RU2707925C1 - Strain of bacteria salmonella enterica subspecies enterica serovar typhi as a control strain for phenotypic and molecular studies in diagnosing typhoid fever - Google Patents
Strain of bacteria salmonella enterica subspecies enterica serovar typhi as a control strain for phenotypic and molecular studies in diagnosing typhoid fever Download PDFInfo
- Publication number
- RU2707925C1 RU2707925C1 RU2019101943A RU2019101943A RU2707925C1 RU 2707925 C1 RU2707925 C1 RU 2707925C1 RU 2019101943 A RU2019101943 A RU 2019101943A RU 2019101943 A RU2019101943 A RU 2019101943A RU 2707925 C1 RU2707925 C1 RU 2707925C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- strain
- serovar typhi
- enterica
- typhoid fever
- salmonella enterica
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/42—Salmonella
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к микробиологии (бактериологии), а именно к разделу определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам и молекулярной детекции механизмов резистентности и может быть использовано в качестве контрольного штамма для контроля качества при диагностике брюшного тифа: на этапах фенотипических исследований (определение чувствительности к антибиотикам: выявление устойчивости высокого уровня к фторхинолонам) и молекулярных исследований (определение механизма устойчивости к фторхинолонам путем детекции мутаций в гене gyrA).The invention relates to microbiology (bacteriology), and in particular to the section for determining the sensitivity of microorganisms to antimicrobials and molecular detection of resistance mechanisms and can be used as a control strain for quality control in the diagnosis of typhoid fever: at the stages of phenotypic studies (determination of sensitivity to antibiotics: identification high level of resistance to fluoroquinolones) and molecular studies (determination of the mechanism of resistance to fluoroquinolones by mutation detection in the gyrA gene).
По литературным данным в различных странах мира выделяют штаммы Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi, устойчивые к фторхинолонам за счет мутаций в хромосомном гене gyrA. Большинство зарубежных штаммов имеют устойчивость низкого уровня к фторхинолонам, обусловленную одной мутацией вида Ser83Phe. Штаммы Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi, выделенные в других странах, не могут быть ввезены и использованы в качестве контрольных штаммов при диагностике брюшного тифа в РФ. На территории РФ штаммы Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi, характеризующиеся устойчивостью высокого уровня к фторхинолонам, обусловленной двумя мутациями в хромосомном гена gyrA вида Ser83Phe и Asp87Asn ранее не обнаружены, не изучены и не депонированы.According to literature data, strains of Salmonella enterica sbsp are isolated in different countries of the world. enterica serovar Typhi resistant to fluoroquinolones due to mutations in the gyrA chromosomal gene. Most foreign strains have low resistance to fluoroquinolones, due to a single mutation of the species Ser83Phe. Strains of Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi isolated in other countries cannot be imported and used as control strains in the diagnosis of typhoid fever in the Russian Federation. In the territory of the Russian Federation, strains of Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi, characterized by a high level of resistance to fluoroquinolones caused by two mutations in the chromosome of the gyrA gene of the species Ser83Phe and Asp87Asn, have not been previously detected, studied, or deposited.
При диагностике брюшного тифа необходимо проводить постоянный контроль качества различных этапов исследования, в том числе при определении чувствительности штаммов Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi к существующим антимикробным препаратам, использующимся для лечения брюшного тифа в качестве препаратов первого выбора (фторхинолонов). Для разработки новых фторхинолонов для лечения брюшного тифа необходимо точно установить механизмы устойчивости к антибиотикам молекулярными методами. Для контроля качества этих этапов исследования требуются контрольные штаммы Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi с известным уровнем устойчивости к фторхинолонам и известным механизмом устойчивости (мутациями в хромосомных генах).When diagnosing typhoid fever, it is necessary to constantly monitor the quality of various stages of the study, including when determining the sensitivity of Salmonella enterica sbsp strains. enterica serovar Typhi to existing antimicrobials used to treat typhoid fever as the first choice (fluoroquinolones). To develop new fluoroquinolones for the treatment of typhoid fever, it is necessary to precisely establish the mechanisms of antibiotic resistance by molecular methods. To control the quality of these stages of the study, control strains of Salmonella enterica sbsp are required. enterica serovar Typhi with a known level of resistance to fluoroquinolones and a known resistance mechanism (mutations in chromosomal genes).
