KR102212623B1

KR102212623B1 - Skin-improving material controlling expression of cadherin11 or N-cadherin and method for screening the material

Info

Publication number: KR102212623B1
Application number: KR1020140045547A
Authority: KR
Inventors: 이애영; 김난형; 이태룡; 최현정; 이은경; 조은경
Original assignee: (주)아모레퍼시픽; 동국대학교 산학협력단
Priority date: 2014-04-16
Filing date: 2014-04-16
Publication date: 2021-02-09
Also published as: KR20150119741A; WO2015160147A1

Abstract

본 발명은 캐드헤린11(Cadherin 11) 및 N-캐드헤린(N-cadherin) 중 하나 이상의 발현 억제 물질을 유효성분으로 포함하는 피부 개선용 조성물 및 이를 포함하는 피부 개선 키트를 제공함으로써 피부 과색소침착증을 개선할 수 있으며, 피부 미백 효과를 제공할 수 있다. 피부 주름생성을 방지 또는 완화할 수 있으므로, 우수한 항노화 효과를 제공한다. 또한, 본 발명은 섬유아세포(fibroblast), 각질형성세포(keratinocyte) 및 멜라닌 생성세포(melanocyte) 중 2종 이상의 공배양물을 포함하는 피부 개선 물질 스크리닝 시스템, 및 상기 피부 개선 물질 스크리닝 시스템의 공배양물에 후보물질을 처리하는 단계, 및 캐드헤린11 및 N-캐드헤린 중 하나 이상의 발현 변화를 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 개선 물질의 스크리닝 방법을 제공함으로써, 생체외(in vitro)에서도 임상적으로 캐드헤린11, N-캐드헤린의 발현 변화를 용이하게 측정하여, 피부 개선 물질을 효과적으로 스크리닝할 수 있다. The present invention provides a skin improvement composition comprising at least one expression inhibitory substance of Cadherin 11 and N-cadherin as an active ingredient, and a skin improvement kit comprising the same. Can be improved, and skin whitening effect can be provided. As it can prevent or alleviate skin wrinkles, it provides an excellent anti-aging effect. In addition, the present invention relates to a skin improvement material screening system comprising two or more co-cultures of fibroblasts, keratinocytes, and melanocytes, and a co-culture of the skin improvement material screening system. By providing a method for screening a skin improvement substance comprising the step of treating the candidate substance and measuring the change in expression of at least one of cadherin 11 and N-cadherin, clinical trials in vitro As a result, changes in the expression of cadherin 11 and N-cadherin can be easily measured to effectively screen skin improvement substances.

Description

Skin-improving material controlling expression of cadherin11 or N-cadherin and method for screening the material}

본 발명은 캐드헤린11 또는 N-캐드헤린 발현을 조절하는 피부 개선 물질 및 이를 스크리닝하는 방법에 대한 것이다. The present invention relates to a skin improvement substance that modulates the expression of cadherin 11 or N-cadherin and a method for screening the same.

피부는 자외선에 의한 피부 세포의 손상을 차단하기 위하여 멜라닌(melanin)이라는 천연 색소를 가지고 있다. 멜라닌은 피부의 표피-진피 경계 부위인 기저막 위에 위치한 멜라닌 생성 세포(melanocyte)에 의해 만들어지고 주변에 있는 각질 형성 세포(keratinocyte)로 이동하게 되는데 필요 이상으로 멜라닌이 많이 만들어지거나 과도하게 분산되게 되면 원치 않은 피부 과색소침착증이 발생한다.The skin has a natural pigment called melanin in order to block damage to skin cells caused by ultraviolet rays. Melanin is made by melanocytes located on the basement membrane, which is the epidermal-dermis boundary of the skin, and moves to the surrounding keratinocytes.If more melanin is produced or excessively dispersed than necessary, it is desired. Skin hyperpigmentation occurs.

피부 과색소침착증은 과도한 멜라닌 생성과 분산에 의한 것으로 정상적인 피부와 그 발생 원인이나 기전이 다르다. 기미나 흑자, 검버섯과 같은 피부 과색소침착증의 특징 중에 하나는 멜라닌 생성 세포가 본래의 위치를 이탈하여 기저막에서 진피 속으로 이동하는 것인데 멜라닌 생성 세포가 진피 속으로 어떻게 이동하고 진피 속으로 들어갔을 때 멜라닌 생성과 분산에는 어떤 영향이 있는지, 그리고 섬유아세포가 멜라닌 생성 세포에 미치는 영향은 무엇인지에 대한 연구 결과가 없다는 문제가 있었다.Skin hyperpigmentation is caused by excessive melanin production and dispersion, and the cause or mechanism of its occurrence is different from that of normal skin. One of the characteristics of skin hyperpigmentation such as spots, black spots, and age spots is that melanocytes move from the basement membrane to the dermis by leaving their original location. How the melanogenic cells move into the dermis and enter the dermis There was a problem that there was no research result on what effect it has on melanogenesis and dispersion, and what effect fibroblasts have on melanogenic cells.

