RU2572575C1 - Mean for intracellular delivery of nucleic acids to cells of mammals - Google Patents
Mean for intracellular delivery of nucleic acids to cells of mammals Download PDFInfo
- Publication number
- RU2572575C1 RU2572575C1 RU2014144069/10A RU2014144069A RU2572575C1 RU 2572575 C1 RU2572575 C1 RU 2572575C1 RU 2014144069/10 A RU2014144069/10 A RU 2014144069/10A RU 2014144069 A RU2014144069 A RU 2014144069A RU 2572575 C1 RU2572575 C1 RU 2572575C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- ltp
- peptide
- nucleic acids
- transfection
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области генной инженерии и биохимии, а также к медицине и фармацевтике. The invention relates to the field of genetic engineering and biochemistry, as well as to medicine and pharmaceuticals.
В настоящее время разрабатывается и испытывается несколько десятков лекарственных средств, предназначенных для генной терапии онкологических, воспалительных, инфекционных заболеваний, а также заболеваний, связанных с нарушением обмена веществ. В составе таких генно-терапевтических препаратов присутствуют нуклеиновые кислоты (НК) в виде молекул дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) и рибонуклеиновой кислоты (РНК). Также в последнее время большой интерес представляет разработка РНК и ДНК вакцин, например, в отношении вируса гепатита С. Данные вакцинные препараты также в своем составе содержат НК. К тому же открытие феномена - РНК-интерференции, как способа регуляции генной экспрессии, существенно подтолкнуло исследователей и фармацевтические компании к разработке генно-терапевтических препаратов, содержащих в своем составе молекулы миРНК (малые интерферирующие РНК).Currently, several dozens of drugs are being developed and tested for the gene therapy of cancer, inflammatory, infectious diseases, as well as diseases associated with metabolic disorders. Nucleic acids (NKs) in the form of molecules of deoxyribonucleic acid (DNA) and ribonucleic acid (RNA) are present in the composition of such gene therapeutic drugs. Recently, it has also been of great interest to develop RNA and DNA vaccines, for example, with respect to hepatitis C. These vaccine preparations also contain NK. In addition, the discovery of the phenomenon of RNA interference, as a way of regulating gene expression, has significantly pushed researchers and pharmaceutical companies to develop gene-therapeutic drugs containing siRNA molecules (small interfering RNAs).
Однако все подобные препараты способны проявлять свою биологическую активность только после проникновения содержащихся в них молекул НК в цитоплазму или ядро клеток. В то же время, известно, что самопроизвольно ни ДНК, ни РНК не способны преодолевать цитоплазматическую или ядерную мембрану. В связи с этим, главным препятствием для внедрения генно-терапевтических препаратов в медицинскую практику является отсутствие эффективных, малотоксичных средств доставки НК в клетки-мишени.However, all such drugs are able to show their biological activity only after the penetration of NK molecules contained in them into the cytoplasm or cell nucleus. At the same time, it is known that spontaneously neither DNA nor RNA is able to cross the cytoplasmic or nuclear membrane. In this regard, the main obstacle to the introduction of gene therapeutic drugs in medical practice is the lack of effective, low-toxic means of delivering NK to target cells.
Также известно, что «голая» нуклеиновая кислота может быть локально доставлена в отдельные органы и ткани, например, мышцы или печень, с помощью физических методов, таких как гидродинамические инъекции или «бомбардировка» молекулами ДНК. Помимо низкой эффективности эти методы невозможно использовать для системной доставки генетического материала, кроме того, они являются экономически затратными. Поэтому большее внимание уделяется исследованиям по созданию систем доставки как вирусной, так и невирусной природы.It is also known that naked nucleic acid can be locally delivered to individual organs and tissues, such as muscles or the liver, using physical methods such as hydrodynamic injections or bombardment of DNA molecules. In addition to low efficiency, these methods cannot be used for systemic delivery of genetic material, in addition, they are economically costly. Therefore, more attention is paid to research on the creation of delivery systems of both viral and non-viral nature.
Из имеющихся способов, вирусные системы пока являются наиболее эффективными транспортными средствами доставки нуклеиновых кислот. Однако, несмотря на значительные усилия в этой сфере за последние 15 лет, реализация их в клинической практике осложняется, что связано с их недостатками. В частности, вирусные векторы вызывают нежелательный иммунный ответ, а также приводят к инсерционному мутагенезу. Уже имеется значительный негативный опыт использования вирусных векторов у человека. Так, например, 18-летний волонтер Гелсингер умер во время клинических исследований генно-терапевтического препарата, где в качестве вектора использовался аденовирус. Также известен печальный эпизод, когда у 30% детей развилась лейкемия после использования препарата, сконструированного на основе ретровируса и предназначенного для лечения врожденного иммунодефицита.Of the available methods, viral systems are by far the most efficient nucleic acid delivery vehicles. However, despite significant efforts in this area over the past 15 years, their implementation in clinical practice is becoming more complicated, due to their shortcomings. In particular, viral vectors elicit an unwanted immune response and also lead to insertional mutagenesis. There is already significant negative experience with the use of viral vectors in humans. For example, an 18-year-old volunteer Gelsinger died during clinical trials of a gene-therapeutic drug, where adenovirus was used as a vector. A sad episode is also known when 30% of children developed leukemia after using a drug designed on the basis of a retrovirus designed to treat congenital immunodeficiency.
Поэтому наиболее привлекательным, с точки зрения безопасности, решением является разработка невирусных систем доставки молекул ДНК и РНК на основе катионных липосом и пептидов. Этим соединениям присущи такие важные свойства, как неинфекционность, низкая иммуногенность и биодеградируемость. Как липосомы, так и пептиды способны образовывать комплексы с отрицательно заряженными НК и конденсировать их в компактные наноструктуры. Комплексование, с одной стороны, обеспечивает защиту НК от действия нуклеаз, а с другой, способствует их транслокации через клеточные мембраны, обычно, путем эндоцитоза. В качестве НК-связывающих агентов могут выступать катионные синтетические полимеры (например, полиэтиленимины), основные полиаминокислоты (полилизины, полиаргинины), хитозаны, катионные пептиды различного состава (например, пептид из белка ТАТ-ВИЧ) и липосомы. Степень компактизации НК, т.е. физический размер формируемого комплекса НК/носитель, сильно влияет на эффективность его транслокации через клеточную мембрану. Эффективность также зависит от суммарного заряда комплекса, который, в свою очередь, определяется отношением количества положительных зарядов носителя к количеству отрицательных фосфатных групп НК (величина R). Обычно в составе комплекса катионный носитель находится в избытке, обеспечивая суммарный позитивный заряд всего комплекса, что повышает эффективность его проникновения в клетки, т.к. поверхность клетки обычно несет отрицательный заряд. Кроме того, при взаимодействии носителя с НК происходит увеличение размера комплекса носитель/НК по сравнению с исходными размерами отдельных компонентов до их взаимодействия, при этом оптимальным для эффективного проникновения в клетки размером формируемых наночастиц является не более 200-300 нм.Therefore, the most attractive, from the point of view of safety, solution is the development of non-viral delivery systems of DNA and RNA molecules based on cationic liposomes and peptides. These compounds have such important properties as non-infectivity, low immunogenicity and biodegradability. Both liposomes and peptides are able to form complexes with negatively charged nanocrystals and condense them into compact nanostructures. The complexation, on the one hand, protects the NK from the action of nucleases, and on the other hand, promotes their translocation through cell membranes, usually by endocytosis. NK-binding agents may include cationic synthetic polymers (e.g. polyethyleneimines), basic polyamino acids (polylysines, polyarginines), chitosans, cationic peptides of various compositions (e.g., peptide from the TAT-HIV protein) and liposomes. The degree of compaction of NK, i.e. the physical size of the formed NK / carrier complex strongly affects the efficiency of its translocation through the cell membrane. Efficiency also depends on the total charge of the complex, which, in turn, is determined by the ratio of the number of positive charges of the carrier to the number of negative phosphate groups of nanocrystals (R value). Usually, the cationic carrier is in excess in the complex, providing the total positive charge of the whole complex, which increases the efficiency of its penetration into cells, because the cell surface usually carries a negative charge. In addition, when the carrier interacts with the NK, the size of the carrier / NK complex increases compared to the initial sizes of the individual components prior to their interaction, and the optimal size for the formed nanoparticles to penetrate into the cells is not more than 200-300 nm.
В настоящее время липосомы, по сравнению с пептидами, наиболее широко используются в качестве стандартных носителей для трансфекции клеток в научных исследованиях (in vitro), но высокий уровень токсичности и низкая стабильность делает их малоприменимыми в медицине. Тем не менее на данный момент имеется ряд липосомных соединений, разработанных зарубежными фармацевтическими компаниями Alnylam, Silence Therapeutics, Tekmira и Calando Pharmaceuticals, которые успешно проходят клинические исследования. Анализируя результаты доклинических и клинических исследований липосом, можно заключить, что высокоэффективные варианты, разработанные на сегодняшний день, как правило, оказываются достаточно токсичными. Поэтому их использование у человека разрешено лишь для пациентов с онкологическими заболеваниями и гепатитом C, поскольку для лечения данных патологий допускается применение лекарственных средств с низким коэффициентом безопасности (например, химиотерапия). Таким образом, создание эффективных и при этом малотоксичных средств доставки молекул ДНК и РНК в клетки продолжает оставаться актуальной задачей для медицины.Currently, liposomes, in comparison with peptides, are most widely used as standard carriers for transfection of cells in scientific research (in vitro), but the high level of toxicity and low stability makes them inapplicable in medicine. Nevertheless, there are currently a number of liposome compounds developed by foreign pharmaceutical companies Alnylam, Silence Therapeutics, Tekmira and Calando Pharmaceuticals, which are successfully undergoing clinical trials. Analyzing the results of preclinical and clinical studies of liposomes, we can conclude that the highly effective options developed to date, as a rule, are quite toxic. Therefore, their use in humans is allowed only for patients with cancer and hepatitis C, since the use of drugs with a low safety factor (for example, chemotherapy) is allowed to treat these pathologies. Thus, the creation of effective and at the same time low-toxic means of delivering DNA and RNA molecules to cells continues to be an urgent task for medicine.
