular mechanisms of AD pathogenesis are studied using the so-called experimental AD models (mainly in mice), which have a development of the Th2 immune response and a number of other signs similar to humans [1] [8] [9].

В результате изучения клинического материала от пациентов с БА и экспериментальных моделей на лабораторных животных, удалось установить, что воспаление дыхательных путей связано с инфильтрацией в ткань легких воспалительных клеток, в частности эозинофилов, нейтрофилов и высвобождением ими провоспалительных медиаторов, таких как гистамин и лейкотриены, которые, в свою очередь, влияют на гладкую мускулатуру дыхательных путей, вызывая бронхоконстрикцию [1]. Также патогенез БА связан с ремоделированием бронхов, которое включает ряд патогенетических процессов, а именно: гипертрофию гладких мышц, гиперплазию бокаловидных клеток эпителия бронхов, утолщение субэпителиальной базальной мембраны, увеличение толщины стенок бронхов, что в совокупности приводит к необратимой обструкции и гиперчувствительности дыхательных путей. Считается, что ремоделирование бронхов происходит под действием факторов роста, которые выделяются инфильтрирующими в ткань легких клетками [3].As a result of studying clinical material from patients with AD and experimental models in laboratory animals, it was found that airway inflammation is associated with the infiltration into the lung tissue of inflammatory cells, in particular eosinophils, neutrophils and their release of pro-inflammatory mediators, such as histamine and leukotrienes, which , in turn, affect the smooth muscles of the respiratory tract, causing bronchoconstriction [1]. AD pathogenesis is also associated with bronchial remodeling, which includes a number of pathogenetic processes, namely: smooth muscle hypertrophy, goblet glass goblet cell hyperplasia, thickening of the subepithelial basement membrane, increase in bronchial wall thickness, which together leads to irreversible obstruction and hypersensitivity of the respiratory tract. It is believed that bronchial remodeling occurs under the influence of growth factors, which are secreted by cells infiltrating into lung tissue [3].

В большинстве случаев основной причиной такого воспаления дыхательных путей является сенсибилизация пациента к аллергену, например, к пыльце растений, клещам домашней пыли и т.д. Попавшие в организм аллергены захватываются дендритными клетками дыхательных путей, которые презентируют их Т-лимфоцитам. У лиц, имеющих генетическую предрасположенность, или подверженных воздействию определенных факторов окружающей среды, все это вызывает иммунную реакцию Th2-типа, т.е. происходит дифференцировка нативных Т-клеток в Th2-клетки, которые начинают продуцировать специфические цитокины: IL-4, IL-5, IL-9, IL-13 и др. Данные цитокины обеспечивают формирование основных признаков БА [3].In most cases, the main cause of this inflammation of the airways is the sensitization of the patient to an allergen, for example, plant pollen, house dust mites, etc. Allergens that enter the body are captured by dendritic cells of the respiratory tract, which present them to T-lymphocytes. In persons with a genetic predisposition, or exposed to certain environmental factors, all this causes an Th2-type immune response, i.e. differentiation of native T cells into Th2 cells occurs, which begin to produce specific cytokines: IL-4, IL-5, IL-9, IL-13, etc. These cytokines provide the formation of the main signs of AD [3].

В многочисленных исследованиях показано, что наиболее патогенетически-значимыми цитокинами из вышеуказанных являются IL-4 и IL-13. Как известно, IL-4 и IL-13 способствуют синтезу В-клетками специфических IgE-антител, которые впоследствии фиксируются на поверхности тучных клеток и базофилов. Тучные клетки и базофилы, накапливающиеся в слизистой оболочке бронхов, подвергаются дегрануляции после взаимодействия вновь попавших аллергенов с IgE-антителами на их поверхности. В результате дегрануляции из клеток высвобождаются медиаторы аллергического воспаления: гистамин, лейкотриены, простагландины и тромбоцит-активирующий фактор, которые в течение нескольких минут вызывают сильное сужение дыхательных путей, отек стенок бронхов и гиперсекрецию слизи. Другие известные цитокины, такие как IL-5, IL-25 и IL-33, индуцируют инфильтрацию эозинофилами дыхательных путей, приводя к воспалению [2]. Инфильтрация эозинофилов в слизистую оболочку бронхов является важным признаком аллергической астмы, причем эозинофилия в легких сохраняется даже при отсутствии клинических симптомов. Эозинофилы, как тучные клетки и базофилы, также способны дегранулировать медиаторы воспаления, которые приводят к повреждению бронхов, в частности бронхиального эпителия. В результате этих повреждений эпителия образуются неплотные контакты между клетками, что способствует проникновению аллергенов в ткани дыхательных путей. Барьерные функции эпителия могут быть нарушены не только провоспалительными клетками, такими как эозинофилы, но и респираторными вирусами, факторами окружающей среды, что приводит к обострению БА [4]. Кроме того, эпителий дыхательных путей способен самостоятельно продуцировать провоспалительные цитокины, тем самым принимая участие в патогенезе заболевания [6].Numerous studies have shown that the most pathogenetically significant cytokines of the above are IL-4 and IL-13. As is known, IL-4 and IL-13 promote the synthesis of specific IgE antibodies by B cells, which are subsequently fixed on the surface of mast cells and basophils. Mast cells and basophils that accumulate in the mucous membrane of the bronchi undergo degranulation after the interaction of newly ingested allergens with IgE antibodies on their surface. As a result of degranulation, mediators of allergic inflammation are released from the cells: histamine, leukotrienes, prostaglandins and a platelet-activating factor, which within a few minutes cause a strong narrowing of the airways, swelling of the walls of the bronchi and hypersecretion of mucus. Other known cytokines, such as IL-5, IL-25, and IL-33, induce airway eosinophil infiltration, leading to inflammation [2]. Infiltration of eosinophils into the mucous membrane of the bronchi is an important sign of allergic asthma, and eosinophilia in the lungs persists even in the absence of clinical symptoms. Eosinophils, like mast cells and basophils, are also able to degranulate inflammatory mediators that lead to damage to the bronchi, in particular the bronchial epithelium. As a result of these injuries of the epithelium, loose contacts between the cells are formed, which facilitates the penetration of allergens into the tissues of the respiratory tract. The barrier functions of the epithelium can be disrupted not only by pro-inflammatory cells, such as eosinophils, but also by respiratory viruses, environmental factors, which leads to an exacerbation of AD [4]. In addition, the epithelium of the respiratory tract is able to independently produce pro-inflammatory cytokines, thereby taking part in the pathogenesis of the disease [6].

Экспериментально была установлена роль IL-9 в развитии симптомов БА. В частности, IL-9 вовлечен в продукцию слизи, которая затрудняет процесс дыхания, что является одним из ключевых признаков БА. В моделях с использованием мышей, нокаутных по IL-9, показано снижение выработки слизи эпителием дыхательных путей после инактивации этого гена [5].The role of IL-9 in the development of AD symptoms has been experimentally established. In particular, IL-9 is involved in the production of mucus, which makes breathing difficult, which is one of the key signs of AD. In models using IL-9 knockout mice, a decrease in mucus production by the epithelium of the respiratory tract after inactivation of this gene was shown [5].

