RU2522810C1

RU2522810C1 - Carrier for targeted delivery of nucleic acids to cells expressing receptor cxcr4

Info

Publication number: RU2522810C1
Application number: RU2012158198/10A
Authority: RU
Inventors: Анна Алексеевна ЕГОРОВА; Мария Сергеевна БОГАЧЕВА; Анастасия Николаевна ШУБИНА; Владислав Сергеевич БАРАНОВ; Антон Вячеславович КИСЕЛЕВ
Original assignee: Антон Вячеславович КИСЕЛЕВ; Общество с ограниченной ответственностью "Биогармония" (ООО "Биогармония")
Priority date: 2012-12-21
Filing date: 2012-12-21
Publication date: 2014-07-20
Also published as: RU2012158198A

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: carrier is proposed for targeted delivery of nucleic acids to cells expressing the receptor CXCR4, which consists of a sequence-ligand to the receptor CXCR4 with the amino acid sequence KPVSLSYRSPSRFFESH, the linker part of two molecules of ε-aminohexanoic acid linking the sequence-ligand to the sequence for compaction of nucleic acids, the sequence providing compaction of nucleic acids and the complex output from endosomes CHRRRRRRHC.

EFFECT: invention can be used for targeted delivery of genetic structures into cells with the receptor CXCR4 on the surfaces, such as malignant tumour and stem cells, in order to correct genetic defects, influence on processes of implementation of the genetic information and prevention of diseases.

3 cl, 7 dwg, 4 ex

Description

Данное изобретение относится к генной терапии, нано- и биотехнологии, фармацевтике, медицине и может быть использовано для доставки генетических конструкций в клетки с целью нормализации, ослабления или ликвидации патологического процесса, полного или частичного восстановления поврежденных или утраченных функций клеток, тканей и органов. Тканеспецифичность доставки генных конструкций обеспечивается благодаря использованию лигандных последовательностей к рецептору CXCR4.This invention relates to gene therapy, nano- and biotechnology, pharmaceuticals, medicine and can be used to deliver genetic constructs to cells in order to normalize, weaken or eliminate the pathological process, complete or partial restoration of damaged or lost functions of cells, tissues and organs. Tissue-specific delivery of gene constructs is achieved through the use of ligand sequences to the CXCR4 receptor.

Генную терапию от подходов традиционной медицины отличает то, что она ориентирована на борьбу с причиной заболевания, а не с симптомами или последствиями болезни, как в случае традиционной медицины. Первоначально генную терапию рассматривали как возможность коррекции дефекта в гене при моногенных заболеваниях путем замены мутантного фрагмента. В экспериментах на трансгенных животных было показано, что более продуктивным подходом может являться введение пациенту полноценно работающей копии гена. В настоящее время наряду с "терапевтическими" генами в клинических испытаниях применяют олигонуклеотидные последовательности ДНК и РНК. Так, перспективным направлением генной терапии является доставка антисмысловых нуклеотидов, в том числе малых интерферирующих РНК (миРНК), с целью направленной регуляции активности определенных генов.What distinguishes gene therapy from traditional medicine approaches is that it focuses on combating the cause of the disease, rather than on the symptoms or consequences of the disease, as is the case with traditional medicine. Initially, gene therapy was considered as the possibility of correcting a defect in a gene in monogenic diseases by replacing a mutant fragment. In experiments on transgenic animals, it was shown that the introduction of a fully working copy of the gene to the patient may be a more productive approach. Currently, along with the “therapeutic” genes, oligonucleotide DNA and RNA sequences are used in clinical trials. So, a promising area of gene therapy is the delivery of antisense nucleotides, including small interfering RNAs (siRNAs), with the goal of targeted regulation of the activity of certain genes.

Инъекции конструкций "голой" (naked) плазмидной ДНК были одним из первых подходов при разработке стратегии генотерапевтического лечения. В начале 90-х годов Вульфом с соавторами было показано, что инъекция плазмидной конструкции, содержащей маркерный ген lacZ, в мышцу мыши приводит к проникновению плазмиды в клетку и экспрессии гена β-галактозидазы в миофибриллах (Wolff JA, Malone RW, Williams P, Chong W, Acsadi G, Jani A, Felgner PL. Direct gene transfer into mouse muscle in vivo // Science. 1990; 247: 1465-1468). Однако основными недостатками введения "голой" плазмидной ДНК являются низкая эффективность проникновения в клетки и краткосрочность экспрессии введенных конструкций в большинстве органов и тканей. Низкая эффективность трансфекции с использованием незащищенных генетических конструкций послужила толчком к разработке методов доставки нуклеиновых кислот. В разрабатываемых подходах к доставке генетических конструкций можно выделить несколько основных направлений: использование вирусных векторов и невирусные способы доставки, включающие в себя физические способы и невирусные носители.Injection of naked plasmid DNA constructs was one of the first approaches in developing a gene therapy treatment strategy. In the early 90s, Wulf et al. Showed that injection of a plasmid construct containing the lacZ marker gene into mouse muscle leads to the penetration of the plasmid into the cell and expression of the β-galactosidase gene in myofibrils (Wolff JA, Malone RW, Williams P, Chong W, Acsadi G, Jani A, Felgner PL. Direct gene transfer into mouse muscle in vivo // Science. 1990; 247: 1465-1468). However, the main disadvantages of introducing naked plasmid DNA are the low penetration efficiency into cells and the short-term expression of the introduced constructs in most organs and tissues. The low transfection efficiency using unprotected genetic constructs led to the development of nucleic acid delivery methods. In the developed approaches to the delivery of genetic constructs, several main directions can be distinguished: the use of viral vectors and non-viral delivery methods, including physical methods and non-viral carriers.

Вирусопосредованный перенос является высокоэффективным способом доставки нуклеиновых кислот, благодаря естественному механизму проникновения в клетки-мишени и способности защитить геном от разрушения внутриклеточными ферментами. К достоинствам данного вида векторов относится прежде всего тканеспецифичность, способность трансфецировать делящиеся и неделящиеся клетки, обеспечение долговременной экспрессии за счет интеграции в хромосому клетки-хозяина. Наиболее изученными являются векторы, созданные на основе ретровирусов, адено- и адено-ассоциировнных вирусов. Однако данный подход имеет некоторые недостатки. Ретро- и адено-ассоциированные вирусы имеют ограниченный размер клонированного фрагмента ДНК и риск инсерционного мутагенеза при встраивании вируса в геном хозяина. Серьезным недостатком аденовирусных векторов является ярко выраженный иммунный ответ при высоких дозах и повторных введениях аденовирусных конструкций (Walther W., Stein U. Viral vectors for gene transfer: a review of their use in the treatment of human disease // Drugs. - 2000. - V.60. - P.249-271, патент РФ №2252255, C12N 15/37, C12N 15/86, C12N 15/861, C12N 15/867, опубл. 2005.05.20).Virus-mediated transfer is a highly efficient method for delivering nucleic acids, due to the natural mechanism of penetration into target cells and the ability to protect the genome from destruction by intracellular enzymes. The advantages of this type of vectors include, first of all, tissue specificity, the ability to transfect dividing and non-dividing cells, ensuring long-term expression due to integration into the chromosome of the host cell. The most studied are vectors created on the basis of retroviruses, adeno- and adeno-associated viruses. However, this approach has some disadvantages. Retro- and adeno-associated viruses have a limited size of the cloned DNA fragment and the risk of insertional mutagenesis when the virus is inserted into the host genome. A serious drawback of adenoviral vectors is a pronounced immune response at high doses and repeated injections of adenoviral constructs (Walther W., Stein U. Viral vectors for gene transfer: a review of their use in the treatment of human disease // Drugs. - 2000. - V.60. - P.249-271, RF patent No. 2252255, C12N 15/37, C12N 15/86, C12N 15/861, C12N 15/867, publ. 2005.05.20).