Наиболее близким по сущности к заявляемому изобретению является штамм Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi, выделенный в Камбоджи, который имеет такие же две мутации в хромосомном гене gyrA (Ser83Phe и Asp87Asn), как и штамм, предлагаемый в качестве изобретения (Kuijpers LMF, Phe Т, Veng СН, Lim K, Ieng S, Kham С, et al. (2017) The clinical and microbiological characteristics of enteric fever in Cambodia, 2008-2015//PLoS. Negl. Trop. Dis. - 2017. - Vol. 11, №9: e0005964. https://doi.org/10.1371/journal. pntd.0005964). Однако данный штамм характеризуется устойчивостью к хинолонам низкого уровня (минимальная подавляющая концентрация ципрофлоксацина составляет 0,38 мг/л) и может быть использован в качестве контрольного штамма при изучении штаммов с устойчивостью только низкого уровня (с минимальной подавляющей концентрацией ципрофлоксацина от 0,12 до 0,5 мг/л) и не позволяет проводить контроль диагностики штаммов с устойчивостью высокого уровня (с минимальной подавляющей концентрацией ципрофлоксацина от 2,0 до 32,0 мг/л).The closest in essence to the claimed invention is a strain of Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi, isolated in Cambodia, which has the same two mutations in the gyrA chromosome gene (Ser83Phe and Asp87Asn) as the strain of the invention (Kuijpers LMF, Phe T, Veng CH, Lim K, Ieng S, Kham C , et al. (2017) The clinical and microbiological characteristics of enteric fever in Cambodia, 2008-2015 // PLoS. Negl. Trop. Dis. - 2017 .-- Vol. 11, No. 9: e0005964. https: // doi. org / 10.1371 / journal.pntd.0005964). However, this strain is characterized by resistance to low quinolones (the minimum inhibitory concentration of ciprofloxacin is 0.38 mg / l) and can be used as a control strain when studying strains with only low resistance (with a minimum inhibitory concentration of ciprofloxacin from 0.12 to 0 , 5 mg / l) and does not allow monitoring the diagnosis of strains with high level stability (with a minimum inhibitory concentration of ciprofloxacin from 2.0 to 32.0 mg / l).
Предлагаемый в качестве изобретения штамм Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi B-8452 помогает преодолеть это ограничение, поскольку характеризуется двумя свойствами, позволяющими использовать его как контрольный штамм (устойчивостью высокого уровня (минимальная подавляющая концентрация ципрофлоксацина составляет 6,0 мг/л) и двумя мутациями в хромосомном гена gyrA вида Ser83Phe и Asp87Asn) и может быть использован в качестве контрольного штамма при изучении штаммов с устойчивостью высокого уровня в рамках диагностики брюшного тифа.Proposed as an invention, a strain of Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi B-8452 helps to overcome this limitation, because it is characterized by two properties that allow it to be used as a control strain (high level resistance (minimum inhibitory concentration of ciprofloxacin is 6.0 mg / l) and two mutations in the chromosomal gyrA gene of the species Ser83Phe and Asp87Asn ) and can be used as a control strain in the study of strains with high level resistance in the diagnosis of typhoid fever.
Изобретение направлено на разработку контрольного штамма Salmonella enterica sbsp. serovar Typhi, необходимого для обеспечения достоверной диагностики и лечения брюшного тифа.The invention is directed to the development of a control strain of Salmonella enterica sbsp. serovar Typhi, necessary to ensure reliable diagnosis and treatment of typhoid fever.
Авторами получен контрольный штамм для контроля качества различных этапов лабораторной диагностики брюшного тифа, с устойчивостью высокого уровня к фторхинолонам и двумя мутациями в гене gyrA вида Ser83Phe и Asp87Asn.The authors obtained a control strain for quality control of various stages of laboratory diagnosis of typhoid fever, with high resistance to fluoroquinolones and two mutations in the gyrA gene of the species Ser83Phe and Asp87Asn.