한국등록특허 제10-0840144호Korean Patent Registration No. 10-0840144

본 발명의 구현 예들은 피부의 미백 및 노화의 개선에 효과적인 피부 개선 물질 및 이를 스크리닝하는 시스템과 스크리닝 방법을 제공하고자 한다. Embodiments of the present invention are intended to provide a skin-improving material effective in improving skin whitening and aging, and a system and a screening method for screening the same.

본 발명의 구현 예들은 캐드헤린11(Cadherin 11) 및 N-캐드헤린(N-cadherin) 중 하나 이상의 발현 억제 물질을 유효성분으로 포함하는 피부 개선용 조성물 및 이를 포함하는 피부 개선 키트를 제공한다.Embodiments of the present invention provide a composition for improving skin comprising as an active ingredient a substance that inhibits expression of at least one of Cadherin 11 and N-cadherin, and a skin improvement kit comprising the same.

본 발명의 다른 구현 예들은 섬유아세포(fibroblast), 각질형성세포(keratinocyte) 및 멜라닌 생성세포(melanocyte) 중 2종 이상의 공배양물을 포함하는 피부 개선 물질 스크리닝 시스템을 제공한다.Other embodiments of the present invention provide a skin improvement material screening system comprising a co-culture of at least two of fibroblasts, keratinocytes, and melanocytes.

또한, 본 발명의 구현 예들은 상기 피부 개선 물질 스크리닝 시스템의 공배양물에 후보물질을 처리하는 단계, 및 캐드헤린11 및 N-캐드헤린 중 하나 이상의 발현 변화를 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 개선 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.In addition, embodiments of the present invention include treating a candidate substance in a co-culture of the skin improvement substance screening system, and measuring changes in expression of at least one of cadherin 11 and N-cadherin. It provides a method for screening skin improvement substances.

본 발명에 따른 피부 개선 조성물은 피부 각질형성세포, 섬유아세포 또는 멜라닌 생성 세포의 캐드헤린11 및 N-캐드헤린 중 하나 이상의 발현을 억제함으로써 멜라닌 생성세포의 멜라닌 생성효소인 티로시나제, 그 전사인자인 MITF 발현을 억제하고 RAC과 베타-카테닌의 활성을 억제할 수 있다. 이로써 멜라닌의 생성 및 분산을 억제하여 피부 과색소침착증을 개선할 수 있으며, 피부 미백 효과를 제공할 수 있다. 또한 캐드헤린11의 발현을 억제함으로써 콜라겐 분해효소의 발현을 억제하여, 콜라겐 분해를 방지하고 멜라닌 생성세포의 기저막에서 진피로의 이동을 억제하여, 피부 주름생성을 방지 또는 완화할 수 있으므로, 우수한 항노화 효과를 나타낸다. Skin improvement composition according to the present invention is by inhibiting the expression of one or more of cadherin 11 and N-cadherin in skin keratinocytes, fibroblasts or melanogenic cells, tyrosinase, a melanin synthase of melanocytes, and MITF, a transcription factor thereof. It can inhibit expression and inhibit the activity of RAC and beta-catenin. As a result, it is possible to suppress the production and dispersion of melanin to improve skin hyperpigmentation, and to provide a skin whitening effect. In addition, by suppressing the expression of cadherin 11, it inhibits the expression of collagen-degrading enzyme, prevents collagen degradation, and inhibits the migration of melanogenic cells from the basement membrane to the dermis, thereby preventing or alleviating skin wrinkles It has an aging effect.

본 발명의 피부 개선 물질 스크리닝 시스템 및 스크리닝 방법은 섬유아세포, 각질형성세포 및 멜라닌 생성세포 중 2종 이상의 공배양물을 포함함으로써 실제 피부 조직의 유전자 발현 정도 및 신호전달 인자의 인산화 정도와 유사한 조건을 가지므로, 생체외(in vitro)에서도 임상적으로 캐드헤린11, N-캐드헤린의 발현 변화를 효과적으로 측정할 수 있다. The skin-improving substance screening system and screening method of the present invention includes a co-culture of two or more of fibroblasts, keratinocytes, and melanogenic cells, thereby having conditions similar to the degree of gene expression in actual skin tissue and the degree of phosphorylation of signaling factors. Therefore, it is possible to effectively measure changes in the expression of cadherin 11 and N-cadherin clinically even in vitro.