На сегодняшний день разработан ряд альтернативных подходов для доставки генетических конструкций в клетки и ткани. К ним относят физические методы доставки и использование комплексов генетических конструкций с невирусными носителями. Наиболее популярными физическими методами доставки нуклеиновых кислот являются метод баллистической трансфекции и метод электропорации. При электропорации используют кратковременные электрические импульсы, приводящие к временной дестабилизации плазматической мембраны и образованию в ней пор, что увеличивает проницаемость клеток для экзогенных молекул, таких как ДНК, РНК. Метод баллистической трансфекции основан на попадании в клетки микрочастиц золота или вольфрама с адсорбированными на их поверхности генетическими конструкциями. Необходимое для попадания в клетки ускорение металлических частиц достигается с помощью электрического разряда или направленного потока гелия. Основными недостатками существующих физических методов трансфекции являются невысокая эффективность и локальность эффекта доставки нуклеиновых кислот. Они позволяют генетическим конструкциям преодолеть клеточную мембрану и избежать включения в эндосомы, предотвращая таким образом энзиматическую деградацию, но, как правило, не обеспечивают длительной персистенции введенных нуклеиновых кислот (Wells D.J. Gene therapy progress and prospects: electroporation and other physical methods // Gene Ther. - 2004. - V.11, №18. - P.1363-1369; Wang S., Joshi S., Lu S. Delivery of DNA to skin by particle bombardment // Methods Mol Biol. - 2004. - V.245. - P.185-196; Herweijer H., Wolff J.A. Progress and prospects: naked DNA gene transfer and therapy // Gene therapy. - 2003. - V.10, №6. - P.453-458).To date, a number of alternative approaches have been developed for the delivery of genetic constructs to cells and tissues. These include physical delivery methods and the use of complexes of genetic constructs with non-viral carriers. The most popular physical methods for delivering nucleic acids are ballistic transfection and electroporation. For electroporation, short-term electrical impulses are used, leading to temporary destabilization of the plasma membrane and the formation of pores in it, which increases the permeability of cells to exogenous molecules such as DNA and RNA. The ballistic transfection method is based on the ingress of gold or tungsten microparticles into cells with genetic constructs adsorbed on their surface. The acceleration of metal particles necessary for getting into the cells is achieved by means of an electric discharge or a directed helium flow. The main disadvantages of existing physical methods of transfection are the low efficiency and locality of the effect of nucleic acid delivery. They allow genetic constructs to cross the cell membrane and avoid incorporation into endosomes, thereby preventing enzymatic degradation, but, as a rule, do not provide long-term persistence of introduced nucleic acids (Wells DJ Gene therapy progress and prospects: electroporation and other physical methods // Gene Ther. - 2004. - V.11, No. 18. - P.1363-1369; Wang S., Joshi S., Lu S. Delivery of DNA to skin by particle bombardment // Methods Mol Biol. - 2004. - V.245 . - P.185-196; Herweijer H., Wolff JA Progress and prospects: naked DNA gene transfer and therapy // Gene therapy. - 2003. - V.10, No. 6. - P.453-458).

Невирусные носители являются альтернативой вирусопосредованному переносу генетических конструкций в клетки млекопитающих. Невирусные носители легко синтезируются, легкость их модификации позволяет вносить изменения в структуру и состав молекул, тем самым, совершенствуя средства доставки. При использовании невирусных носителей отсутствуют ограничения на размер доставляемой генетической конструкции. Кроме того, они менее токсичны, в большинстве случаев не вызывают специфического иммунного ответа и более безопасны в применении in vivo по сравнению с вирусными векторами. Поэтому введение генетической конструкции, упакованной в невирусные носители, может осуществляться повторно. Исследование невирусных носителей развивается в направлении улучшения трансфецирующих свойств генетических конструкций путем образования комплексов с различными синтетическими соединениями (липидами, олиго- и полипептидами, полимерами и др.) (например, патент РФ №2336090, A61K 39/00, A61K 47/00, опубл. 2008.10.20). Совершенствование невирусных средств доставки во многом зависит от детального понимания барьеров на пути проникновения нуклеиновых кислот в клетки организма (Schmidt-Wolf G.D., Schmidt-Wolf I.G. Non-viral and hybrid vectors in human gene therapy: an update // Trends Mol Med. - 2003. - V.9, №2. - P.67-72; Gardlic R., Palffy R., Hodosy J., Turna J., Celec P. Vectors and delivery systems in gene therapy // Med Sci Monit. - 2005. - V.11, №4. - P.110-121; Wiethoff С.М., Middaugh C.R. Barriers to nonviral gene delivery // J Pharm Sci. - 2003. - V.92, №2. - P.203-217).Non-viral carriers are an alternative to virus-mediated transfer of genetic constructs into mammalian cells. Non-viral carriers are easily synthesized, the ease of their modification allows you to make changes in the structure and composition of molecules, thereby improving the delivery system. When using non-viral carriers, there are no restrictions on the size of the delivered genetic construct. In addition, they are less toxic, in most cases do not cause a specific immune response and are safer to use in vivo compared to viral vectors. Therefore, the introduction of a genetic construct packaged in non-viral carriers can be repeated. The study of non-viral carriers is developing in the direction of improving the transfecting properties of genetic constructs by forming complexes with various synthetic compounds (lipids, oligo- and polypeptides, polymers, etc.) (for example, RF patent No. 2336090, A61K 39/00, A61K 47/00, publ. . 2008.10.20). The improvement of non-viral delivery vehicles depends largely on a detailed understanding of the barriers to the penetration of nucleic acids into body cells (Schmidt-Wolf GD, Schmidt-Wolf IG Non-viral and hybrid vectors in human gene therapy: an update // Trends Mol Med. - 2003 . - V.9, No. 2. - P.67-72; Gardlic R., Palffy R., Hodosy J., Turna J., Celec P. Vectors and delivery systems in gene therapy // Med Sci Monit. - 2005 . - V.11, No. 4. - P.110-121; Wiethoff S.M., Middaugh CR Barriers to nonviral gene delivery // J Pharm Sci. - 2003. - V.92, No. 2. - P.203. -217).

Пептидные носители являются перспективной группой средств доставки нуклеиновых кислот в клетки млекопитающих. Использование катионных пептидов для компактизации нуклеиновых кислот более предпочтительно, чем использование высокомолекулярных соединений, таких как гетерогенные поли-L-лизины. Основными направлениями развития пептидных носителей являются: (1) придание им эндосомолитических свойств, (2) присоединение лигандов тканеспецифичных рецепторов, (3) сигналов ядерной локализации в случае, когда необходимо доставить генетическую конструкцию в ядро.Peptide carriers are a promising group of means for delivering nucleic acids to mammalian cells. The use of cationic peptides to compact nucleic acids is more preferable than the use of high molecular weight compounds, such as heterogeneous poly-L-lysines. The main directions of development of peptide carriers are: (1) giving them endosomolytic properties, (2) attachment of tissue-specific receptor ligands, (3) nuclear localization signals when it is necessary to deliver the genetic construct to the nucleus.

Первым барьером на пути внутриклеточного проникновения комплексов является плазматическая мембрана. Большинство комплексов взаимодействуют с поверхностью клетки с помощью электростатических сил. Было показано, что основными неспецифическими молекулами, с которыми связываются комплексы на основе невирусных носителей, являются гликозамингликаны, которые присутствуют на поверхности всех клеток и участвуют во многих клеточных процессах, таких как дифференциация, адгезия и миграция. Для специфического взаимодействия с клеточной поверхностью в состав комплексов включают лиганды к рецепторам на поверхности клеток: трипептидный фрагмент RGD (интегрины присутствуют на поверхности многих клеток), трансферрин (его рецептор обладает повышенной экспрессией в пролиферирующих клетках), асиалоорозомукоид (асиалогликопротеиновый рецептор имеет специфическую экспрессию в гепатоцитах печени) (Schaffner Р., Dard М.М. Structure and function of RGD peptides involved in bone biology // Cell Mol Life Sci. 2003; 60: 119-132; Wu G.Y., Wu C.H. Receptor-mediated gene delivery and expression in vivo // J Biol Chem. 1988; 263: 14621-14624; Kircheis R., Wagner E. Polycation/DNA complexes for in vivo gene delivery // Gene therapy and regulation 2000; 1: 95-114).The first barrier to the intracellular penetration of complexes is the plasma membrane. Most complexes interact with the cell surface using electrostatic forces. It has been shown that the main nonspecific molecules with which complexes based on non-viral carriers bind are glycosaminoglycans, which are present on the surface of all cells and are involved in many cellular processes, such as differentiation, adhesion and migration. For specific interaction with the cell surface, the complexes include ligands for receptors on the cell surface: the RGD tripeptide fragment (integrins are present on the surface of many cells), transferrin (its receptor has increased expression in proliferating cells), asialorozomucoid (asialoglycoprotein receptor has specific expression in hepatocytes liver) (Schaffner R., Dard M.M. Structure and function of RGD peptides involved in bone biology // Cell Mol Life Sci. 2003; 60: 119-132; Wu GY, Wu CH Receptor-mediated gene delivery and expression in vivo // J Biol Chem. 1988; 263: 14621-14624; Kirc heis R., Wagner E. Polycation / DNA complexes for in vivo gene delivery // Gene therapy and regulation 2000; 1: 95-114).