В связи с высокой токсичностью липосомных конструкций наиболее перспективными выглядят менее токсичные и более стабильные катионные пептидные носители. К тому же в живых организмах трансмембранный транспорт обычно обеспечивают похожие специализированные белки, содержащие позитивно-заряженные аминокислотные последовательности. Сами по себе такие последовательности представляют собой позитивно заряженные пептиды и проявляют высокую транспортную активность. Их обозначают термином cell-penetrating peptides (СРР), т.е. проникающие пептиды (ПП). Среди различных изученных ПП одни представляют собой фрагменты природных белков, другие построены из комбинаций различных участков белка, дизайн некоторых ПП основан на чисто умозрительных гипотезах с учетом структурных соображений. Общим для всех ПП является наличие положительного заряда при физиологическом значении рН, их длина составляет 8-30 аминокислот. Установлено, что транспорт ПП через клеточную мембрану осуществляется рецептор-независимым путем, преимущественно путем эндоцитоза.Due to the high toxicity of liposomal structures, less toxic and more stable cationic peptide carriers appear to be the most promising. Moreover, in living organisms, transmembrane transport is usually provided by similar specialized proteins containing positively charged amino acid sequences. By themselves, such sequences are positively charged peptides and exhibit high transport activity. They are denoted by the term cell-penetrating peptides (CPP), i.e. penetrating peptides (PP). Among the various studied PPs, some are fragments of natural proteins, others are built from combinations of different protein sections, the design of some PPs is based on purely speculative hypotheses, taking into account structural considerations. Common to all PP is the presence of a positive charge at a physiological pH value, their length is 8-30 amino acids. It was found that the transport of PP across the cell membrane is carried out by the receptor-independent pathway, mainly by endocytosis.
Главными преимуществами использования синтетических пептидов над липосомами являются их низкая токсичность ввиду их быстрой деградации в клетке-мишени, и практически неограниченные возможности в дизайне структур, которые могут представлять собой линейные, циклические и дендримерные пептиды с желаемым суммарным зарядом, трехмерной структурой и энантиомерным составом. Кроме того, привлекательной является их устойчивость при хранении, сравнительная дешевизна методов их синтеза и масштабируемость производства, причем в полностью в автоматическом режиме. По этим параметрам пептиды имеют явное конкурентное преимущество по сравнению с липосомами как средством доставки.The main advantages of using synthetic peptides over liposomes are their low toxicity due to their rapid degradation in the target cell, and almost unlimited possibilities in the design of structures, which can be linear, cyclic and dendrimeric peptides with the desired total charge, three-dimensional structure and enantiomeric composition. In addition, their stability during storage, the comparative low cost of their synthesis methods and the scalability of production, moreover, in fully automatic mode, are attractive. In these parameters, the peptides have a clear competitive advantage over liposomes as a delivery vehicle.
Одним из перспективных вариантов доставки НК являются дендримерные соединения. Дендримеры представляют собой разветвленные трехмерные структуры с плотным ядром и внешним слоем, состоящим из одних и тех же заряженных группировок. По аналогии с липоплексами и полиплексами их называют еще дендриплексами. Наличие большого количества концевых заряженных групп они способны эффективно связывать НК. Например, молекула дендримера на основе полипропиленимина содержит 64 (100%) концевых аминогрупп (5-я генерация, DAB 64), способных акцептировать протоны от НК при нейтральном рН. Их использование в качестве агентов доставки молекул НК в значительной степени сосредоточено на использовании полиамидоаминов (РАМАМ). В 1993 г. впервые были опубликованы результаты исследований о том, что молекулы ДНК, содержащие гены люциферазы и β-галактозидазы, могут быть доставлены в клетки с помощью РАМАМ-дендримеров. В 1996 г. появились данные исследований об эффективности трансфекции генетического материала при помощи дендримеров на различных клеточных линиях. Было показано, что различные поколения протонированных дендримеров взаимодействуют с отрицательно заряженными плазмидными ДНК, и этот комплекс стабилен при физиологических условиях даже в присутствии додецилсульфата натрия. Результативность трансфекции зависела от типа дендримеров, в некоторых случаях эффективность трансфекции в 10-100 раз превышала эффективность известных коммерческих катионных липидов.One of the promising ND delivery options is dendrimer compounds. Dendrimers are branched three-dimensional structures with a dense core and an outer layer consisting of the same charged groups. By analogy with lipoplexes and polyplexes, they are also called dendriplexes. The presence of a large number of terminal charged groups, they are able to effectively bind NK. For example, a polypropyleneimine-based dendrimer molecule contains 64 (100%) amino terminal groups (5th generation, DAB 64) capable of accepting protons from nanocrystals at neutral pH. Their use as agents for delivery of NK molecules is largely focused on the use of polyamidoamines (RAMAM). In 1993, research results were first published that DNA molecules containing luciferase and β-galactosidase genes can be delivered to cells using PAMAM dendrimers. In 1996, research data appeared on the effectiveness of transfection of genetic material using dendrimers on various cell lines. It has been shown that various generations of protonated dendrimers interact with negatively charged plasmid DNA, and this complex is stable under physiological conditions even in the presence of sodium dodecyl sulfate. The transfection efficiency depended on the type of dendrimers; in some cases, the transfection efficiency was 10-100 times higher than the efficiency of known commercial cationic lipids.
Дендримеры могут также применяться для переноса генов с целью лечения злокачественных новообразований. При генетической терапии рост опухоли может быть заторможен с помощью контроля ангиогенеза. Так, при исследовании эффективности дендримеров как носителей генов при раке молочной железы РАМАМ-дендримеры ассоциировали с 36-мерными анионными олигомерами для доставки ангиостатина и генов тканевого ингибитора металлопротеиназы (TIMP-2). В результате трансфекции in vitro при разработке заявляемого изобретения было показано значительное уменьшение пролиферации эндотелиальных клеток и торможение развития эндотелиальных и раковых клеток. На конечном этапе работы трансфер генов в опухолевую область был проверен на мышах in vivo, у которых наблюдалось существенное снижение роста опухолей.Dendrimers can also be used for gene transfer for the treatment of malignant neoplasms. With genetic therapy, tumor growth can be inhibited by controlling angiogenesis. Thus, in studying the efficacy of dendrimers as gene carriers for breast cancer, PAMAM dendrimers were associated with 36-dimensional anionic oligomers for the delivery of angiostatin and genes for the tissue metalloproteinase inhibitor (TIMP-2). As a result of in vitro transfection during the development of the claimed invention, a significant decrease in the proliferation of endothelial cells and inhibition of the development of endothelial and cancer cells was shown. At the final stage of the work, the transfer of genes into the tumor region was tested in mice in vivo, in which a significant decrease in tumor growth was observed.
Также было показано, что формирование дендриплекса между дендримером и НК предотвращает их взаимодействие с сывороточным альбумином, которое, как известно, является основным препятствием для доставки свободных НК в пораженные органы и ткани при генной терапии.It was also shown that the formation of a dendriplex between the dendrimer and NK prevents their interaction with serum albumin, which, as you know, is the main obstacle to the delivery of free NK to the affected organs and tissues during gene therapy.
Таким образом, катионные дендримерные пептидные носители представляют собой перспективный класс соединений для внутриклеточной доставки молекул ДНК и РНК при использовании в составе генно-терапевтических лекарственных средств.Thus, cationic dendrimer peptide carriers are a promising class of compounds for intracellular delivery of DNA and RNA molecules when used as part of gene therapeutic drugs.
Известны изобретения для внутриклеточной доставки НК.Known inventions for intracellular delivery of NK.
Так, первые патенты по доставке молекул НК были связаны с использованием дендримеров РАМАМ-типа, полученные German and Szoka (США) в 1998, и в дальнейшем они служили основой для многочисленных модификаций при получении препаратов для доставки генов (см. “Recent patents in dendrimers for nanomedicine: evolution 2014 - Recent Patents on Nanomedicine, 2014, 4 (1), 000-0001877-9123/14 © 2014 Bentham Science Publishers).Thus, the first patents for the delivery of NK molecules were associated with the use of PAMAM-type dendrimers obtained by German and Szoka (USA) in 1998, and subsequently they served as the basis for numerous modifications in the preparation of gene delivery preparations (see “Recent patents in dendrimers for nanomedicine: evolution 2014 - Recent Patents on Nanomedicine, 2014, 4 (1), 000-0001877-9123 / 14 © 2014 Bentham Science Publishers).
Также из уровня техники известно, что аргинин-содержащие пептиды и ковалентно связанные с молекулами НК хорошо проникают в клетки и обеспечивают их трансфекцию с эффективностью, даже лучшей, чем известные проникающие пептиды из природных белков, таких как ТАТ и Пенетратин (Luo К, Li С, Wang G, Nie Υ, Не В, Wu Y, Gu Ζ. Peptide dendrimers as efficient and biocompatible gene delivery vectors: Synthesis and in vitro characterization. J. Control Release, 2011, 55(1):77-87). Причем дополнительное введение в терминальные ветви дендримера остатков глицина или ε-аминогексановой кислоты и гистидина может повышать трансфецирующую активность данных конъюгатов, по-видимому, за счет увеличения гибкости пептидных цепей и менее жесткому связыванию НК с дендримером. Тем не менее в данном изобретении, как и в ряду других, осуществляется не электростатическое формирование комплекса НК/носитель, а их жесткое ковалентное взаимодействие. Такой принцип формирования комплекса значительно усложняет практическую реализацию изобретения ввиду необходимости дополнительной химической модификации молекул носителя и НК, с последующей очисткой комплекса, что сопряжено с потерями и снижением выхода конечного продукта.It is also known from the prior art that arginine-containing peptides and NK molecules covalently bound to the molecules penetrate the cells well and ensure their transfection with an efficiency even better than the known penetrating peptides from natural proteins, such as TAT and Penetratin (Luo K, Li C , Wang G, Nie Υ, Ne B, Wu Y, Gu Pe. Peptide dendrimers as efficient and biocompatible gene delivery vectors: Synthesis and in vitro characterization. J. Control Release, 2011, 55 (1): 77-87). Moreover, the additional introduction of glycine or ε-aminohexanoic acid and histidine residues into the terminal branches of the dendrimer can increase the transfecting activity of these conjugates, apparently due to an increase in the flexibility of the peptide chains and less rigid binding of NK to the dendrimer. Nevertheless, in this invention, as well as in a number of others, it is not the electrostatic formation of the NK / carrier complex that is carried out, but their rigid covalent interaction. This principle of complex formation greatly complicates the practical implementation of the invention due to the need for additional chemical modification of carrier molecules and nanocrystals, followed by purification of the complex, which is associated with losses and a decrease in the yield of the final product.