도 1a 내지 도 1e는 miR-675가 캐드헤린11(CDH11)의 3UTR을 타겟팅함으로써 캐드헤린11의 발현을 억제함 보여주는 실험결과이다. 구체적으로, 도 1a의 상부는 miR-675와 캐드헤린11 mRNA의 3'UTR간의 상보적인 서열을 나타낸 것이고, 도 1a의 하부는 정상인간 섬유아세포내에 pMIR-CDH11 또는 변이체(mutant)가 miR-675와 함께, 또는 miR-675 없이 트랜스펙션되어 배양된 경우의 루시페라제 활성(luciferase activity)의 상대비(도 1a의 하부)를 나타낸 것이다(P<0.05). 이때 도 1a 하부의 그래프는 다섯개의 독립적인 실험으로부터 얻은 값을 평균±SD하여 나타낸 것이다. 도 1b 및 도 1c는 섬유아세포(FB) 및 각질형성세포(KC)에 다양한 농도의 miR-675의 유사체 또는 억제제를 처리하지 않은 경우(도 1b)와 처리한 경우(도 1c; 왼쪽이 유사체, 오른쪽이 억제제를 처리한 경우)의 각 캐드헤린11(CDH11) 발현정도를 웨스턴블랏 분석(Western blot analysis)하여 나타낸 것이다. 이때, β-액틴(β-actin)은 국제규격인 것을 사용하였다. 도 1d는 miR-675이 감소된 다섯명의 기미 환자의 정상 색소 피부 대비 과색소침착된 피부의 캐드헤린11 발현량의 상대비를 RT(Real time) PCR로 분석한 결과를 나타낸 것이다. 이때 GAPDH는 국제규격의 것을 사용하였다. 도 1e는 안티-캐드헤린11 및 안티-K14 항체를 사용한 miR-675가 감소된 4명의 기미환자의 정상 색소 피부(N) 및 과색소침착된 피부(L)를 면역형광염색하여 형광현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 2a 내지 도 2f는 섬유아세포내 캐드헤린11의 발현과 멜라닌 형성과의 관련성을 보여주는 실험결과이다. 구체적으로, 도 2a는 섬유아세포-멜라닌 생성세포 공배양으로, 왼쪽부터 단분자막 공배양, 챔버 하부의 섬유아세포 및 인서트(insert) 상부의 멜라닌 생성세포의 공배양 및 인서트 외측의 섬유아세포 및 인서트 상부의 멜라닌 생성세포의 공배양을 각각 도시한 것이다. 도 2b는 캐드헤린11(CDH11) 유전자 또는 캐드헤린11 siRNA를 트랜스펙션한 후 캐드헤린11 발현정도를 웨스턴 블랏 분석하여 나타낸 것이다(그래프 x축의 왼쪽부터 control, CDH11, control siRNA, CDH11 siRNA). 도 2c는 캐드헤린11이 과발현 또는 발현감소된 섬유아세포와 공배양된 멜라닌 생성세포의 LY294002가 처리, 또는 처리되지 않은 경우의 티로시나제(tyrosinase), MITF, CREB, p-CREB, ERK, p-ERK, AKT, p-AKT, Wnt-3A, 및 β-카테닌(β-catenin)의 발현정도를 웨스턴 블랏 분석하여 나타낸 것이다. 도 2d는 캐드헤린11이 과발현 또는 발현감소된 섬유아세포 단분자막 공배양물의 막(membranous) 및 핵 부위의 β-카테닌 발현량을 웨스턴 블랏 분석하여 나타낸 것이다. 도 2e는 안티-캐드헤린11 항체를 사용한, 캐드헤린11이 발현감소된 섬유아세포 단분자막 공배양물내 면역침강(Immunoprecipitation) 결과를 나타낸 것이다. 도 2f는 안티-캐드헤린11 및 안티-β-카테닌 항체들을 사용한, 캐드헤린11이 발현감소된 섬유아세포 단분자막 공배양물의 면역형광염색 결과를 나타낸 것이다(scale bar = 50㎛). 이때 각 그래프는 다섯개의 독립적인 실험으로부터 얻은 값을 평균±SD하여 나타낸 것이다(P<0.05).
도 3a 및 도 3b는 섬유아세포내 캐드헤린11 발현과 멜라노좀(melanosome)이동과의 관련성을 보여주는 실험결과이다. 구체적으로, 도 3a는 인서트 외측의 섬유아세포(캐드헤린11 과발현 또는 발현감소) 및 인서트 내측의 각질형성세포/멜라닌 생성세포로 된 공배양 시스템에서 세포에 안티-TYRP1 및 안티-K14 항체들을 사용한 FACS 분석결과를 나타낸 것이다. 도 3b는 멜라닌 생성 세포의 세포돌기(dendrite) 형성에 관여하는 Rac1, LY294002가 처리 또는 무처리된 p-Rac1 및 PAR2 발현을 웨스턴 블랏 분석한 결과를 나타낸 것이다. 이때 각 그래프는 다섯개의 독립적인 실험으로부터 얻은 값을 평균±SD하여 나타낸 것이다(P<0.05).
도 4a 내지 도 4f는 각질형성세포내 캐드헤린11의 발현과 멜라닌형성 및 멜라노좀 이동의 관련성을 확인한 실험결과를 나타낸 것이다. 구체적으로, 도 4a는 캐드헤린11 유전자 또는 캐드헤린 siRNA를 트렌스펙션한 후의 캐드헤린11 발현을 웨스턴 블랏 분석한 결과를 나타낸 것이다. 도 4ba 및 도 4bb는 캐드헤린11이 과발현 또는 발현감소된 각질형성세포와 공배양된 멜라닌 생성세포내 LY294002가 처리 또는 무처리된 티로시나제, MITF, CREB, p-CREB, AKT, p-AKT, Wnt-3A 및 β-카테닌의 발현을 웨스턴 블랏 분석한 결과를 나타낸 것이다. 도 4c는 캐드헤린11이 과발현된 각질형성세포와 공배양된 멜라닌 생성세포의 세포질 및 핵 부분내 β-카테닌의 발현을 웨스턴 블랏 분석한 결과를 나타낸 것이다. 도 4d는 안티-캐드헤린11 항체를 이용한 면역 침강 웨스턴 블랏으로 캐드헤린11 억제제가 β-카테닌 및 Wnt-3A의 결합에 미치는 영향을 나타낸 것이다. 도 4e는 캐드헤린11이 과발현 또는 발현감소된 각질형성세포와 멜라닌 생성 세포를 공배양했을 때 멜라노좀을 가지고 있는(TRP1: 멜라노좀 표지 단백질) 각질형성세포의 수(Keratin14: 각질형성세포 표지 단백질)를 FACS 분석으로 나타낸 결과이다. 도 4f는 캐드헤린11이 과발현 또는 발현감소된 각질형성세포와의 공배양물들내 Rac1, p-Rac1 및 PAR2 발현을 웨스턴 블랏 분석한 결과를 나타낸 것이다. 이때 각 그래프는 다섯개의 독립적인 실험으로부터 얻은 값을 평균±SD하여 나타낸 것이다(P<0.05).
도 5a 및 도 5b는 섬유아세포내 캐드헤린11의 MMP-1(matrix metalloproteinase-1) 및 MMP-2(matrix metalloproteinase-2) 발현유도 실험결과를 나타낸 것이다. 구체적으로, 도 5a는 케드헤린11이 과발현 또는 발현감소된 섬유아세포내 콜라겐 분해효소인 MMP-1 및 MMP-2 발현을 웨스턴 블랏 분석한 결과를 나타낸 것이다. 이때 각 그래프는 다섯개의 독립적인 실험으로부터 얻은 값을 평균±SD하여 나타낸 것이다(P<0.05). 도 5b는 안티-타입 IV 콜라겐 및 안티-K14 항체들을 사용한, miR-675가 감소된 네명의 기미 환자들의 과색소침착 및 정상 색소 피부의 면역형광 염색결과를 형광현미경으로 측정한 결과를 나타낸 것이다(scale bar = 50㎛).
도 6a 내지 도 6h는 섬유아세포내 캐드헤린11의 멜라닌 생성세포내 N-캐드헤린 발현유도 실험결과를 나타낸 것이다. 구체적으로, 도 6a 및 6b는 캐드헤린11이 과발현(도 6a) 및 발현감소(도 6b)된 섬유아세포-멜라닌 생성세포 공배양물의 N-캐드헤린 및 E-캐드헤린 발현에 대한 차이를 웨스턴 블랏 분석하여 나타낸 도이다. 도 6c 및 도 6d는 캐드헤린11이 과발현(도 6c) 및 발현감소(도 6d)된 섬유아세포의 단분자막 공배양물에 안티-캐드헤린11 및 안티-N-캐드헤린 항체를 사용하여 면역형광염색한 결과를 나타낸 것이다. 도 6e는 캐드헤린11이 발현감소된 섬유아세포의 단분자막 공배양물에 안티-캐드헤린11 항체를 사용하여 면역침각한 결과를 나타낸 것이다(scale bar = 50㎛). 도 6f는 멜라닌 생성세포의 유무에 따른 캐드헤린11이 과발현된 섬유아세포내 Twist1 발현을 웨스턴 블랏 분석한 결과를 나타낸 것이다. 도 6g는 N-캐드헤린이 발현감소 또는 발현감소되지 않은 캐드헤린11 과발현 섬유아세포와 공배양된 인서트내 멜라닌 생성세포의 티로시나제 발현을 웨스턴 블랏분석한 결과를 나타낸 것이다. 도 6h는 캐드헤린11이 과발현 또는 발현감소된 섬유아세포의 존재하 멜라닌 생성세포 이동에 대한 보이든 챔버 분석(Boyden chamber assay) 결과를 나타낸 도이다. 이때 각 그래프는 다섯개의 독립적인 실험으로부터 얻은 값을 평균±SD하여 나타낸 것이다(P<0.05).
도 7a 및 도 7b는 각질형성세포내 캐드헤린11의 EMT 유도 실험결과를 나타낸 것으로, 구체적으로 멜라닌 생성세포의 유무에 따른 캐드헤린11 과발현 각질형성세포내 N-캐드헤린, E-캐드헤린 및 Twist1 발현을 웨스턴블랏 분석한 결과를 나타낸 것이다. 이때 그래프는 다섯개의 독립적인 실험으로부터 얻은 값을 평균±SD하여 나타낸 것이다(P<0.05).