Заявляемый штамм выделен от больного брюшным тифом, идентифицирован до вида Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi бактериологическими и серологическими методами. Устойчивость высокого уровня к фторхинолонам установлена стандартизованными методами диско-диффузионным и градиентных концентраций; наличие и вид мутаций в хромосомном гене gyrA определено при анализе данных полногеномного секвенирования штамма на приборе MiSeq с использованием наборов реагентов MiSeq Reagent Kit v2 и Nextera XT (Illumina, США). Сборку и анализ геномов проводили с помощью CLC Genomics Workbench 8.0 (QIAGEN, США).The inventive strain isolated from a patient with typhoid fever, identified to the species Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi by bacteriological and serological methods. High level resistance to fluoroquinolones is established by standardized methods of disco-diffusion and gradient concentrations; The presence and type of mutations in the gyrA chromosomal gene was determined by analyzing the data of genome-wide sequencing of the strain on the MiSeq instrument using the MiSeq Reagent Kit v2 and Nextera XT reagent kits (Illumina, USA). The assembly and analysis of genomes was carried out using CLC Genomics Workbench 8.0 (QIAGEN, USA).
Штамм депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» под номером В-8452.The strain is deposited in the State collection of pathogenic microorganisms and cell cultures "GKPM-Obolensk" under the number B-8452.
Характеристика штамма Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi B-8452.Characterization of the strain Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi B-8452.
Морфологические признаки: клетки прямые, палочковидной формы, подвижные, с перитрихиальными жгутиками, грамотрицательные, неспорообразующие.Morphological signs: cells are straight, rod-shaped, motile, with peritrichous flagella, gram-negative, non-spore-forming.
Патогенные свойства: штамм патогенный для человека, 3 группа патогенности согласно СП 1.2.036-95 и СП 1.3.2322-08.Pathogenic properties: pathogenic strain for humans, group 3 pathogenicity according to SP 1.2.036-95 and SP 1.3.2322-08.
Культуральные свойства: хемоорганотроф, каталазоположительный, оксидозоотрицательный, растет на питательных средах (агар Эндо, висмут-сульфит-агар, гектоен-агар, XLD-arap, агар Плоскирева) при оптимальной температуре 37°С при рН 7,2, образуя характерные для бактерий Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi колонии.Cultural properties: chemoorganotroph, catalase-positive, oxide-negative, grows on nutrient media (Endo agar, bismuth-sulfite-agar, hectoen-agar, XLD-arap, Ploskirev agar) at an optimum temperature of 37 ° C at pH 7.2, forming bacteria-specific Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi colony.
Антигенная характеристика: по результатам серологического исследования штамм относится к группе O9 (D), серовару S.Typhi и имеет антигенную формулу 9,12, Vi:d:-Antigenic characteristics: according to the results of serological studies, the strain belongs to the O9 (D) group, S. Typhi serovar and has the antigenic formula 9,12, Vi: d: -
Основные свойства штамма:The main properties of the strain:
1. Устойчивость высокого уровня к фторхинолонам:1. High level resistance to fluoroquinolones:
- минимальная подавляющая концентрация налидиксовой кислоты более 256,0 мг/л, диаметр зоны задержки роста - 6 мм;- the minimum inhibitory concentration of nalidixic acid is more than 256.0 mg / l, the diameter of the zone of growth inhibition is 6 mm;
- минимальная подавляющая концентрация ципрофлоксацина - 6,0 мг/л;- the minimum inhibitory concentration of ciprofloxacin is 6.0 mg / l;
- диаметр зоны задержки роста вокруг диска с пефлоксацином - 6 мм.- the diameter of the zone of growth inhibition around the disk with pefloxacin is 6 mm.
Стабильность свойств штамма Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi B-8452 (диаметров зон задержки роста и значений минимальных подавляющих концентраций) подтверждена путем повторения в течение 7 дней процедуры определения чувствительности к фторхинолонам диско-диффузионным методом и методом градиентных концентраций с агаром Мюллера-Хинтон, дисков и полосок с антибиотиками различных производителей: Oxoid (Великобритания), BioRad (США), HiMedia (Индия) и НИЦФ (Россия). Штамм давал стабильные результаты на агарах, дисках и полосках всех производителей при тестировании в течение 7 дней.The stability of the properties of the strain Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi B-8452 (diameters of growth inhibition zones and minimum inhibitory concentrations) was confirmed by repeating within 7 days the procedure for determining the sensitivity to fluoroquinolones by the disk diffusion method and the gradient concentration method with Mueller-Hinton agar, disks and strips with antibiotics from various manufacturers : Oxoid (UK), BioRad (USA), HiMedia (India) and NICF (Russia). The strain gave stable results on agar, discs and strips of all manufacturers when tested for 7 days.
