RU2706071C1

RU2706071C1 - Test system and method for production thereof

Info

Publication number: RU2706071C1
Application number: RU2018130736A
Authority: RU
Inventors: Ирина Николаевна Сабурина; Анастасия Алексеевна Горкун; Тамара Дмитриевна Колокольцова; Настасья Владимировна Кошелева; Ирина Михайловна Зурина; Екатерина Витальевна Джуссоева; Сергей Георгиевич Морозов
Priority date: 2018-08-24
Filing date: 2018-08-24
Publication date: 2019-11-13

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: invention relates to the field of biotechnology, namely to a cell spheroid, its production and evaluation of the effect on the functional activity of melanocytes. Method involves suspending a melanocyte culture in a complete growth medium for melanocytes, sowing the melanocyte culture on petri dishes in density of 104 kl/cm², passaging of culture to produce culture of melanocytes of passage 3, dissolution of agarose in basic growth medium to obtain agarose solution with concentration of 20 g/l, placing agarose solution into a plastic mold to obtain a plastic mold containing polymerised agarose, extruding polymerised agarose from a plastic mold into a base growth medium to obtain an agarose plate and transplanting culture of passage 3 melanocytes on prepared agarose plate to obtain cell spheroid. Cell spheroid is placed in a complete growth medium for melanocytes, is in non-adhesive conditions, contains 500–3,000 melanocytes, has a spherical shape, a smooth surface, diameter of 50–200 mcm, is capable of melanin synthesis, wherein the melanocytes in the spheroid composition do not proliferate in the absence of the assessed physical and/or chemical effect. Method for evaluating effect of functional activity of melanocytes using cell spheroid includes physical and/or chemical action on cellular spheroid, measurement of functional activity level of melanocytes in cell spheroid and evaluation of effect of impact by comparing level of functional activity of melanocytes in cell spheroid subjected to action, with level of functional activity of melanocytes in cell spheroid of control group.

EFFECT: invention widens the range of available technical means.

37 cl, 1 tbl, 15 dwg, 2 ex

Description

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, а именно, к технологии создания тканеинженерных конструкций. Также настоящее изобретение относится к области разработки биологических тест - систем.The present invention relates to the field of biotechnology, namely, to the technology of creating tissue-engineering structures. Also, the present invention relates to the field of development of biological test systems.

Кожа человека является самым большим его органом и защищает организм от широкого спектра внешних воздействий, начиная от ультрафиолетового излучения и механического повреждения, заканчивая защитой от проникновения патогенных микроорганизмов. В коже выделяют три основных слоя - эпидермис, дерма и гиподерма (подкожная жировая ткань) (Montagna W., 2012). Верхний слой -эпидермис отделен от дермы базальной мембраной и представляет собой многослойный эпителий. Так как основная популяция клеток способна синтезировать кератин, то называются эти клетки кератиноциты. Кроме кератиноцитов в эпидермисе также присутствуют меланоциты и клетки Лангерганса (Быков В.Л., 2007).Human skin is its largest organ and protects the body from a wide range of external influences, ranging from ultraviolet radiation and mechanical damage, ending with protection against the penetration of pathogenic microorganisms. Three main layers are distinguished in the skin - the epidermis, dermis and hypodermis (subcutaneous adipose tissue) (Montagna W., 2012). The upper layer of the epidermis is separated from the dermis by the basement membrane and is a multilayer epithelium. Since the main population of cells is capable of synthesizing keratin, keratinocytes are called these cells. In addition to keratinocytes, the epidermis also contains melanocytes and Langerhans cells (Bykov V.L., 2007).

Меланоциты - клетки-производные нервного гребня, которые синтезируют меланин для защиты внутренних слоев кожи от солнечного ультрафиолетового излучения. Воздействие ультрафиолета (УФ) приводит к фотостарению кожи, что вызывает утолщение и атрофию эпидермального слоя за счет накопления дезорганизованного коллагена и эластина. Фотостарение сопровождается появлением глубоких морщин и пигментных пятен, пожелтением, дряблостью и сухостью кожи, телеангиоэктазией, предопухолевыми поражениями, атрофией, эластозом и актинической пурпурой (Helfrich et al., 2008).Melanocytes are derived cells of the neural crest that synthesize melanin to protect the inner layers of the skin from solar ultraviolet radiation. Exposure to ultraviolet radiation (UV) leads to photoaging of the skin, which causes thickening and atrophy of the epidermal layer due to the accumulation of disorganized collagen and elastin. Photoaging is accompanied by the appearance of deep wrinkles and age spots, yellowing, sagging and dry skin, telangiectasia, precancerous lesions, atrophy, elastosis and actinic purpura (Helfrich et al., 2008).

Одним из защитных механизмом кожи против воздействий УФ является активная продукция меланина и перенос его из меланоцитов в кератиноциты с помощью меланосом. Меланин препятствует проникновению УФ в глубокие слои кожи и блокирует выброс АФК. В меланоцитах кожи в основном синтезируется два типа меланина - эумеланин, (черный пигмент) и феомеланин (пигмент красного или желтого типа). Пигментный фенотип кожи в основном определяет рецептор к меланокортину 1 (MCR1). Активация этого рецептора его агонистами α-меланоцит стимулирующим гормоном (αMSH) и адренокортикотропным гормоном (АКТГ) стимулирует меланогенный каскад, приводящий к синтезу эумеланина. Антагонист - сигнальный белок Agouti (ASP) - может обратить описанный процесс и активировать синтез феомеланина (Yamaguchi et al., 2007). Кроме того, интенсивность синтеза меланина в меланоцитах напрямую зависит от количества и активности в клетке фермента тирозиназы, который катализирует два первых этапа образования меланина: гидроксилирование L-тирозина в L-дигидроксифенилаланин (L-DOPA, L-ДОФА) и последующее окисление L-ДОФА в соответствующий хинон - L-дофахинон. Триггером, переключающим дальнейшим синтез, является цистеин: в его присутствии образуется феомеланин, в противном случае - эумеланин (Gillbro et al., 2011).One of the protective mechanisms of the skin against UV exposure is the active production of melanin and its transfer from melanocytes to keratinocytes using melanosomes. Melanin prevents the penetration of UV into the deeper layers of the skin and blocks the release of ROS. In skin melanocytes, two types of melanin are mainly synthesized - eumelanin, (black pigment) and pheomelanin (pigment of red or yellow type). The pigmented phenotype of the skin mainly determines the receptor for melanocortin 1 (MCR1). Activation of this receptor by its agonists α-melanocyte stimulating hormone (αMSH) and adrenocorticotropic hormone (ACTH) stimulates the melanogenic cascade, leading to the synthesis of eumelanin. The antagonist, the Agouti signaling protein (ASP), can reverse the described process and activate the synthesis of pheomelanin (Yamaguchi et al., 2007). In addition, the intensity of melanin synthesis in melanocytes directly depends on the amount and activity of the tyrosinase enzyme in the cell, which catalyzes the first two stages of melanin formation: hydroxylation of L-tyrosine to L-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA, L-DOPA) and subsequent oxidation of L-DOPA to the corresponding quinone - L-dopaquinone. The trigger switching the further synthesis is cysteine: in its presence pheomelanin is formed, otherwise eumelanin (Gillbro et al., 2011).

Таким образом, поддержание постоянной пигментации кожи зависит от множества последовательных процессов: миграции меланобластов в ткань в течение эмбриогенеза, их жизнеспособности и дифференцировки в меланоциты, плотности меланоцитов в коже, структурных компонентов меланом и синтеза различных типов меланина (эу- и феомеланина), созревания и транспортировки меланосом в дендритные отростки меланоцитов и переноса их в кератиноциты, и, наконец, от распределения меланина в супрабазальных слоях кожи (Yamaguchi et al., 2007).Thus, maintaining constant skin pigmentation depends on many successive processes: migration of melanoblasts into tissue during embryogenesis, their viability and differentiation into melanocytes, density of melanocytes in the skin, structural components of melanomas and the synthesis of various types of melanin (eu and pheomelanin), maturation and transporting melanosomes to dendritic processes of melanocytes and transferring them to keratinocytes, and, finally, from the distribution of melanin in the suprabasal layers of the skin (Yamaguchi et al., 2007).

Нарушение любого из этапов регуляции синтеза меланина может привести к потере пигментации, формированию участка кожи измененного цвета, появлению пигментных пятен и опухолей. Основным разрушающим фактором является УФ, который активирует УФ-чувствительные белки (Slominski et al., 2004) и увеличивает экспрессию мастера транскрипционной регуляции пигментации - MITF (Yamaguchi et al., 2007) - основного регулятора процессов, описанных выше. В частности, MITF активирует экспрессию гена TYR (тирозинкиназа), PMEL 17 (или gp100 - белок премеланосом) и Bcl-2 (антиапоптотический фактор), что приводит к повышенному синтезу меланина в отдельных областях кожи (Lin, Fisher, 2007). Прямую регуляцию экспрессии MITF синергически осуществляют транскрипционные факторы Sox 10 и РАХ3 (Hou et al., 2006, Bondurand et al., 2000). После воздействия УФ синтез АФК приводит к нарушение окислительно-восстановительного баланса в меланосомах и переключает синтез с феомеланина на эумеланин (Slominski et al., 2004). То есть, сложный многоэтапный процесс меланогенеза находится под контролем как эндогенных, так и экзогенных факторов.Violation of any of the stages of regulation of melanin synthesis can lead to loss of pigmentation, the formation of a skin area of a changed color, the appearance of age spots and tumors. The main damaging factor is UV, which activates UV-sensitive proteins (Slominski et al., 2004) and increases the expression of the master of transcriptional regulation of pigmentation - MITF (Yamaguchi et al., 2007) - the main regulator of the processes described above. In particular, MITF activates the expression of the TYR (tyrosine kinase) gene, PMEL 17 (or gp100 - premelanosome protein) and Bcl-2 (antiapoptotic factor), which leads to increased melanin synthesis in certain areas of the skin (Lin, Fisher, 2007). Direct regulation of MITF expression is synergistically performed by Sox 10 and PAX3 transcription factors (Hou et al., 2006, Bondurand et al., 2000). After exposure to UV, ROS synthesis leads to a violation of the redox balance in melanosomes and switches synthesis from pheomelanin to eumelanin (Slominski et al., 2004). That is, the complex multi-stage process of melanogenesis is controlled by both endogenous and exogenous factors.