도 8은 기미 피부에서의 캐드헤린11의 역할을 개략적으로 나타낸 도이다.1A to 1E are experimental results showing that miR-675 inhibits the expression of cadherin 11 by targeting the 3'UTR of cadherin 11 (CDH11). Specifically, the upper part of FIG. 1A shows the complementary sequence between miR-675 and the 3'UTR of Cadherin 11 mRNA, and the lower part of FIG. 1A shows pMIR-CDH11 or a mutant miR-675 in normal human fibroblasts. It shows the relative ratio of luciferase activity (lower part of Fig. 1A) when transfected with or without miR-675 and cultured (P<0.05). At this time, the graph in the lower part of Fig. 1a shows the mean±SD of values obtained from five independent experiments. 1B and 1C are fibroblasts (FB) and keratinocytes (KC) in which various concentrations of miR-675 analogs or inhibitors were not treated (FIG. 1B) and treated (FIG. 1C; left analog, The right side shows the expression level of each cadherin 11 (CDH11) in the case of treatment with the inhibitor) by Western blot analysis. At this time, β-actin was used as an international standard. Figure 1d shows the results of analyzing the relative ratio of the expression level of cadherin 11 in hyperpigmented skin compared to normal pigmented skin of five melasma patients with reduced miR-675 by RT (Real time) PCR. At this time, GAPDH was used in international standards. FIG. 1E is an immunofluorescence staining of normal pigmented skin (N) and hyperpigmented skin (L) of 4 melasma patients with reduced miR-675 using anti-cadherin 11 and anti-K14 antibodies and observed with a fluorescence microscope. It shows one result.
2A to 2F are experimental results showing the relationship between expression of cadherin 11 and melanin formation in fibroblasts. Specifically, Figure 2a is a fibroblast-melanogenic cell co-culture, from the left to a monomolecular membrane co-culture, a co-culture of fibroblasts in the lower chamber and melan-producing cells on the upper insert, and fibroblasts outside the insert and on the top of the insert. It shows the co-culture of melanogenic cells, respectively. Figure 2b shows the degree of expression of cadherin 11 after transfection of cadherin 11 (CDH11) gene or cadherin 11 siRNA by Western blot analysis (from the left of the graph x-axis control, CDH11, control siRNA, CDH11 siRNA). Figure 2c is tyrosinase (tyrosinase), MITF, CREB, p-CREB, ERK, p-ERK when LY294002 of melanogenic cells co-cultured with fibroblasts co-cultured with cadherin 11 overexpressed or reduced expression , AKT, p-AKT, Wnt-3A, and β-catenin (β-catenin) is expressed by Western blot analysis. Figure 2d shows the expression level of β-catenin in the membrane (membranous) and nuclear region of the fibroblast monolayer co-culture of cadherin 11 overexpressed or reduced by Western blot analysis. Figure 2e shows the results of immunoprecipitation in a fibroblast monolayer co-culture with reduced expression of cadherin 11 using an anti-cadherin 11 antibody. Figure 2f shows the results of immunofluorescence staining of fibroblast monolayer co-cultures with reduced expression of cadherin 11 using anti-cadherin 11 and anti-β-catenin antibodies (scale bar = 50 μm). At this time, each graph represents the mean±SD of the values obtained from five independent experiments (P<0.05).
3A and 3B are experimental results showing the relationship between cadherin 11 expression and melanosome movement in fibroblasts. Specifically, Figure 3a is a FACS using anti-TYRP1 and anti-K14 antibodies to cells in a co-culture system consisting of fibroblasts outside the insert (overexpression or reduced expression of cadherin 11) and keratinocytes/melanin producing cells inside the insert. It shows the analysis result. Figure 3b shows the results of Western blot analysis of the expression of p-Rac1 and PAR2 treated with or without Rac1, LY294002, which are involved in the formation of dendrite of melanin-producing cells. At this time, each graph represents the mean±SD of the values obtained from five independent experiments (P<0.05).