Известно изобретение, описанное в патенте US 6376248 “Peptide-enhanced transfections», в котором авторы предлагают многочисленные композиции для трансфекции клеток эукариот, включающие комплексы НК с пептидами, где нуклеиновая кислота связана ковалентно с линейным катионным пептидом с аминокислотной последовательностью ТАТ-пептида (из ВИЧ), дендримером или липопептидом. Описанные в патенте дендримеры являются производными коммерческого дендримера РАМАМ (от компании Dendritech Inc.) с высокой молекулярной массой, к концевым группам которого присоединены остатки лизина (LysDmer) или аргинина (ArgDmer). Однако известное решение обладает повышенной токсичностью, сложно в получении, имеет ограниченный срок хранения.The invention is described in US Pat. No. 6,376,248, “Peptide-enhanced transfections,” in which we propose numerous compositions for transfecting eukaryotic cells, including NK complexes with peptides, where the nucleic acid is covalently linked to a linear cationic peptide with the amino acid sequence of the TAT peptide (from HIV ), dendrimer or lipopeptide. The dendrimers described in the patent are high molecular weight derivatives of the commercial PAMAM dendrimer (from Dendritech Inc.), to the terminal groups of which are attached lysine (LysDmer) or arginine (ArgDmer) residues. However, the known solution has increased toxicity, is difficult to obtain, has a limited shelf life.
Анализ заявляемого изобретения в сравнении с известным и широко используемым соединением, таким как Lipofectamine®2000 и дендримерами, описанными в патенте US 6376248, показал, что заявляемое средство обладает следующими преимуществами:Analysis of the claimed invention in comparison with the well-known and widely used compound, such as
1) Благодаря наличию в его составе только природных аминокислот, заявляемое средство, так называемый лизин-транспортный пептид (LTP), обладает низкой токсичностью в отношении клеток млекопитающих, по сравнению с липосомами Lipofectamine®2000.1) Due to the presence of only natural amino acids in its composition, the claimed agent, the so-called lysine transport peptide (LTP), has low toxicity to mammalian cells, compared with
2) Заявляемое средство (LTP), в отличие от Lipofectamine®2000, обладает способностью доставлять в различные типы клеток млекопитающих нуклеиновые кислоты, что позволяет рассматривать его как перспективный агент для трансфекции клеток молекулами РНК и ДНК.2) The claimed agent (LTP), unlike
3) Для доставки НК в клетки требуется лишь простое смешивание водных растворов НК и заявляемого средства LTP, после чего происходит электростатическое формирование комплекса HK/LTP, т.е. в отличие от дендримеров, описанных в патенте US 6376248, не требуется сложной процедуры приготовления ковалентного комплекса (конъюгата).3) For the delivery of NK into cells, only simple mixing of aqueous NK solutions and the inventive LTP agent is required, after which the electrostatic formation of the HK / LTP complex occurs, i.e. unlike the dendrimers described in US Pat. No. 6,376,248, a complicated procedure for preparing a covalent complex (conjugate) is not required.
4) Заявляемое средство, в отличие от липосом Lipofectamine®2000, стабильно при хранении в сухом виде.4) The inventive tool, unlike
5) Синтез LTP в сравнении с липосомами Lipofectamine®2000 и дендримеров, описанных в патенте US 6376248, легко осуществлять с использованием автоматического пептидного синтезатора.5) The synthesis of LTP in comparison with
6) В отличие от липосом Lipofectamine®2000 и дендримеров, описанных в патенте US 6376248 В1, пептид LTP содержит свободную меркаптогруппу в С-концевом цистеине, что позволяет присоединять к нему репортерные метки, необходимые для изучения фармакокинетики, которая является необходимым этапом при доклинических исследованиях.6) Unlike
Известен носитель для направленной доставки нуклеиновых кислот в клетки, экспрессирующие рецептор CXCR4, состоящий из последовательности-лиганда к рецептору CXCR4 с последовательностью аминокислот KPVSLSYRSPSRFFESH, линкерного участка из двух молекул G-аминогексановой кислоты, соединяющей последовательность-лиганд с последовательностью для компактизации нуклеиновых кислот, последовательности, обеспечивающей компактизацию нуклеиновых кислот и выход комплекса из эндосом CHRRRRRRHC (патент РФ №2522810), выбранный в качестве ближайшего аналога. Однако известный носитель по указанному изобретению имеет большие размеры, что не позволяет эффективно осуществить доставку нуклеиновых кислот в клетки млекопитающих, не имеющих рецептора CXCR4. Также известный носитель имеет иную структуру и иной механизм проникновения (рецептор-опосредованный), нежели заявляемое средство LTP.A carrier is known for the targeted delivery of nucleic acids to cells expressing the CXCR4 receptor, consisting of a ligand sequence for the CXCR4 receptor with the amino acid sequence KPVSLSYRSPSRFFESH, a linker site of two G-aminohexanoic acid molecules connecting the ligand sequence with a sequence for compiling nucleic acids, a sequence ensuring the compaction of nucleic acids and the exit of the complex from endosomes CHRRRRRRHC (RF patent No. 2522810), selected as the closest analogue. However, the known carrier according to this invention is large, which does not allow the efficient delivery of nucleic acids to mammalian cells that do not have a CXCR4 receptor. Also, the known carrier has a different structure and a different penetration mechanism (receptor-mediated) than the claimed LTP agent.
Поиск по источникам научно-технической и патентной литературы показал, что заявляемое средство LTP в доступных источниках не описано.A search in the sources of scientific, technical and patent literature showed that the claimed LTP is not described in available sources.
Задачей изобретения является создание малотоксичного эффективного средства для внутриклеточной доставки нуклеиновых кислот в клетки млекопитающих.The objective of the invention is to provide a low toxic effective agent for intracellular delivery of nucleic acids in mammalian cells.
Поставленная задача решается за счет того, что средство для внутриклеточной доставки нуклеиновых кислот в клетки млекопитающих представляет собой катионный дендримерный пептид, содержащий 8 остатков аргинина, 7 остатков лизина, аланин и цистеин со структурной формулой (Arg)8(Lys)4(Lys)2LysAlaCys-NH2.The problem is solved due to the fact that the means for intracellular delivery of nucleic acids to mammalian cells is a cationic dendrimer peptide containing 8 residues of arginine, 7 residues of lysine, alanine and cysteine with the structural formula (Arg) 8 (Lys) 4 (Lys) 2 LysAlaCys-NH 2 .
При отношении количества положительных зарядов к количеству отрицательных фосфатных групп нуклеиновых кислот, равном или выше 8, средство для внутриклеточной доставки нуклеиновых кислот в клетки млекопитающих оно полностью взаимодействует с плазмидной ДНК.When the ratio of the number of positive charges to the number of negative phosphate groups of nucleic acids equal to or higher than 8, the means for intracellular delivery of nucleic acids to mammalian cells completely interacts with plasmid DNA.
При отношении количества положительных зарядов к количеству отрицательных фосфатных групп нуклеиновых кислот от 24 до 96 средство для внутриклеточной доставки нуклеиновых кислот в клетки млекопитающих способно эффективно трансфецировать различные типы клеток.When the ratio of the number of positive charges to the number of negative phosphate groups of nucleic acids is from 24 to 96, the means for the intracellular delivery of nucleic acids into mammalian cells is able to efficiently transfect various types of cells.
При ЛД50 для 0,8-1,5 мг/мл средство для внутриклеточной доставки нуклеиновых кислот в клетки млекопитающих является малотоксичным.With an LD of 50 for 0.8-1.5 mg / ml, the agent for intracellular delivery of nucleic acids to mammalian cells is low toxic.
Изобретение поясняется чертежами.The invention is illustrated by drawings.
На фиг. 1 представлена структура катионного дендримерного пептида LTP в двух видах: А - аминокислоты представлены в трехбуквенном обозначении, Б - аминокислоты представлены в однобуквенном обозначении, на фиг. 2 представлены копии полученных результатов при аналитической высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) очищенного пептида LTP, на фиг. 3 представлены копии масс-спектра очищенного пептида LTP (MALDI-TOF, прибор BRUKER Microflex LT), на фиг. 4 представлены химические формулы основных реагентов, применяемых в синтезе LTP, на фиг. 5 представлена схема цикла основных операций твердофазного синтеза пептида, на фиг. 6 представлены микрофотографии LTP и смеси LTP с плазмидой pGL3 (LTP/pGL3), на фиг. 7 представлены фотографии интенсивности окраски плазмидной ДНК (pGL3) и комплекса LTP/pGL3 после электрофоретического разделения в 1% агарозном геле, на фиг. 8 представлена диаграмма эффективности трансфекции клеток 293Т с использованием LTP, на фиг. 9 представлена диаграмма эффективности трансфекции клеток HelaHI с использованием LTP, на фиг. 10 представлена диаграмма эффективности трансфекции клеток А549 с использованием LTP, на фиг. 11 представлена диаграмма эффективности трансфекции клеток МТ4 с использованием LTP, на фиг. 12 представлена диаграмма эффективности трансфекции не стимулированных клеток селезенки мыши с использованием LTP.In FIG. 1 shows the structure of the cationic dendrimer peptide LTP in two forms: A - amino acids are presented in a three-letter designation, B - amino acids are presented in a single-letter designation, in FIG. 2 presents copies of the results obtained by analytical high performance liquid chromatography (HPLC) of the purified LTP peptide, FIG. 3 is a copy of the mass spectrum of the purified LTP peptide (MALDI-TOF, BRUKER Microflex LT); FIG. 4 presents the chemical formulas of the main reagents used in the synthesis of LTP, in FIG. 5 is a flow chart of the basic operations of solid-phase synthesis of a peptide; FIG. 6 shows micrographs of LTP and a mixture of LTP with plasmid pGL3 (LTP / pGL3), FIG. 7 shows photographs of the staining intensity of plasmid DNA (pGL3) and the LTP / pGL3 complex after electrophoretic separation in 1% agarose gel, FIG. 8 is a diagram of the efficacy of transfection of 293T cells using LTP; FIG. 9 is a graph of HelaHI cell transfection efficiency using LTP, FIG. 10 is a graph of the efficiency of transfection of A549 cells using LTP, FIG. 11 is a graph of MT4 cell transfection efficiency using LTP; FIG. 12 is a performance chart of transfection of non-stimulated mouse spleen cells using LTP.