Поэтому для подавления гиперпигментации и аномального меланогенеза требуется применение комбинированных препаратов, способных оказать воздействие на разных этапах и уровнях регуляции синтеза меланина. Чтобы изучить эффективность и механизмы воздействия комбинированных препаратов требуются новые высокочувствительные, но при этом простые для исполнения методы и модели проведения экспериментальных исследований и их контроля с ограниченным использованием лабораторных животных. В настоящее время для исследования препаратов против гиперпигментации в условиях in vitro используют первичные культуры меланоцитов и кератиноцитов (Lei et al., 2002), а также тканевые эквиваленты, полученные из клеток с индуцированной плюрипотентностью (iPSC) (Gledhill et al., 2015).Therefore, to suppress hyperpigmentation and abnormal melanogenesis, the use of combined drugs is required, which can have an effect at different stages and levels of regulation of melanin synthesis. To study the effectiveness and mechanisms of action of combined preparations, new highly sensitive, but at the same time simple, methods and models for conducting experimental studies and their control with limited use of laboratory animals are required. Primary cultures of melanocytes and keratinocytes (Lei et al., 2002), as well as tissue equivalents obtained from cells with induced pluripotency (iPSC) (Gledhill et al., 2015), are currently used to study anti-hyperpigmentation preparations in vitro.

Важным аспектом исследования тестируемых препаратов является анализ их канцерогенности. Ранее для исследования развития меланомы и тестирования эффективности противоопухолевых препаратов были предложены 3D культуры (сфероиды) и 2D культуры опухолевых клеток меланомы (Beaumont et al., 2013, Perego et al., 2010). Однако данные изобретения не получили в дальнейшем широкого распространения в связи со сложностью воспроизведения результатов и отсутствием возможности при росте меланомы in vitro предсказать молекулярный или функциональный фенотип раковых клеток (Schatton, Frank, 2010). В отличие от опухолевых клеток, культура нормальных, нетрансформированных меланоцитов в виде сфероидов обладает стандартными характеристиками в отношении пролиферации и молекулярного фенотипа клеток и может быть применена для исследования причин перерождения клеток кожи человека в стволовые раковые клетки, а также для оценки канцерогенности лекарственных и косметических препаратов. Это связано с тем, что используемые в настоящее время диагностические маркеры меланомы включают в себя изменения в синтезе ключевых белков меланогенеза, таких как MITF, gp100 и Sox10 (Parmiani, 2016, Weinstein et al., 2014), которые с помощью иммуноцитохимического анализа можно быстро выявить in vitro.An important aspect of the study of test drugs is the analysis of their carcinogenicity. Previously, 3D cultures (spheroids) and 2D cultures of melanoma tumor cells (Beaumont et al., 2013, Perego et al., 2010) were proposed to study the development of melanoma and test the effectiveness of antitumor drugs. However, these inventions were not subsequently widely disseminated due to the difficulty of reproducing the results and the inability to predict the molecular or functional phenotype of cancer cells during in vitro melanoma growth (Schatton, Frank, 2010). Unlike tumor cells, a culture of normal, non-transformed melanocytes in the form of spheroids has standard characteristics with respect to proliferation and the molecular phenotype of cells and can be used to study the causes of degeneration of human skin cells into stem cancer cells, as well as to evaluate the carcinogenicity of drugs and cosmetics. This is due to the fact that the currently used diagnostic markers of melanoma include changes in the synthesis of key melanogenesis proteins, such as MITF, gp100 and Sox10 (Parmiani, 2016, Weinstein et al., 2014), which can be quickly immunocytochemical analysis identify in vitro.

Ближайшим аналогом заявленного изобретения являются коммерческие тканевые эквиваленты «MelanoDerm» (Costin et al., 2013). Тканевые эквиваленты «MelanoDerm» состоят из нормальных человеческих эпидермальных кератиноцитов (NHEK) и меланоцитов (NHM), культивированных с образованием многослойной, высокодифференцированной модели эпидермиса человека. Культура NHM подвергается меланогенезу, приводящему к тканевой пигментации. «MelanoDerm» производится с использованием бессывороточной среды без искусственных стимуляторов меланогенеза, таких как ТРА и IBMX. Тканевые экиваленты выращивают на вставках для тканевой культуры на границе между воздухом и жидкостью, что позволяет местно использовать смягчители кожи или средства самозажигания. Тканевые эквиваленты «MelanoDerm» предназначены для оценки косметических и фармацевтических препаратов, предназначенных для модуляции пигментации кожи in vitro [https://www.mattek.com/products/melanodeirn/].The closest analogue of the claimed invention are commercial tissue equivalents "MelanoDerm" (Costin et al., 2013). MelanoDerm tissue equivalents consist of normal human epidermal keratinocytes (NHEK) and melanocytes (NHM) cultured to form a multilayer, highly differentiated human epidermis model. The NHM culture undergoes melanogenesis leading to tissue pigmentation. MelanoDerm is produced using a serum-free medium without artificial melanogenesis stimulants such as TPA and IBMX. Tissue equivalents are grown on inserts for tissue culture at the interface between air and liquid, which allows local use of skin softeners or self-ignition agents. MelanoDerm tissue equivalents are intended for the evaluation of cosmetic and pharmaceutical preparations designed to modulate in vitro skin pigmentation [https://www.mattek.com/products/melanodeirn/].

Недостатком данного изобретения является невозможность проведения длительных исследований с его использованием, что обусловлено структурной нестабильностью тканевых эквивалентов. Другим недостатком данного изобретения является невозможность анализа одного и того же образца тканевого эквивалента некоторыми из методов анализа в динамике, что обусловлено необходимостью проведения разрушающей пробоподготовки образца перед непосредственным анализом. Например, для иммуногистохимического исследования необходимо предварительно получить гистологические срезы тканевого эквивалента, что, очевидно, приводит к его непригодности для дальнейшего анализа данного образца. Фазово-контрастная прижизненная цейтраферная микроскопия невозможна при работе с тканями.The disadvantage of this invention is the inability to conduct long-term studies using it, due to the structural instability of tissue equivalents. Another disadvantage of this invention is the impossibility of analyzing the same tissue equivalent sample by some of the dynamic analysis methods, due to the need for destructive sample preparation of the sample before direct analysis. For example, for immunohistochemical studies, it is necessary to first obtain histological sections of tissue equivalent, which, obviously, leads to its unsuitability for further analysis of this sample. Phase-contrast intravital time-lapse microscopy is not possible when working with tissues.

Таким образом, задачей заявленного изобретения является создание тест - системы для оценки эффекта воздействия на функциональную активность меланоцитов, посредством которой было бы возможно проводить длительные исследования и которая, при этом, позволяла бы производить исследования без разрушающей пробоподготовки образцов, а также используя методы анализа, применение которых было невозможно при использовании аналогов.Thus, the objective of the claimed invention is the creation of a test system to assess the effect on the functional activity of melanocytes, through which it would be possible to conduct long-term studies and which, at the same time, would allow to carry out studies without destructive sample preparation of samples, as well as using analysis methods, application which was impossible when using analogues.

Решение поставленной задачи обеспечивается тем, что тест - система для оценки эффекта воздействия на функциональную активность меланоцитов содержит меланоциты, культивированные-в виде сфероидов.The solution to this problem is ensured by the fact that the test - a system for assessing the effect on the functional activity of melanocytes contains melanocytes cultured in the form of spheroids.

Клетки, культивированные в виде сфероидов, обладают уникальными характеристиками, приближенными к ткани. Они не пролиферируют, сохраняют тканеспецифичные характеристики молекулярного фенотипа и обладают способностью к длительному выживанию (более месяца) в культуре. Кроме того, размер сфероидов позволяет производить прижизненный анализ экспрессии различных маркеров и получать данные по изменению функциональной активности и других характеристик клеток под влиянием тестируемого препарата в динамике.Cells cultured as spheroids have unique characteristics close to the tissue. They do not proliferate, retain tissue-specific characteristics of the molecular phenotype and are capable of long-term survival (more than a month) in culture. In addition, the size of the spheroids allows the intravital analysis of the expression of various markers and obtain data on changes in functional activity and other characteristics of cells under the influence of the test drug in dynamics.