В настоящее время для подавления активности IL-4 и IL-13 активно используются моноклональные антитела, что описано в ряде патентных документов (ЕР 2 351 584 А1, ЕР 2 573 121 A1, US 20030235555 А1, US 008461125 B2,). Однако открытие РНК интерференции (РНКи) дало новые возможности для регуляции экспрессии патогенетически-значимых генов, в том числе и генов, вовлеченных в инициацию и развитие БА. РНКи активируется молекулами малых интерферирующих РНК (миРНК), которые имеют нуклеотидную последовательность комплементарную гену-мишени. Главными преимуществами использования препаратов на основе РНКи являются высокая специфичность и эффективность подавления гена-мишени (более чем на 90%), а также то что вводимые миРНК способны действовать в крайне низких концентрациях. Кроме того, привлекательной является сравнительная дешевизна методики. Синтез олигонуклеотидов в настоящее время вполне доступен и прост. Этот факт дает препаратам, созданным на базе, миРНК, важное конкурентное преимущество, по сравнению с моноклональными антителами.Currently, monoclonal antibodies are actively used to suppress the activity of IL-4 and IL-13, which is described in a number of patent documents (EP 2 351 584 A1, EP 2 573 121 A1, US 20030235555 A1, US 008461125 B2,). However, the discovery of RNA interference (RNAi) provided new opportunities for regulating the expression of pathogenetically significant genes, including genes involved in the initiation and development of AD. RNAi is activated by molecules of small interfering RNAs (siRNAs), which have a nucleotide sequence complementary to the target gene. The main advantages of using RNAi-based drugs are the high specificity and efficiency of suppressing the target gene (more than 90%), as well as the fact that the introduced siRNAs can act in extremely low concentrations. In addition, the comparatively low cost of the technique is attractive. The synthesis of oligonucleotides is currently quite affordable and simple. This fact provides siRNA-based drugs with an important competitive advantage over monoclonal antibodies.

Как было указано выше IL-4 представляет собой плейотропный цитокин, который обладает широким спектром биологических эффектов в патогенезе БА. Более поздние научные исследования показали, что IL-4 и другой патогенетически-значимый цитокин IL-13 и имеют общий рецепторный компонент, а также сходную сигнальную трансдукцию. Этот факт был использован при создании одного из подходов к терапии БА, заключающегося в применении моноклональных к обоим мишеням и биспецифических антител, которые связываются с IL-4 и/или IL-13. Исследователям удалось добиться стабильного производства данных антител и успешного использования этой системы in vivo. Этот подход представлен в одном из охранных документов (патент ЕР 2574630 А1).As mentioned above, IL-4 is a pleiotropic cytokine that has a wide range of biological effects in the pathogenesis of AD. More recent scientific studies have shown that IL-4 and another pathogenetically significant cytokine IL-13 both have a common receptor component, as well as similar signal transduction. This fact was used to create one of the approaches to the treatment of AD consisting in the use of monoclonal and bispecific antibodies to both targets that bind to IL-4 and / or IL-13. Researchers have been able to achieve stable production of these antibodies and the successful use of this system in vivo. This approach is presented in one of the protection documents (patent EP 2574630 A1).

Помимо ингибирования путем непосредственного связывания цитокина, можно снижать его активность посредством блокирования соответствующего рецептора. Известно, что сигнальный путь IL-4 опосредован гетеродимерным комплексом двух белков рецептора: IL-4Rα и γ-цепи IL-2-рецептора. Создание моноклонального антитела Х2/45, направленного против внеклеточного домена IL-4Rα позволило предположить его для ингибирования IL-4-опосредованных реакций, в том числе и для создания нового способа терапии БА. Этот подход представлен в одном из охранных документов (патент WO 2009121847 A2), который относится к области применения антител или антигенсвязывающих фрагментов антител, специфичных для человеческого рецептора к IL-4.In addition to inhibition by direct binding of the cytokine, its activity can be reduced by blocking the corresponding receptor. It is known that the IL-4 signaling pathway is mediated by a heterodimeric complex of two receptor proteins: IL-4Rα and the γ-chain of IL-2 receptor. The creation of a monoclonal antibody X2 / 45 directed against the extracellular domain of IL-4Rα suggested it to inhibit IL-4-mediated reactions, including the creation of a new method for the treatment of AD. This approach is presented in one of the security documents (patent WO 2009121847 A2), which relates to the field of application of antibodies or antigen-binding fragments of antibodies specific for the human receptor for IL-4.

Известно, что связывание IgE с FcεRI-рецепторами эффекторных клеток (тучные клетки, базофилы) индуцирует высвобождение медиаторов воспаления (гистамин, лейкотриены) и вызывает острые симптомы аллергического воспаления. Таким образом, взаимодействие IgE-FcεRI является ключевым в патогенезе БА. Этот факт был использован при создании подхода к терапии аллергических воспалений в том числе БА. В результате исследования был идентифицирован Fab фрагмент антитела, который является ингибитором IgE-FcεRI взаимодействия. Показано также, что данный ингибитор способен связываться со свободным и клеточно-связанным IgE. Этот подход представлен в охранном документе (патент WO 2002079257 А1).It is known that the binding of IgE to FcεRI receptors of effector cells (mast cells, basophils) induces the release of inflammatory mediators (histamine, leukotrienes) and causes acute symptoms of allergic inflammation. Thus, the interaction of IgE-FcεRI is key in the pathogenesis of AD. This fact was used to create an approach to the treatment of allergic inflammation, including AD. As a result of the study, a Fab antibody fragment was identified that is an inhibitor of IgE-FcεRI interaction. It was also shown that this inhibitor is able to bind to free and cell-bound IgE. This approach is presented in a title document (patent WO2002079257 A1).

Поскольку IgE-антитела являются ключевыми в патогенезе аллергической БА, то был разработан способ лечения БА с помощью антител, нейтрализующих IgE. Этот подход реализован в одном из изобретений (патент 1997004807 А1).Since IgE antibodies are key in the pathogenesis of allergic AD, a method has been developed for the treatment of AD using antibodies that neutralize IgE. This approach is implemented in one of the inventions (patent 1997004807 A1).

Несмотря на сравнительно недавнее открытие РНКи уже имеются исследования по применению данного подхода к терапии БА. В частности, созданы молекулы миРНК способные подавлять гены, участвующие в синтезе IgE - одного из основных медиаторов аллергического воспаления. Данный подход представлен в одном из охранных документов (патент US 20060058255 А1), однако в данной разработке не фигурирует РНКи-опосредуемое подавление IL-13.Despite the relatively recent discovery of RNAi, there are already studies on the application of this approach to the treatment of AD. In particular, miRNA molecules capable of suppressing the genes involved in the synthesis of IgE, one of the main mediators of allergic inflammation, have been created. This approach is presented in one of the security documents (patent US 20060058255 A1), however, in this development does not appear RNAi-mediated suppression of IL-13.