Средство для внутриклеточной доставки нуклеиновых кислот в клетки млекопитающих представляет собой катионный дендримерный пептид, при этом он содержит 8 остатков аргинина, 7 остатков лизина, аланин и цистеин со структурной формулой (Arg)8(Lys)4(Lys)2LysAlaCys-NH2. На фиг. 1 представлена структура заявленного катионного дендримерного пептида.The agent for intracellular delivery of nucleic acids to mammalian cells is a cationic dendrimer peptide, while it contains 8 arginine residues, 7 lysine residues, alanine and cysteine with the structural formula (Arg) 8 (Lys) 4 (Lys) 2 LysAlaCys-NH 2 . In FIG. 1 shows the structure of the claimed cationic dendrimer peptide.
Было установлено, что средство для внутриклеточной доставки нуклеиновых кислот в клетки млекопитающих полностью взаимодействует с плазмидной ДНК, если отношение количества положительных зарядов к количеству отрицательных фосфатных групп нуклеиновых кислот равно или выше 8.It was found that the means for intracellular delivery of nucleic acids into mammalian cells fully interacts with plasmid DNA if the ratio of the number of positive charges to the number of negative phosphate groups of nucleic acids is equal to or higher than 8.
Также было установлено, что средство для внутриклеточной доставки нуклеиновых кислот в клетки млекопитающих при отношении количества положительных зарядов к количеству отрицательных фосфатных групп нуклеиновых кислот от 24 до 96 способно эффективно трансфецировать различные типы клеток.It was also found that a means for the intracellular delivery of nucleic acids into mammalian cells with a ratio of the number of positive charges to the number of negative phosphate groups of nucleic acids from 24 to 96 is able to efficiently transfect various types of cells.
В результате проведенных экспериментов было доказано, что заявленное средство для внутриклеточной доставки нуклеиновых кислот в клетки млекопитающих при ЛД50 для 0,8-1,5 мг/мл является малотоксичным.As a result of the experiments, it was proved that the claimed tool for intracellular delivery of nucleic acids to mammalian cells at LD 50 for 0.8-1.5 mg / ml is low toxic.
В предлагаемом изобретении был проведен выбор оптимальной структуры катионного дендримерного пептида - LTP.In the present invention, the choice of the optimal structure of the cationic dendrimer peptide - LTP.
Пока не существует определенного алгоритма выбора оптимальной конструкции носителя НК, поскольку трансфекция - сложный, многофакторный процесс, многие ступени которого еще плохо изучены, особенно механизмы транслокации клеточной мембраны и внутриклеточных барьеров. Поэтому дизайн таких структур, в том числе катионных дендримерных пептидов, базируется на обзоре известных литературных данных, анализе функционирования природных транспортных белков и экспериментальной проверке изменений различных структурных особенностей. Проведенный предварительный анализ обусловил выбор 22 катионных пептидных последовательностей в качестве предполагаемых эффективных носителей молекул НК (таблица 1).So far, there is no definite algorithm for choosing the optimal NK carrier design, since transfection is a complex, multifactorial process, many stages of which are still poorly studied, especially the mechanisms of translocation of the cell membrane and intracellular barriers. Therefore, the design of such structures, including cationic dendrimer peptides, is based on a review of well-known literature data, analysis of the functioning of natural transport proteins, and experimental verification of changes in various structural features. A preliminary analysis led to the selection of 22 cationic peptide sequences as the proposed effective carriers of NK molecules (table 1).
Выбранные структуры можно подразделить на три основные группы: линейные пептиды, липопептиды, содержащие привязанный к N-концу остаток пальмитиновой кислоты, и - дендримерные пептиды, имеющие ветвления по аминогруппам лизина. Дальнейший выбор оптимальной структуры носителя базировался на результатах экспериментов по трансфекции клеточных культур.The selected structures can be divided into three main groups: linear peptides, lipopeptides containing the palmitic acid residue attached to the N-terminus, and dendrimer peptides having branching at the amino groups of lysine. Further selection of the optimal carrier structure was based on the results of experiments on transfection of cell cultures.
Для этого все соединения с различной структурой, представленные в таблице 1, были синтезированы твердофазным методом, очищены и использованы в экспериментах по изучению эффективности трансфекции. Трансфекционная активность синтезированных структур оценивалась в эксперименте in vitro с использованием клеточной линии HEK293Т (эмбриональная почка человека). Различные концентрации синтезированных пептидов индивидуально смешивались с одинаковым количеством (0,25 мкг) плазмидной ДНК, несущей репортерный ген GFP (зеленый флуоресцирующий белок); плазмида pUCHR IRES GFP. Конечный объем смеси = 80 мкл питательной среды optiMEM (Gibco, США), не содержащей антибиотики и эмбриональную телячью сыворотку (ЭТС). Смесь пептида и ДНК инкубировалась при комнатной температуре в течение 30 минут, при этом происходило образование электростатического комплекса пепетид/ДНК. После этого весь объем смеси (80 мкл) был внесен в предварительно подготовленную культуру клеток НЕК293Т. Культура клеток готовилась заранее в 48-луночном плейте (Costar, США): количество клеток 75000 в объеме 300 мкл полной питательно среды ДМЕМ (Gibco, США), содержащая 10% ЭТС (Hyclone, США) и 80 мг/л антибиотика Гентамицина (Gibco, США). Далее после внесения смеси в лунки с клетками их инкубировали 48 часов при 37 C в 5% атмосфере СО2. После инкубации осуществляли оценку эффективности проникновения плазмиды pUCHR IRES GFP методом флуоресцентной микроскопии. Эффективность проникновение ДНК в клетки была прямо пропорциональная интенсивности флуоресценции клеток, т.е. чем эффективнее пептид способствует внутриклеточному проникновению ДНК, тем выше интенсивность флуоресценции.For this, all compounds with different structures presented in Table 1 were synthesized by the solid-phase method, purified and used in experiments to study the efficiency of transfection. The transfection activity of the synthesized structures was evaluated in an in vitro experiment using the HEK293T cell line (human embryonic kidney). Different concentrations of the synthesized peptides were individually mixed with the same amount (0.25 μg) of plasmid DNA carrying the GFP reporter gene (green fluorescent protein); plasmid pUCHR IRES GFP. The final volume of the mixture = 80 μl of optiMEM nutrient medium (Gibco, USA) that does not contain antibiotics and fetal calf serum (ETS). The mixture of peptide and DNA was incubated at room temperature for 30 minutes, while the formation of the electrostatic complex peptid / DNA. After that, the entire volume of the mixture (80 μl) was added to the previously prepared HEK293T cell culture. The cell culture was prepared in advance in a 48-well plate (Costar, USA): the number of cells 75000 in a volume of 300 μl of complete nutrient medium DMEM (Gibco, USA) containing 10% ETS (Hyclone, USA) and 80 mg / l of the antibiotic Gentamicin (Gibco , USA). Then, after the mixture was added to the wells with cells, they were incubated for 48 hours at 37 ° C in 5% CO 2 atmosphere. After incubation, the penetration efficiency of the pUCHR IRES GFP plasmid was evaluated by fluorescence microscopy. The efficiency of DNA penetration into cells was directly proportional to the fluorescence intensity of cells, i.e. the more effective the peptide promotes the intracellular penetration of DNA, the higher the fluorescence intensity.
По результатам данного исследования (таб. 1) можно заключить, что наибольшую трансфекционную активность из изученных пептидов проявлял дендримерный катионный пептид с формулой (R)8(K)4(K)2KAC-NH2, обозначенный нами как LTP, являющийся объектом данного изобретения.According to the results of this study (Table 1), it can be concluded that the dendrimer cationic peptide with the formula (R) 8 (K) 4 (K) 2 KAC-NH 2 , designated by us as LTP, which is the object of this inventions.
Обозначения, используемые в таблице 1:Designations used in table 1:
«-» - отсутствует трансфекционная активность (нет флуоресцирующих клеток);“-” - no transfection activity (no fluorescent cells);
«+» - незначительная трансфекционная активность (присутствуют единичные флуоресцирующие клетки, менее 1%);"+" - slight transfection activity (there are single fluorescent cells, less than 1%);
«++» - низкая трансфекционная активность (1-10% флуоресцирующих клеток);"++" - low transfection activity (1-10% of fluorescent cells);
«+++» - умеренная трансфекционная активность (10-25% флуоресцирующих клеток);"+++" - moderate transfection activity (10-25% of fluorescent cells);
«++++» - выраженная трансфекционная активность (25-50% флуоресцирующих клеток);"++++" - pronounced transfection activity (25-50% of fluorescent cells);
«+++++» - высокая трансфекционная активность (более 50% флуоресцирующих клеток);"+++++" - high transfection activity (more than 50% of fluorescent cells);
Трансфекционная эффективность указанных катионных пептидов оценивалась по интенсивности флуоресценции клеток.The transfection efficiency of these cationic peptides was evaluated by the intensity of cell fluorescence.
Таким образом, структурная особенность заявленного изобретения такова (фиг. 1), что катионный дендримерный пептид содержит 16 гуанидиновых групп на внешнем слое. Благодаря этому, в водном растворе и в широком диапазоне pH пептид имеет сильный позитивный заряд (+16), способствующий его комплексованию с отрицательно заряженной нуклеиновой кислотой и взаимодействию с клеткой.Thus, the structural feature of the claimed invention is such (Fig. 1) that the cationic dendrimer peptide contains 16 guanidine groups on the outer layer. Due to this, in an aqueous solution and in a wide pH range, the peptide has a strong positive charge (+16), which contributes to its complexation with a negatively charged nucleic acid and interaction with the cell.
Синтез и очистку катионного дендримерного пептида LTP проводят твердофазным методом, используя стандартный протокол Fmoc-химии и N-гидроксибензотриазол/диизопропилкарбодиимидный (ГБТ/ДИП) метод активации Fmoc-аминокислот. В качестве полимера-носителя используют коммерческие реактивы: смолу Rink Amide МВНА, или Wang. В качестве исходных производных аминокислот применяют: Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH (фиг. 4). Стандартный цикл включет промывку (ДМФА), удаление Fmoc-защиты (20% пиперидин в ДМФА), предварительное активирование Fmoc-аминокислоты (ДИП/ГБТ) и конденсацию в среде ДМФА/N-метилпирролидон при 2-кратном избытке карбоксильного компонента (~0,5 часа). Контроль над полнотой реакции осуществляют нингидриновым методом и при необходимости реакцию конденсации повторяют. Конечные пептиды отщепляют от полимера трифторуксусной кислотой в присутствии скавенджеров (тиоанизол, этандитиол, фенол, диметилсульфид).The synthesis and purification of the cationic dendrimer peptide LTP is carried out by the solid-phase method using the standard protocol of Fmoc chemistry and N-hydroxybenzotriazole / diisopropylcarbodiimide (GBT / DIP) method of activation of Fmoc amino acids. As the carrier polymer, commercial reagents are used: Rink Amide MVNA resin, or Wang. As the initial derivatives of amino acids used: Fmoc-Cys (Trt) -OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH (Fig. 4). The standard cycle includes washing (DMF), removal of Fmoc protection (20% piperidine in DMF), preliminary activation of the Fmoc amino acid (DIP / GBT) and condensation in DMF / N-methylpyrrolidone with a 2-fold excess of the carboxyl component (~ 0, 5 hours). The completeness of the reaction is monitored by the ninhydrin method and, if necessary, the condensation reaction is repeated. The final peptides are cleaved from the polymer with trifluoroacetic acid in the presence of scavengers (thioanisole, ethanedithiol, phenol, dimethyl sulfide).