В качестве варианта осуществления изобретения, для формирования сфероидов может быть использована первичная или вторичная (после пересева первичной) культура нормальных, нетрансформированных меланоцитов. Первичная культура может быть выделена из кожи человека с помощью соответствующего протокола выделения [Tsuji, Т. and Karasek, М., 1983. A procedure for the isolation of primary cultures of melanocytes from newborn and adult human skin. Journal of investigative dermatology, 81(2)]. Первичная или вторичная культура клеток должна обладать стандартными характеристиками меланоцитов по отношению к пролиферативной активности и молекулярному фенотипу. Перевиваемые (иммортализованные и/или опухолевые) меланоциты не могут быть использованы в качестве культуры в составе заявленной тест-системы по причине того, что функциональная активность таких клеток отличается от тканеспецифичной активности меланоцитов in vivo.As an embodiment of the invention, for the formation of spheroids, a primary or secondary (after reseeding primary) culture of normal, untransformed melanocytes can be used. Primary culture can be isolated from human skin using the appropriate isolation protocol [Tsuji, T. and Karasek, M., 1983. A procedure for the isolation of primary cultures of melanocytes from newborn and adult human skin. Journal of investigative dermatology, 81 (2)]. The primary or secondary cell culture should have standard melanocyte characteristics in relation to proliferative activity and molecular phenotype. Transplantable (immortalized and / or tumor) melanocytes cannot be used as a culture in the claimed test system because the functional activity of such cells differs from the tissue-specific activity of melanocytes in vivo.

Используемая культура меланоцитов должна быть проверена на отсутствие контаминирующих агентов: микоплазм, бактерий, грибов и вирусов.The used culture of melanocytes should be checked for the absence of contaminating agents: mycoplasmas, bacteria, fungi and viruses.

В качестве варианта осуществления изобретения, культура нормальных, нетрансформированных меланоцитов для формирования сфероидов может быть предварительно заморожена в жидком азоте.As an embodiment of the invention, a culture of normal, non-transformed melanocytes to form spheroids may be pre-frozen in liquid nitrogen.

Как вариант, в качестве меланоцитов в составе заявленной тест-системы могут быть использованы культуры НЕМ (Human Epidermal Melanocytes, Cell Applications, Inc., Catalog No.: 104-05n, 104-05a) или схожие культуры (спецификация на указанные культуры - в материалах заявки).Alternatively, NEM cultures (Human Epidermal Melanocytes, Cell Applications, Inc., Catalog No .: 104-05n, 104-05a) or similar cultures (specification for these cultures can be used as melanocytes in the claimed test system) application materials).

При этом в качестве варианта осуществления изобретения, сфероиды могут иметь средний размер в диапазоне 50-200 мкм.Moreover, as an embodiment of the invention, the spheroids may have an average size in the range of 50-200 microns.

В качестве варианта осуществления изобретения, каждый сфероид состоит из 500-3000 меланоцитов.As an embodiment of the invention, each spheroid consists of 500-3000 melanocytes.

Как вариант, меланоциты, культивированные в виде сфероидов, могут быть разделены на опытную и контрольную группу.Alternatively, melanocytes cultured as spheroids can be divided into experimental and control groups.

Решение поставленной задачи также обеспечивается способом получения заявленной тест-системы, включающий:The solution to this problem is also provided by the method of obtaining the claimed test system, including:

A) Суспендирование меланоцитов в полной ростовой среде для культивирования.A) Suspension of melanocytes in a complete growth medium for cultivation.

Для перевозки культуры меланоцитов чаще всего используется специальная транспортировочная среда, от которой клетки перед вышеуказанной процедурой суспендирования необходимо отмыть, например, путем перенесения культуры меланоцитов в центрифужные пробирки с добавлением раствора Хенкса и последующего осаждения культуры клеток путем центрифугирования в течение 7 мин на 1000об/мин, при 100g с последующим удалением супернатанта. После чего к осадку добавляется полная ростовая среда для культивирования и осуществляется суспендирование клеток.For transporting a culture of melanocytes, a special transportation medium is most often used, from which the cells must be washed before the above suspension procedure, for example, by transferring the culture of melanocytes to centrifuge tubes with the addition of Hanks solution and subsequent sedimentation of the cell culture by centrifugation for 7 min at 1000 rpm, at 100g followed by removal of the supernatant. Then, a complete growth medium for cultivation is added to the sediment, and the cells are suspended.

Б) Высевание культуры меланоцитов на чашки Петри.B) Sowing culture of melanocytes on Petri dishes.

Как вариант, клетки могут перенесены в чашки Петри в плотности 10⁴ кл/см².Alternatively, cells can be transferred to Petri dishes at a density of 10 ⁴ cells / cm ² .

B) Пассирование культуры с получением культуры меланоцитов 3 пассажа.B) Passaging the culture to obtain a culture of melanocytes 3 passage.

Как вариант, пассирование культуры может проводиться с помощью раствора ферментов для отмывки и снятия клеток с поверхности чашкиAlternatively, the culture can be passaged using an enzyme solution for washing and removing cells from the surface of the plate

Как вариант, раствор для отмывки может включать растворы версена и трипсина (0,1-5 мг/л).Alternatively, the washing solution may include versene and trypsin solutions (0.1-5 mg / L).

Замена полной ростовой среды может производиться, например, каждые двое суток.Replacement of the full growth medium can be carried out, for example, every two days.

Г) Растворение агарозы в базовой ростовой среде с получением раствора агарозы.D) Dissolution of agarose in a basic growth medium to obtain an agarose solution.

Как вариант, навеска агарозы из расчета концентрации 20 г/л растворяется в базовой ростовой среде, в качестве которой на данном этапе может применяться среда DMEM/F12.Alternatively, a weighed sample of agarose at a concentration of 20 g / l is dissolved in the base growth medium, which DMEM / F12 medium can be used at this stage.

Д) Помещение раствора агарозы в пластмассовую форму на 5 минут с получением пластмассовой формы, содержащей полимеризованную агарозу.E) Putting the agarose solution in a plastic mold for 5 minutes to obtain a plastic mold containing polymerized agarose.

Специальные формы для получения агарозных планшетов известны из уровня техники и производятся, например, компанией Micro Tissues®Special forms for producing agarose tablets are known in the art and are manufactured, for example, by Micro Tissues®

[https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/z764086?lang=en&region=RU][https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/z764086?lang=en&region=RU]

Е) Выдавливание полимеризованной агарозы из пластмассовой формы в базовую ростовую среду с получением агарозного планшета.E) Extruding polymerized agarose from a plastic mold into a base growth medium to obtain an agarose plate.

Как вариант, в качестве базовой ростовой среды на данном этапе может применяться среда DMEM/F12.Alternatively, DMEM / F12 can be used as the base growth medium at this stage.

Ж) Перенесение культуры меланоцитов 3 пассажа на полученный агарозный планшет с получением заявленной тест - системы.G) Transferring the culture of melanocytes of the 3rd passage to the obtained agarose tablet to obtain the claimed test system.

Решение поставленной задачи также обеспечивается способом оценки эффекта воздействия на функциональную активность меланоцитов с использованием заявленной тест - системы, включающим в себя следующие стадии:The solution to this problem is also provided by a method for assessing the effect on the functional activity of melanocytes using the claimed test system, which includes the following stages:

- воздействие на заявленную тест - систему;- impact on the claimed test - system;

- измерение уровня функциональной активности меланоцитов в составе заявленной тест- measurement of the level of functional activity of melanocytes in the composition of the claimed test

- системы.- systems.

- оценка эффекта воздействия путем сравнения уровня функциональной активности меланоцитов в составе заявленной тест - системы, подвергнутых воздействию с уровнем функциональной активности меланоцитов в составе контрольной группы заявленной тест - системы.- assessment of the effect of exposure by comparing the level of functional activity of melanocytes in the composition of the claimed test system, exposed to the level of functional activity of melanocytes in the control group of the claimed test system.

При этом воздействием на указанную выше тест - систему может являться как химическое, так и физическое воздействие.In this case, the impact on the above test - system can be both chemical and physical effects.

Как вариант, функциональным свойством меланоцитов может являться степень компактизации меланоцитов в составе сфероида. В таком случае измерение осуществляется методом морфометрического анализа по изменению площади проекции сфероида.Alternatively, the functional property of melanocytes may be the degree of compaction of melanocytes in the composition of the spheroid. In this case, the measurement is carried out by morphometric analysis by changing the projection area of the spheroid.

Как вариант, в качестве функциональной активности меланоцитов может измеряться уровень пролиферации. В таком случае измерение осуществляется методом подсчета количества Ki67 - позитивных клеток и/или методом подсчета количества PCNA - позитивных клеток.Alternatively, the level of proliferation can be measured as the functional activity of melanocytes. In this case, the measurement is carried out by counting the number of Ki67 - positive cells and / or by counting the number of PCNA - positive cells.

Как вариант, в качестве функциональной активности меланоцитов может измеряться уровень меланина. В таком случае измерение осуществляется методом фотометрического анализа и/или спектрофотометрического анализа. Также измерение может быть проведено методами микроскопии (визуально).Alternatively, melanin levels can be measured as the functional activity of melanocytes. In this case, the measurement is carried out by photometric analysis and / or spectrophotometric analysis. Also, the measurement can be carried out by microscopy (visually).

Как вариант, в качестве функциональной активности меланоцитов может измеряться уровень синтеза фактора созревания меланосом gp100. В таком случае измерение может осуществляться различными методами: методом иммуногистохимического анализа, методом иммуноцитохимического анализа, методом вестерн - блоттинга, методом ПЦР - анализа экспрессии гена.Alternatively, the level of synthesis of the maturation factor gp100 melanosomes can be measured as the functional activity of melanocytes. In this case, the measurement can be carried out by various methods: immunohistochemical analysis, immunocytochemical analysis, western blotting, PCR analysis of gene expression.

Как вариант, в качестве функциональной активности меланоцитов может измеряться уровень синтеза транскрипционного фактора Sox10. В таком случае измерение может осуществляться различными методами: методом иммуногистохимического анализа, методом иммуноцитохимического анализа, методом вестерн - блоттинга, методом ПЦР - анализа экспрессии гена.Alternatively, the level of synthesis of the transcription factor Sox10 can be measured as the functional activity of melanocytes. In this case, the measurement can be carried out by various methods: immunohistochemical analysis, immunocytochemical analysis, western blotting, PCR analysis of gene expression.