Известно, что CD23 участвует в активации Т-лимфоцитов, которые в свою очередь вовлечение в патогенезе БА. Этот факт был использован при создании подхода к терапии БА, основывающемся на подавлении CD23 с помощью миРНК. При реализации данного подхода доказано ингибирование связывания IgE в эффекторными клетками у пациентов. Этот подход описан в одном из охранных документов (патент US 8461125 В2).It is known that CD23 is involved in the activation of T-lymphocytes, which in turn are involved in the pathogenesis of AD. This fact was used to create an approach to AD therapy based on the suppression of CD23 by siRNA. When implementing this approach, inhibition of IgE binding in effector cells in patients has been proven. This approach is described in one of the protection documents (patent US 8461125 B2).

Еще один подход, заключается в РНКи-опосредованном подавлении генов, регулирующих синтез IgE. Были изучены различные пути введения РНКи-агентов, в результате было предложено использовать такой подход для терапии IgE-опосредованных заболеваний, к которым в некоторых случаях относиться и БА. Этот подход описан в охранном документе (патент US 20110112169 A1).Another approach is RNAi-mediated suppression of genes that regulate IgE synthesis. Various routes of administration of RNAi agents were studied; as a result, it was proposed to use this approach for the treatment of IgE-mediated diseases, which in some cases include AD. This approach is described in a title of protection (patent US 20110112169 A1).

Наиболее близким аналогом данного изобретения является способ лечения бронхиальной астмы, осложняющих ее респираторных вирусных инфекций и других воспалительных заболеваний дыхательных путей с использованием препарата на основе малой интерферирующей РНК (миРНК) (RU 2526146, 20.08.2014).The closest analogue of this invention is a method of treating bronchial asthma, complicating its respiratory viral infections and other inflammatory diseases of the respiratory tract using a drug based on small interfering RNA (siRNA) (RU 2526146, 08.20.2014).

Данный способ заключается в одновременном подавлении гена р респираторно-синцитиального вируса (далее - РСВ) и провоспалительного гена il-4 мыши, при этом для подавления гена р РСВ, необходимого для его репликации в клетке, используют молекулу миРНК - SEQ ID NO 1 (siP1), а для подавления провоспалительного гена il-4 мыши используют молекулу миРНК - SEQ ID NO 15 (siIL4-408).This method consists in simultaneously suppressing the p gene of the respiratory syncytial virus (hereinafter referred to as RSV) and the pro-inflammatory mouse il-4 gene, while in order to suppress the RSV gene p necessary for its replication in the cell, the siRNA molecule - SEQ ID NO 1 (siP1 ), and to suppress the pro-inflammatory mouse il-4 gene, the siRNA molecule - SEQ ID NO 15 (siIL4-408) is used.

Отличительной особенностью данного способа является применение препарата миРНК для лечения бронхиальной астмы на фоне респираторно-синцитиального вируса. К недостаткам данного метода можно отнести, то, что в отсутствии у астматиков РСВ-инфекции данный метод будет недостаточно эффективным, поскольку происходит подавления только IL-4.A distinctive feature of this method is the use of siRNA preparation for the treatment of bronchial asthma against the background of respiratory syncytial virus. The disadvantages of this method can be attributed to the fact that in the absence of RSV infection in asthmatics, this method will not be effective enough, since only IL-4 is suppressed.

Хотя IL-13 и IL-4 имеют определенные функциональные сходства, изучение заболевания на животных моделях и мышах с «выключенным» геном показало, что IL-13 обладает уникальными эффекторными функциями, отличными от IL-4 и независимо от других Th2-цитокинов, является необходимым и достаточным для индукции всех признаков аллергической астмы [7]. Многочисленные последующие эксперименты подтвердили, что IL-13 играет более значимую роль в патогенезе БА, чем другие Th2-цитокины в эффекторных функциях, связанных с симптомами астмы.Although IL-13 and IL-4 have certain functional similarities, the study of the disease in animal models and mice with the gene turned off showed that IL-13 has unique effector functions, different from IL-4 and independently of other Th2 cytokines, is necessary and sufficient for the induction of all signs of allergic asthma [7]. Numerous subsequent experiments have confirmed that IL-13 plays a more significant role in the pathogenesis of AD than other Th2 cytokines in the effector functions associated with asthma symptoms.

Поэтому задачей данного изобретения является разработка способа лечения бронхиальной астмы, включающий введение молекул малых интерферирующий РНК (миРНК), подавляющих экспрессию гена IL-13, а также их смесь с миРНК, подавляющих экспрессию гена IL-4.Therefore, the objective of this invention is to develop a method for the treatment of bronchial asthma, including the introduction of molecules of small interfering RNA (siRNAs) that inhibit the expression of the IL-13 gene, as well as their mixture with siRNAs that suppress the expression of the IL-4 gene.

Для решения данной задачи были разработаны молекулы миРНК, подавляющие экспрессию гена IL-13, а также разработано средство, содержащее их смесь с миРНК, подавляющими экспрессию гена IL-4 и их использование на мышиной модели аллергической БА.To solve this problem, siRNA molecules that suppress IL-13 gene expression were developed, and a tool containing their mixture with siRNAs that suppress IL-4 gene expression and their use in a mouse model of allergic AD was developed.

Способ профилактики и лечения аллергической бронхиальной астмы включает введение субъекту эффективного количества средства, содержащего молекулы миРНК, подавляющие экспрессию гена IL-13, представленные последовательностями SEQ ID NO 7 и SEQ ID NO 8. Средство дополнительно содержит молекулы миРНК, подавляющие экспрессию гена IL-4, представленные последовательностями SEQ ID NO 3 и SEQ ID NO 6. Полученные молекулы миРНК вводят интраназально или ингаляционно.A method for the prevention and treatment of allergic bronchial asthma includes administering to the subject an effective amount of an agent containing siRNA molecules that suppress the expression of the IL-13 gene represented by the sequences SEQ ID NO 7 and SEQ ID NO 8. The agent further comprises siRNA molecules that suppress the expression of the IL-4 gene, represented by the sequences SEQ ID NO 3 and SEQ ID NO 6. The resulting siRNA molecules are administered intranasally or by inhalation.