Сырой продукт высаждают сухим серным эфиром, экстрагируют водной уксусной кислотой и экстракт лиофилизируют. Очистку пептида проводят методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) (фиг. 2), например, на колонке Grace Vydac 218 ТР54, а структуру очищенного пептида подтверждают масс-спектрометрией (фиг. 3).The crude product is precipitated with dry sulfuric ether, extracted with aqueous acetic acid and the extract is lyophilized. The peptide was purified by high performance liquid chromatography (HPLC) (Fig. 2), for example, on a Grace Vydac 218 TP54 column, and the structure of the purified peptide was confirmed by mass spectrometry (Fig. 3).
Полученные параметры стандартного образца LTP: время удерживания на аналитической колонке: 10,1±0,2 мин, масс-спектр (MALDI-TOF): m/z=2337,471±1 при расчетной массе: 2337,98.The obtained parameters of the standard LTP sample: retention time on the analytical column: 10.1 ± 0.2 min, mass spectrum (MALDI-TOF): m / z = 2337.471 ± 1 with an estimated mass of 2337.98.
Для аналитической высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) очищенного пептида LTP была использована аналитическая колонка Grace Vydac 218ТР54 (150×4.6 мм), содержащая 5 мкм сорбент С18. Подвижная фаза: 0,1% водный раствор трифторуксусной кислоты (А) и ацетонитрил (Б) - смесь, 1 мл/мин. Градиент, % состав: 0-2 мин (А - 100%); 2-25 мин (Б - линейно от 0 до 70%); 25-27 мин (Б - 70%); 27-29 мин (Б - линейно от 70 до 0%); 29-35 мин (А - 100%).For analytical high performance liquid chromatography (HPLC) of the purified LTP peptide, a Grace Vydac 218TP54 analytical column (150 × 4.6 mm) containing 5 μm sorbent C18 was used. Mobile phase: 0.1% aqueous solution of trifluoroacetic acid (A) and acetonitrile (B) - mixture, 1 ml / min. Gradient,% composition: 0-2 min (A - 100%); 2-25 min (B - linearly from 0 to 70%); 25-27 min (B - 70%); 27-29 min (B - linearly from 70 to 0%); 29-35 min (A - 100%).
Пример 1.Example 1
Синтез осуществлялся следующим образом.The synthesis was carried out as follows.
На фиг. 4 представлены химические формулы основных реагентов, применяемых в синтезе LTP.In FIG. 4 presents the chemical formulas of the main reagents used in the synthesis of LTP.
Схема твердофазного синтеза основана на повторяющемся цикле стандартных операций (фиг. 5), который включает:The solid-phase synthesis scheme is based on a repeating cycle of standard operations (Fig. 5), which includes:
1) На старте навеску исходной смолы Rink Amide вносят в реактор, добавляют ДМФА, энергично перемешивают суспензию до полного набухания смолы, операцию повторяют 3 раза по 3 мин, удаляя растворитель фильтрованием через пористое дно под вакуумом или под давлением.1) At the start, a weighed portion of the initial Rink Amide resin is introduced into the reactor, DMF is added, the suspension is vigorously stirred until the resin completely swells, the operation is repeated 3 times for 3 minutes, removing the solvent by filtration through a porous bottom under vacuum or under pressure.
2) Удаление Fmoc-защиты 20% раствором 4-метилпиперидина (МПП) в течение 10 мин.2) Removal of Fmoc protection with a 20% solution of 4-methylpiperidine (MPP) within 10 minutes
3) Промывка смолы.3) Flushing the resin.
4) Добавление в реактор активированной Fmoc-аминокислоты (см. 5.2.6) в среде ДМФА/г4-метилпирролидон (МП) для присоединения очередной Fmoc-аминокислоты и инкубацией в течение 30 мин.4) Adding activated Fmoc amino acid to the reactor (see 5.2.6) in DMF / g4-methylpyrrolidone (MP) medium to add another Fmoc amino acid and incubation for 30 min.
5) Промывка смолы.5) Flushing the resin.
6) Анализ на полноту реакции присоединения нингидриновым методом (см. пункт 5.2.9),6) Analysis of the completeness of the addition reaction by the ninhydrin method (see paragraph 5.2.9),
Затем операции по пунктам 2-6 повторяются. Если нингидриновый тест показывает наличие свободной аминогруппы (окрашивание зерен смолы), то операции по пунктам 4 и 5 повторяются, пока нингидриновый тест не покажет отрицательной реакции.Then the operations in paragraphs 2-6 are repeated. If the ninhydrin test shows the presence of a free amino group (staining of the resin grains), then the operations in
На фиг. 5 представлена схема цикла основных операций твердофазного синтеза пептида. Использованы следующие обозначения: Fmoc-AA -Fmoc-аминокислота, n=1, 2, 3 и т.д..In FIG. 5 is a diagram of the cycle of basic operations of solid-phase synthesis of a peptide. The following notation is used: Fmoc-AA -Fmoc-amino acid, n = 1, 2, 3, etc.
Нингидриновый тест (анализ полноты реакции конденсации) проводят путем отбора пробы смолы (1-3 мг гранул смолы) в стеклянную пробирку и добавления к ней 0.5 мл раствора нингидрина (2% раствор в н-бутаноле) выдерживанием пробирки в термостате при 110°С 5 мин. Отсутствие окрашивания гранул смолы (малиновый цвет) свидетельствует о полноте (~100%) прохождения реакции. При наличии окрашивания гранул реакцию конденсации (п. 3) повторяют.The ninhydrin test (analysis of the completeness of the condensation reaction) is carried out by taking a resin sample (1-3 mg of resin granules) in a glass tube and adding 0.5 ml of ninhydrin solution (2% solution in n-butanol) to it by keeping the tube in an incubator at 110 °
Количества реагентов рассчитаны на синтез LTP, исходя из загрузки в реактор 3,0 г смолы Fmoc-RinkAmide (1.74 ммоль Fmoc - из расчета 0,58 ммоля/г смолы, фирма AnaSpec).The amounts of reagents were calculated for LTP synthesis based on loading 3.0 g of Fmoc-RinkAmide resin into the reactor (1.74 mmol Fmoc - based on 0.58 mmol / g resin, AnaSpec).
Arg8Lys4Lys2LysAla-Cys-NH2 Arg 8 Lys 4 Lys 2 LysAla-Cys-NH 2
После последней конденсации (присоединения Fmoc-Arg(Pbf)-OH) стандартную промывку дополняют промывкой этанолом и диэтиловым эфиром и затем высушиванием конечной Fmoc-пептидил-смолы в вакууме до постоянного веса.After the last condensation (addition of Fmoc-Arg (Pbf) -OH), the standard washing is supplemented by washing with ethanol and diethyl ether and then drying the final Fmoc-peptidyl resin in vacuo to constant weight.
Отщепление пептида от смолы проводят в отдельном сосуде путем перемешивания суспензии высушенной Fmoc-пептидил-смолы в смеси 2,25 г кристаллического фенола, 0,75 мл 1,2-этандитиола, 1,5 мл тиоанизола, 1,5 мл диет, воды и 30 мл трифторуксусной кислоты в течение 3 часов при комнатной температуре. Затем суспензию фильтруют через стеклянную фильтровальную воронку с плотным пористым диском (№3) в круглодонную колбу. Осадок на фильтре дополнительно промывают небольшими порциями этанола и объединенный фильтрат, содержащий пептид, смешивают с 200 мл сухого диэтилового эфира. В результате последней операции образуется осадок, суспензию отстаивают, надосадочную жидкость декантируют и сливают в отходы. Остаток опять суспендируют в 100 мл диэтилового эфира, суспензию отстаивают, надосадочную жидкость декантируют и сливают в отходы. Остаток высушивают в вакууме и растворяют в 50 мл уксусной кислоты для экстракции свободного пептида и сырой экстракт фильтруют через стеклянный фильтр №3. Полученный фильтрат высушивают лиофильно (сублимационная сушка), получая в итоге сырой пептид.The peptide is cleaved from the resin in a separate vessel by mixing a suspension of dried Fmoc-peptidyl resin in a mixture of 2.25 g of crystalline phenol, 0.75 ml of 1,2-ethanedithiol, 1.5 ml of thioanisole, 1.5 ml of diets, water and 30 ml trifluoroacetic acid for 3 hours at room temperature. Then the suspension is filtered through a glass filter funnel with a dense porous disk (No. 3) into a round bottom flask. The filter cake was further washed with small portions of ethanol and the combined peptide containing filtrate was mixed with 200 ml of dry diethyl ether. As a result of the last operation, a precipitate forms, the suspension is settled, the supernatant is decanted and poured into waste. The residue is again suspended in 100 ml of diethyl ether, the suspension is sedimented, the supernatant is decanted and discarded. The residue was dried in vacuo and dissolved in 50 ml of acetic acid to extract the free peptide, and the crude extract was filtered through a No. 3 glass filter. The resulting filtrate is freeze-dried (freeze-drying), resulting in a crude peptide.