Как вариант, в качестве функциональной активности меланоцитов может измеряться уровень синтеза основного фактора меланогенеза MiTF. В таком случае измерение может осуществляться различными методами: методом иммуногистохимического анализа, методом иммуноцитохимического анализа, методом вестерн - блоттинга, методом ПЦР - анализа экспрессии гена.Alternatively, the level of synthesis of the main factor of melanogenesis MiTF can be measured as the functional activity of melanocytes. In this case, the measurement can be carried out by various methods: immunohistochemical analysis, immunocytochemical analysis, western blotting, PCR analysis of gene expression.

Как вариант, в качестве функциональной активности меланоцитов может измеряться уровень экспрессии гена рецептора к меланокортину MCR1. В таком случае измерение может осуществляться различными методами: методом обратно -транскрипционного ПЦР - анализа, методом ПЦР - анализа в реальном времени.Alternatively, the expression level of the melanocortin receptor gene MCR1 can be measured as the functional activity of melanocytes. In this case, the measurement can be carried out by various methods: by the method of reverse transcriptional PCR analysis, by the real-time PCR method.

Как вариант, в качестве функциональной активности меланоцитов может измеряться уровень экспрессии гена тирозиназы TYR. В таком случае измерение может осуществляться различными методами: методом обратно - транскрипционного ПЦР -анализа, методом ПЦР - анализа в реальном времени.Alternatively, the expression level of the tyrosinase gene TYR can be measured as the functional activity of melanocytes. In this case, the measurement can be carried out by various methods: the method of reverse transcription PCR analysis, the method of real-time PCR analysis.

В зависимости от дизайна исследования, меланоциты в составе контрольной группы заявленной тест - системы могут не подвергаться воздействию или подвергаться воздействию, эффект которого на функциональные свойства меланоцитов известен.Depending on the design of the study, the melanocytes in the control group of the claimed test system may not be exposed or may be exposed whose effect on the functional properties of melanocytes is known.

На Фиг. 1 представлена динамика формирования сфероидов из суспензии меланоцитов в неадгезивных 3D условиях в стандартной ростовой среде (контроль) и в среде с добавлением препарата Meso-Xanthin F199 в разведении 1:10 (эксперимент). Фазово-контрастная прижизненная цейтраферная микроскопия (Cell-IQ, СМ Technologies, Финляндия).In FIG. Figure 1 shows the dynamics of the formation of spheroids from a suspension of melanocytes under non-adhesive 3D conditions in a standard growth medium (control) and in a medium supplemented with Meso-Xanthin F199 at a 1:10 dilution (experiment). Phase-contrast intravital time-lapse microscopy (Cell-IQ, CM Technologies, Finland).

На Фиг. 2 представлена динамика накопления меланина в сфероидах из меланоцитов в присутствии препарата Meso-Xanthin F199 (эксперимент), физиологического раствора NaCl (контроль). *р<0,05 в сравнении с отрицательным контролем (однофакторный дисперсионный анализ с последующим применением метода множественных сравнений).In FIG. Figure 2 shows the dynamics of accumulation of melanin in spheroids from melanocytes in the presence of Meso-Xanthin F199 preparation (experiment), physiological NaCl solution (control). * p <0.05 in comparison with the negative control (one-way analysis of variance followed by multiple comparisons).

На Фиг. 3 представлены результаты иммуноцитохимического анализа экспрессии gp100 (красный) меланоцитами человека в сфероидах, 1 сутки культивирования. Ядра окрашены Hoechst 33258 (синий). Применялась лазерная сканирующая конфокальная микроскопия.In FIG. 3 presents the results of immunocytochemical analysis of the expression of gp100 (red) by human melanocytes in spheroids, 1 day of cultivation. The cores are stained with Hoechst 33258 (blue). Used laser scanning confocal microscopy.

На Фиг. 4 представлены результаты имммуноцитохимического анализа экспрессии gp100 (красный) меланоцитами человека в сфероидах, 3 сутки культивирования. Ядра окрашены Hoechst 33258 (синий). Применялась лазерная сканирующая конфокальная микроскопия.In FIG. 4 presents the results of immunocytochemical analysis of the expression of gp100 (red) by human melanocytes in spheroids, 3 days of cultivation. The cores are stained with Hoechst 33258 (blue). Used laser scanning confocal microscopy.

На Фиг. 5 представлены результаты имммуноцитохимического анализа экспрессии gp100 (красный) меланоцитами человека в сфероидах, 7 сутки культивирования. Ядра окрашены Hoechst 33258 (синий). Применялась лазерная сканирующая конфокальная микроскопия.In FIG. 5 presents the results of immunocytochemical analysis of the expression of gp100 (red) by human melanocytes in spheroids, 7 days of cultivation. The cores are stained with Hoechst 33258 (blue). Used laser scanning confocal microscopy.

На Фиг. 6 представлены результаты иммуноцитохимического анализа экспрессии MITF (красный) меланоцитами человека в сфероидах, 1 сутки культивирования. Ядра окрашены Hoechst 33258 (синий). Применялась лазерная сканирующая конфокальная микроскопия.In FIG. 6 presents the results of immunocytochemical analysis of the expression of MITF (red) by human melanocytes in spheroids, 1 day of cultivation. The cores are stained with Hoechst 33258 (blue). Used laser scanning confocal microscopy.

На Фиг. 7 представлены результаты иммуноцитохимического анализа экспрессии MITF (красный) меланоцитами человека в сфероидах, 3 сутки культивирования. Ядра окрашены Hoechst 33258 (синий). Применялась лазерная сканирующая конфокальная микроскопия.In FIG. 7 presents the results of immunocytochemical analysis of the expression of MITF (red) by human melanocytes in spheroids, 3 days of cultivation. The cores are stained with Hoechst 33258 (blue). Used laser scanning confocal microscopy.

На Фиг. 8 представлены результаты иммуноцитохимического анализа экспрессии MITF (красный) меланоцитами человека в сфероидах, 7 сутки культивирования. Ядра окрашены Hoechst 33258 (синий). Применялась лазерная сканирующая конфокальная микроскопия.In FIG. 8 presents the results of immunocytochemical analysis of the expression of MITF (red) by human melanocytes in spheroids, 7 days of cultivation. The cores are stained with Hoechst 33258 (blue). Used laser scanning confocal microscopy.

На Фиг. 9 представлены результаты иммуноцитохимического анализа экспрессии Sox 10 (красный) меланоцитами человека в сфероидах, 1 сутки культивирования. Ядра окрашены Hoechst 33258 (синий). Применялась лазерная сканирующая конфокальная микроскопия.In FIG. 9 presents the results of immunocytochemical analysis of the expression of Sox 10 (red) by human melanocytes in spheroids, 1 day of cultivation. The cores are stained with Hoechst 33258 (blue). Used laser scanning confocal microscopy.

На Фиг. 10 представлены результаты иммуноцитохимического анализа экспрессии Sox 10 (красный) меланоцитами человека в сфероидах, 3 сутки культивирования. Ядра окрашены Hoechst 33258 (синий). Применялась лазерная сканирующая конфокальная микроскопия.In FIG. 10 shows the results of immunocytochemical analysis of the expression of Sox 10 (red) by human melanocytes in spheroids, 3 days of cultivation. The cores are stained with Hoechst 33258 (blue). Used laser scanning confocal microscopy.

На Фиг. 11 представлены результаты иммуноцитохимического анализа экспрессии Sox 10 (красный) меланоцитами человека в сфероидах, 7 сутки культивирования. Ядра окрашены Hoechst 33258 (синий). Применялась лазерная сканирующая конфокальная микроскопия.In FIG. 11 shows the results of immunocytochemical analysis of the expression of Sox 10 (red) by human melanocytes in spheroids, 7 days of cultivation. The cores are stained with Hoechst 33258 (blue). Used laser scanning confocal microscopy.

На Фиг. 12 представлены данные по уровню экспрессии гена MCR1 меланоцитами человека в сфероидах. Приведены средние значения ± стандартное отклонение. Метод ПЦР в реальном времени, RQ - относительные единицы, данные нормализовали по репортерному гену ТВР. *р<0,05 в сравнении с контрольной группой «Сфероиды + NaCl» (однофакторный дисперсионный анализ с последующим применением метода множественных сравнений).In FIG. 12 presents data on the level of expression of the MCR1 gene by human melanocytes in spheroids. The mean values are ± standard deviation. Real-time PCR method, RQ - relative units, data were normalized by the TBP reporter gene. * p <0.05 in comparison with the control group "Spheroids + NaCl" (one-way analysis of variance, followed by the use of multiple comparisons).

На Фиг. 13 представлены данные по уровню экспрессии гена TYR меланоцитами человека в сфероидах. Приведены средние значения±стандартное отклонение. Метод ПЦР в реальном времени, RQ - относительные единицы, данные нормализовали по репортерному гену ТВР. *р<0,05 в сравнении с контрольной группой «Сфероиды + NaCl» (однофакторный дисперсионный анализ с последующим применением метода множественных сравнений).In FIG. 13 presents data on the level of TYR gene expression by human melanocytes in spheroids. The mean values are ± standard deviation. Real-time PCR method, RQ - relative units, data were normalized by the TBP reporter gene. * p <0.05 in comparison with the control group "Spheroids + NaCl" (one-way analysis of variance, followed by the use of multiple comparisons).