4A to 4F show experimental results confirming the relationship between expression of cadherin 11 in keratinocytes and melanogenesis and melanosome movement. Specifically, FIG. 4A shows the results of Western blot analysis of cadherin 11 expression after transfection of cadherin 11 gene or cadherin siRNA. 4ba and 4bb show tyrosinase, MITF, CREB, p-CREB, AKT, p-AKT, Wnt in melanin-producing cells co-cultured with keratinocytes in which cadherin 11 is overexpressed or reduced in expression. It shows the results of Western blot analysis of the expression of -3A and β-catenin. Figure 4c shows the results of Western blot analysis of the expression of β-catenin in the cytoplasm and nuclear portion of the keratinocytes co-cultured with keratinocytes co-cultured with cadherin 11. 4D is an immunoprecipitation western blot using an anti-cadherin 11 antibody, showing the effect of a cadherin 11 inhibitor on the binding of β-catenin and Wnt-3A. Figure 4e is the number of keratinocytes having melanosomes (TRP1: melanosomal labeling protein) when keratinocytes with overexpression or reduced expression of cadherin 11 and melanogenic cells are co-cultured (Keratin14: keratinocyte marker protein) ) Is the result of FACS analysis. Figure 4f shows the results of Western blot analysis of the expression of Rac1, p-Rac1 and PAR2 in co-cultures with keratinocytes in which cadherin 11 is overexpressed or reduced in expression. At this time, each graph represents the mean±SD of the values obtained from five independent experiments (P<0.05).
5A and 5B show experimental results of induction of expression of matrix metalloproteinase-1 (MMP-1) and matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) of cadherin 11 in fibroblasts. Specifically, FIG. 5A shows the results of Western blot analysis of the expression of collagenases MMP-1 and MMP-2 in fibroblasts in which ketherin 11 is overexpressed or reduced in expression. At this time, each graph represents the mean±SD of the values obtained from five independent experiments (P<0.05). Figure 5b shows the results of measuring the results of hyperpigmentation and immunofluorescence staining of normal pigmented skin of four melasma patients with reduced miR-675 using anti-type IV collagen and anti-K14 antibodies with a fluorescence microscope ( scale bar = 50 μm).
6A to 6H show the results of experiments inducing N-cadherin expression in melanin producing cells of cadherin 11 in fibroblasts. Specifically, Figures 6a and 6b show the difference in N-cadherin and E-cadherin expression of fibroblast-melanogenic cell cocultures in which cadherin 11 is overexpressed (Figure 6a) and reduced expression (Figure 6b). It is a diagram showing the analysis. 6C and 6D show immunofluorescence staining using anti-cadherin 11 and anti-N-cadherin antibodies in monolayer co-culture of fibroblasts with overexpression of cadherin 11 (FIG. 6c) and reduced expression (FIG. 6d ). It shows the results. Figure 6e shows the result of immunoprecipitation using an anti-cadherin 11 antibody in a monolayer co-culture of fibroblasts with reduced expression of cadherin 11 (scale bar = 50 μm). 6F shows the results of Western blot analysis of Twist1 expression in fibroblasts overexpressed with cadherin 11 according to the presence or absence of melanin producing cells. 6G shows the results of Western blot analysis of tyrosinase expression of melanin-producing cells in inserts co-cultured with Cadherin 11 overexpressing fibroblasts in which N-cadherin expression is reduced or not expressed. 6H is a diagram showing the results of Boyden chamber assay on the migration of melanogenic cells in the presence of fibroblasts in which cadherin 11 is overexpressed or reduced in expression. At this time, each graph represents the mean±SD of the values obtained from five independent experiments (P<0.05).
7A and 7B show the results of an EMT induction experiment of cadherin 11 in keratinocytes. Specifically, N-cadherin, E-cadherin and Twist1 in keratinocytes overexpressing cadherin 11 according to the presence or absence of melanogenic cells. It shows the results of Western blot analysis of expression. At this time, the graph shows the mean±SD of the values obtained from five independent experiments (P<0.05).
8 is a diagram schematically showing the role of cadherin 11 in spot skin.