Первичную очистку сырого пептида проводят путем гель-проникающей хроматографии, используя стеклянную колонку ПСК24/500 (диаметр 24 мм, длина 500 мм) с наполнителем Toyopearl HW-40 (сшитый гидроксилированный метакрилатный полимер), используя в качестве подвижной фазы 0,1% водный раствор аммиака, скорость потока 60 мл/час. Фракции вещества, выходящие с колонки, детектируют с помощью спектрофотометрического детектора при длине волны 254 нм. В колонку вносят фильтрованный (0,45 мкм фильтр) раствор 120 мг сырого пептида в 4 мл 0,1% водном растворе аммиака с концентрацией (30 мг/мл). Фракцию, соответствующую первому пику (зона свободного объема колонки), отделяют, замораживают и высушивают лиофильно, получая 84 мг полусырого пептида.The crude peptide is initially purified by gel permeation chromatography using a PSK24 / 500 glass column (
Полусырой пептид очищают путем градиентной высокоэффективной хроматографии (ВЭЖХ), используя препаративную хроматографическую систему, оснащенную препаративной колонкой (250×22 мм), содержащей 10 мкм-сорбент с обращенной С18 фазой (Vydac 218ТР1022), бинарным градиентным насосом, детектором с переменной длиной волны (длина волны установлена на 226 нм), коллектором фракций, самописцем, компьютером для управления насосом, расчета времени удерживания и площади пиков. Температура колонки поддерживается на уровне комнатной, скорость потока 10 мл/мин.The semi-crude peptide was purified by high performance gradient chromatography (HPLC) using a preparative chromatographic system equipped with a preparative column (250 × 22 mm) containing a 10 μm sorbent with reversed C18 phase (Vydac 218TP1022), a binary gradient pump, a variable wavelength detector ( the wavelength is set to 226 nm), fraction collector, recorder, computer for pump control, calculation of retention time and peak area. The column temperature is maintained at room temperature, a flow rate of 10 ml / min.
Состав подвижной фаза изменяется во времени согласно ниже приведенной диаграмме и таблице (таблица 3).The composition of the mobile phase varies over time according to the following diagram and table (table 3).
Хроматограмма полусырого пептида показывает наличие трех мажорных фракций (пиков). Данные масс-спектрометрии показывали, что фракция, содержащая требуемый пептид LTP с мол. массой 2338, соответствует пику с временем удерживания около 10 мин. Фракцию с временем удерживания 9,975 мин выделяли, высушивали лиофильно и сухой остаток повторно хроматографировали в тех же условиях. Аналитическая хроматограмма показывала один пик с временем удерживания около 10 мин (фиг. 2). Содержание пептида определяют по относительной площади пика к суммарной площади всех пиков.The chromatogram of a half-baked peptide shows the presence of three major fractions (peaks). Mass spectrometry data showed that the fraction containing the desired LTP peptide with a mol. mass 2338, corresponds to a peak with a retention time of about 10 minutes A fraction with a retention time of 9.975 min was isolated, lyophilized and the dry residue was rechromatographed under the same conditions. An analytical chromatogram showed one peak with a retention time of about 10 minutes (FIG. 2). The peptide content is determined by the relative peak area to the total area of all peaks.
Анализ гомогенности пептида проводят на той же хроматографической системе, используя аналитическую ВЭЖХ-колонку (5 мкм-сорбент Vydac 218ТР54, размеры колонки 4,6×250 мм). Содержание основного пика (площадь), время удерживания около 10 мин должно быть не менее 93%.The analysis of the homogeneity of the peptide is carried out on the same chromatographic system using an analytical HPLC column (5 μm sorbent Vydac 218TP54, column size 4.6 × 250 mm). The content of the main peak (area), the retention time of about 10 minutes should be at least 93%.
Подтверждение подлинности структуры пептида проводят следующим образом. Анализ проводят путем масс-спектрометрии, используя метод МАЛДИ (MALDI), матрично-активированную лазерную десорбцию/ионизацию. Масс-спектр очищенного пептида должен показывать преимущественное наличие молекулярного иона с m/z=2338±1 Да (фиг. 3).Verification of the authenticity of the structure of the peptide is carried out as follows. The analysis is carried out by mass spectrometry using the MALDI method (MALDI), matrix-activated laser desorption / ionization. The mass spectrum of the purified peptide should show the predominant presence of a molecular ion with m / z = 2338 ± 1 Da (Fig. 3).
Пример 2Example 2
Взаимодействие катионного дендримерного пептида LTP с нуклеиновыми кислотами.The interaction of the cationic dendrimer peptide LTP with nucleic acids.
О способности дендримерного пептида LTP взаимодействовать с НК можно судить по данным электронной микроскопии, путем сравнения микрофотографий пептида LTP и электростатического комплекса LTP/HK. Для этого были получены микрофотографии раствора LTP в концентрации 1,12 мкг/мл в стерильном физиологическом растворе (ПанЭко, Россия) и микрофотокрафии смеси LTP с НК, концентрацией 1,12 мкг/мл (для LTP) + 0,02 мкг/мг (для НК), где в качестве НК выступала плазмида pGL3 (Invitrogen, США). Анализ микрофотографий позволят судить об увеличении размера частиц, запечатленных в смеси LTP с НК в сравнении с LTP. По всей видимости, такое увеличение в размерах частиц происходит за счет взаимодействия LTP с плазмидной ДНК (pGL3) (фиг. 6). Таким образом, можно предположить, что катионный пептид LTP способен взаимодействовать с НК и формировать электростатический комплекс LTP/HK.The ability of the LTP dendrimer peptide to interact with NK can be judged by electron microscopy by comparing microphotographs of the LTP peptide and the LTP / HK electrostatic complex. For this, micrographs of a LTP solution at a concentration of 1.12 μg / ml in sterile physiological solution (PanEco, Russia) and microphotography of a mixture of LTP with NK, a concentration of 1.12 μg / ml (for LTP) + 0.02 μg / mg ( for NK), where the plasmid pGL3 (Invitrogen, USA) acted as NK. The analysis of microphotographs will make it possible to judge the increase in the size of particles imprinted in a mixture of LTP with NC compared with LTP. Apparently, this increase in particle size occurs due to the interaction of LTP with plasmid DNA (pGL3) (Fig. 6). Thus, it can be assumed that the cationic peptide LTP is able to interact with NK and form an electrostatic LTP / HK complex.
Кроме того, о взаимодействии дендримерного пептида LTP с НК можно судить по снижению интенсивности окрашивания плазмидной ДНК (pGL3) красителем этидиум бромидом. Известно, что краситель этидиум бромид окрашивает только свободную ДНК, не связанную ДНК. Для оценки влияния LTP на интенсивность окрашивания ДНК (плазмиды pGL3) был проведен следующий эксперимент. Смешивались различные концентрации пептида LTP с одинаковым количеством 0,5 мкг плазмидной ДНК (pGL3). В качестве контроля использовали 0,5 мкг pGL3 без добавления LTP. После смешивания LTP с pGL3 смесь инкубировали 30 минут при комнатной температуре для образования электростатического комплекса LTP/pGL3. После чего смесь подвергали разделению в 1% агарозном геле, содержащем 10 мкг/мл красителя этидиум бромида. Разделение осуществлялось при напряжении 80V в течение 1 часа. При этом свободная ДНК (заряженная отрицательно) двигалась к катоду (сверху вниз на фиг. 7), и при движении ДНК через гель происходило ее окрашивание этидиум бромидом, находящимся в составе геля. В то же время если происходит взаимодействие LTP с ДНК и образование электростатического комплекса LTP/ДНК, то ДНК в составе данного комплекса окрашиваться не будет. В результате оказалось, что по мере увеличения концентрации LTP в комплексе LTP/pGL3 происходит снижение интенсивности окраски ДНК (дорожки 3-10 на фиг. 7), что свидетельствует о уменьшении количества несвязавшейся ДНК в образцах (фиг. 5). Окраска ДНК отсутствует на дорожках 6-10 (фиг. 5), что свидетельствует об отсутствии несвязавшейся ДНК в данных образцах, т.е. вся ДНК полностью связывается с LTP при R=8 и более.In addition, the interaction of the dendrimer peptide LTP with NK can be judged by the decrease in the intensity of staining of plasmid DNA (pGL3) with dye ethidium bromide. It is known that the dye ethidium bromide stains only free DNA, not bound DNA. The following experiment was conducted to evaluate the effect of LTP on the intensity of DNA staining (plasmid pGL3). Various concentrations of the LTP peptide were mixed with the same amount of 0.5 μg plasmid DNA (pGL3). As a control, 0.5 μg pGL3 was used without the addition of LTP. After mixing LTP with pGL3, the mixture was incubated for 30 minutes at room temperature to form an electrostatic LTP / pGL3 complex. After which the mixture was subjected to separation in 1% agarose gel containing 10 μg / ml of dye ethidium bromide. Separation was carried out at a voltage of 80V for 1 hour. In this case, free DNA (negatively charged) moved to the cathode (from top to bottom in Fig. 7), and when the DNA moved through the gel, it was stained with ethidium bromide contained in the gel. At the same time, if LTP interacts with DNA and the formation of an electrostatic LTP / DNA complex, then the DNA in this complex will not be stained. As a result, it turned out that as the LTP concentration in the LTP / pGL3 complex increases, the DNA color intensity decreases (lanes 3-10 in Fig. 7), which indicates a decrease in the amount of unbound DNA in the samples (Fig. 5). DNA staining is absent in lanes 6-10 (Fig. 5), which indicates the absence of unbound DNA in these samples, i.e. all DNA fully binds to LTP at R = 8 or more.
Дорожка 1 соответствует 0,5 мкг плазмидной ДНК - pGL3. Дорожки 2-10 соответствуют комплексу LTP/pGL3, состоящему из 0,5 мкг pGL3 и LTP при различной величине R (дорожка 2 - R=0,5; дорожка 3 - R=1; дорожка 4 - R=2; дорожка 5 - R=4; дорожка 6 - R=8; дорожка 7 - R=16; дорожка 8 - R=32; дорожка 8 - R=62; дорожка 9 - R=128; дорожка 10 - R=256). R - соотношение количества позитивных зарядов LTP к количеству отрицательных зарядов плазмидной ДНК pGL3 в комплекса LTP/pGL3.
Пример 3Example 3
Эффективная трансфекция различных типов клеток млекопитающих с помощью катионного дендримерного пептида LTP.Effective transfection of various types of mammalian cells using the cationic dendrimer peptide LTP.