Возможным подходом для создания системы направленного транспорта генов является модификация носителя лигандом к хемокиновому рецептору CXCR4. CXCR4 является рецептором фактора миграции стволовых клеток хемокина SDF-1 и представлен в гематопоэтических клетках, эндотелии сосудов, нейронах, мышечных сателлитных клетках. Отмечен высокий уровень экспрессии данного гена в более чем 20 видах раковых опухолей (рак груди, простаты и др.), а также в мигрирующих стволовых клетках (Juarez J, Bendall L, Bradstock К. Chemokines and their Receptors as Therapeutic Targets: The Role of the SDF-1/CXCR4 Axis. // Curr Pharm Des 2004; 10: 1245-1259). Таким образом, включение в состав молекул носителя лигандных последовательностей для связывания с рецептором CXCR4 является перспективным путем создания систем целевой доставки генов в клетки.A possible approach for creating a system of targeted gene transport is to modify the carrier with a ligand to the CXCR4 chemokine receptor. CXCR4 is a receptor for the stem cell migration factor chemokine SDF-1 and is present in hematopoietic cells, vascular endothelium, neurons, and muscle satellite cells. A high level of expression of this gene was noted in more than 20 types of cancerous tumors (breast, prostate, etc.), as well as in migrating stem cells (Juarez J, Bendall L, Bradstock K. Chemokines and their Receptors as Therapeutic Targets: The Role of the SDF-1 / CXCR4 Axis. // Curr Pharm Des 2004; 10: 1245-1259). Thus, the inclusion of ligand sequences for binding to the CXCR4 receptor in the carrier molecules is a promising way to create systems for targeted gene delivery to cells.

В результате процесса эндоцитоза комплексы носителя с нуклеиновыми кислотами оказываются заключенными внутри ранних эндосом, которые после процесса сортировки либо возвращаются на поверхность клетки, либо сливаются с лизосомами в составе так называемых поздних эндосом. Комплексы, неспособные покинуть эндосому, подвергаются деградации лизосомальными ферментами. Одним из возможных механизмов выхода из эндосомального компартмента является механизм «протонной губки» с участием молекул гистидина. Согласно гипотезе «протонной губки» свободные аминогруппы полимера при pH эндосомы ниже 6.0 способны протонироваться, т.е. присоединять вновь поступающие протоны, предотвращая закисление эндосом. Это влечет за собой поступление в эндосому дополнительных протонов, а также связанный с ним транспорт ионов хлора и воды. Вследствие этого происходит набухание эндосомы и ее последующий осмолизис.As a result of the endocytosis process, the complexes of the carrier with nucleic acids are enclosed within the early endosomes, which after the sorting process either return to the cell surface or merge with the lysosomes in the so-called late endosomes. Complexes that are unable to leave the endosome undergo degradation by lysosomal enzymes. One of the possible mechanisms of exit from the endosomal compartment is the mechanism of the "proton sponge" with the participation of histidine molecules. According to the “proton sponge” hypothesis, free amino groups of the polymer at endosome pH below 6.0 are able to protonate, i.e. attach newly arriving protons, preventing endosome acidification. This entails the entry of additional protons into the endosome, as well as the transport of chlorine and water ions associated with it. As a result of this, swelling of the endosome and its subsequent osmolysis occurs.

Невирусные носители на основе катионных полимеров, такие как полилизины, ранее были исследованы в качестве средств доставки нуклеиновых кислот в клетки. Их основным недостатком является высокая токсичность. Возможной стратегией по снижению токсичности полимеров является уменьшение их молекулярного веса. Однако низкомолекулярные носители неспособны образовывать комплексы, стабильные при физиологических условиях, и эффективно защищать генетические конструкции от деградации. Для решения проблемы стабильности комплексов низкомолекулярных пептидов с нуклеиновым кислотами используют метод образования перекрестных сшивок между молекулами носителя с целью получения соединения с большим молекулярным весом. В качестве перспективных носителей на сегодняшний день рассматриваются синтетические самосшивающиеся цистеин-богатые пептиды. Наличие остатков цистеина, фланкирующих последовательность данных пептидов, обуславливает возможность образования дисульфидных связей между молекулами. Самосшивающиеся за счет остатков цистеина пептиды способны формировать плотные комплексы с плазмидной ДНК. После попадания в клетку происходит редукция дисульфидных связей и высвобождение ДНК из состава комплексов. Кроме того, редукция дисульфидных связей приводит к уменьшению токсичности соединения до уровня низкомолекулярных пептидов (McKenzie DL, Smiley Е, Kwok KY, Rice KG. Low Molecular Weight Disulfide Cross-Linking Peptides as Nonviral Gene Delivery Carriers // Bioconjugate Chem. 2000; 11: 901-909. Tanaka K, Kanazawa T, Ogawa T, Takashima Y, Fukuda T, Okada H. Disulfide crosslinked stearoyl carrier peptides containing arginine and histidine enhance siRNA uptake and gene silencing // International Journal of Pharmaceutics. 2010; 398: 219-224).Non-viral carriers based on cationic polymers, such as polylysines, have previously been investigated as a means of delivering nucleic acids to cells. Their main disadvantage is high toxicity. A possible strategy to reduce the toxicity of polymers is to reduce their molecular weight. However, low molecular weight carriers are unable to form complexes that are stable under physiological conditions and to effectively protect genetic constructs from degradation. To solve the stability problem of complexes of low molecular weight peptides with nucleic acids, the method of crosslinking between carrier molecules is used to obtain a compound with a high molecular weight. Synthetic self-crosslinking cysteine-rich peptides are currently considered promising carriers. The presence of cysteine residues flanking the sequence of these peptides makes it possible to form disulfide bonds between molecules. Peptides self-crosslinking due to cysteine residues are capable of forming dense complexes with plasmid DNA. After getting into the cell, the reduction of disulfide bonds and the release of DNA from the complex occurs. In addition, the reduction of disulfide bonds reduces the toxicity of the compound to the level of low molecular weight peptides (McKenzie DL, Smiley E, Kwok KY, Rice KG. Low Molecular Weight Disulfide Cross-Linking Peptides as Nonviral Gene Delivery Carriers // Bioconjugate Chem. 2000; 11: 901-909. Tanaka K, Kanazawa T, Ogawa T, Takashima Y, Fukuda T, Okada H. Disulfide crosslinked stearoyl carrier peptides containing arginine and histidine enhance siRNA uptake and gene silencing // International Journal of Pharmaceutics. 2010; 398: 219- 224).

Результатом исследований пептидных носителей как средств доставки генетических конструкций должно стать создание модульного носителя, который бы содержал в себе сигналы для преодоления всех барьеров транспорта нуклеиновых кислот в клетку. Такие молекулярные коньюгаты представляют собой "искусственные вирусы", которые, однако, являются более безопасными в использовании, чем вирусные векторы. Вариант модульного носителя генетических конструкций был предложен Трентин с коллегами. Они разработали мультидоменный пептид, который содержал в своем составе цистеин-богатый пептид СНК6НС для связывания ДНК и выхода комплексов из эндосом и соединенную с ним через разделяющий спейсер последовательность сайта связывания трансглютаминазы. С помощью фактора свертываемости крови XIII комплексы внедряются в фибрильный матрикс, что обеспечивает пролонгированность генной доставки. Данный подход можно применять при тканевых повреждениях, когда существует необходимость в доставке генов ростовых факторов. Однако использование фибрильного матрикса подразумевает локальный характер доставки генных конструкций и ограничивает область применения данного модульного носителя (Trentin D, Hubbell J, Hall H. Non-viral gene delivery for local and controlled DNA release // Journal of Controlled Release. 2005; 102: 263-275).The result of studies of peptide carriers as a means of delivering genetic constructs should be the creation of a modular carrier that contains signals to overcome all barriers to the transport of nucleic acids into the cell. Such molecular conjugates are "artificial viruses", which, however, are safer to use than viral vectors. A variant of the modular carrier of genetic constructs was proposed by Trentin and colleagues. They developed a multidomain peptide that contained the cysteine-rich peptide SNK6HC for DNA binding and exit of complexes from endosomes and the transglutaminase binding site sequence connected to it via a spacer-separating site. Using the coagulation factor XIII, the complexes are introduced into the fibrillar matrix, which ensures prolonged gene delivery. This approach can be used for tissue damage, when there is a need for the delivery of growth factor genes. However, the use of a fibril matrix implies the local nature of the delivery of gene constructs and limits the scope of this modular carrier (Trentin D, Hubbell J, Hall H. Non-viral gene delivery for local and controlled DNA release // Journal of Controlled Release. 2005; 102: 263 -275).