본 명세서에서 "피부"라 함은, 동물의 체표를 덮는 조직을 의미하는 것으로서, 얼굴 또는 바디 등의 체표를 덮는 조직뿐만 아니라, 두피와 모발을 포함하는 최광의의 개념이다.In the present specification, the term "skin" refers to a tissue covering the body surface of an animal, and is the broadest concept including the scalp and hair, as well as the tissue covering the body surface such as a face or body.

이하, 본 발명을 본 명세서에 첨부된 도면을 참조로 하여 상세하게 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings.

본 발명의 구현예들은 캐드헤린11(Cadherin 11(CDH11), ACCESSION: AAD27755, VERSION: AAD27755.1, GI: 4689094) 및 N-캐드헤린(N-cadherin, (ACCESSION: AAB22854, VERSION: AAB22854.1, GI: 253483) 중 하나 이상의 발현 억제 물질을 유효성분으로 포함하는 피부 개선용 조성물을 제공한다.Embodiments of the present invention are Cadherin 11 (CDH11), ACCESSION: AAD27755, VERSION: AAD27755.1, GI: 4689094) and N-cadherin, (ACCESSION: AAB22854, VERSION: AAB22854.1 , GI: 253483) provides a composition for improving skin comprising one or more expression inhibitory substances as an active ingredient.