На Фиг. 14 представлен профиль распределения жизнеспособных и клеток на разных стадиях апоптоза для сфероидов из меланоцитов (А) и тканевых эквивалентов Меланодерм (Б).In FIG. Figure 14 shows the distribution profile of viable and cells at different stages of apoptosis for spheroids from melanocytes (A) and tissue equivalents of Melanoderm (B).

На Фиг. 15 представлено процентное соотношение числа живых клеток и клеток в раннем и позднем апоптозе в сфероидах из меланоцитов и тканевом эквиваленте Меланодерм. *р<0,05 при сравнении двух групп (однофакторный дисперсионный анализ с последующим применением метода множественных сравнений).In FIG. 15 shows the percentage of the number of living cells and cells in early and late apoptosis in spheroids from melanocytes and tissue equivalent Melanoderm. * p <0.05 when comparing two groups (one-way analysis of variance followed by multiple comparisons).

Настоящее изобретение проиллюстрировано далее посредством следующих примеров.The present invention is further illustrated by the following examples.

Пример 1. Получение заявленной тест-системы.Example 1. Obtaining the claimed test system.

Заявленная тест - система получена следующим образом:The claimed test - the system is obtained as follows:

На первом этапе культура меланоцитов (Human Epidermal Melanocytes, Cell Applications, Inc., Catalog No.: 104-05n) концентрировалась и отмывалась от транспортировочной среды путем перенесения культуры меланоцитов в центрифужные пробирки с добавлением 15 мл раствора Хенкса (Р020п, ПанЭко) и последующего осаждения культуры клеток путем центрифугирования в течение 7 мин на 1000 об/мин, при 100g с последующим удалением супернатанта. Затем проводилось суспендирование осадка культуры меланоцитов в полной ростовой среде для меланоцитов (135-500, CELL Applications, Inc).At the first stage, the culture of melanocytes (Human Epidermal Melanocytes, Cell Applications, Inc., Catalog No .: 104-05n) was concentrated and washed from the transport medium by transferring the culture of melanocytes into centrifuge tubes with the addition of 15 ml of Hanks solution (P020p, PanEco) and the subsequent sedimentation of cell culture by centrifugation for 7 min at 1000 rpm, at 100 g followed by removal of the supernatant. Then, suspension of the melanocyte culture sediment was carried out in a complete growth medium for melanocytes (135-500, CELL Applications, Inc).

На втором этапе производили высевание культуры меланоцитов на чашки Петри в плотности 10⁴ кл/см² с последующим пассированием культуры с помощью раствора для отмывки, содержащем растворы версена и трипсина (0,1 мг/л). Замена полной ростовой среды проводилась каждые двое суток.At the second stage, the culture of melanocytes was plated on Petri dishes at a density of 10 ⁴ cells / cm ² , followed by passaging the culture using a washing solution containing versene and trypsin solutions (0.1 mg / l). Replacement of the complete growth medium was carried out every two days.

Параллельно с вышеуказанным процессом производили подготовку агарозных 3D - планшетов. Для этого агарозу (А6013, Sigma-Aldrich) растворяли в концентрации 20 г/л в базовой ростовой среде DMEM/F12 с получением раствора агарозы. Затем раствор агарозы помещали в пластмассовую форму (3D Petri Dishes, Microtissue, США) на 5 минут с получением пластмассовой формы, содержащей полимеризованную агарозу, которую затем с осторожностью выдавливали из пластмассовой формы в базовую ростовую среду DMEM/F12 с получением агарозного планшета.In parallel with the above process, agarose 3D tablets were prepared. For this, agarose (A6013, Sigma-Aldrich) was dissolved at a concentration of 20 g / L in DMEM / F12 basic growth medium to obtain an agarose solution. Then the agarose solution was placed in a plastic mold (3D Petri Dishes, Microtissue, USA) for 5 minutes to obtain a plastic mold containing polymerized agarose, which was then carefully squeezed out of the plastic mold into DMEM / F12 base growth medium to obtain an agarose plate.

На последнем этапе культуру меланоцитов 3 пассажа переносили на полученный агарозный планшет с получением заявленной тест - системы.At the last stage, the culture of passage 3 melanocytes was transferred to the obtained agarose plate to obtain the claimed test system.

Пример 2. Оценка эффекта воздействия на функциональную активность меланоцитов посредством заявленной тест - системы.Example 2. Evaluation of the effect on the functional activity of melanocytes through the claimed test system.

Для изучения влияния препарата Meso-Xanthin F199 на функциональную активность меланоцитов в условиях, приближенных к нативной ткани, была использована тест - система, содержащая меланоциты, культивированные в виде сфероидов.To study the effect of the Meso-Xanthin F199 preparation on the functional activity of melanocytes under conditions close to native tissue, we used a test system containing melanocytes cultured as spheroids.

Материалы и методыMaterials and methods

Для исследования использовали аликвоты коммерческого препарата Meso-Xanthin F199, смешанные с полной ростовой средой в соотношении 1:10 (по объему). В качестве отрицательного контроля использовали эквивалентное количество физиологического раствора NaCl.For the study used aliquots of the commercial drug Meso-Xanthin F199, mixed with full growth medium in a ratio of 1:10 (by volume). An equivalent amount of physiological NaCl solution was used as a negative control.

3D культивирование меланоцитов человека3D cultivation of human melanocytes

Для изучения влияния Meso-Xanthin F199 на накопление меланина меланоцитами в условиях, приближенных к нативной ткани, суспензию культуры клеток 3 пассажа с добавлением препарата и без него помещали на неадгезивные агарозные планшеты.To study the effect of Meso-Xanthin F199 on melanin accumulation by melanocytes under conditions close to native tissue, passage 3 cell culture suspension with and without drug was placed on non-adhesive agarose plates.

Агарозные планшеты получали за счет полимеризации агарозы в специальных пластмассовых формах (3D Petri Dishes, Microtissue, США).Agarose tablets were obtained by polymerization of agarose in special plastic forms (3D Petri Dishes, Microtissue, USA).

Для данного этапа исследования использовали аликвоты Meso-Xanthin F199, смешанные с полной ростовой средой в соотношении объемов 1:10. В качестве негативного контроля использовали эквивалентное количество физиологического раствора NaCl. Осадок меланоцитов ресуспендировали в полной ростовой среде и помещали на агарозные планшеты в концентрации 1×10³ клеток в лунку. Агарозные планшеты помещали в 12-луночные культуральные планшеты и вели прижизненное наблюдение в стандартных условиях камеры прибора Cell-IQ («СМ Technologies)), Финляндия) с фоторегистрацией каждые 20 минут.Полученные сфероиды фиксировали на 1, 3 и 7 сутки.Aliquots of Meso-Xanthin F199 mixed with full growth medium in a volume ratio of 1:10 were used for this stage of the study. As a negative control, an equivalent amount of physiological NaCl solution was used. The melanocyte sediment was resuspended in complete growth medium and placed on agarose plates at a concentration of 1 × 10 ³ cells per well. Agarose plates were placed in 12-well culture plates and monitored intravitally under standard Cell-IQ camera conditions (CM Technologies, Finland) with photographic recording every 20 minutes. The resulting spheroids were fixed on days 1, 3, and 7.

Фиксация тканевых эквивалентов Меланодерм и сфероидов из меланоцитов человекаFixation of tissue equivalents of Melanoderm and spheroids from human melanocytes

Перед фиксацией 3D культуры, сфероиды собирали в общую пробирку типа эппендорф с помощью наконечника до 1000 мкл. Далее сфероиды осаждали с помощью центрифугирования (1 мин, 600 об/мин, 600 g), супернатант сливали и добавляли к осажденным сфероидам раствор фосфатно-солевого буфера (рН=7,4). Данную операцию повторяли еще два раза. После третьего центрифугирования к сфероидам добавляли 4%-ный раствор параформальдегида, в котором сфероиды фиксировали 20 мин при +4°С.Before fixing the 3D culture, spheroids were collected in a common tube of the eppendorf type using a tip of up to 1000 μl. Next, the spheroids were precipitated by centrifugation (1 min, 600 rpm, 600 g), the supernatant was discarded, and a solution of phosphate-saline buffer was added to the precipitated spheroids (pH = 7.4). This operation was repeated two more times. After the third centrifugation, a 4% paraformaldehyde solution was added to the spheroids, in which the spheroids were fixed for 20 min at + 4 ° С.

Иммуноцитохимический анализImmunocytochemical analysis

Сфероиды перед окрашиванием помещали на полилизиновые предметные стекла. После предварительной подготовки срезы и сфероиды инкубировали с первичными антителами к антигенам gp 100 (ab 137078, Abeam), Sox10 (ab 155279, Abeam), MiTF (ab 122982, Abeam), а также Ki-67 (ab 15580, Abeam). Результат визуализировали с помощью вторичных антител, конъюгированных с флуорохромами FITC (Е=525 нм) и DyLight594 (Е=617 нм). Ядра докрашивали флуоресцентным красителем бис-бензимид - Hoechst 33258 (0,002 мг/мл, 10 минут, 25°С). После окрашивания избыток красителя удаляли троекратной сменой фосфатно-солевого буфера (рН=7,4). Полученные препараты заключали в монтирующую среду витрогель (12-001, Биовитрум) и анализировали в видимом и ультрафиолетовом световых диапазонах с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа Olympus Fluoview FV10 («Olympus», Япония).Before staining, spheroids were placed on polylysine slides. After preliminary preparation, sections and spheroids were incubated with primary antibodies to gp 100 antigens (ab 137078, Abeam), Sox10 (ab 155279, Abeam), MiTF (ab 122982, Abeam), as well as Ki-67 (ab 15580, Abeam). The result was visualized using secondary antibodies conjugated with FITC fluorochromes (E = 525 nm) and DyLight594 (E = 617 nm). The nuclei were stained with a Horechst 33258 fluorescent dye bis-benzimide (0.002 mg / ml, 10 minutes, 25 ° С). After staining, excess dye was removed by changing the phosphate-saline buffer three times (pH = 7.4). The obtained preparations were enclosed in a Vitrogel mounting medium (12-001, Biovitrum) and analyzed in the visible and ultraviolet light ranges using an Olympus Fluoview FV10 laser scanning confocal microscope (Olympus, Japan).