При разработке модульных носителей особое внимание должно уделяться исследованию комбинаций лигандов-рецепторов, специфичных к клеткам-мишеням различных типов. Примером таких комбинаций может быть пара CXCR4-SDF-1α. CXCR4 является рецептором фактора миграции стволовых клеток хемокина SDF-1α и экспрессируется в гематопоэтических клетках, эндотелии сосудов, мышечных сателлитных клетках. Отмечен высокий уровень экспрессии данного гена в более чем 20 видах раковых опухолей (рак груди, простаты и др.), а также в мигрирующих стволовых клетках. Для доставки генетического материала в клетки, экспрессирующие рецептор CXCR4, Ле Бон с коллегами использовали синтетический лиганд к данному рецептору - AMD3100, который был соединен с полиэтиленимином или катионными липидами. Комплексы генетического материала с данными соединениями не приводили к достоверному повышению эффективности доставки маркерного гена в CXCR4+ клетки по сравнению с соединениями без сигналов. Носители, применяемые Ле Боном, не были эффективными, потому что специфическая доставка с их помощью возможна только при добавлении в среду трансфекции вещества, способствующего интернализации рецептора CXCR4 (форболовый эфир). (Le Bon В, Van Craynest N, Daoudi JM, Di Giorgio C, Domb AJ, Vierling P. AMD3100 Conjugates as Components of Targeted Nonviral Gene Delivery Systems: Synthesis and in Vitro Transfection Efficiency of CXCR4-Expressing Cells // Bioconjugate Chem 2004, 15: 413-423).In the development of modular carriers, particular attention should be paid to the study of ligand-receptor combinations specific for different types of target cells. An example of such combinations may be a pair of CXCR4-SDF-1α. CXCR4 is a receptor for the stem cell migration factor chemokine SDF-1α and is expressed in hematopoietic cells, vascular endothelium, and muscle satellite cells. A high level of expression of this gene was noted in more than 20 types of cancerous tumors (breast, prostate, etc.), as well as in migrating stem cells. To deliver the genetic material to cells expressing the CXCR4 receptor, Le Bon et al. Used a synthetic ligand for this receptor, AMD3100, which was coupled to polyethyleneimine or cationic lipids. Complexes of genetic material with these compounds did not lead to a significant increase in the efficiency of marker gene delivery in CXCR4 + cells compared to compounds without signals. The carriers used by Le Bon were not effective, because specific delivery with them is possible only when a substance is added to the transfection medium that promotes the internalization of the CXCR4 receptor (phorbol ester). (Le Bon B, Van Craynest N, Daoudi JM, Di Giorgio C, Domb AJ, Vierling P. AMD 3100 Conjugates as Components of Targeted Nonviral Gene Delivery Systems: Synthesis and in Vitro Transfection Efficiency of CXCR4-Expressing Cells // Bioconjugate Chem 2004, 15: 413-423).

Таким образом, существует необходимость в создании носителя, модифицированного лигандом к рецептору CXCR4, способного обеспечить специфическую доставку нуклеиновых кислот в CXCR4+ клетки и не оказывать влияния на близлежащие ткани. Такой носитель обеспечивается настоящим изобретением.Thus, there is a need to create a carrier modified with a ligand to the CXCR4 receptor, capable of providing specific delivery of nucleic acids to CXCR4 + cells and not affect nearby tissues. Such a carrier is provided by the present invention.

В основу настоящего изобретения положена задача разработки носителя для направленной доставки нуклеиновых кислот в клетки, экспрессирующие рецептор CXCR4, для специфической доставки генетических конструкций в клетки, на поверхности которых представлен рецептор CXCR4, в котором за счет использования модульных носителей генетических конструкций, содержащих в своем составе последовательность-лиганд к рецептору CXCR4, достигают повышения эффективности и специфичности доставки маркерного гена.The present invention is based on the task of developing a carrier for targeted delivery of nucleic acids to cells expressing the CXCR4 receptor for the specific delivery of genetic constructs to cells on the surface of which the CXCR4 receptor is presented, in which, through the use of modular carriers of genetic constructs containing the sequence ligand to the CXCR4 receptor, achieve increased efficiency and specificity of marker gene delivery.

Достижение поставленной технической задачи обеспечивается тем, что носитель для направленной доставки нуклеиновых кислот в клетки, экспрессирующие рецептор CXCR4, состоит из:The achievement of the technical task is ensured by the fact that the carrier for the targeted delivery of nucleic acids to cells expressing the CXCR4 receptor consists of:

- последовательности-лиганда к рецептору CXCR4 с последовательностью аминокислот - KPVSLSYRSPSRFFESH;- ligand sequences for the CXCR4 receptor with the amino acid sequence - KPVSLSYRSPSRFFESH;

- линкерного участка из двух молекул ε-аминогексановой кислоты, соединяющей последовательность-лиганд с последовательностью для компактизации нуклеиновых кислот;- a linker site of two molecules of ε-aminohexanoic acid connecting the ligand sequence to the sequence for compaction of nucleic acids;

- последовательности, обеспечивающей компактизацию нуклеиновых кислот и выход комплекса из эндосом - CHRRRRRRHC.- a sequence that ensures the compaction of nucleic acids and the exit of the complex from endosomes - CHRRRRRRHC.

Для достижения эффективной трансфекции необходимо использование данных носителей в комплексе с генетическим материалом.To achieve effective transfection, the use of these carriers in combination with genetic material is necessary.

В качестве генетического материала может быть использована плазмидная ДНК, содержащая ген интереса, или олигонуклеотидные последовательности РНК, миРНК и ДНК. Изобретение поясняется с помощью фиг.1-7.As genetic material, plasmid DNA containing the gene of interest or oligonucleotide sequences of RNA, siRNA and DNA can be used. The invention is illustrated using figures 1-7.

На фиг.1 показано изменение интенсивности флуоресценции бромистого этидия при увеличении зарядовых соотношений носитель/ДНК в комплексах L1/ДНК, L2/ДНК и L3/ДНК. Падение интенсивности флуоресценции свидетельствует о возрастании плотности формировавшихся комплексов. Выход кривых флюоресценции на плато указывает на то, что комплексы достигли плотности, достаточной для гашения флуоресценции бромистого этидия.Figure 1 shows the change in the fluorescence intensity of ethidium bromide with increasing charge / carrier ratios in the L1 / DNA, L2 / DNA and L3 / DNA complexes. A decrease in the fluorescence intensity indicates an increase in the density of the formed complexes. The emergence of fluorescence curves on a plateau indicates that the complexes have reached a density sufficient to quench fluorescence of ethidium bromide.

На фиг.2 продемонстрировано изменение интенсивности флуоресценции красителя SybrGreen при увеличении зарядовых соотношений носитель/миРНК в комплексах L1/миРНК, L2/миРНК и L3/миРНК. Выход кривых флюоресценции на плато указывает на то, что комплексы достигли плотности, достаточной для полного гашения флуоресценции Sybr Green.Figure 2 shows the change in the fluorescence intensity of the SybrGreen dye with increasing charge / carrier ratio in the L1 / siRNA, L2 / siRNA and L3 / siRNA complexes. The appearance of fluorescence curves on a plateau indicates that the complexes have reached a density sufficient to completely quench the fluorescence of Sybr Green.

На фиг.3 приведена зависимость активности β-галактозидазы в клетках HeLa (CXCR4+) после трансфекции комплексами L1/ДНК, L2/ДНК и L3/ДНК. В этом случае использовали комплексы, сформированные при следующих зарядовых соотношениях носитель/ДНК: 4/1, 8/1, 12/1. В качестве контролей эксперимента служили интактная молекула ДНК, комплексы ПЭИ/ДНК 8/1 (положительный контроль эксперимента) и комплексы, содержащие ДНК и контрольный пептид (L0). L0 отличается от носителей в настоящем изобретении отсутствием сигнала связывания с рецептором CXCR4 и представляет собой последовательность CHRRRRRRHC. Эффективность доставки маркерного гена носителями L1, L2 и L3 была в 10 раз выше, чем контролем L0.Figure 3 shows the dependence of β-galactosidase activity in HeLa cells (CXCR4 +) after transfection with L1 / DNA, L2 / DNA and L3 / DNA complexes. In this case, the complexes formed at the following charge carrier / DNA ratios were used: 4/1, 8/1, 12/1. The intact DNA molecule, PEI / DNA 8/1 complexes (positive control of the experiment), and complexes containing DNA and the control peptide (L0) were used as controls for the experiment. L0 differs from the carriers in the present invention in the absence of a binding signal to the CXCR4 receptor and is a CHRRRRRRHC sequence. The efficiency of marker gene delivery by L1, L2, and L3 carriers was 10 times higher than the L0 control.