기미(melasma)와 같은 피부 과색소침착증 환자의 피부에는 마이크로RNA인 miR-675가 감소되어 있다. 상기 miR-675는 H19 유래 마이크로RNA로서 H19 유전자는 기미부위에서 하향조절(downregulation)된다. 상기 miR-675는 MITF(microphthalmia-associated transcription factor)를 타겟으로 하며, 엑소좀(exosome)내의 각질형성세포(kerinocyte)로부터 방출된다. 상기 miR-675는 상기 MITF 이외에 본 발명의 일 구현예에 따른 조성물의 유효성분인 캐드헤린11도 타겟으로 한다. 상기 캐드헤린11의 3'UTR(untranslate region)은 miRNA 타겟 추정부위를 포함한다. 구체적으로, miR-675는 캐드헤린11의 3'UTR을 포함하는 세포로 트랜스펙션(transfection)할 수 있지만 캐드헤린11 3'UTR의 변이체는 캐드헤린11의 발현을 감소시키지 않는다(도 1a 참조). 이는 캐드헤린11의 3'UTR에 miR-675이 직접결합함을 의미한다. 캐드헤린11의 발현량의 증가 또는 감소는 miR-675, 예를 들면 miR-675의 유사체(mimic) 또는 억제제(inhibitor)의 트랜스펙션에 의해 유도될 수 있다. 이에 따라, 과색소침착증인 경우 miR-675가 그 타겟 유전자인 각질 형성세포와 섬유아세포의 캐드헤린11의 발현을 억제하지 못하기 때문에 과색소침착증 부위에서 그 발현이 증가하게 된다.The skin of patients with skin hyperpigmentation such as melasma has a reduced microRNA, miR-675. The miR-675 is an H19-derived microRNA, and the H19 gene is downregulated at the melasma region. The miR-675 targets MITF (microphthalmia-associated transcription factor), and is released from kerinocytes in exosomes. In addition to the MITF, the miR-675 targets cadherin 11, which is an active ingredient of the composition according to an embodiment of the present invention. The 3'UTR (untranslate region) of Cadherin 11 contains an estimated miRNA target site. Specifically, miR-675 can be transfected into cells containing 3'UTR of cadherin 11, but a variant of cadherin 11 3'UTR does not reduce the expression of cadherin 11 (see FIG. 1A). ). This means that miR-675 directly binds to the 3'UTR of cadherin11. The increase or decrease in the expression level of cadherin 11 can be induced by transfection of miR-675, for example miR-675 mimic or inhibitor. Accordingly, in the case of hyperpigmentation, miR-675 cannot inhibit the expression of cadherin 11 in keratinocytes and fibroblasts, which are target genes, and thus its expression increases at the site of hyperpigmentation.

본 발명의 구현예들에 따른 상기 캐드헤린11은 Ca² ⁺의존성 막관통 세포 연접 분자인 캐드헤린의 상과(superfamily)로서, 상기 캐드헤린은 타입-1 막관통 단백질로 세포연접에 중요한 역할을 하며 조직내에서 세포들이 밀착연접을 형성한다. 캐드헤린11은 배아 발달, 조직의 형태 형성, 종양의 침윤과 전이, 염증, 및 신호 전달에 기여한다. 본 발명의 구현예들에 따른 상기 캐드헤린 11은 각질형성세포 및 섬유아세포에서 발현한다. 상기 캐드헤린11은 멜라닌 생성세포에서는 발현하지 않지만, 상기 섬유아세포 유래 캐드헤린11은 멜라닌 생성세포를 기저막에서 진피로 이동시킬 수 있다. 섬유아세포 또는 각질형성세포 유래 캐드헤린11은 각각 AKT-β-카테닌(β-catenin)-Wnt와 AKT-Rac1 경로(pathway)를 통한 멜라닌 형성(melanogenesis) 및 멜라노좀(melanosome) 뿐만 아니라, EMT(epithelial-mesenchymal transition)를 겪는 세포 내에서 N-캐드헤린의 상향조절(upregulation)에 관여한다.The cadherin 11 according to the embodiments of the present invention is a superfamily of cadherin, a Ca ² ⁺ dependent transmembrane cell-connecting molecule, and the cadherin is a type-1 transmembrane protein that plays an important role in cell connection. The cells form a tight junction in the tissue. Cadherin 11 contributes to embryonic development, tissue morphogenesis, tumor invasion and metastasis, inflammation, and signaling. The cadherin 11 according to embodiments of the present invention is expressed in keratinocytes and fibroblasts. The cadherin 11 is not expressed in melanin-producing cells, but the fibroblast-derived cadherin 11 can move melanin-producing cells from the basement membrane to the dermis. Cadherin 11 derived from fibroblasts or keratinocytes, as well as melanogenesis and melanosome through AKT-β-catenin-Wnt and AKT-Rac1 pathways, respectively, EMT ( It is involved in the upregulation of N-cadherin in cells undergoing epithelial-mesenchymal transition.