Техническими результатами предлагаемого способа является эффективное воздействие вводимых молекул миРНК, представленных последовательностями SEQ ID NO 7 и SEQ ID NO 8, подавляющих экспрессию гена провоспалительного цитокина IL-13, а также их смесь с миРНК, подавляющих экспрессию гена IL-4, представленных последовательностями SEQ ID NO 3 и SEQ ID NO 6, что обеспечивает одновременное воздействие на два провоспалительных цитокина IL-13 и IL-4, т.е. подавление двух генов-мишеней, обуславливая синергетический эффект молекул миРНК, приводящий к существенному снижению уровня гиперреактивности бронхов (снижению удельной сопротивляемости бронхов) и аллергического воспаления в легких (снижение общей клеточности, эозинофилов).The technical results of the proposed method is the effective effect of the introduced siRNA molecules represented by the sequences SEQ ID NO 7 and SEQ ID NO 8 that suppress the expression of the pro-inflammatory cytokine IL-13 gene, as well as their mixture with siRNAs that suppress the expression of the IL-4 gene represented by SEQ ID sequences NO 3 and SEQ ID NO 6, which provides simultaneous effects on two pro-inflammatory cytokines IL-13 and IL-4, i.e. suppression of two target genes, causing a synergistic effect of siRNA molecules, leading to a significant decrease in the level of bronchial hyperreactivity (decrease in specific resistance of the bronchi) and allergic inflammation in the lungs (decrease in general cellularity, eosinophils).

Преимущественно, в способе профилактики и лечения бронхиальной астмы полученные препараты миРНК вводят интраназально.Advantageously, in the method for the prevention and treatment of bronchial asthma, the resulting siRNA preparations are administered intranasally.

Краткое описание чертежей.A brief description of the drawings.

Фиг. 1. Изменение интенсивности флуоресценции GFP⁺-клеток 293Т после ко-трансфекции молекул миРНК и рекомбинантной плазмиды pUCHR IL13 IRES GFP.FIG. 1. Changes in the fluorescence intensity of 293T GFP ⁺ cells after co-transfection of siRNA molecules and recombinant plasmid pUCHR IL13 IRES GFP.

Фиг. 2. Изменение экспрессии IL-13 в клетках 293Т после ко-трансфекции молекул миРНК и рекомбинантной плазмиды pUCHR IL13 IRES GFP.FIG. 2. Changes in IL-13 expression in 293T cells after co-transfection of siRNA molecules and recombinant plasmid pUCHR IL13 IRES GFP.

Фиг. 3. Изменение концентрации IL-13 в супернатантах клеток 293Т после ко-трансфекции молекул миРНК и рекомбинантной плазмиды pUCHR IL13 IRES GFP.FIG. 3. Change in the concentration of IL-13 in the supernatants of 293T cells after co-transfection of siRNA molecules and the recombinant plasmid pUCHR IL13 IRES GFP.

Фиг. 4. Изменение интенсивности флуоресценции GFP⁺-клеток 293Т после ко-трансфекции молекул миРНК и рекомбинантной плазмиды pUCHR IL4 IRES GFP.FIG. 4. Change in fluorescence intensity of 293T GFP ⁺ cells after co-transfection of siRNA molecules and recombinant plasmid pUCHR IL4 IRES GFP.

Фиг. 5. Изменение экспрессии IL-4 в клетках 293Т после ко-трансфекции молекул миРНК и рекомбинантной плазмиды pUCHR IL4 IRES GFP.FIG. 5. Changes in IL-4 expression in 293T cells after co-transfection of siRNA molecules and recombinant plasmid pUCHR IL4 IRES GFP.

Фиг. 6. Изменение концентрации IL-4 мыши в супернатантах клеток 293Т после ко-трансфекции молекул миРНК и рекомбинантной плазмиды pUCHR IL4 IRES GFP.FIG. 6. Change in the concentration of mouse IL-4 in the supernatants of 293T cells after co-transfection of siRNA molecules and recombinant plasmid pUCHR IL4 IRES GFP.

Фиг. 7. Изменение уровней сывороточных anti-OVA-IgE у животных при интраназальном введении молекул миРНК, подавляющих экспрессию генов IL-4 и IL-13.FIG. 7. Changes in serum anti-OVA-IgE levels in animals with intranasal administration of siRNA molecules that suppress the expression of IL-4 and IL-13 genes.

Фиг. 8. Изменение уровней сывороточных anti-OVA-IgG2a у животных при интраназальном введении препаратов миРНК, подавляющих экспрессию генов IL-4 и IL-13.FIG. 8. Change in serum levels of anti-OVA-IgG2a in animals with intranasal administration of siRNA preparations that suppress the expression of IL-4 and IL-13 genes.

Фиг. 9. Изменение удельной сопротивляемости дыхательных путей у животных при интраназальном введении препаратов миРНК, подавляющих экспрессию генов IL-4 и IL-13.FIG. 9. Change in the specific resistance of the respiratory tract in animals with intranasal administration of siRNA preparations that suppress the expression of IL-4 and IL-13 genes.

Фиг. 10. Изменения общей клеточности бронхо-альвеолярного лаважа у животных при интраназальном введении препаратов миРНК, подавляющих экспрессию генов IL-4 и IL-13.FIG. 10. Changes in the total cellularity of broncho-alveolar lavage in animals with intranasal administration of siRNA preparations that suppress the expression of IL-4 and IL-13 genes.

Фиг. 11. Патологические изменения в ткани легких у животных при интраназальном введении препаратов миРНК, подавляющих экспрессию генов IL-4 и IL-13.FIG. 11. Pathological changes in lung tissue in animals with intranasal administration of siRNA preparations that suppress the expression of IL-4 and IL-13 genes.

Подробное описание изобретения.DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Разработка способа лечения и профилактики аллергической бронхиальной астмы, работающего на основе механизма РНК-интерференции, проводилась с использованием мышиных моделей.The development of a method for the treatment and prevention of allergic bronchial asthma, based on the mechanism of RNA interference, was carried out using mouse models.

Пример 1. Получение молекул миРНК, подавляющих экспрессию IL-13 и IL-4.Example 1. Obtaining miRNA molecules that suppress the expression of IL-13 and IL-4.

Проектирование молекул миРНК было осуществлено с помощью специального программного обеспечения OligoWalk, которое рассчитывает термодинамические параметры гибридизации РНК-олигонуклеотидов, предсказывает их свободную энергию связывания с мРНК-мишенью. С использованием программы OligoWalk было спрогнозировано 44 различных вариантов молекул миРНК, из которых были выбраны наиболее оптимальные варианты миРНК. Выбор осуществлялся в соответствии со следующими критериями: положение участка отжига на мРНК гена-мишени (il-13 мыши) не должен находиться ближе 50 пн относительно Start-кодона гена, т.к. в данном участке мРНК-мишени инициируется трансляция, которая сопряжена с привлечением различных инициирующих белковых факторов, что снижает пространственную доступность данного участка для молекул миРНК, и как следствие понижает их активность. Кроме того, следовало избегать повторяющихся более 4 раз нуклеотидов таких как «АААА» и «GGGG». В итоге было создано 6 вариантов миРНК против гена гена IL-4 (SEQ ID NO 1-6) и 4 варианта миРНК против IL-13 (SEQ ID NO 7-10) (таб. 1).The design of siRNA molecules was carried out using special OligoWalk software, which calculates the thermodynamic parameters of hybridization of RNA oligonucleotides and predicts their free binding energy to the target mRNA. Using the OligoWalk program, 44 different siRNA molecule variants were predicted, from which the most optimal siRNA variants were selected. The selection was carried out in accordance with the following criteria: the position of the annealing site on the mRNA of the target gene (mouse il-13) should not be closer than 50 bp relative to the Start codon of the gene, because in this region of the target mRNA, translation is initiated, which is associated with the involvement of various initiating protein factors, which reduces the spatial availability of this region for siRNA molecules, and as a result reduces their activity. In addition, nucleotides such as “AAAA” and “GGGG” that were repeated more than 4 times should be avoided. As a result, 6 siRNA variants against the IL-4 gene gene (SEQ ID NO 1-6) and 4 siRNA variants against IL-13 (SEQ ID NO 7-10) were created (Table 1).