На фиг.4 приведена зависимость активности β-галактозидазы в клетках A172 (CXCR4+) после трансфекции комплексами L1/ДНК, L2/ДНК и L3/ДНК. Использованы комплексы, сформированные при следующих зарядовых соотношениях носитель/ДНК: 4/1, 8/1, 12/1. В качестве контролей эксперимента служили интактная молекула ДНК, комплексы ПЭИ/ДНК 8/1 и комплексы, содержащие ДНК и носитель L0. Эффективность доставки маркерного гена носителями L1, L2 и L3 была в 10 раз выше, чем контролем L0 при зарядовом соотношении носитель/ДНК 4/1. При увеличении зарядовых соотношений эффективность комплексов с носителем L3 была более чем в 5 раз выше, чем с носителей L0.Figure 4 shows the dependence of β-galactosidase activity in A172 (CXCR4 +) cells after transfection with L1 / DNA, L2 / DNA and L3 / DNA complexes. The complexes formed at the following charge ratios of carrier / DNA were used: 4/1, 8/1, 12/1. The intact DNA molecule, PEI / DNA 8/1 complexes, and complexes containing DNA and the L0 carrier were used as controls of the experiment. The efficiency of marker gene delivery by L1, L2, and L3 carriers was 10 times higher than the L0 control at a carrier / DNA charge ratio of 4/1. With increasing charge ratios, the efficiency of complexes with the L3 carrier was more than 5 times higher than with the L0 carriers.

На фиг.5 показана зависимость активности β-галактозидазы в клетках СНО (CXCR4-) после трансфекции комплексами L1/ДНК, L2/ДНК и L3/ДНК. Использованы комплексы, сформированные при следующих зарядовых соотношениях носитель/ДНК: 4/1, 8/1, 12/1. В качестве контролей эксперимента служили интактная молекула ДНК, комплексы ПЭИ/ДНК 8/1 и комплексы, содержащие ДНК и носитель L0. Эффективность доставки маркерного гена носителями L1, L2 и L3 достоверно не отличалась от таковой с использованием контроля L0.Figure 5 shows the dependence of β-galactosidase activity in CHO cells (CXCR4-) after transfection with L1 / DNA, L2 / DNA and L3 / DNA complexes. The complexes formed at the following charge ratios of carrier / DNA were used: 4/1, 8/1, 12/1. The intact DNA molecule, PEI / DNA 8/1 complexes, and complexes containing DNA and the L0 carrier were used as controls of the experiment. The efficiency of marker gene delivery by L1, L2, and L3 carriers did not significantly differ from that using the L0 control.

Носители без последовательности-лиганда неспособны обеспечить достоверно высокого по сравнению с контролем уровня доставки генетического материала и клетках без рецептора. В то же время эффективность комплексов ДНК с носителем L0, последовательность которого является частью молекулярного коньюгата, была достоверно выше, чем при использовании интактной плазмиды. Это свидетельствует об эффективности данной последовательности при компактизации ДНК и выходе комплексов из эндосом.Carriers without a ligand sequence are unable to provide a significantly higher level of delivery of genetic material and cells without a receptor compared to control. At the same time, the efficiency of DNA complexes with the L0 carrier, the sequence of which is part of the molecular conjugate, was significantly higher than when using an intact plasmid. This indicates the effectiveness of this sequence in the compaction of DNA and the exit of complexes from endosomes.

На фиг.6 показана зависимость активности β-галактозидазы в мезенхимных стволовых клетках человека, обработанных вальпроевой кислотой, после трансфекции комплексами L1/ДНК, L2/ДНК и L3/ДНК. Вальпроевая кислота увеличивает количество рецептора CXCR4 на поверхности стволовых клеток (Tsai L-K, Leng Y, Wang Z, Leeds P, Chuang D-M. The Mood Stabilizers Valproic Acid and Lithium Enhance Mesenchymal Stem Cell Migration via Distinct Mechanisms // Neuropsychopharmacology. 2010; 35: 2225-2237). Использованы комплексы, сформированные при зарядовом соотношении носитель/ДНК 4/1. В качестве контролей эксперимента служили интактная молекула ДНК, комплексы ПЭИ/ДНК 8/1 и комплексы, содержащие ДНК и носитель L0. Эффективность доставки маркерного гена носителями L2 и L3 была в 3-9 раз выше, чем контролем L0. Мезенхимные стволовые клетки человека рассматриваются в качестве перспективных агентов для клеточной и генной терапии различных заболеваний человека. В то же время они относятся к одним из наиболее трудно трансфецируемых типов клеток. Природный лиганд рецептора CXCR4 - хемокин SDF-1α, на основе которого разработана последовательность-лиганд в составе носителей, является фактором миграции стволовых клеток (Kucia М, Reca R, Miekus К, Wanzeck J, Wojakowski W, Janowska-Wieczorek A, Ratajczak J, Ratajczak MZ Trafficking of Normal Stem Cells and Metastasis of Cancer Stem Cells Involve Similar Mechanisms: Pivotal Role of the SDF-1-CXCR4 Axis // Stem Cells. 2005; 23: 879-894). Таким образом, включение в состав носителей пептида с лигандом рецептора CXCR4 позволяет повысить эффективность трансфекции мезенхимных стволовых клеток.Figure 6 shows the dependence of β-galactosidase activity in human mesenchymal stem cells treated with valproic acid after transfection with L1 / DNA, L2 / DNA and L3 / DNA complexes. Valproic acid increases the amount of CXCR4 receptor on the surface of stem cells (Tsai LK, Leng Y, Wang Z, Leeds P, Chuang DM. The Mood Stabilizers Valproic Acid and Lithium Enhance Mesenchymal Stem Cell Migration via Distinct Mechanisms // Neuropsychopharmacology. 2010; 35: 2225 -2237). Used complexes formed at a charge ratio of carrier / DNA 4/1. The intact DNA molecule, PEI / DNA 8/1 complexes, and complexes containing DNA and the L0 carrier were used as controls of the experiment. The efficiency of marker gene delivery by L2 and L3 carriers was 3–9 times higher than the L0 control. Human mesenchymal stem cells are considered as promising agents for cell and gene therapy of various human diseases. At the same time, they are one of the most difficult to transfect cell types. The natural ligand of the CXCR4 receptor, SDF-1α chemokine, on the basis of which the ligand sequence was developed as a carrier, is a stem cell migration factor (Kucia M, Reca R, Miekus K, Wanzeck J, Wojakowski W, Janowska-Wieczorek A, Ratajczak J, Ratajczak, MZ, Trafficking of Normal Stem Cells and Metastasis of Cancer Stem Cells Involve Similar Mechanisms: Pivotal Role of the SDF-1-CXCR4 Axis // Stem Cells. 2005; 23: 879-894). Thus, the inclusion of a peptide with a ligand of the CXCR4 receptor in the composition of the carriers improves the efficiency of transfection of mesenchymal stem cells.

На фиг.7 показано изменение экспрессии гена VEGFA в клетках A172 (CXCR4+) после трансфекции комплексами L1/миРНК, L2/миРНК и L3/миРНК. Использованы комплексы, сформированные при следующих зарядовых соотношениях носитель/миРНК: 8/1, 16/1. В качестве контролей эксперимента служили интактная молекула миРНК, комплексы ПЭИ/миРНК 8/1 и комплексы, содержащие миРНК и носитель L0. При доставке комплексов L1/миРНК, L2/миРНК и L3/миРНК уровень экспрессии гена VEGFA был достоверно ниже по сравнению с использованием комплексов L0/миРНК при соответствующих зарядовых соотношениях. После доставки комплексов L1/миРНК уровень экспрессии составлял 43% и 32% от базального уровня при зарядовых соотношениях 8/1 и 16/1 соответственно. После доставки комплексов L2/миРНК уровень экспрессии составлял 44% и 38%, L3/миРНК - 42% и 36%. Действие «незащищенной» миРНК не приводило к подавлению экспрессии гена VEGFA.Figure 7 shows the change in VEGFA gene expression in A172 (CXCR4 +) cells after transfection with L1 / siRNA, L2 / siRNA and L3 / siRNA complexes. We used the complexes formed at the following charge ratios of the carrier / siRNA: 8/1, 16/1. The intact siRNA molecule, the PEI / siRNA 8/1 complexes, and the complexes containing siRNA and the L0 carrier were used as controls of the experiment. Upon delivery of the L1 / siRNA, L2 / siRNA and L3 / siRNA complexes, the level of expression of the VEGFA gene was significantly lower compared to the use of L0 / siRNA complexes at the corresponding charge ratios. After the delivery of L1 / siRNA complexes, the expression level was 43% and 32% of the basal level at charge ratios of 8/1 and 16/1, respectively. After delivery of L2 / siRNA complexes, the expression level was 44% and 38%, L3 / siRNA - 42% and 36%. The action of "unprotected" siRNA did not lead to inhibition of VEGFA gene expression.