2. Молекулярный механизм устойчивости к фторхинолонам: две мутации в хромосомном гене gyrA вида Ser83Phe и Asp87Asn. Стабильность наличия мутаций в геноме контрольного штамма Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi B-8452 подтверждалась повторным секвенированием ДНК штамма и анализом нуклеотидной последовательности после хранения штамма в течение 6 мес.при -70°С на криосреде.2. The molecular mechanism of resistance to fluoroquinolones: two mutations in the chromosomal gyrA gene of the species Ser83Phe and Asp87Asn. Stability of mutations in the genome of the control strain of Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi B-8452 was confirmed by repeated sequencing of the DNA strain and analysis of the nucleotide sequence after storage of the strain for 6 months at -70 ° C on a cryomedium.
Изобретение реализуется следующим образом.The invention is implemented as follows.
Пример 1. Контроль качества определения чувствительности возбудителя брюшного тифа S.Typhi к антимикробным препаратам диско-диффузионным методом.Example 1. Quality control of determining the sensitivity of the causative agent of typhoid fever S. Typhi to antimicrobial agents by the disk diffusion method.
Чувствительность штаммов Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi к фторхинолонам диско-диффузионным методом проводили согласно Клиническим рекомендациям «Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам» версия 03-2018. Использовали чашки Петри с агаром Мюллера-Хинтон высотой 4 мм. Исследуемые штаммы и контрольный штамм выращивали на кровяном агаре в течении 24 часов при +37°С. Для каждого исследуемого штамма и контрольного штамма отбирали несколько изолированных однотипных колоний и готовили инокулюмы мутностью 0,5 MF в стерильном 0,9% растворе хлорида натрия. Инокулюмы засевали ватным стерильным тампоном на отдельные чашки Петри с агаром; накладывали диски, пропитанные антибиотиками - налидиксовая кислота, 30 мкг и пефлоксацин 5 мкг. Инкубировали посевы в течении 24 часов при +35°С. Учитывали результат путем измерения зоны задержки роста культуры вокруг дисков с антибиотиками, интерпретировали результат согласно Клиническим рекомендациям и относили исследуемые штаммы к категориям «Чувствительный», «Устойчивый», «Промежуточный». Контрольный штамм Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi B-8452 проявлял заявленные свойства и давал стабильные результаты: диаметр зоны задержки роста вокруг диска с налидиксовой кислотой - 6 мм, вокруг диска с пефлоксацином - 6 мм и относился к категории «Устойчивый» к фторхинолонам.The sensitivity of strains of Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi to fluoroquinolones by the disk diffusion method was carried out according to the Clinical recommendations “Determination of the sensitivity of microorganisms to antimicrobial agents” version 03-2018. Used Petri dishes with Muller-Hinton agar 4 mm high. The studied strains and the control strain were grown on blood agar for 24 hours at + 37 ° C. For each studied strain and control strain, several isolated colonies of the same type were selected and inoculums with a turbidity of 0.5 MF were prepared in a sterile 0.9% sodium chloride solution. Inoculums were seeded with a sterile cotton swab on separate Petri dishes with agar; Antibiotic-impregnated discs were applied - nalidixic acid, 30 μg and pefloxacin 5 μg. Crops were incubated for 24 hours at + 35 ° C. The result was taken into account by measuring the growth inhibition zone of the culture around antibiotic disks, the result was interpreted according to the Clinical recommendations, and the studied strains were categorized as “Sensitive”, “Stable”, “Intermediate”. The control strain of Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi B-8452 showed the claimed properties and gave stable results: the diameter of the growth inhibition zone around the disk with nalidixic acid was 6 mm, around the disk with pefloxacin it was 6 mm and belonged to the category of “Resistant” to fluoroquinolones.