Пример 2. Получение средства, содержащего молекулы миРНК, подавляющие экспрессию IL-13 и IL-4.Example 2. Obtaining funds containing miRNA molecules that suppress the expression of IL-13 and IL-4.

Получение средства, содержащего молекулы миРНК, подавляющие экспрессию IL-13: готовят водный раствор миРНК, содержащий siIL13-95 и siIL13-195 в массовом соотношении 1:1 концентрацией 0,6 мкг/мкл.Obtaining funds containing siRNA molecules that suppress the expression of IL-13: prepare an aqueous siRNA solution containing siIL13-95 and siIL13-195 in a mass ratio of 1: 1 concentration of 0.6 μg / μl.

Получение средства, содержащего молекулы миРНК, подавляющие экспрессию IL-13 и IL-4: готовят водный раствор миРНК, содержащий siIL-4-267, siIL-4-408, siIL13-95 и siIL13-195 в массовом соотношении 1:1:1:1 концентрацией 0,6 мкг/мкл.Obtaining funds containing miRNA molecules that suppress the expression of IL-13 and IL-4: prepare an aqueous miRNA solution containing siIL-4-267, siIL-4-408, siIL13-95 and siIL13-195 in a mass ratio of 1: 1: 1 : 1 concentration of 0.6 μg / μl.

Возможность успешного использования молекул миРНК в качестве высокоспецифичного средства «выключения» экспрессии провоспалительных генов была доказана экспериментально. В ходе экспериментов in vitro экспрессия генов IL-4 и IL-13 была успешно подавлена с использованием молекул миРНК, что описывается примером 3.The possibility of the successful use of siRNA molecules as a highly specific means of “turning off” the expression of pro-inflammatory genes has been experimentally proven. During in vitro experiments, expression of the IL-4 and IL-13 genes was successfully suppressed using siRNA molecules as described in Example 3.

Пример 3. Подавление экспресии генов IL-13 и IL-4 с использованием молекул миРНК in vitro.Example 3. Inhibition of gene expression of IL-13 and IL-4 using siRNA molecules in vitro.

Для тестирования спроектированных молекул миРНК, в экспериментах in vitro была создана экзогенная модель экспрессии этого гена в хорошо трансфецируемых клетках 293Т. Эффективность спроектированных молекул миРНК была оценена с использованием данной модели различными методами. Для этого 1×10⁵ клеток 293Т трансфецировали смесью, состоящей из 0,5 мкг плазмиды pUCHR IL13 IRES GFP или pUCHR IL4 IRES GFP, экспрессирующей ИЛ-13 или ИЛ-4 и 1 мкг соответствующей миРНК. Сутки после ко-трансфекции методом проточной цитометрии было оценено количество GFP⁺-клеток, а также средняя интенсивность их флуоресценции. Как оказалось, вариант миРНК (siIL 13-95) приводил к заметному снижению интенсивности флуоресценции GFP⁺-клеток в 5 раз, в сравнении с отрицательным контролем (рисунок 1). На рисунке 1 представлена средняя интенсивность флуоресценции клеток 293Т в % относительно контроля (siIL4). Интенсивность флуоресценции клеток при ко-трансфекции siIL4 и pUCHR IL13 IRES GFP принято за 100%. Как оказалось, вариант миРНК (siIL4-408) приводил к заметному снижению интенсивности флуоресценции GFP⁺-клеток в 5 раз, в сравнении с отрицательным контролем (рисунок 4). На рисунке 4 представлена средняя интенсивность флуоресценции клеток 293Т в % относительно контроля (siP4). Интенсивность флуоресценции клеток при ко-трансфекции siP4 и pUCHR IL4 IRES GFP принято за 100%.To test the designed siRNA molecules, an in vitro exogenous model of expression of this gene in well-transfected 293T cells was created. The effectiveness of the designed miRNA molecules was evaluated using this model using various methods. For this, 1 × 10 ⁵ 293T cells were transfected with a mixture consisting of 0.5 μg of the plasmid pUCHR IL13 IRES GFP or pUCHR IL4 IRES GFP expressing IL-13 or IL-4 and 1 μg of the corresponding siRNA. The day after co-transfection by flow cytometry, the number of GFP ⁺ cells and the average intensity of their fluorescence were estimated. As it turned out, the siRNA variant (siIL 13-95) led to a noticeable decrease in the fluorescence intensity of GFP ⁺ cells by 5 times, compared with the negative control (Figure 1). Figure 1 shows the average fluorescence intensity of 293T cells in% relative to the control (siIL4). The fluorescence intensity of cells upon co-transfection of siIL4 and pUCHR IL13 IRES GFP was taken as 100%. As it turned out, the miRNA variant (siIL4-408) led to a noticeable decrease in the fluorescence intensity of GFP ⁺ cells by 5 times, in comparison with the negative control (Figure 4). Figure 4 shows the average fluorescence intensity of 293T cells in% relative to the control (siP4). The fluorescence intensity of cells upon co-transfection of siP4 and pUCHR IL4 IRES GFP is taken as 100%.