Таким образом результаты на фиг.3, 4, 5, 6, 7 свидетельствуют в пользу специфичности доставки нуклеиновых кислот с помощью молекулярных коньюгатов из настоящего изобретения в клетки, на поверхности которых представлен рецептор CXCR4.Thus, the results in FIGS. 3, 4, 5, 6, 7 support the specificity of the delivery of nucleic acids using the molecular conjugates of the present invention to cells on the surface of which a CXCR4 receptor is presented.

Осуществление изобретения можно пояснить следующим образом. Задача настоящего изобретения состоит в обеспечении эффективной и направленной доставки генетических конструкций в клетки с рецептором CXCR4 на поверхности, используя модульные носители, содержащие последовательность-лиганд к данному рецептору.The implementation of the invention can be explained as follows. An object of the present invention is to provide efficient and targeted delivery of genetic constructs to cells with a CXCR4 receptor on the surface using modular carriers containing a ligand sequence for this receptor.

На первом этапе проводят образование комплексов одного из воплощений носителя с генетической конструкцией, содержащей ген "интереса", или с миРНК. Сформированные комплексы используют для доставки генетического материала в соответствующие клетки-мишени. Анализ эффективности проникновения в клетки оценивают с помощью ферментативных, иммуногистохимических и молекулярно-биологических методов.At the first stage, the formation of complexes of one of the embodiments of the carrier with a genetic construct containing the gene of "interest", or with siRNA. The formed complexes are used to deliver genetic material to the corresponding target cells. Analysis of the efficiency of penetration into cells is assessed using enzymatic, immunohistochemical, and molecular biological methods.

Формирование комплексов проводят в изотоническом растворе. Предпочтительным является бессолевой буфер НВМ (Hepes-buffered mannitol). Размер образующихся комплексов составляет 140-250 нм.The formation of complexes is carried out in isotonic solution. Hepes-buffered mannitol is the preferred non-salt buffer. The size of the resulting complexes is 140-250 nm.

В качестве генетических конструкций в одном из воплощений используют плазмидную ДНК.As one of the genetic constructs, plasmid DNA is used in one embodiment.

Плазмидная ДНК содержит в своем составе маркерный (luc, lacZ) или терапевтический ген (в зависимости от заболевания) под контролем соответствующих промоторов и энхансеров (CMV, SV40 и др.) и другие элементы, необходимые, например, для репликации в клетки-хозяине или интеграции в геном. При генотерапевтичеком лечении раковых заболеваний могут быть использованы гены HLA-В7, IL-2, IL-4, TNF, IFN, Р53, тимидинкиназы и проч.Plasmid DNA contains a marker (luc, lacZ) or therapeutic gene (depending on the disease) under the control of appropriate promoters and enhancers (CMV, SV40, etc.) and other elements necessary, for example, for replication in host cells or integration into the genome. In gene therapy for the treatment of cancer, the genes HLA-B7, IL-2, IL-4, TNF, IFN, P53, thymidine kinase, etc. can be used.

В другом воплощении в качестве генетической конструкции используют миРНК, комплементарные специфической последовательности в составе мРНК для подавления синтеза белкового продукта. Например, при генотерапевтичеком лечении опухолей могут быть использованы малые интерферирующие РНК, способные снизить экспрессию генов, кодирующих белки VEGFA, VEGFR1, VEGFR2, HGF, PDGF, FGF и др., что может приводить к снижению ангиогенеза и прекращению развития заболевания. Сформированные комплексы используют для доставки генетического материала в клетки с рецептором CXCR4 на поверхности. Проникновение комплексов с носителем из настоящего изобретения происходит преимущественно с помощью рецептор-опосредованного переноса путем связывания с внеклеточными доменами рецептора CXCR4 и последующей интернализацией рецептора.In another embodiment, siRNAs complementary to the specific sequence in the mRNA are used as a genetic construct to inhibit protein product synthesis. For example, in gene therapy treatment of tumors, small interfering RNAs can be used that can reduce the expression of genes encoding the proteins VEGFA, VEGFR1, VEGFR2, HGF, PDGF, FGF, etc., which can lead to a decrease in angiogenesis and cessation of the development of the disease. The formed complexes are used to deliver genetic material to cells with a CXCR4 receptor on the surface. The penetration of the complexes with the carrier of the present invention occurs mainly through receptor-mediated transfer by binding to the extracellular domains of the CXCR4 receptor and subsequent internalization of the receptor.

Доза молекулярных коньюгатов и генетического материала определяется индивидуально и зависит от типа клеток, количества рецептора CXCR4 на их поверхности и сложности трансфецирования данных клеток.The dose of molecular conjugates and genetic material is determined individually and depends on the type of cells, the amount of CXCR4 receptor on their surface and the complexity of transfection of these cells.

При подборе условий трансфекции они создаются так, чтобы обеспечить наибольшую эффективность доставки. Предпочтительным является инкубация комплексов с клетками в течение 4 часов. Однако можно варьировать это время от 3 до 6 часов. По истечении времени инкубации производят смену среды и оставляют клетки на 24-48 часов (в зависимости от типа клеток и генетического материала) для экспрессии введенных конструкции с геном-интереса или проявления терапевтического эффекта олигонуклеотидов.When selecting transfection conditions, they are created in such a way as to ensure the highest delivery efficiency. Preferred is the incubation of complexes with cells for 4 hours. However, you can vary this time from 3 to 6 hours. After the incubation time has elapsed, the medium is changed and the cells are left for 24-48 hours (depending on the type of cells and genetic material) for expression of the introduced constructs with the gene of interest or for the manifestation of the therapeutic effect of oligonucleotides.

Анализ эффективности доставки проводится ферментативными, иммуногистохимическими или молекулярно-биологическими методами в зависимости от типа введенной генетической конструкции.Analysis of delivery efficiency is carried out by enzymatic, immunohistochemical, or molecular biological methods, depending on the type of genetic construct introduced.

Пример 1. Формирование комплексов ДНК/носитель, РНК/носитель и изучение процесса комплексообразования.Example 1. The formation of complexes of DNA / carrier, RNA / carrier and the study of the complexation process.

В качестве генетического материала для направленной доставки генов в клетки были использованы: 1 - плазмида pCMVLacZnls, содержащая ген β-галактозидазы под контролем промотора цитомегаловируса, 2 - малая интерферирующая РНК (миРНК) против гена VEGFA. Использовали одно из воплощений носителя, содержащего последовательность-лиганд к рецептору CXCR4. Носители генетических конструкций формировали с помощью матричной полимеризации в процессе образования нуклеопептидных комплексов. Использовали следующие комбинации пептида, модифицированного лигандом рецептора CXCR4 и катионного пептида CHRRRRRRHC: носитель L1 содержит 100 мол.% пептида, модифицированного лигандом рецептора CXCR4; носитель L2 содержит 50 мол.% пептида, модифицированного лигандом рецептора CXCR4, и 50 мол.% катионного пептида CHRRRRRRHC; носитель L3 содержит 10 мол.% пептида, модифицированного лигандом рецептора CXCR4, и 90 мол.% катионного пептида CHRRRRRRHC; носитель L0 содержит 100 мол.% катионного пептида CHRRRRRRHC.The following materials were used as genetic material for targeted gene delivery into cells: 1 - plasmid pCMVLacZnls containing the β-galactosidase gene under the control of the cytomegalovirus promoter, 2 - small interfering RNA (siRNA) against the VEGFA gene. Used one of the embodiments of the carrier containing the sequence of the ligand to the receptor CXCR4. Carriers of genetic constructs were formed using matrix polymerization during the formation of nucleopeptide complexes. The following combinations of the CXCR4 ligand modified peptide and CHRRRRRRHC cationic peptide were used: carrier L1 contains 100 mol% of the CXCR4 ligand modified peptide; carrier L2 contains 50 mol% of a peptide modified with a ligand of the CXCR4 receptor and 50 mol% of a cationic peptide CHRRRRRRHC; L3 carrier contains 10 mol% of a peptide modified with a CXCR4 ligand and 90 mol% of a cationic peptide CHRRRRRRHC; the L0 carrier contains 100 mol% of the cationic peptide CHRRRRRRHC.