Фотометрический анализ концентрации меланина в сфероидах из меланоцитов человека.Photometric analysis of the concentration of melanin in spheroids from human melanocytes.

Перед фотометрическим анализом сфероиды отмывали от остатков среды троекратной сменой фосфатно-солевого буфера (рН=7,4) и хранили при температуре минус 20°С. Для экстракции меланина образцы размораживали, высушивали, и к каждому образцу добавляли 250 мкл лизирующего раствора Solvable (6NE9100, PerkinElmer), после чего образцы инкубировали в течение 18 часов на водяной бане при +60°С. После инкубации, образцы тщательно перемешивали на вортексе, осаждали нерастворенные частицы с помощью центрифугирования (5 мин, 13000 об/мин), супернатант разделяли по 100 мкл, вносили в 96-луночный планшет и анализировали оптическую плотность на планшетном фотометре Multiscan GO (Thermo Scientific, США). Калибровочную кривую получали при анализе стандартных растворов с известной концентрацией меланина, приготовленных из сухого вещества (М863, Sigma-Aldrich).Prior to photometric analysis, spheroids were washed from the residual medium by a three-fold change in phosphate-saline buffer (pH = 7.4) and stored at a temperature of minus 20 ° С. To extract melanin, the samples were thawed, dried, and 250 μl of Solvable lysis solution (6NE9100, PerkinElmer) was added to each sample, after which the samples were incubated for 18 hours in a water bath at + 60 ° С. After incubation, the samples were thoroughly mixed on a vortex, insoluble particles were precipitated by centrifugation (5 min, 13000 rpm), the supernatant was separated by 100 μl, added to a 96-well plate and the optical density was analyzed on a Multiscan GO plate photometer (Thermo Scientific, USA). A calibration curve was obtained by analyzing standard solutions with a known concentration of melanin prepared from dry matter (M863, Sigma-Aldrich).

Анализ экспрессии генов методом полимеразной цепной реакции в реальном времениReal-time analysis of gene expression by polymerase chain reaction

Тотальную РНК выделяли, используя TRIReagent (Sigma, США) и ДНКазу I типа (Fermentas, Германия), осаждали в 4М LiCl, ее концентрацию измеряли на спектрофотометре Nanodrop 8000 (Thermo Scientific, США). С использованием обратной транскриптазы M-MLV (Евроген, Россия) и рандомных гексануклеотидов (Силекс, Россия) проводили синтез кДНК. На полученных образцах анализировали экспрессию гена рецептора 1 к меланокортину (MCR1), гена тирозиназы (TYR). В качестве референсного гена, относительно которого измеряли количественное изменение анализируемых генов, использовали ген ТВР. Анализ проводили с помощью праймеров:

Total RNA was isolated using TRIReagent (Sigma, USA) and type I DNase (Fermentas, Germany), precipitated in 4 M LiCl, its concentration was measured on a Nanodrop 8000 spectrophotometer (Thermo Scientific, USA). Using reverse transcriptase M-MLV (Eurogen, Russia) and random hexanucleotides (Silex, Russia), cDNA synthesis was performed. On the obtained samples, the expression of the melanocortin receptor 1 gene (MCR1) and tyrosinase gene (TYR) were analyzed. As a reference gene, relative to which the quantitative change of the analyzed genes was measured, the TBP gene was used. The analysis was performed using primers:

Анализ проводили на автоматическом амплификаторе 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, США) с использованием смеси qPCRmix-HSSYBR+ROX (Евроген, Россия). Расчет относительной экспрессии гена выполняли методом ΔΔCt с учетом эффективности реакции, определенной методом построения стандартных кривых (Bookout et al., 2006).The analysis was performed on a 7500 Real-Time PCR System automatic amplifier (Applied Biosystems, USA) using a mixture of qPCRmix-HSSYBR + ROX (Eurogen, Russia). The relative gene expression was calculated by the ΔΔCt method taking into account the reaction efficiency determined by the method of constructing standard curves (Bookout et al., 2006).

Статистический анализ данныхStatistical Data Analysis

Исследования проводили с помощью пакета прикладных программ STATISTICA 6.0. С использованием критериев Шапиро-Вилка и χ2 Пирсона были проверены гипотезы о нормальности распределений исследуемых показателей. При сравнении параметров, имевших нормальное распределение, использовали однофакторный дисперсионный анализ с последующим применением метода множественных сравнений. При сравнении параметров, имевших ненормальное распределение, использовали критерий Крускалла-Уоллиса.Studies were performed using the STATISTICA 6.0 application software package. Using the Shapiro-Wilk criteria and Pearson χ2, hypotheses on the normality of the distributions of the studied parameters were tested. When comparing parameters that had a normal distribution, one-way analysis of variance was used, followed by the use of the multiple comparisons method. When comparing parameters that had an abnormal distribution, the Kruskall-Wallis test was used.

Результатыresults

Формирование сфероидов из меланоцитов человека в 3D культуре и динамика накопления в них меланина в присутствии препарата Meso-Xanthin F199 и без негоThe formation of spheroids from human melanocytes in 3D culture and the dynamics of accumulation of melanin in them in the presence of and without Meso-Xanthin F199

Клетки третьего пассажа помещали на неадгезивные агарозные планшеты с лунками диаметром 400 мкм для получения 3D культуры - сфероидов. С использованием метода прижизненной цейтраферной микроскопии на приборе Cell IQ (CM Tecnologies, Финляндия) наблюдали динамику формирования сфероидов из меланоцитов в присутствии препарата Meso-Xanthin F199 и без него (Фиг. 1).The cells of the third passage were placed on non-adhesive agarose plates with wells with a diameter of 400 μm to obtain a 3D culture - spheroids. Using the method of intravital time-lapse microscopy on a Cell IQ instrument (CM Tecnologies, Finland), the dynamics of the formation of spheroids from melanocytes was observed in the presence and without Meso-Xanthin F199 preparation (Fig. 1).

В процессе культивирования клеток в 3D условиях наблюдали общие закономерности процесса формирования сфероидов - первоначальная компактизация происходила уже в первые сутки культивирования, процесс компактизации (уплотнения) сфероидов продолжался до 7 суток. Визуальная оценка клеток в сфероиде показала, что в сфероидах контрольной группы (в ростовой среде без добавления препарата) происходило более быстрое и значительное накопление меланина в клетках центральной зоны сфероидов. Сфероиды экспериментальной группы (с добавлением препарата Meso-Xanthin F199) к седьмым суткам культивирования были более светлыми и более компактными.In the process of cell cultivation under 3D conditions, the general patterns of the process of formation of spheroids were observed - initial compaction took place already on the first day of cultivation, the process of compaction (compaction) of spheroids lasted up to 7 days. A visual assessment of the cells in the spheroid showed that a more rapid and significant accumulation of melanin in the cells of the central zone of the spheroids occurred in the spheroids of the control group (in the growth medium without adding the drug). The spheroids of the experimental group (with the addition of Meso-Xanthin F199) by the seventh day of cultivation were lighter and more compact.

Данные спектрофотометрии подтвердили результаты визуальной оценки интенсивности синтеза меланина в контрольных и экспериментальных сфероидах. Как показано на Фиг. 2, если на 1 сутки 3D культивирования средняя концентрация меланина была схожа в обеих группах, то при дальнейшем 3D культивировании - на 3 и 7 сутки, синтез меланина сфероидами в экспериментальной группе в присутствии препарата Meso-Xanthin F199 в разведении 1:10 незначительно повышался, тогда как в группе контроля наблюдали значительное и достоверно значимое увеличение синтеза меланина в процессе культивирования.Spectrophotometry data confirmed the results of a visual assessment of the intensity of melanin synthesis in control and experimental spheroids. As shown in FIG. 2, if on the 1st day of 3D cultivation the average concentration of melanin was similar in both groups, then on further 3D cultivation on the 3rd and 7th day, the synthesis of melanin by spheroids in the experimental group in the presence of Meso-Xanthin F199 diluted slightly at a 1:10 dilution, whereas in the control group, a significant and significantly significant increase in melanin synthesis during cultivation was observed.

Иммуноцитохимический анализ меланосфероидов контрольной и экспериментальной группImmunocytochemical analysis of melanospheroids in the control and experimental groups

При анализе экспрессии транскрипционных факторов меланогенеза, было установлено, что в контрольной группе экспрессия gp100 (Фиг. 3-5), как и транскрипционного фактора MITF (Фиг. 6-8) увеличивалась уже к 3 суткам культивирования, достигая максимума к 7 суткам культивирования. В сфероидах экспериментальной группы экспрессию gp100 и MITF на протяжении всего периода культивирования наблюдали только в отдельных клетках. Фактор Sox 10 экспрессировался в сфероидах обеих групп, уровень его экспрессии увеличивался по мере культивирования (Фиг. 9-11).When analyzing the expression of transcription factors of melanogenesis, it was found that in the control group, the expression of gp100 (Fig. 3-5), as well as the transcription factor MITF (Fig. 6-8) increased already by 3 days of cultivation, reaching a maximum by 7 days of cultivation. In the spheroids of the experimental group, the expression of gp100 and MITF throughout the entire cultivation period was observed only in individual cells. Sox 10 factor was expressed in spheroids of both groups, its expression level increased with cultivation (Fig. 9-11).