Результаты, полученные в ходе количественного ПЦР анализа и ИФА, показали сходную картину. В клетках, взятых через сутки после ко-трансфекции, наблюдается снижение количества копий мРНК-il-13. Наиболее эффективное снижения обеспечивала так же siIL13-95 и siIL13-195 до 3 раз (рисунок 2). На рисунке представлена экспрессия mIL-13 относительно контроля (siIL4). Количество мРНК-il-13 при ко-трансфекции siIL4 и pUCHR IL13 IRES GFP принято за 100%. В клетках, взятых через сутки после ко-трансфекции, наблюдается снижение количества копий мРНК-il-4. Наиболее эффективное снижения обеспечивала так же siIL4-408 до 3 раз (рисунок 5). На рисунке представлено количество копий мРНК-il-4 относительно контроля (siP4). Количество мРНК-il-4 при ко-трансфекции siP4 и pUCHR IL4 IRES GFP принято за 100%.The results obtained during quantitative PCR analysis and ELISA showed a similar picture. In cells taken a day after co-transfection, a decrease in the number of copies of mRNA-il-13 is observed. The most effective reductions were also provided by siIL13-95 and siIL13-195 up to 3 times (Figure 2). The figure shows the expression of mIL-13 relative to the control (siIL4). The amount of mRNA-il-13 upon co-transfection of siIL4 and pUCHR IL13 IRES GFP was taken as 100%. In cells taken a day after co-transfection, a decrease in the number of copies of mRNA-il-4 is observed. The most effective reduction was also provided by siIL4-408 up to 3 times (Figure 5). The figure shows the number of copies of mRNA-il-4 relative to the control (siP4). The amount of mRNA-il-4 upon co-transfection of siP4 and pUCHR IL4 IRES GFP is taken as 100%.

В клеточных супернатантах, в этот же период времени происходит снижение концентрации секретированного клетками IL-13 до 10 раз при внесении в клетки молекул siIL-13-95 и siIL-13-195 (рисунок 3). Аналогичное снижение концентрации IL-4 происходит в клеточных супернатантах, в этот же период времени, при внесении в клетки молекул siIL-4-267 и siIL-4-408 (рисунок 6).In cell supernatants, during the same period of time, the concentration of IL-13 secreted by cells decreases by 10 times when siIL-13-95 and siIL-13-195 molecules are introduced into cells (Figure 3). A similar decrease in IL-4 concentration occurs in cell supernatants, at the same time period, when siIL-4-267 and siIL-4-408 molecules are introduced into cells (Figure 6).

Таким образом, было спроектировано 2 варианта молекул миРНК (siIL-13-95 и siIL-13-195) способных эффективно подавлять экспрессию провоспалительного гена il-13 мыши и 2 варианта молекул миРНК (siIL-4-267 и siIL-4-408) способных эффективно подавлять экспрессию провоспалительного гена il-4 мыши.Thus, 2 variants of siRNA molecules (siIL-13-95 and siIL-13-195) capable of effectively suppressing the expression of the pro-inflammatory mouse il-13 gene and 2 variants of siRNA molecules (siIL-4-267 and siIL-4-408) were designed capable of effectively inhibiting the expression of the pro-inflammatory mouse il-4 gene.

Был разработан режим введения препаратов миРНК модельным животным (мыши самки линии BALB/c с признаками бронхиальной астмы) и показано противовоспалительное действие созданных молекул миРНК, подавляющих экспрессию генов IL-4 и IL-13, что описывается примером 4.A regimen was developed for the administration of siRNA preparations to model animals (female mice of the BALB / c line with signs of bronchial asthma) and the anti-inflammatory effect of the created siRNA molecules that suppress the expression of the IL-4 and IL-13 genes, as described in Example 4, was shown.

Пример 4. Противовоспалительное действие молекул миРНК, подавляющих экспрессию генов IL-13 и IL-4.Example 4. Anti-inflammatory effect of siRNA molecules that suppress the expression of IL-13 and IL-4 genes.

Для оценки противовоспалительной эффективности воздействия молекул миРНК к генам IL-4 и IL-13 экспериментальные животные были разделены на 6 групп, у первых 5-ти групп проводилось моделирование экспериментальной бронхиальной астмы (БА) с использованием модельного аллергена овальбумина (OVA). БА моделировалась у животных в два этапа: этап сенсибилизации, где OVA вводился внутрибрюшинно совместно с адъювантом Al(ОН)₃; этап провокации, где OVA вводился интраназально. Доза и схема введения OVA и Al(ОН)₃ представлены в таблице 2. Группа 1 не получала молекул миРНК. Группам №2, 3, 4 и 5 интраназально (и/н) вводили миРНК: группе 2 - против гена siGFP (неспецифический контроль), группе 3 - против гена IL-4, группе 4 - против гена IL-13 и группе 5 вводилась смесь миРНК против IL-4 и IL-13. Группа 6 никаким манипуляциям не подвергалась. Доза и режим введения молекул миРНК представлены в таблице 2.To evaluate the anti-inflammatory effectiveness of the effect of siRNA molecules on the IL-4 and IL-13 genes, the experimental animals were divided into 6 groups, and experimental bronchial asthma (BA) was simulated using the model ovalbumin allergen (OVA) in the first 5 groups. AD was modeled in animals in two stages: the sensitization stage, where OVA was administered intraperitoneally together with Al (OH) ₃ adjuvant; the provocation stage, where OVA was administered intranasally. The dose and administration schedule of OVA and Al (OH) _{3 are} presented in Table 2. Group 1 did not receive siRNA molecules. Groups 2, 3, 4, and 5 were injected intranasally (i / n) with siRNA: group 2 against the siGFP gene (nonspecific control), group 3 against the IL-4 gene, group 4 against the IL-13 gene and group 5 a mixture of siRNA against IL-4 and IL-13. Group 6 was not subjected to any manipulation. The dose and mode of administration of siRNA molecules are presented in table 2.

После каждого этапа (сенсибилизации и провокации) был осуществлен забор крови и оценены уровни сывороточных антител класса IgE и субкласса IgG2a. Достоверных отличий в изменениях уровней анти-OVA IgE и IgG1 антител не выявлено (рисунок 7, рисунок 8). На рисунках представлены средние концентрации сывороточных анти-OVA IgE и IgG2a антител и ошибки средних. При этом на рисунке приняты следующие условные обозначения: Х - статистически значимо отличается от группы «OVA», #-статистически значимо отличается от группы «siGFP», где отличия считаются достоверными при р<0,05, N=10. Вероятно, это связано с тем, что животным миРНК вводилась локально (интраназально в ткань легких), а не системно (в кровоток), поэтому препарат не оказал влияния на уровни IgE и IgG2a в сыворотке крови.After each stage (sensitization and provocation), a blood sampling was performed and serum antibodies of IgE class and IgG2a subclass were evaluated. There were no significant differences in changes in the levels of anti-OVA IgE and IgG1 antibodies (Figure 7, Figure 8). The figures show the average serum anti-OVA IgE and IgG2a antibody concentrations and mean errors. The following conventions are used in the figure: X - statistically significantly different from the OVA group, # statistically significantly different from the siGFP group, where the differences are considered significant at p <0.05, N = 10. This is probably due to the fact that siRNA was introduced locally (intranasally into lung tissue) rather than systemically (into the bloodstream), so the drug did not affect serum IgE and IgG2a levels.