Приготавливали растворы 0,5 мкг ДНК или РНК в 10 мкл 1X буфера НВМ (5% w/v mannitol, 5 mM Hepes, pH 7.5) и растворы носителя, соответствующие различным зарядовым соотношениям ДНК/носитель или РНК/носитель, в равном объеме буфера. В пробирку-эппендорф с раствором нуклеиновой кислоты постепенно добавляли раствор носителя и интенсивно перемешивали в течение 30 секунд. Полученную смесь оставляли на 2 часа при комнатной температуре для завершения процесса формирования комплексов.Prepared solutions of 0.5 μg of DNA or RNA in 10 μl of 1X HBM buffer (5% w / v mannitol, 5 mM Hepes, pH 7.5) and carrier solutions corresponding to different charge ratios of DNA / carrier or RNA / carrier in an equal volume of buffer . The carrier solution was gradually added to the eppendorf tube with the nucleic acid solution and mixed vigorously for 30 seconds. The resulting mixture was left for 2 hours at room temperature to complete the complexation process.

Результаты по комплексообразованию анализируют методом вытеснения бромистого этидия или SybrGreen. Измерение флуоресценции производят с помощью спектрального сканирующего мультирежимного считывающего устройства Wallac 1420D (Thermo, Finland). Вытеснение бромистого этидия наблюдается при излучении 590 нм (возбуждение при 544 нм) после добавления носителя к ДНК (50 мкг/мл), преинкубированной с интеркалирующим агентом бромистым этидием (400 нг/мл). Вытеснение красителя SybrGreen наблюдается при излучении 590 нм (возбуждение при 485 нм) после добавления носителя к РНК (50 мкг/мл), преинкубированной с однократным раствором SybrGreen. Вытеснение было посчитано по формуле (F-Ff)/(Fb-Ff), где Ff и Fb - это интенсивности флюоресценции бромистого этидия/SybrGreen в отсутствие и присутствии ДНК/РНК соответственно. Результаты представлены на фиг.1, 2.The results of complexation are analyzed by displacement of ethidium bromide or SybrGreen. Fluorescence is measured using a Wallac 1420D spectral scanning multi-mode reader (Thermo, Finland). The displacement of ethidium bromide is observed at 590 nm radiation (excitation at 544 nm) after adding the carrier to DNA (50 μg / ml) preincubated with intercalating agent ethidium bromide (400 ng / ml). Displacement of the SybrGreen dye is observed at 590 nm radiation (excitation at 485 nm) after adding the carrier to RNA (50 μg / ml) preincubated with a single SybrGreen solution. Displacement was calculated by the formula (F-Ff) / (Fb-Ff), where Ff and Fb are the fluorescence intensities of ethidium bromide / SybrGreen in the absence and presence of DNA / RNA, respectively. The results are presented in figures 1, 2.

Пример 2. Проведение трансфекции in vitro.Example 2. In vitro transfection.

Клетки культуры HeLa, A172 и СНО рассевали на культуральные 48 (при использовании ДНК)/24-луночные (при использовании РНК) планшеты (Nunc) за 24 часа до трансфекции из расчета 50000/100000 клеток на лунку, содержащую 500/1000 мкл стандартной культуральной смеси, состоящей из культуральной среды DMEM (Биолот), 10% сыворотки эмбрионов коров (Биолот), 0,01% раствора гентамицина. Мезенхимные стволовые клетки человека рассевали на культуральные 48-луночные планшеты из расчета 30000 клеток на лунку, содержащую 500 мкл стандартной культуральной смеси (αМЕМ (Биолот), 15% сыворотки эмбрионов коров (Биолот), 0,01% раствора гентамицина), через 24 часа в среду трансфекции добавляли раствор вальпроевой кислоты до конечной концентрации 2,5 мМ, инкубировали при температуре 37°C в течение трех часов. Далее проводили смену среды в лунках и оставляли планшет на 48 часов.HeLa, A172, and CHO culture cells were scattered onto 48 (using DNA) / 24-well (using RNA) culture plates (Nunc) 24 hours before transfection at a rate of 50,000 / 100,000 cells per well containing 500/1000 μl of standard culture a mixture consisting of a culture medium DMEM (Biolot), 10% serum of cow embryos (Biolot), 0.01% gentamicin solution. Human mesenchymal stem cells were scattered on 48-well culture plates at a rate of 30,000 cells per well containing 500 μl of a standard culture mixture (αEMEM (Biolot), 15% serum of cow embryos (Biolot), 0.01% gentamicin solution), after 24 hours valproic acid solution was added to the transfection medium to a final concentration of 2.5 mM, incubated at 37 ° C for three hours. Then, the medium was changed in the wells and the plate was left for 48 hours.

Суспензию комплексов приготавливали согласно методике, описанной в примере 1, из расчета 2 мкг ДНК/2,7 мкг РНК на каждую лунку культурального планшета. За 10 минут до внесения суспензии комплексов НК/носитель клетки несколько раз промывали средой DMEM/αMEM и вносили в каждую лунку по 500/1000 мкл среды DMEM/αMEM. Трансфекцию проводили путем добавления суспензии комплексов НК/носитель в среду. После внесения комплексов планшеты с клетками помещали в термостат с температурой 37°C и 5% содержанием CO2 на 4 часа. По прошествии времени инкубации клетки промывали средой DMEM/αMEM и вносили в каждую лунку по 500/1000 мкл стандартной культуральной смеси. Культуральный планшет инкубировали в термостате при температуре 37°C и 5% содержанием CO₂ в течение 48 часов.A suspension of the complexes was prepared according to the procedure described in example 1, at the rate of 2 μg DNA / 2.7 μg RNA per well of the culture plate. 10 minutes before the suspension of the NK / carrier complexes suspension, the cells were washed several times with DMEM / αMEM medium and 500/1000 μl of DMEM / αMEM medium was added to each well. Transfection was performed by adding a suspension of NK / carrier complexes to the medium. After introducing the complexes, the tablets with cells were placed in a thermostat with a temperature of 37 ° C and 5% CO2 for 4 hours. After the incubation time, the cells were washed with DMEM / αMEM medium and 500/1000 μl of the standard culture mixture was added to each well. The culture plate was incubated in a thermostat at a temperature of 37 ° C and 5% CO ₂ for 48 hours.

Пример 3. Выявление экспрессии гена β-галактозидазы после трансфекции in vitro комплексами ДНК/носитель.Example 3. Detection of β-galactosidase gene expression after in vitro transfection with DNA / carrier complexes.

Удаляли среду из культуральный планшетов, промывали клетки в 1×PBS (pH 7.2). В каждую лунку добавляли по 80 мкл лизис буфера (25 мМ Gly-Gly, 15 мМ MgSO4, 4 мМ EGTA, 1 мМ DTT, 1 мМ PMSF; pH 7.8). По 50 мкл лизата переносили в полистироловые планшеты для измерения активности β-галактозидазы. Добавляли в каждую лунку по 50 мкл реакционного раствора 4-метилумбелиферон-β-галактопиранозид - MUG (реакционный раствор MUG: 200 мМ Na-фосфатного буфер (pH 7,3), 2 мМ MgCl₂, 1 мг/мл MUG (Sigma)). Инкубировали 1,5 часа при температуре 37°C. Добавляли в каждую лунку по 100 мкл стоп - реагента (0,2 М глицин (pH 10,0)). Измерение проводили с помощью спектрального сканирующего мультирежимного считывающего устройства Wallac 1420D (Thermo, Finland) при длине волны излучения 355 нм и возбуждения 460 нм. Время экспозиции составляло 0,1 секунды. В качестве контроля использовали фермент β-галактозидазу с известной активностью (mU). Строили калибровочную кривую зависимости активности фермента от интенсивности флуоресценции. На основании калибровочной кривой получали активность β-галактозидазы в пробах. Результаты эксперимента оценивали в относительных световых единицах на 1 мг тотального белка из клеточных экстрактов в лунке культурального планшета. Общее количество белка в каждой лунке измеряли методом Бредфорд относительно калибровочной кривой по бычьему сывороточному альбумину. Результаты представлены на фиг.3, 4, 5, 6.The medium was removed from the culture plates, the cells were washed in 1 × PBS (pH 7.2). 80 μl of lysis buffer (25 mM Gly-Gly, 15 mM MgSO4, 4 mM EGTA, 1 mM DTT, 1 mM PMSF; pH 7.8) was added to each well. 50 μl of the lysate was transferred to polystyrene plates to measure β-galactosidase activity. 50 μl of a 4-methylumbeliferon-β-galactopyranoside-MUG reaction solution (MUG reaction solution: 200 mM Na-phosphate buffer (pH 7.3), 2 mM MgCl ₂ , 1 mg / ml MUG (Sigma)) was added to each well. . Incubated for 1.5 hours at a temperature of 37 ° C. 100 μl stop reagent (0.2 M glycine (pH 10.0)) was added to each well. The measurement was performed using a Wallac 1420D spectral scanning multi-mode reader (Thermo, Finland) at a wavelength of 355 nm and an excitation of 460 nm. The exposure time was 0.1 seconds. The enzyme β-galactosidase with known activity (mU) was used as a control. A calibration curve was constructed of the enzyme activity versus fluorescence intensity. Based on the calibration curve, β-galactosidase activity in the samples was obtained. The experimental results were evaluated in relative light units per 1 mg of total protein from cell extracts in a well of a culture plate. The total amount of protein in each well was measured by the Bradford method relative to the calibration curve for bovine serum albumin. The results are presented in figure 3, 4, 5, 6.