Пример 2. Контроль качества определения чувствительности возбудителя брюшного тифа S.Typhi к антимикробным препаратам методом градиентной диффузии.Example 2. Quality control of determining the sensitivity of the causative agent of typhoid fever S. Typhi to antimicrobial agents by gradient diffusion.
Чувствительность штаммов Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi к фторхинолонам методом градиентной диффузии проводили согласно Клиническим рекомендациям «Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам» версия 03-2018. Использовали чашки Петри с агаром Мюллера-Хинтон высотой 4 мм. Исследуемые штаммы и контрольный штамм выращивали на кровяном агаре в течении 24 часов при +37°С. Для каждого исследуемого штамма и контрольного штамма отбирали несколько изолированных однотипных колоний и готовили инокулюмы мутностью 0,5 MF в стерильном 0,9% растворе хлорида натрия. Инокулюмы засевали ватным стерильным тампоном на отдельные чашки Петри с агаром; накладывали градуированные полоски, пропитанные антибиотиками в градиенте концентраций: налидиксовая кислота - от 0,016 мг/л до 256,0 мг/л и ципрофлоксацин - от 0,002 мг/л до 32,0 мг/л. Инкубировали посевы в течении 24 часов при +35°С. Учитывали значение концентрации в месте пересечения эллипсовидной зоны задержки роста штамма с полоской, интерпретировали результат согласно Клиническим рекомендациям и относили исследуемые штаммы к категориям «Чувствительный», «Устойчивый», «Промежуточный». Контрольный штамм Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi B-8452 проявлял заявленные свойства и давал стабильные результаты: значение минимальной подавляющей концентрации налидиксовой кислотой составляло более 256,0 мг/л (полное отсутствие зоны задержки роста вокруг полоски), ципрофлоксацина - 6 мг/л. Контрольный штамм относился к категории «Устойчивый» к фторхинолонам, уровень устойчивости расценивался как высокий.The sensitivity of strains of Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi to fluoroquinolones by the method of gradient diffusion was carried out according to the Clinical recommendations "Determination of the sensitivity of microorganisms to antimicrobials" version 03-2018. Used Petri dishes with Muller-Hinton agar 4 mm high. The studied strains and the control strain were grown on blood agar for 24 hours at + 37 ° C. For each studied strain and control strain, several isolated colonies of the same type were selected and inoculums with a turbidity of 0.5 MF were prepared in a sterile 0.9% sodium chloride solution. Inoculums were seeded with a sterile cotton swab on separate Petri dishes with agar; Graduated strips were impregnated with antibiotics in a concentration gradient: nalidixic acid - from 0.016 mg / l to 256.0 mg / l and ciprofloxacin - from 0.002 mg / l to 32.0 mg / l. Crops were incubated for 24 hours at + 35 ° C. The concentration value at the intersection of the ellipsoid zone of the growth inhibition of the strain with the strip was taken into account, the result was interpreted according to the Clinical Recommendations, and the studied strains were classified as “Sensitive”, “Stable”, “Intermediate”. The control strain of Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi B-8452 showed the claimed properties and gave stable results: the value of the minimum inhibitory concentration of nalidixic acid was more than 256.0 mg / l (complete absence of the growth inhibition zone around the strip), ciprofloxacin - 6 mg / l. The control strain belonged to the category “Resistant” to fluoroquinolones, the level of resistance was regarded as high.
Пример 3. Контроль качества определения механизма устойчивости к фторхинолонам путем детекции мутаций в гене gyrA по данным полногеномного секвенирования.Example 3. Quality control to determine the mechanism of resistance to fluoroquinolones by detecting mutations in the gyrA gene according to genome sequencing.