Исследование экспрессии генов MCR1 и TYR меланоцитами человека в сфероидах в контроле и экспериментеStudy of the expression of MCR1 and TYR genes by human melanocytes in spheroids in control and experiment

Исследование сфероидов показало снижение экспрессии гена MCR1 на 3 сутки культивирования в присутствии препарата Meso-Xanthin F199. К 7 суткам культивирования экспрессия MCR1 достигала своего минимального значения в экспериментальной группе по сравнению с контрольной группой, к которой добавляли физиологический раствор (NaCl) (Фиг. 12). При этом экспрессия гена в группе контроля с NaCl колебалась на протяжении всего периода культивирования, возрастая к 3 суткам и незначительно снижаясь к 7 суткам.A study of spheroids showed a decrease in the expression of the MCR1 gene on the 3rd day of cultivation in the presence of Meso-Xanthin F199. By 7 days of cultivation, the expression of MCR1 reached its minimum value in the experimental group compared to the control group to which physiological saline (NaCl) was added (Fig. 12). Moreover, gene expression in the control group with NaCl fluctuated throughout the cultivation period, increasing by 3 days and slightly decreasing by 7 days.

В ходе анализа экспрессии гена TYR наблюдали практически полное подавление его синтеза на 7 сутки в эксперименте с добавлением Meso-Xanthin F199, тогда как в контроле с NaCl экспрессия гена сохранялась примерно на одном уровне в течение всего срока 3D культивирования (Фиг. 13).In the analysis of TYR gene expression, an almost complete suppression of its synthesis was observed on day 7 in the experiment with the addition of Meso-Xanthin F199, while in the control with NaCl, gene expression was maintained at approximately the same level throughout the 3D cultivation period (Fig. 13).

ВыводOutput

В ходе исследования Meso-Xanthin F199 проявил себя как препарат с высокой биологической активностью. Полученные результаты свидетельствуют о возможности положительного влияния анализируемого препарата на защитные свойства кожи человека.During the study, Meso-Xanthin F199 proved to be a drug with high biological activity. The results obtained indicate the possibility of a positive effect of the analyzed drug on the protective properties of human skin.

На примененной в исследовании тест - системе, содержащей меланоциты, культивированные в виде сфероидов, показано, что препарат Meso-Xanthin F199 способен подавлять синтез меланина, в итоге понижая его концентрацию в ткани. После проведенного иммуноцитохимического анализа, было установлено, что Meso-Xanthin F199 влияет, в первую очередь, на экспрессию фактора созревания меланосом gp100 и, в меньшей степени, воздействует на экспрессию мастера транскрипции регуляции пигментации MITF и транскрипционный фактор Sox 10. При анализе экспрессии генов MCR1 и TYR было установлено, что Meso-Xanthin F199 способен подавлять экспрессию обоих генов, преимущественно гена тирозиназы. При этом максимальное воздействие инъекционного препарата достигается к последнему дню культивирования in vitro, что свидетельствует о накопительном эффекте.Using the test system used in the study, containing melanocytes cultured in the form of spheroids, it was shown that the Meso-Xanthin F199 preparation is able to suppress melanin synthesis, ultimately lowering its concentration in the tissue. After an immunocytochemical analysis, it was found that Meso-Xanthin F199 affects primarily the expression of the maturation factor melanosome gp100 and, to a lesser extent, affects the expression of the transcription master of MITF pigmentation regulation and transcription factor Sox 10. When analyzing the expression of MCR1 genes and TYR, it was found that Meso-Xanthin F199 is able to suppress the expression of both genes, primarily the tyrosinase gene. In this case, the maximum effect of the injection drug is achieved by the last day of in vitro cultivation, which indicates a cumulative effect.

Полученные данные свидетельствуют об избирательности воздействия исследуемого инъекционного препарата - он подавляет созревание меланосом и интенсивный синтез меланина, однако не блокирует основные пути меланогенеза, следовательно, не способен вызвать тяжелые патофизиологические осложнения. Таким образом, препарат Meso-Xanthin F199 является высокоэффективным против гиперпигментации.The data obtained indicate the selectivity of the effect of the studied injection drug - it inhibits the maturation of melanosomes and intensive synthesis of melanin, but does not block the main pathways of melanogenesis, therefore, it is not able to cause severe pathophysiological complications. Thus, the drug Meso-Xanthin F199 is highly effective against hyperpigmentation.

Также полученные данные позволяют сделать вывод о том, что заявленная тест -система позволяет производить оценку эффекта воздействия на функциональную активность меланоцитов.Also, the data obtained allow us to conclude that the claimed test system allows you to evaluate the effect on the functional activity of melanocytes.

Пример 2. Анализ жизнеспособности клеток в тканевых эквивалентах.Example 2. Analysis of cell viability in tissue equivalents.

Материалы и методыMaterials and methods

Исследование было проведено на тканевых эквивалентах Меланодерм (MEL-300, MatTek Corporation) и заявленной тест-системе, представляющей собой меланоциты, культивированные в виде сфероидов.The study was conducted on tissue equivalents of Melanoderm (MEL-300, MatTek Corporation) and the claimed test system, which is a melanocyte cultured in the form of spheroids.

Культивирование тканевых эквивалентов МеланодермCultivation of tissue equivalents Melanoderm

Набор тканевых эквивалентов, содержащий 24 образца, был транспортирован в лабораторию при температурном режиме +4°С, после чего образцы, расположенные в специальных держателях, были перенесены в культуральные шестилуночные планшеты в индивидуальные лунки. Каждый образец был помещен на подставку (MEL-STND, MatTek Corporation) на границу между водной и воздушной средами. Тканевые эквиваленты культивировали в полной ростовой среде, предоставляемой компанией вместе с образцами (EPI-100-NMM-113, MatTek Corporation) в стандартных условиях (370С, 5% CO2), замену среды производили ежедневно. Анализ жизнеспособности клеток в тканевом эквиваленте производили на 14 сутки 3D культивирования.A set of tissue equivalents containing 24 samples was transported to the laboratory at a temperature of + 4 ° C, after which the samples located in special holders were transferred to six-well culture plates in individual wells. Each sample was placed on a stand (MEL-STND, MatTek Corporation) at the interface between aqueous and air environments. Tissue equivalents were cultured in a complete growth medium provided by the company together with samples (EPI-100-NMM-113, MatTek Corporation) under standard conditions (37 ° C, 5% CO2); the medium was changed daily. Analysis of cell viability in tissue equivalent was performed on day 14 of 3D culture.

Для изучения жизнеспособности меланоцитов в условиях, приближенных к нативной ткани, монослойные культуры клеток 3 пассажа с добавлением препарата и без него помещали на неадгезивные агарозные планшеты. Агарозные планшеты получали за счет полимеризации агарозы в специальных пластмассовых формах (3D Petri Dishes, Microtissue, США).To study the viability of melanocytes under conditions close to native tissue, monolayer cell cultures of passage 3 with and without the addition of the drug were placed on non-adhesive agarose plates. Agarose tablets were obtained by polymerization of agarose in special plastic forms (3D Petri Dishes, Microtissue, USA).

Для этого культуру, достигшую конфлюэнтного состояния, диссоциировали с помощью раствора версена (Р080п, ПанЭко) и 0,25% раствора трипсина (Р036п, ПанЭко), полученную суспензию клеток помещали в центрифужные пробирки объемом 15 мл. Действие трипсина инактивировали добавлением 500 мкл сыворотки Феталклон (SH3010903, HyClone), далее суспензию клеток осаждали с помощью центрифугирования (100 g, 1000 об/мин, 7 минут). Осадок ресуспендировали в полной ростовой среде и помещали на агарозные планшеты в концентрации 1×10³ клеток в лунку, где они формировали сфероиды. Замену полной ростовой среды производили каждые двое суток. Анализ жизнеспособности клеток производили на 14 сутки 3D культивирования.For this, a culture that reached a confluent state was dissociated using a versene solution (P080p, PanEco) and a 0.25% trypsin solution (P036p, PanEco), the resulting cell suspension was placed in 15 ml centrifuge tubes. Trypsin was inactivated by the addition of 500 μl of fetalclone serum (SH3010903, HyClone), then the cell suspension was precipitated by centrifugation (100 g, 1000 rpm, 7 minutes). The pellet was resuspended in complete growth medium and placed on agarose plates at a concentration of 1 × 10 ³ cells per well, where they formed spheroids. The complete growth medium was replaced every two days. Analysis of cell viability was performed on day 14 of 3D culture.