Пример 4. Выявление экспрессии гена VEGFA после трансфекции in vitro комплексами миРНК/носитель.Example 4. Detection of VEGFA gene expression after in vitro transfection with siRNA / carrier complexes.

Из лунок планшета удаляли культуральную смесь, после чего 2 раза промывали раствором, содержащим трипсин и версен в соотношении 1:3. Добавляли 150 мкл раствора трипсина и версена на лунку и инкубировали при температуре 37°C в течение 10 минут. Добавляли 150 мкл 1×PBS, центрифугировали 10 мин при 2200 оборотах в минуту, сливали жидкую фракцию. Далее проводили выделение РНК с помощью раствора Trizol (Quiagen, Германия) согласно протоколу фирмы-производителя. Для синтеза кДНК смешивали 5 мкл РНК, 1 мкл гексопраймеров (15 OE/мл) и 15 мкл H₂O, оставляли на 5 мин при 70°C, после чего добавляли 2,5 мкл буфера для обратной транскриптазы, 4 мкл дезоксирибонуклеотидов (2 мМ), 0,5 мкл обратной транскриптазы (200 ед. акт/мкл). Проводили амплификацию при следующих условиях: 10 мин при температуре 25°C, 60 мин при 37°C, 10 мин при 70°C. Измерение концентрации кДНК проводили на спектрофотометре NanoDrop (США). Для анализа экспрессии гена VEGFA проводили реакцию ПЦР в реальном времени использовали набор (ЗАО «Синтол», Москва), в состав которого входили 10x Eva Green, смесь дезоксирибонуклеотидов (2,5 мМ), MgCl₂ (25 мМ), Taq-полимераза (5 ед./мкл), dH₂O. Использовались следующие последовательности праймеров: F'-5TGCCGACAGGATGCAGAAG3', R-5'GCCGATCCACACGGAGTACT3' (к гену β-актина); F-5'CAACATCACCATGCAGATTATGC3', R-5'CCCACAGGGATTTTCTTGTCTT3' (к гену VEGFA). Амплификацию проводили в термоциклер Rotor-Gene 3000 (Corbett Research, Австралия). Полученные данные анализировали с помощью программного обеспечения Rotor-Gene version 6.1.71 (Corbett Research, Австралия). Были получены значения порогового цикла флуоресценции (Ct) для каждого образца в двух повторностях. Были построены две калибровочные кривые для исследуемого и референсного гена методом линейной регрессии. Далее с помощью метода относительного количественного анализа (Relative Quantitation), рассчитывали относительную концентрацию для каждого образца. Уровень экспрессии гена VEGFA выражали относительно уровня экспрессии гена β-актина.The culture mixture was removed from the plate wells, and then washed 2 times with a solution containing trypsin and versene in a ratio of 1: 3. Added 150 μl of a solution of trypsin and versene per well and incubated at 37 ° C for 10 minutes. 150 μl of 1 × PBS was added, centrifuged for 10 min at 2200 rpm, and the liquid fraction was drained. Then, RNA was isolated using a Trizol solution (Quiagen, Germany) according to the protocol of the manufacturer. For the synthesis of cDNA, 5 μl of RNA, 1 μl of hexoprimers (15 OE / ml) and 15 μl of H ₂ O were mixed, left for 5 min at 70 ° C, after which 2.5 μl of reverse transcriptase buffer, 4 μl of deoxyribonucleotides were added (2 mM), 0.5 μl reverse transcriptase (200 units act / μl). Amplification was carried out under the following conditions: 10 min at 25 ° C, 60 min at 37 ° C, 10 min at 70 ° C. The cDNA concentration was measured on a NanoDrop spectrophotometer (USA). For analysis of VEGFA gene expression, a real-time PCR reaction was performed using a kit (Syntol CJSC, Moscow), which included 10x Eva Green, a mixture of deoxyribonucleotides (2.5 mmol), MgCl ₂ (25 mmol), Taq polymerase ( 5 units / μl), dH ₂ O. The following primer sequences were used: F'-5TGCCGACAGGATGCAGAAG3 ', R-5'GCCGATCCACACGGAGTACT3' (to the β-actin gene); F-5'CAACATCACCATGCAGATTATGC3 ', R-5'CCCACAGGGATTTTCTTGTCTT3' (to the VEGFA gene). Amplification was performed using a Rotor-Gene 3000 thermal cycler (Corbett Research, Australia). The data obtained were analyzed using Rotor-Gene version 6.1.71 software (Corbett Research, Australia). The values of the threshold fluorescence cycle (Ct) were obtained for each sample in duplicate. Two calibration curves were constructed for the test and reference gene by linear regression. Next, using the method of relative quantitative analysis (Relative Quantitation), calculated the relative concentration for each sample. The level of expression of the VEGFA gene was expressed relative to the level of expression of the β-actin gene.

Результаты представлены на фиг.7.The results are presented in Fig.7.

Настоящее изобретение может быть использовано для направленной доставки генетического материала с целью коррекции генных дефектов, придания клеткам новых функций и лечения заболеваний. Наличие экспрессии CXCR4 более чем в 20 видах раковых опухолей позволяет говорить о важности данного изобретения для генной терапии ряда онкологических заболеваний. В число таких заболеваний входят рак груди, кишечника, легких, печени, желудка, печени, лейкемии и лимфомы. Специфическая доставка суицидных генов, генов-супрессоров опухоли, интерферирующих РНК приведет к избирательной гибели клеток, в которые проникли комплексы с соответствующим генетическим материалом. Рецептор CXCR4 присутствует на поверхности большинства типов стволовых клеток, стволовых клетках гематопоэтического ряда, костного мозга, миелоидных и лимфоидных стволовых клетках. Присутствие рецептора CXCR4 на стволовых клетках, предшественниках мышечных клеток позволяет говорить о возможном использовании данного изобретения для ех vivo терапии различных заболеваний.The present invention can be used for targeted delivery of genetic material in order to correct gene defects, give cells new functions and treat diseases. The presence of CXCR4 expression in more than 20 types of cancer tumors suggests the importance of this invention for gene therapy of a number of oncological diseases. Such diseases include cancer of the breast, intestines, lungs, liver, stomach, liver, leukemia, and lymphoma. Specific delivery of suicide genes, tumor suppressor genes, interfering RNAs will lead to selective death of cells into which complexes with the corresponding genetic material have penetrated. The CXCR4 receptor is present on the surface of most types of stem cells, hematopoietic stem cells, bone marrow, myeloid and lymphoid stem cells. The presence of the CXCR4 receptor on stem cells, the precursors of muscle cells, suggests the possible use of this invention for ex vivo therapy of various diseases.

Claims

1. A carrier for targeted delivery of nucleic acids to cells expressing a CXCR4 receptor, characterized in that the carrier consists of:
- ligand sequences for the CXCR4 receptor with the amino acid sequence - KPVSLSYRSPSRFFESH;
- a linker site of two molecules of ε-aminohexanoic acid connecting the ligand sequence to the sequence for compaction of nucleic acids;
- a sequence that ensures the compaction of nucleic acids and the exit of the complex from endosomes - CHRRRRRRHC.

2. The carrier according to claim 1, characterized in that plasmid DNA is used as the genetic material for the carriers.

3. The carrier according to claim 1, characterized in that the oligonucleotide sequences of RNA and DNA interfering with RNA are used as genetic material.