О способности катионного пептида LTP трансфецировать различные типы клеток свидетельствуют данные экспериментов in vitro. Для анализа трансфекционной активности катионный пептид в смешивали с плазмидной ДНК (pGL3), несущей репортерный ген люциферазы в различных соотношениях позитивного заряда LTP к отрицательному заряду молекул ДНК (величина R). Смесь пептида LTP и 0,2 мкг pGL3 готовили в объеме 80 мкл питательной среды optiMEM, после чего инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут для образования электростатического комплекса LTP/pGL3. После этого раствор комплекса вносили в различные типы клеток, подготовленные заранее. В экспериментах использовали следующие типы клеток млекопитающих различного происхождения: НЕК293Т - эмбриональная почка человека в количестве 75000 клеток, HelaHI - эпителиоидная карцинома шейки матки в количестве 75000 клеток, А549 - карцинома легкого в количестве 75000 клеток, МТ4 - Τ-клетки человека, выделенные от пациента с Т-клеточной лейкемией в количестве 300000 клеток, не стимулированные клетки селезенки мышей линии BALB/c в количестве 1000000 клеток. В качестве положительного контроля использовали коммерческий реагент липосомной природы Lipofectamine200 (Invitrogen, США). После внесения образов в клетки их инкубировали в течение 2 суток при температуре 37С в 5% атмосфере СO2. После инкубации клетки лизировали в 70-300 мкл буфера GLO lysis buffer (Promega, США) в течение 5-10 минут при комнатной температуре, после чего лизаты клеток центрифугировали при 10000 оборотах в минуту в течение 3-5 минут для осаждения клеточного дебриза. Надосадок в количестве 50 мкл отбирали в отдельные микропробирки для последующего анализа на количественное содержание в них фермента люциферазы. Для этого к 50 мкл лизата добавляли реагент люциферин (Promega, США) в количестве 50 мкл после чего полученная смесь излучала свет, интенсивность которого детектировалась с использование люминометра (Promega, США). Чем выше интенсивность свечения образца, тем выше содержание в нем фермента люциферазы, который экспрессируется после проникновения в клетки плазмидной ДНК - pGL3. Т.е. чем выше интенсивность излучения, тем выше трансфекционная активность образца.The ability of the cationic peptide LTP to transfect various types of cells is evidenced by in vitro experiments. To analyze the transfection activity, the cationic peptide was mixed with plasmid DNA (pGL3) carrying the luciferase reporter gene in different ratios of the positive charge of LTP to the negative charge of DNA molecules (R value). A mixture of LTP peptide and 0.2 μg pGL3 was prepared in a volume of 80 μl of optiMEM culture medium, and then incubated at room temperature for 30 minutes to form an electrostatic LTP / pGL3 complex. After this, the solution of the complex was introduced into various types of cells prepared in advance. The following types of mammalian cells of various origins were used in the experiments: HEK293T - human embryonic kidney in the amount of 75,000 cells, HelaHI - epithelioid carcinoma of the cervix in the amount of 75,000 cells, A549 - lung carcinoma in the amount of 75,000 cells, MT4 - human Τ cells isolated from the patient with T-cell leukemia in the amount of 300,000 cells, non-stimulated spleen cells of BALB / c mice in the amount of 1,000,000 cells. A commercial liposome reagent Lipofectamine200 (Invitrogen, USA) was used as a positive control. After introducing the images into the cells, they were incubated for 2 days at a temperature of 37C in a 5% CO 2 atmosphere. After incubation, the cells were lysed in 70-300 μl of GLO lysis buffer (Promega, USA) for 5-10 minutes at room temperature, after which the cell lysates were centrifuged at 10,000 rpm for 3-5 minutes to precipitate cell debris. The supernatant in an amount of 50 μl was taken into separate microtubes for subsequent analysis on the quantitative content of the luciferase enzyme in them. For this, luciferin reagent (Promega, USA) was added to 50 μl of the lysate in an amount of 50 μl, after which the resulting mixture emitted light, the intensity of which was detected using a luminometer (Promega, USA). The higher the luminescence intensity of the sample, the higher the content of the luciferase enzyme, which is expressed after penetration of plasmid DNA - pGL3 into the cells. Those. the higher the radiation intensity, the higher the transfection activity of the sample.
В экспериментах по трансфекции культуры клеток HEK293Т показано, что активность LTP была сравнима с коммерческим реагентом Lipofectamine2000. Оптимальное соотношение R находилось в пределах от 96 до 254 (фиг. 8). При трансфекции клеток HelaHI также наблюдалась выраженная трансфекционная активность LTP с оптимальной величиной R в пределах от 48 до 254 (фиг. 9). При изучении эффективности трансфекции клеток А549 показано, что оптимальное соотношение (R) находится в пределах от 32 до 254 (фиг. 10). При изучении эффективности трансфекции клеток МТ4 показано, что оптимальная соотношение (R) находится в пределах от 24 до 96 (фиг. 11). Также дендримерный катионный пептид LTP способен трансфецировать нестимулированные клетки селезенки мышей линии BALB/c (фиг. 12) с оптимальным R от 32 до 96.In experiments on transfection of HEK293T cell culture, it was shown that LTP activity was comparable to the commercial Lipofectamine2000 reagent. The optimal ratio of R was in the range from 96 to 254 (Fig. 8). During transfection of HelaHI cells, pronounced transfection activity of LTP was also observed with an optimal R value ranging from 48 to 254 (Fig. 9). When studying the efficiency of transfection of A549 cells, it was shown that the optimal ratio (R) is in the range from 32 to 254 (Fig. 10). When studying the efficiency of transfection of MT4 cells, it was shown that the optimal ratio (R) is in the range from 24 to 96 (Fig. 11). Also, the dendrimer cationic peptide LTP is capable of transfecting unstimulated spleen cells of BALB / c mice (Fig. 12) with an optimal R from 32 to 96.
На фиг. 8 представлена диаграмма эффективности трансфекции клеток 293Т с использованием LTP, гдеIn FIG. 8 is a diagram of the efficiency of transfection of 293T cells using LTP, where
R - соотношение количества положительных зарядов LTP к количеству отрицательных зарядов плазмиды pGL3;R is the ratio of the number of positive charges of LTP to the number of negative charges of plasmid pGL3;
pLuc - плазмида pGL3, кодирующая ген люциферазы luc;pLuc — plasmid pGL3 encoding the luc luciferase gene;
LU - световые единицы (light units);LU - light units;
# - достоверно отличает от Lf2000 (Lipofectamine2000 (Invitrogen, США), использованный в качестве положительного контроля);# - significantly distinguishes from Lf2000 (Lipofectamine2000 (Invitrogen, USA), used as a positive control);
× - достоверно отличается от pLuc (плазмида pGL3 без каких-либо трансфекционных реагентов).× - significantly different from pLuc (plasmid pGL3 without any transfection reagents).
На фиг. 9 приняты следующие обозначения:In FIG. 9 the following notation is accepted:
R - соотношение количества положительных зарядов LTP к количеству отрицательных зарядов плазмиды pGL3;R is the ratio of the number of positive charges of LTP to the number of negative charges of plasmid pGL3;
pLuc - плазмида pGL3, кодирующая ген люциферазы luc.pLuc is the pGL3 plasmid encoding the luciferase gene luc.
LU - световые единицы (light units);LU - light units;
Lf2000 - Lipofectamine2000 (Invitrogen, США), используется в качестве положительного контроля;Lf2000 - Lipofectamine2000 (Invitrogen, USA), used as a positive control;
× - достоверно отличается от pLuc (плазмида pGL3 без каких-либо трансфекционных реагентов).× - significantly different from pLuc (plasmid pGL3 without any transfection reagents).
На фиг. 10, представляющей собой диаграмму эффективности трансфекции клеток А549 с использованием LTP, приняты следующие обозначения:In FIG. 10, which is a diagram of the efficiency of transfection of A549 cells using LTP, the following notation:
R - соотношение количества положительных зарядов LTP к количеству отрицательных зарядов плазмиды pGL3;R is the ratio of the number of positive charges of LTP to the number of negative charges of plasmid pGL3;
pLuc - плазмида pGL3, кодирующая ген люциферазы luc;pLuc — plasmid pGL3 encoding the luc luciferase gene;
LU - световые единицы (light units);LU - light units;
Lf2000 - Lipofectamine2000 (Invitrogen, США), используется в качестве положительного контроля;Lf2000 - Lipofectamine2000 (Invitrogen, USA), used as a positive control;
* - достоверно отличается от pLuc (плазмида pGL3 без каких-либо трансфекционных реагентов).* - significantly different from pLuc (plasmid pGL3 without any transfection reagents).
На фиг. 11 представлена диаграмма эффективности трансфекции клеток МТ4 с использованием LTP, гдеIn FIG. 11 is a graph of MT4 cell transfection efficiency using LTP, where
R - соотношение количества положительных зарядов LTP к количеству отрицательных зарядов плазмиды pGL3;R is the ratio of the number of positive charges of LTP to the number of negative charges of plasmid pGL3;
pLuc - плазмида pGL3, кодирующая ген люциферазы luc;pLuc — plasmid pGL3 encoding the luc luciferase gene;
LU - световые единицы (light units);LU - light units;
Lf2000 - Lipofectamine2000 (Invitrogen, США), используется в качестве положительного контроля;Lf2000 - Lipofectamine2000 (Invitrogen, USA), used as a positive control;
× - достоверно отличается от pLuc (плазмида pGL3 без каких-либо трансфекционных реагентов).× - significantly different from pLuc (plasmid pGL3 without any transfection reagents).
На фиг. 12 представлена диаграмма эффективности трансфекции нестимулированных клеток селезенки мыши с использованием LTP, гдеIn FIG. 12 is a performance chart of transfection of unstimulated mouse spleen cells using LTP, where
R - соотношение количества положительных зарядов LTP к количеству отрицательных зарядов плазмиды pGL3;R is the ratio of the number of positive charges of LTP to the number of negative charges of plasmid pGL3;
pLuc - плазмида pGL3, кодирующая ген люциферазы luc;pLuc — plasmid pGL3 encoding the luc luciferase gene;
LU - световые единицы (light units);LU - light units;
Lf2000 - Lipofectamine2000 (Invitrogen, США), используется в качестве положительного контроля;Lf2000 - Lipofectamine2000 (Invitrogen, USA), used as a positive control;
× - достоверно отличается от pLuc (плазмида pGL3 без каких-либо трансфекционных реагентов).× - significantly different from pLuc (plasmid pGL3 without any transfection reagents).
Таким образом, суммировав результаты трансфекции пяти различных типов клеток, можно заключить, что наиболее оптимальное соотношение LTP и НК находится в пределах от 24 до 96. Использование данных соотношений позволяет эффективно трансфецировать различные типы клеток.Thus, summarizing the results of transfection of five different types of cells, we can conclude that the most optimal ratio of LTP and NK is in the range from 24 to 96. Using these ratios allows you to efficiently transfect different types of cells.