Анализ жизнеспособности клеток в сфероидах и тканевых эквивалентах Меланодерм Полученные сфероиды и тканевые эквиваленты Меланодерм на 14 сутки культивирования помещали в центрифужные пробирки объемом 15 мл и диссоциировали до суспензии клеток с помощью раствора версена (Р080п, ПанЭко) и 0,25% раствора трипсина (Р036п, ПанЭко). Далее действие трипсина инактивировали добавлением к каждому образцу 500 мкл сыворотки Феталклон (SH3010903, HyClone), после чего полученные суспензии клеток осаждали с помощью центрифугирования (100 g, 1000 об/мин, 7 минут). Осадок каждого образца ресуспендировали в 1 мл фосфатно-солевого буфера (рН=7,4), содержащего 1% сыворотки Феталклон (SH3010903, HyClone). Далее, в соответствии с протоколом анализа от каждого образца отбирали пробу объемом 100 мкл и инкубировали со 100 мкл реагента для анализа апоптоза Аннексии V + мертвые клетки (МСН100105, Merck) в течение 20 минут при комнатной температуре в темноте. Жизнеспособность клеток анализировали с помощью клеточного анализатора Muse (Merck). Всего было исследовано три образца сфероидов (по 256 сфероидов в каждом образце) и три образца тканевых эквивалентов Меланодерм.Analysis of cell viability in spheroids and tissue equivalents of Melanoderm The obtained spheroids and tissue equivalents of Melanoderm on the 14th day of cultivation were placed in 15 ml centrifuge tubes and dissociated to a cell suspension using versene solution (P080p, PanEco) and 0.25% trypsin solution (P036p, PanEco). Next, the action of trypsin was inactivated by adding 500 μl of fetalclone serum (SH3010903, HyClone) to each sample, after which the obtained cell suspensions were precipitated by centrifugation (100 g, 1000 rpm, 7 minutes). The precipitate of each sample was resuspended in 1 ml of phosphate-buffered saline (pH = 7.4) containing 1% fetalclone serum (SH3010903, HyClone). Further, in accordance with the analysis protocol, a sample of 100 μl was taken from each sample and incubated with 100 μl of annexia V + dead cell apoptosis assay reagent (MCH100105, Merck) for 20 minutes at room temperature in the dark. Cell viability was analyzed using a Muse cell analyzer (Merck). In total, three samples of spheroids were studied (256 spheroids in each sample) and three samples of tissue equivalents of Melanoderm.

Результатыresults

В ходе анализа жизнеспособности профиль распределения живых клеток и клеток в апоптозе (Фиг. 14) показал, что большая часть клеток в тканевых эквивалентах Меланодерм находились на стадии позднего апоптоза, в отличие от сфероидов из меланоцитов, представленных преимущественно живыми клетками. Среднее количество живых клеток в сфероидах превышало 85%, тогда как количество живых клеток в тканевых эквивалентах составляло не более 10% (данные приведены в Таблице 1).In the course of the viability analysis, the distribution profile of living cells and cells in apoptosis (Fig. 14) showed that most of the cells in the tissue equivalents of Melanoderm were at the stage of late apoptosis, in contrast to spheroids from melanocytes, represented mainly by living cells. The average number of living cells in spheroids exceeded 85%, while the number of living cells in tissue equivalents was not more than 10% (data are shown in Table 1).

Значимые различия были установлены только при сравнении числа жизнеспособных клеток и клеток в позднем апоптозе, количество клеток в раннем апоптозе в сфероидах и эквивалентах было одинаковым (Фиг. 15).Significant differences were found only when comparing the number of viable cells and cells in late apoptosis, the number of cells in early apoptosis in spheroids and equivalents was the same (Fig. 15).

Таким образом, к 14 суткам культивирования сфероиды из меланоцитов, в отличие от тканевых эквивалентов Меланодерм, сохраняли высокую жизнеспособность клеток и, следовательно, являются более предпочтительной тест-системой для долгосрочных исследований.Thus, by the 14th day of cultivation, spheroids from melanocytes, unlike the tissue equivalents of Melanoderm, retained high cell viability and, therefore, are a more preferable test system for long-term studies.

Claims

1. Cellular spheroid for assessing the effect of physical and / or chemical effects on the functional activity of melanocytes, characterized in that it is placed in a complete growth medium for melanocytes, is in non-adhesive conditions, includes 500-3000 melanocytes, has a spherical shape, smooth surface, diameter 50 -200 μm, capable of synthesizing melanin, while the melanocytes in the composition of the spheroid do not proliferate in the absence of an estimated physical and / or chemical effect.

2. A method of obtaining a cell spheroid according to claim 1, including:

- suspension of the culture of melanocytes in a complete growth medium for melanocytes;

- sowing culture of melanocytes on Petri dishes at a density of 10 ⁴ cells / cm ² ;

- passaging the culture to obtain a culture of melanocytes of the 3rd passage;

- dissolution of agarose in a basic growth medium to obtain an agarose solution with a concentration of 20 g / l;

- placing the agarose solution in a plastic form to obtain a plastic form containing polymerized agarose;

- extruding polymerized agarose from a plastic mold into a base growth medium to obtain an agarose tablet;

- transferring the culture of melanocytes of passage 3 to the obtained agarose plate to obtain a cell spheroid according to claim 1.

3. A method for evaluating the effect on the functional activity of melanocytes using a cell spheroid according to claim 1, comprising the following stages:

- physical and / or chemical effects on the cell spheroid according to claim 1;

- measuring the level of functional activity of melanocytes in the composition of the cell spheroid according to claim 1;

- assessment of the effect of exposure by comparing the level of functional activity of melanocytes in the composition of the cell spheroid according to claim 1, exposed to the level of functional activity of melanocytes in the composition of the cell spheroid of the control group.

4. The evaluation method according to p. 3, characterized in that the impact on the test system according to p. 1 is a chemical effect.

5. The evaluation method according to p. 3, characterized in that the impact on the test system according to p. 1 is a physical effect.

6. The evaluation method according to p. 3, characterized in that the functional property of melanocytes is the degree of compaction of melanocytes in the composition of the spheroid.

7. The evaluation method according to claim 6, characterized in that the degree of compaction of melanocytes in the composition of the spheroid is measured by morphometric analysis by changing the projection area of the spheroid.

8. The evaluation method according to p. 3, characterized in that the functional property of melanocytes is the level of proliferation.

9. The evaluation method according to claim 8, characterized in that the proliferation level is measured by counting the number of Ki67 positive cells.

10. The evaluation method according to p. 8, characterized in that the measurement of the level of proliferation is carried out by counting the number of PCNA-positive cells.

11. The evaluation method according to p. 3, characterized in that the functional property of melanocytes is the level of melanin.

12. The evaluation method according to p. 11, characterized in that the measurement of the level of melanin is carried out by the method of photometric analysis.

13. The evaluation method according to p. 11, characterized in that the measurement of the level of melanin is carried out by spectrophotometric analysis.

14. The evaluation method according to p. 11, characterized in that the measurement of the level of melanin is carried out by microscopy.

15. The evaluation method according to p. 3, characterized in that the functional property of melanocytes is the level of synthesis of the maturation factor melanosome gp100.

16. The evaluation method according to p. 15, characterized in that the measurement of the level of synthesis of the maturation factor of melanosomes gp100 is carried out by immunohistochemical analysis.

17. The evaluation method according to p. 15, characterized in that the measurement of the level of synthesis of the maturation factor of melanosomes gp100 is carried out by immunocytochemical analysis.

18. The evaluation method according to p. 15, characterized in that the level of synthesis of the maturation factor of melanosome gp100 is carried out by Western blotting.

19. The evaluation method according to p. 15, characterized in that the level of synthesis of the maturation factor of melanosome gp100 is carried out by PCR analysis of gene expression.

20. The evaluation method according to p. 3, characterized in that the functional property of melanocytes is the level of synthesis of the transcription factor Sox10.

21. The evaluation method according to p. 20, characterized in that the measurement of the synthesis level of the transcription factor Sox10 is carried out by immunohistochemical analysis.

22. The evaluation method according to p. 20, characterized in that the measurement of the level of synthesis of the transcription factor Sox10 is carried out by immunocytochemical analysis.

23. The evaluation method according to p. 20, characterized in that the measurement of the level of synthesis of the transcription factor Sox10 is carried out by Western blotting.

24. The evaluation method according to p. 20, characterized in that the measurement of the level of synthesis of the transcription factor Sox10 is carried out by PCR analysis of gene expression.

25. The evaluation method according to p. 3, characterized in that the functional property of melanocytes is the level of synthesis of the main factor melanogenesis MiTF.

26. The evaluation method according to p. 25, characterized in that the measurement of the level of synthesis of the main factor of melanogenesis MiTF is carried out by the method of immunohistochemical analysis.

27. The evaluation method according to p. 25, characterized in that the measurement of the level of synthesis of the main factor of melanogenesis MiTF is carried out by the method of immunocytochemical analysis.

28. The evaluation method according to p. 25, characterized in that the measurement of the synthesis level of the main factor of melanogenesis MiTF is carried out by Western blotting.

29. The evaluation method according to p. 25, characterized in that the measurement of the level of synthesis of the main factor of melanogenesis MiTF is carried out by PCR analysis of gene expression.

30. The evaluation method according to p. 3, characterized in that the functional property of melanocytes is the level of expression of the receptor gene for melanocortin MCR1.

31. The evaluation method according to p. 30, characterized in that the measurement of the expression level of the receptor gene for melanocortin MCR1 is carried out by the method of reverse transcription PCR analysis.

32. The evaluation method according to p. 30, characterized in that the measurement of the expression level of the receptor gene for melanocortin MCR1 is carried out by real-time PCR analysis.

33. The evaluation method according to p. 3, characterized in that the functional property of melanocytes is the expression level of the tyrosinase TYR gene.

34. The evaluation method according to p. 33, characterized in that the measurement of the expression level of the tyrosinase TYR gene is carried out by the method of reverse transcription PCR analysis.

35. The evaluation method according to p. 33, characterized in that the measurement of the level of expression of the tyrosinase TYR gene is carried out by real-time PCR analysis.

36. The evaluation method according to p. 3, characterized in that the melanocytes in the test system according to p. 1 of the control group are not affected.

37. The evaluation method according to p. 3, characterized in that the melanocytes in the test system according to p. 1 of the control group are exposed, the effect of which on the functional properties of melanocytes is known.