Детекцию мутаций в хромосомном гене gyrA проводили путем анализа данных полногеномного секвенирования. Выделение ДНК из исследуемых штаммов и контрольного штамма Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi B-8452 проводили с использованием набора QIAamp DNA Mini Kit для выделения ДНК из тканей, мазков, крови и биологическихжидкостей (QIAGEN) согласно инструкции производителя. Качество и количество полученной ДНК оценили путем электрофореза в 0,5×ТВЕ-буфере в 1,5% агарозном геле, а также используя спектрофотометр QIAxpert при длине волны 260 нм. Подготовку библиотек проводили с использованием набора для подготовки библиотек Nextera DNA Sample Preparation Kit, набора индексов Nextera Index Kit и сменных крышек, магнитных частиц AMPure ХР Beads согласно стандартному протоколу производителя. Секвенирование геномов исследуемых штаммов и контрольного штамма проводили на приборе MiSeq с использованием наборов реагентов MiSeq Reagent Kit v2 и Nextera XT (Illumina, США). Сборку и анализ геномов проводили с помощью CLC Genomics Workbench 8.0 (QIAGEN, США). Поиск мутаций в хромосомных генах, отвечающих за устойчивость к фторхинолонам, у исследуемых штаммов и контрольного штамма проводили с помощью веб-сервера ResFinder Датского Технического Университета, куда вводили данные секвенирования в формате fasta. Контрольный штамм Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi B-8452 проявлял заявленные свойства: стабильно обнаруживались две мутации в хромосомном гене gyrA вида Ser83Phe и Asp87Asn.Mutation in the gyrA chromosomal gene was detected by analysis of genome-wide sequencing data. Isolation of DNA from the studied strains and the control strain of Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi B-8452 was performed using the QIAamp DNA Mini Kit to isolate DNA from tissues, smears, blood, and biological fluids (QIAGEN) according to the manufacturer's instructions. The quality and quantity of the obtained DNA was evaluated by electrophoresis in 0.5 × TBE buffer in a 1.5% agarose gel, and also using a QIAxpert spectrophotometer at a wavelength of 260 nm. The libraries were prepared using the Nextera DNA Sample Preparation Kit, the Nextera Index Kit and replaceable covers, AMPure XP Beads magnetic particles according to the manufacturer's standard protocol. The genomes of the studied strains and the control strain were sequenced using a MiSeq instrument using the MiSeq Reagent Kit v2 and Nextera XT reagent kits (Illumina, USA). The assembly and analysis of genomes was carried out using CLC Genomics Workbench 8.0 (QIAGEN, USA). Mutations in the chromosomal genes responsible for resistance to fluoroquinolones in the studied strains and the control strain were carried out using the ResFinder web server of the Danish Technical University, where sequencing data in fasta format was entered. The control strain of Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi B-8452 showed the claimed properties: two mutations were stably found in the chromosomal gyrA gene of the species Ser83Phe and Asp87Asn.
Для обеспечения достоверной диагностики брюшного тифа необходимо проводить контроль качества на каждом этапе исследования материала. Предлагаемый штамм Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi B-8452 обладает стабильными свойствами, позволяющими контролировать два этапа диагностики: этап определение чувствительности и устойчивости высокого уровня возбудителя к фторхинолонам двумя фенотипическими методами, а также этапа определения механизма устойчивости (двух мутаций в гене gyrA вида Ser83Phe и Asp87Asn) молекулярными методами.To ensure reliable diagnosis of typhoid fever, it is necessary to conduct quality control at each stage of the study of the material. The proposed strain of Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi B-8452 has stable properties that allow you to control two stages of diagnosis: the stage of determining the sensitivity and resistance of a high level of the pathogen to fluoroquinolones by two phenotypic methods, as well as the stage of determining the resistance mechanism (two mutations in the gyrA gene of the species Ser83Phe and Asp87Asn) by molecular methods.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019101943A RU2707925C1 (en) | 2019-01-24 | 2019-01-24 | Strain of bacteria salmonella enterica subspecies enterica serovar typhi as a control strain for phenotypic and molecular studies in diagnosing typhoid fever |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019101943A RU2707925C1 (en) | 2019-01-24 | 2019-01-24 | Strain of bacteria salmonella enterica subspecies enterica serovar typhi as a control strain for phenotypic and molecular studies in diagnosing typhoid fever |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2707925C1 true RU2707925C1 (en) | 2019-12-02 |