Пример 4Example 4
Катионный дендримерный пептид LTP является малотоксичным соединением.The cationic dendrimer peptide LTP is a low toxicity compound.
Катионный пептид LTP является малотоксичным соединением, о чем свидетельствуют данные, полученные в МТТ-тесте с использованием культуры клеток НЕК293Т (эмбриональная почка человека). Для изучения токсичности LTP в МТТ-тесте клетки НЕК293Т засевали в 96-луночный планшет (Costar, США) в 100 мкл полной питательной среды ДМЕМ (Gibco, США) в количестве 30000 клеток/лунку и инкубировали его в СO2-инкубаторе при температуре 37°C в течение 1 суток для образования монослоя клеток. После этого в клетки вносили 8 двоичных разведений пептида LTP, начиная с концентрации 3 мг/мл, и инкубировали совместно с клетками в течение 1 суток в тех же условиях. После инкубации к клеткам добавляли краситель МТТ (Sigma, США) в объеме 50 мкл и инкубировали в тех же условиях в течение 4 часов. При этом краситель окрашивал жизнеспособные клетки, таким образом интенсивность окраски лунок, в которых происходила гибель клеток, снижалась. Для высвобождения красителя из клеток в питательный раствор клетки лизировали добавлением 50 мкл раствора SDS с последующей инкубацией в течение суток в тех же условиях. Интенсивность окраски раствора в лунках измеряли с помощью планшетного фотометра (BioRad, США) при длинах волн 570 и 610 нм. В итоге по данным МТТ-теста ЛД50 для LTP колеблется в пределах 800-1500 мкг/мл. В то же время липосомные трансфекционные соединения более токсичны, их ЛД50 колеблется в пределах 7-40 мкг/мл. Таким образом заявленное изобретение - LTP является малотоксичным соединением.The cationic peptide LTP is a low-toxic compound, as evidenced by the data obtained in the MTT test using cell culture HEK293T (human embryonic kidney). To study the toxicity of LTP in the MTT test, HEK293T cells were seeded in a 96-well plate (Costar, USA) in 100 μl of a complete medium of DMEM (Gibco, USA) in the amount of 30,000 cells / well and incubated in a CO 2 incubator at a temperature of 37 ° C for 1 day to form a monolayer of cells. After that, 8 binary dilutions of the LTP peptide were introduced into the cells, starting from a concentration of 3 mg / ml, and incubated together with the cells for 1 day under the same conditions. After incubation, MTT dye (Sigma, USA) was added to the cells in a volume of 50 μl and incubated under the same conditions for 4 hours. In this case, the dye stained viable cells, thus, the color intensity of the wells in which the cell death occurred decreased. To release the dye from the cells into the nutrient solution, the cells were lysed by adding 50 μl of SDS solution, followed by incubation for a day under the same conditions. The color intensity of the solution in the wells was measured using a plate photometer (BioRad, USA) at wavelengths of 570 and 610 nm. As a result, according to the MTT test, the LD 50 for LTP ranges from 800-1500 μg / ml. At the same time, liposome transfection compounds are more toxic, their LD 50 ranges from 7-40 μg / ml. Thus, the claimed invention - LTP is a low toxicity compound.
Таким образом, вышеизложенное подтверждает, что заявленное изобретение обеспечивает транспорт молекул нуклеиновых кислот в цитоплазму и ядро различных типов клеток млекопитающих.Thus, the foregoing confirms that the claimed invention provides the transport of nucleic acid molecules into the cytoplasm and nucleus of various types of mammalian cells.
Заявленное изобретение относится к классу малотоксичных соединений.The claimed invention relates to the class of low toxic compounds.
Заявленное изобретение в дальнейшем может быть использовано в качестве нетоксичного носителя молекул ДНК и РНК в составе генно-терапевтических лекарственных средств для лечения различных заболеваний.The claimed invention can be further used as a non-toxic carrier of DNA and RNA molecules in the composition of gene-therapeutic drugs for the treatment of various diseases.
Claims (2)
и при отношении количества положительных зарядов катионного дендримерного пептида к количеству фосфатных групп нуклеиновых кислот от 24 до 96 эффективно проникает в различные типы клеток.1. A means for intracellular delivery of nucleic acids to mammalian cells, which is a cationic dendrimer peptide, characterized in that it contains 8 residues of arginine, 7 residues of lysine, alanine and cysteine with the structural formula:
and when the ratio of the number of positive charges of the cationic dendrimer peptide to the number of phosphate groups of nucleic acids from 24 to 96 effectively penetrates into various types of cells.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2014144069/10A RU2572575C1 (en) | 2014-10-31 | 2014-10-31 | Mean for intracellular delivery of nucleic acids to cells of mammals |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2014144069/10A RU2572575C1 (en) | 2014-10-31 | 2014-10-31 | Mean for intracellular delivery of nucleic acids to cells of mammals |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2572575C1 true RU2572575C1 (en) | 2016-01-20 |
Family
ID=55086980
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2014144069/10A RU2572575C1 (en) | 2014-10-31 | 2014-10-31 | Mean for intracellular delivery of nucleic acids to cells of mammals |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2572575C1 (en) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2620170C1 (en) * | 2016-08-02 | 2017-05-23 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научный центр "Институт иммунологии" Федерального медико-биологического агентства России | Application of cationic peptides for human melanoma cells death induction |
| RU2710895C1 (en) * | 2018-11-21 | 2020-01-14 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научный центр "Институт иммунологии" Федерального медико-биологического агентства России (ФГБУ "ГНЦ Институт иммунологии" ФМБА России) | Composition inhibiting expression of interleukin-4 and interleukin-13 genes for therapy of allergic rhinitis |
| RU2771605C2 (en) * | 2020-10-26 | 2022-05-06 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научный центр "Институт иммунологии" Федерального медико-биологического агентства России (ФГБУ "ГНЦ Институт иммунологии" ФМБА России) | Peptides for intracellular delivery of nucleic acids |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6376248B1 (en) * | 1997-03-14 | 2002-04-23 | Life Technologies, Inc. | Peptide-enhanced transfections |
| RU2522810C1 (en) * | 2012-12-21 | 2014-07-20 | Антон Вячеславович КИСЕЛЕВ | Carrier for targeted delivery of nucleic acids to cells expressing receptor cxcr4 |
-
2014
- 2014-10-31 RU RU2014144069/10A patent/RU2572575C1/en active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6376248B1 (en) * | 1997-03-14 | 2002-04-23 | Life Technologies, Inc. | Peptide-enhanced transfections |
| RU2522810C1 (en) * | 2012-12-21 | 2014-07-20 | Антон Вячеславович КИСЕЛЕВ | Carrier for targeted delivery of nucleic acids to cells expressing receptor cxcr4 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| LUO К. et al., Peptide dendrimers as efficient and biocompatible gene delivery vectors: Synthesis and in vitro characterization, J. Control Release, 2011, v.155, n.1, p. 77-87. * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2620170C1 (en) * | 2016-08-02 | 2017-05-23 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научный центр "Институт иммунологии" Федерального медико-биологического агентства России | Application of cationic peptides for human melanoma cells death induction |
| RU2710895C1 (en) * | 2018-11-21 | 2020-01-14 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научный центр "Институт иммунологии" Федерального медико-биологического агентства России (ФГБУ "ГНЦ Институт иммунологии" ФМБА России) | Composition inhibiting expression of interleukin-4 and interleukin-13 genes for therapy of allergic rhinitis |
| RU2771605C2 (en) * | 2020-10-26 | 2022-05-06 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научный центр "Институт иммунологии" Федерального медико-биологического агентства России (ФГБУ "ГНЦ Институт иммунологии" ФМБА России) | Peptides for intracellular delivery of nucleic acids |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Wang et al. | Construction of cell penetrating peptide vectors with N-terminal stearylated nuclear localization signal for targeted delivery of DNA into the cell nuclei | |
| Wiradharma et al. | Self-assembled oligopeptide nanostructures for co-delivery of drug and gene with synergistic therapeutic effect | |
| Wan et al. | Multifunctional peptide-lipid nanocomplexes for efficient targeted delivery of DNA and siRNA into breast cancer cells | |
| Kozhikhova et al. | A novel peptide dendrimer LTP efficiently facilitates transfection of mammalian cells | |
| KR101581926B1 (en) | self-assembly peptide nano-capsule and drug-delivery carrier comprising the same | |
| EP2491952A1 (en) | A system for cargo delivery into the cells | |
| KR101447901B1 (en) | Adipocyte targeted non-viral gene delivery system | |
| CN105624192B (en) | Preparation of breast cancer cell strain capable of stably secreting near-infrared fluorescence labeled exosomes | |
| RU2572575C1 (en) | Mean for intracellular delivery of nucleic acids to cells of mammals | |
| CN108250267A (en) | A kind of polypeptide, the common assembly of polypeptide-siRNA inductions and application thereof | |
| Begum et al. | Bombesin/oligoarginine fusion peptides for gastrin releasing peptide receptor (GRPR) targeted gene delivery | |
| Weiss et al. | Intracellular peptide delivery using amphiphilic lipid‐based formulations | |
| CN116162132A (en) | Cyclic polypeptide vector for efficient delivery of nucleic acids and variants thereof | |
| US11618901B2 (en) | Anti-miRNA carrier conjugated with a peptide binding to a cancer cell surface protein and use thereof | |
| JP2024505744A (en) | Ionizable cationic lipid analog materials and their application as drug delivery carriers | |
| Rosli et al. | Peptide based DNA nanocarriers incorporating a cell-penetrating peptide derived from neurturin protein and poly-L-lysine dendrons | |
| WO2021045210A1 (en) | Ferritin enclosing peptide | |
| Jung et al. | PAMAM dendrimer conjugated with n-terminal oligopeptides of mouse fibroblast growth factor 3 as a novel gene carrier | |
| CN110003311B (en) | New application of polypeptide Ahf-caltide | |
| Zabel et al. | siRNA Therapeutics for Protein Misfolding Diseases of the Central Nervous System | |
| Ryu et al. | Efficient and safe small RNA delivery to macrophage using peptide‐based nanocomplex | |
| Sun et al. | New amphiphilic N-phosphoryl oligopeptides designed for gene delivery | |
| RU2771605C2 (en) | Peptides for intracellular delivery of nucleic acids | |
| JP6840914B2 (en) | A method for intracellularly transporting peptides, constructs, and cargo molecules having cell membrane permeability. | |
| KR20080041037A (en) | Complex of protein transduction peptide and small interference rna and use thereof |