Через сутки после заключительной провокации у животных была оценена удельная сопротивляемость дыхательных путей (sRaw), в ответ на введение возрастающих концентраций метахолина (6,25, 12,5, 25 мг/мл). В результате у группы, получавшей siIL-13, показана тенденция к снижению удельной сопротивляемости бронхов, по сравнению с группой, животных, не получавших миРНК (OVA), и группой, получавшей неспецифические молекулы миРНК (siGFP). Наибольший эффект снижения гиперреактивности бронхов достигался при интраназальном введении смеси молекул миРНК против обоих генов IL-4 и IL-13 мышам с индуцированной астмой, т.е. наблюдался синергетический эффект молекул миРНК (рисунок 9). При этом на рисунке приняты следующие условные обозначения: Х- статистически значимо отличается от группы «OVA», #-статистически значимо отличается от группы «siGFP», где отличия считаются достоверными при р<0,05, N=10. Таким образом, одновременное воздействие на два провоспалительных цитокина IL-4 и IL-13 обеспечивает подавление двух генов-мишеней, обуславливая синергетический эффект молекул миРНК, приводящий к существенному снижению уровня гиперреактивности бронхов (снижению удельной сопротивляемости бронхов), являющейся одним из ведущих патофизиологических признаков БА.One day after the final provocation in animals, the specific airway resistance (sRaw) was assessed in response to the introduction of increasing concentrations of methacholine (6.25, 12.5, 25 mg / ml). As a result, the group treated with siIL-13 showed a tendency to decrease in the specific resistance of the bronchi, compared with the group of animals that did not receive siRNA (OVA) and the group that received non-specific siRNA molecules (siGFP). The greatest effect of reducing bronchial hyperreactivity was achieved with intranasal administration of a mixture of siRNA molecules against both IL-4 and IL-13 genes in mice with induced asthma, i.e. a synergistic effect of siRNA molecules was observed (Figure 9). The following conventions are used in the figure: X - statistically significantly different from the OVA group, # - statistically significantly different from the siGFP group, where the differences are considered significant at p <0.05, N = 10. Thus, the simultaneous action of two pro-inflammatory cytokines IL-4 and IL-13 suppresses two target genes, causing a synergistic effect of siRNA molecules, leading to a significant decrease in bronchial hyperreactivity (decrease in specific bronchial resistance), which is one of the leading pathophysiological signs of AD .

Кроме того, исследование общей клеточности и клеточного состава бронхо-альвеолярного лаважа мышей показало снижение количества клеток в БАЛ у экспериментальных животных группы 4, получавшей siIL-13, снижалось в 3,1 и 1,8 раза в сравнении с животными, не получавшими молекул миРНК (OVA) и животными, получавшими неспецифические молекулы миРНК (siGFP), соответственно. Более выраженное снижение общей клеточности БАЛ наблюдалось у группы 5, получавшей миРНК против обоих генов IL-4 и IL-13 - здесь наблюдалось снижение количества клеток в 5,5 и 3,3 раза в сравнении с животными, не получавшими молекул миРНК (OVA) и животными, получавшими неспецифические молекулы миРНК (siGFP), соответственно, что также свидетельствует о синергетическом эффекте молекул миРНК (рисунок 10). Как упоминалось выше важными маркерами аллергического воспаления в легких являются эозинофилы. В третьей, четвертой и пятой группах, получавших siIL-4, siIL-13 и siIL-4/siIL13, соответственно отмечалась тенденция к снижению эозинофилии по сравнению с группой, получавшей контрольную миРНК (siGFP) на 25%, 63% и 62%, соответственно. Эти данные свидетельствуют о том, что подавление гена IL-13 и подавление обоих цитокинов (IL-4 и IL-13) приводит к более существенному снижению аллергического воспаления, нежели подавление только гена IL-4 (рисунок 10). Аналогично, синергетических эффект молекулы миРНК обоих типов (siIL-4/siIL-13) оказывают на интенсивность инфильтрации других провоспалительных леток - лимфоцитов (рисунок 10). При этом на рисунке приняты следующие условные обозначения: Х - статистически значимо отличается от группы «OVA», #-статистически значимо отличается от группы «siGFP», где отличия считаются достоверными при р≤0,05, N=10.In addition, a study of the total cellularity and cellular composition of the broncho-alveolar lavage of mice showed a decrease in the number of cells in BAL in experimental animals of group 4 treated with siIL-13, decreased by 3.1 and 1.8 times in comparison with animals not treated with siRNA molecules (OVA) and animals treated with nonspecific siRNA molecules (siGFP), respectively. A more pronounced decrease in total BAL cellularity was observed in group 5, which received siRNAs against both IL-4 and IL-13 genes - there was a decrease in the number of cells by 5.5 and 3.3 times in comparison with animals that did not receive siRNA molecules (OVA) and animals treated with nonspecific siRNA molecules (siGFP), respectively, which also indicates the synergistic effect of siRNA molecules (Figure 10). As mentioned above, eosinophils are important markers of allergic pneumonia. In the third, fourth and fifth groups treated with siIL-4, siIL-13 and siIL-4 / siIL13, respectively, there was a tendency to a decrease in eosinophilia compared with the group receiving control siRNA (25%, 63% and 62%, respectively. These data indicate that suppression of the IL-13 gene and suppression of both cytokines (IL-4 and IL-13) leads to a more significant reduction in allergic inflammation than suppression of the IL-4 gene only (Figure 10). Similarly, the synergistic effect of both types of siRNA molecules (siIL-4 / siIL-13) is exerted on the intensity of infiltration of other pro-inflammatory letlets - lymphocytes (Figure 10). The following conventions are used in the figure: X - statistically significantly different from the OVA group, # statistically significantly different from the siGFP group, where the differences are considered significant at p≤0.05, N = 10.