Family
ID=68836431
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2019101943A RU2707925C1 (en) | 2019-01-24 | 2019-01-24 | Strain of bacteria salmonella enterica subspecies enterica serovar typhi as a control strain for phenotypic and molecular studies in diagnosing typhoid fever |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2707925C1 (en) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2744203C1 (en) * | 2020-06-29 | 2021-03-03 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека" (ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера) | Strain of bacteria salmonella enterica sbsp_ enterica serovar kentucky b-9045 of the international multiresistant clone of salmonella kentucky st198 used as a control strain for phenotypic and molecular studies in diagnosing salmonellosis |
| RU2744205C1 (en) * | 2020-06-29 | 2021-03-03 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека" (ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера) | Strain of bacteria salmonella enterica subsp_ enterica serovar newport b-9044 of the international multiresistant clone of salmonella newport mdr-ampc/cmy-2, used as a control strain for phenotypic and molecular studies in diagnosing salmonellosis |
| RU2753412C1 (en) * | 2020-12-04 | 2021-08-16 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов" (ФГБУ "ВГНКИ") | Strain of salmonella enterica bacteria as control strain for phenotypic and molecular studies in diagnosis of salmonellosis |
| RU2759396C1 (en) * | 2020-12-22 | 2021-11-12 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов" (ФГБУ "ВГНКИ") | Salmonella enterica bacterial strain (vkshm-b-849 m) as a control strain for microbiological and molecular genetic studies in determining antibiotic resistance |
| RU2782213C1 (en) * | 2021-12-29 | 2022-10-24 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов" (ФГБУ "ВГНКИ") | Salmonella infantis bacterial strain used as a positive control for molecular genetic and microbiological studies related to the determination of sensitivity of microorganisms to antibacterial drugs |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2520161C1 (en) * | 2013-03-22 | 2014-06-20 | Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИСХМ Россельхозакадемии) | Salmonella enteritidis var issatschenko 32/3 bacteria strain as means for obtaining biological attractant against mouse-like rodents |
-
2019
- 2019-01-24 RU RU2019101943A patent/RU2707925C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2520161C1 (en) * | 2013-03-22 | 2014-06-20 | Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИСХМ Россельхозакадемии) | Salmonella enteritidis var issatschenko 32/3 bacteria strain as means for obtaining biological attractant against mouse-like rodents |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| ЕЛИУСИЗОВА А.Б. и др. "Чувствительность к фторхинолонам сальмонелл в Сибири и на Дальнем Востоке" // Тихоокеанский медицинский журнал, 2010, N 4, с.51-54. * |
| ЕЛИУСИЗОВА А.Б. и др. "Чувствительность к фторхинолонам сальмонелл в Сибири и на Дальнем Востоке" // Тихоокеанский медицинский журнал, 2010, N 4, с.51-54. КАФТЫРЕВА Л.А. и др. "Многообразие механизмов антибиотикорезистентности сальмонелл" // Инфекция и иммунитет, 2011, т.1, N 4, с.303-310. * |
| КАФТЫРЕВА Л.А. и др. "Многообразие механизмов антибиотикорезистентности сальмонелл" // Инфекция и иммунитет, 2011, т.1, N 4, с.303-310. * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2744203C1 (en) * | 2020-06-29 | 2021-03-03 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека" (ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера) | Strain of bacteria salmonella enterica sbsp_ enterica serovar kentucky b-9045 of the international multiresistant clone of salmonella kentucky st198 used as a control strain for phenotypic and molecular studies in diagnosing salmonellosis |
| RU2744205C1 (en) * | 2020-06-29 | 2021-03-03 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека" (ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера) | Strain of bacteria salmonella enterica subsp_ enterica serovar newport b-9044 of the international multiresistant clone of salmonella newport mdr-ampc/cmy-2, used as a control strain for phenotypic and molecular studies in diagnosing salmonellosis |
| RU2753412C1 (en) * | 2020-12-04 | 2021-08-16 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов" (ФГБУ "ВГНКИ") | Strain of salmonella enterica bacteria as control strain for phenotypic and molecular studies in diagnosis of salmonellosis |
| RU2759396C1 (en) * | 2020-12-22 | 2021-11-12 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов" (ФГБУ "ВГНКИ") | Salmonella enterica bacterial strain (vkshm-b-849 m) as a control strain for microbiological and molecular genetic studies in determining antibiotic resistance |
| RU2782213C1 (en) * | 2021-12-29 | 2022-10-24 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов" (ФГБУ "ВГНКИ") | Salmonella infantis bacterial strain used as a positive control for molecular genetic and microbiological studies related to the determination of sensitivity of microorganisms to antibacterial drugs |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2707925C1 (en) | Strain of bacteria salmonella enterica subspecies enterica serovar typhi as a control strain for phenotypic and molecular studies in diagnosing typhoid fever | |
| Jurcisek et al. | The PilA protein of non‐typeable Haemophilus influenzae plays a role in biofilm formation, adherence to epithelial cells and colonization of the mammalian upper respiratory tract | |
| Matsuda et al. | Sensitive quantitative detection of commensal bacteria by rRNA-targeted reverse transcription-PCR | |
| Graells et al. | Legionella pneumophila recurrently isolated in a Spanish hospital: Two years of antimicrobial resistance surveillance | |
| RU2707548C1 (en) | Strain of bacteria salmonella enterica subspecies enterica serovar typhi b-8453 with low level resistance to fluoroquinolones, used as a control strain for phenotypic and molecular studies in diagnosing typhoid fever | |
| Lopes et al. | Discriminating typical and atypical cystic fibrosis‐related bacteria by multiplex PNA‐FISH | |
| CN112961805B (en) | Salmonella typhimurium with quinolone drug resistance genes gyrA and parE mutated simultaneously and application thereof | |
| CN112961804B (en) | Salmonella typhimurium and application thereof | |
| RU2744203C1 (en) | Strain of bacteria salmonella enterica sbsp_ enterica serovar kentucky b-9045 of the international multiresistant clone of salmonella kentucky st198 used as a control strain for phenotypic and molecular studies in diagnosing salmonellosis | |
| Ghielmetti et al. | Advancing animal tuberculosis surveillance using culture-independent long-read whole-genome sequencing | |
| KR101999574B1 (en) | Direct detection of the active form of beta-lactam-hydrolysing enzymes by using Mass spectrophotometry | |
| Marquetoux et al. | What counts? A review of in vitro methods for the enumeration of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis | |
| Seng et al. | Phenotypic and genetic alterations of Burkholderia pseudomallei in patients during relapse and persistent infections | |
| Mozioğlu et al. | Oligomer based real-time detection of microorganisms producing nuclease enzymes | |
| RU2744205C1 (en) | Strain of bacteria salmonella enterica subsp_ enterica serovar newport b-9044 of the international multiresistant clone of salmonella newport mdr-ampc/cmy-2, used as a control strain for phenotypic and molecular studies in diagnosing salmonellosis | |
| Podgorny et al. | Isolation of single Chlamydia-infected cells using laser microdissection | |
| CN104032032A (en) | Peptide nucleic acid probe set and kit used for detecting pseudomonas aeruginosa, klebsiella pneumoniae and/or baumanii | |
| JP2018068261A (en) | Lamp method primer set, examination kit for staphylococcus epidermis and method of examining staphylococcus epidermis | |
| RU2782213C1 (en) | Salmonella infantis bacterial strain used as a positive control for molecular genetic and microbiological studies related to the determination of sensitivity of microorganisms to antibacterial drugs | |
| RU2567011C2 (en) | PEPTIDE-NUCLEIC ACID PROBE, SET AND METHOD FOR DETECTION AND/OR QUANTITATIVE DETERMINATION OF Salmonella spp AND THEIR APPLICATIONS | |
| RU2752895C1 (en) | Salmonella enterica bacterial strain vgnki-11 (vkshm-b-848m) as control strain for phenotypic and molecular studies in diagnosis of salmonellosis | |
| AYA et al. | Multi-locus Sequence Typing of Multi-Drug Resistant Escherichia coli isolated from Urinary Tract Infections. | |
| Al-Maeni | Detecting the Variation in the lasI Gene and Their Relation with Biofilm in Pseudomonas aeruginosa Isolates | |
| Pinatih et al. | Phenotypic and genotypic of gram-positive coccus β-hemolysis bacteria isolatesfrom tonsil and nasal of pig and antimicrobial susceptibility test against penicillin G and tetracycline | |
| RU2753412C1 (en) | Strain of salmonella enterica bacteria as control strain for phenotypic and molecular studies in diagnosis of salmonellosis |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20210125 |