Гистологические исследования срезов ткани легких показали сходную динамику: животные, получавшие миРНК против генов IL-4 и IL-13 или против обоих генов-мишеней демонтрировали снижение уровня инфильтрации провоспалительных клеток, в частности эозинофилов и лимфоцитов. Также анализ показал тенденцию к снижению слизистой метаплазии эпителия бронхов, гиперплазии эпителия и общей картины воспаления в группах 3, 4 и 5, в сравнении с первой группой, не получавшей миРНК и второй группой, получавшей неспецифические молекулы миРНК (siGFP) (рисунок 11). Однако стоит отметить, что наибольший положительный эффект, по данным гистологического анализа, проявляют молекулы миРНК, направленные против гена IL-13, а не против гена IL-4 или против обоих генов. Таким образом, синергичного эффекта молекул миРНК против обоих генов-мишеней, как было установлено при изменении гиперреактивности бронхов или при анализе клеточного состава БАЛ, не выявлялось данным методом анализа. Вероятно, это связано с тем, что изменение гиперреактивности бронхов и оценка состава БАЛ являются более интегральными показателями уровня воспаления в легких по сравнению с гистологическим анализов, т.е. они оценивают общее состояние дыхательной системы. В тоже время при приготовлении гистологических срезов ткани легких толщиной 4 мкм и при последующем их анализе могут ускользать некоторые локальные очаги воспаления в легких. В связи с этим данные об изменении гиперерактивности бронхов и клеточного состава БАЛ являются более значимыми при анализе результатов влияния молекул миРНК на показатели аллергической бронхиальной астмы.Histological studies of sections of lung tissue showed similar dynamics: animals treated with siRNA against the IL-4 and IL-13 genes or against both target genes demonstrated a decrease in the level of infiltration of pro-inflammatory cells, in particular eosinophils and lymphocytes. The analysis also showed a tendency towards a decrease in mucosal metaplasia of the bronchial epithelium, epithelial hyperplasia, and the general picture of inflammation in groups 3, 4, and 5, in comparison with the first group that did not receive siRNA and the second group that received non-specific siRNA molecules (siGFP) (Figure 11). However, it is worth noting that the greatest positive effect, according to histological analysis, is shown by siRNA molecules directed against the IL-13 gene, and not against the IL-4 gene or against both genes. Thus, the synergistic effect of siRNA molecules against both target genes, as was established with a change in bronchial hyperreactivity or in the analysis of BAL cell composition, was not detected by this analysis method. This is probably due to the fact that changes in bronchial hyperreactivity and assessment of the composition of BAL are more integral indicators of the level of pneumonia in comparison with histological analyzes, i.e. they evaluate the general condition of the respiratory system. At the same time, when preparing histological sections of lung tissue 4 microns thick and subsequent analysis, some local foci of inflammation in the lungs can slip away. In this regard, the data on changes in bronchial hypereactivity and BAL cell composition are more significant when analyzing the results of the influence of siRNA molecules on allergic bronchial asthma.

Таким образом, результатом данного изобретения является успешное использование молекул миРНК, направленных против провоспалительного гена IL-13, а также их смесь миРНК против гена IL-4 для лечения бронхиальной астмы. Подавление данных генов в ткани легких приводит к существенному снижению уровня гиперреактивности бронхов и аллергического воспаления в легких, при этом значительный положительный эффект оказывают молекулы миРНК, направленные против гена IL-13, а также наблюдается синергетический эффект при применении молекул миРНК против обоих цитокинов одновременно.Thus, the result of this invention is the successful use of siRNA molecules directed against the proinflammatory IL-13 gene, as well as their miRNA mixture against the IL-4 gene for the treatment of bronchial asthma. The suppression of these genes in lung tissue leads to a significant decrease in the level of bronchial hyperreactivity and allergic inflammation in the lungs, while siRNA molecules directed against the IL-13 gene have a significant positive effect, and a synergistic effect is observed when siRNA molecules are used against both cytokines simultaneously.

Список источниковList of sources

1. Agache I. [и др.]. Untangling asthma phenotypes and endotypes. // Allergy. 2012. №7 (67). C. 835-46.1. Agache I. [et al.]. Untangling asthma phenotypes and endotypes. // Allergy. 2012. No7 (67). C. 835-46.

2. Fahy J. V. Eosinophilic and Neutrophilic Inflammation in Asthma: Insights from Clinical Studies // Proceedings of the American Thoracic Society. 2009. №3 (6). C. 256-259.2. Fahy J. V. Eosinophilic and Neutrophilic Inflammation in Asthma: Insights from Clinical Studies // Proceedings of the American Thoracic Society. 2009. No3 (6). C. 256-259.

3. Holgate S.T. Pathogenesis of asthma. // Clinical and experimental allergy: journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology. 2008. №6 (38). C. 872-97.3. Holgate S.T. Pathogenesis of asthma. // Clinical and experimental allergy: journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology. 2008. No. 6 (38). C. 872-97.

4. Holgate S.T. Innate and adaptive immune responses in asthma. // Nature medicine. 2012. №5(18). C. 673-83.4. Holgate S.T. Innate and adaptive immune responses in asthma. // Nature medicine. 2012. No5 (18). C. 673-83.

5. Kearley J. [и др.]. IL-9 governs allergen-induced mast cell numbers in the lung and chronic remodeling of the airways. // American journal of respiratory and critical care medicine. 2011. №7 (183). C. 865-75.5. Kearley J. [et al.]. IL-9 governs allergen-induced mast cell numbers in the lung and chronic remodeling of the airways. // American journal of respiratory and critical care medicine. 2011. No7 (183). C. 865-75.

6. Koziol-White C.J., Damera G., Panettieri R.A. Targeting airway smooth muscle in airways diseases: an old concept with new twists. // Expert review of respiratory medicine. 2011. №6 (5). C. 767-77.6. Koziol-White C.J., Damera G., Panettieri R.A. Targeting airway smooth muscle in airways diseases: an old concept with new twists. // Expert review of respiratory medicine. 2011. No6 (5). C. 767-77.

7. Walter D.M. [и др.]. Critical role for IL-13 in the development of allergen-induced airway hyperreactivity. // Journal of immunology (Baltimore, Md.: 1950). 2001. №8 (167). C. 4668-4675.7. Walter D.M. [and etc.]. Critical role for IL-13 in the development of allergen-induced airway hyperreactivity. // Journal of immunology (Baltimore, Md .: 1950). 2001. No8 (167). C. 4668-4675.

8. Крючков, H.A.; Бабахин, A.A.; Башкатова, Ю.Н.; Козмин, Л.Д.; Барсигян, Г.Г.; Хаитов, М.Р.; Мартынов А.И. Краткосрочная безадъювантная модель IgE-зависимой бронхиальной астмы у лабораторных мышей с использованием аллергена пыльцы тимофеевки // Российский аллергологический журнал. 2008. (4). С. 37-45.8. Kryuchkov, H.A .; Babakhin, A.A .; Bashkatova, Yu.N.; Kozmin, L.D .; Barsigyan, G.G .; Khaitov, M.R .; Martynov A.I. Short-term non-adjuvant model of IgE-dependent bronchial asthma in laboratory mice using timothy pollen allergen // Russian Allergological Journal. 2008. (4). S. 37-45.

9. Шиловский, И.П.; Бабахин, А.А.; Прозорова, М.С.; Гайсина, А.Р.; Камышников, О.Ю.; Хаитов М.Р. Разработка безадъювантной модели хронической бронхиальной астмы у мышей // Российский иммунологический журнал. 2014. №17 (3). С. 638-641.9. Shilovsky, I.P .; Babakhin, A.A .; Prozorova, M.S .; Gaysina, A.R .; Kamyshnikov, O.Y .; Khaitov M.R. Development of a non-adjuvant model of chronic bronchial asthma in mice // Russian Immunological Journal. 2014. No17 (3). S. 638-641.

Claims

1. A method of treating allergic bronchial asthma, comprising administering to the subject an effective amount of an agent containing siRNA molecules, characterized in that the agent contains a mixture of siRNA molecules that inhibit the expression of the IL-13 and IL-4 gene represented by the sequences SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 3 and SEQ ID NO 6.

2. The method according to p. 1, characterized in that the agent is administered intranasally or inhalation.