도 8을 참조로 하여 본 발명의 구현예들에 포함되는 상기 캐드헤린11에 대하여 보다 구체적으로 살펴보면 다음과 같다. 섬유아세포 및 각질형성세포내 캐드헤린11의 과발현은 공배양된 멜라닌 생성세포내 N-캐드헤린의 발현을 유도하게 되는데, 이는 표준(canonical) Wnt 및 AKT 활성경로를 통한 멜라닌 형성 및 AKT/Rac1 인산화(phosphorylation)을 통한 멜라노좀의 이동과 연관된다. 즉, 캐드헤린11이 과발현된 섬유아세포 및 각질형성세포는 각질형성세포, 멜라닌 생성세포, 섬유아세포에 존재하는 N-캐드헤린 발현을 증가시킨다. N-캐드헤린 및 Twist1 발현의 증가, 및/또는 E-캐드헤린 발현의 감소에 의해 EMT를 촉진시킨다. 또한 RAC과 β-카테닌을 통하여 멜라닌의 생성 및 분산을 증가시킨다. 한편, 섬유아세포내 캐드헤린11 과발현은 콜라겐 분해효소인 MMP-1(matrix metalloproteinase-1) 및 MMP-2(matrix metalloproteinase-2) 발현을 증가시켜 기저막과 진피에 있는 콜라겐이 분해되고, 세포 이동을 가능하게 한다. 또한 멜라닌 생성세포 내 N-캐드헤린의 발현 증가는 섬유아세포 및 멜라닌 생성세포 사이의 세포간 접촉을 도와준다. 이로써 멜라닌 생성세포는 기저막에서 위치를 이탈하여 진피 속으로 이동하여 피부 주름을 촉진하게 된다.A more detailed look at the CAD Herin 11 included in the embodiments of the present invention with reference to FIG. 8 is as follows. Overexpression of cadherin 11 in fibroblasts and keratinocytes induces the expression of N-cadherin in co-cultured melanogenic cells, which is melanin formation and AKT/Rac1 phosphorylation through canonical Wnt and AKT activation pathways. It is associated with the movement of melanosomes through (phosphorylation). That is, fibroblasts and keratinocytes overexpressing cadherin 11 increase the expression of N-cadherin present in keratinocytes, melanogenic cells, and fibroblasts. EMT is promoted by increasing N-cadherin and Twist1 expression, and/or decreasing E-cadherin expression. It also increases the production and dispersion of melanin through RAC and β-catenin. On the other hand, cadherin 11 overexpression in fibroblasts increases the expression of collagen-degrading enzymes MMP-1 (matrix metalloproteinase-1) and MMP-2 (matrix metalloproteinase-2), thereby degrading collagen in the basement membrane and dermis and inhibiting cell migration. Make it possible. In addition, the increased expression of N-cadherin in melanocytes helps cell-to-cell contact between fibroblasts and melanocytes. As a result, the melanogenic cells move away from the basement membrane and move into the dermis to promote skin wrinkles.

이에 본 발명의 구현예들은 캐드헤린 11 및 N-캐드헤린 중 하나 이상의 발현을 억제시키는 물질을 유효성분으로 포함함으로써, 멜라닌 생성 세포의 멜라닌 생성을 억제할 수 있다. 따라서 miR-675의 감소로 캐드헤린11의 발현이 증가된 과색소침착증 피부를 개선할 수 있거나, 피부에 미백효과를 제공할 수 있다. 또한, 캐드헤린11의 발현을 억제하거나 N-캐드헤린의 발현을 억제함으로써, MMP-1 및 MMP-2를 예로 들 수 있는 콜라겐 분해효소의 발현을 억제하여 콜라겐 분해를 억제할 수 있다. 이로서 피부 주름생성을 방지하고 피부 항노화 효과를 제공할 수 있다. 본 발명의 일 구현예로서 상기 조성물은 예를 들어 상기 캐드헤린11 또는 N-캐드헤린의 mRNA에 결합하는 siRNA, 및 캐드헤린11 또는 N-캐드헤린의 항체 중 하나 이상을 유효성분으로 포함할 수 있다. Accordingly, embodiments of the present invention may suppress melanogenesis in melanogenic cells by including a substance that inhibits the expression of one or more of cadherin 11 and N-cadherin as an active ingredient. Therefore, the reduction of miR-675 can improve hyperpigmented skin with increased expression of cadherin 11, or can provide a skin whitening effect. In addition, by suppressing the expression of cadherin 11 or N-cadherin, the expression of collagen-degrading enzymes, such as MMP-1 and MMP-2, can be suppressed and collagen degradation can be suppressed. This can prevent skin wrinkles and provide skin anti-aging effects. As an embodiment of the present invention, the composition may include, for example, siRNA that binds to the mRNA of Cadherin 11 or N-cadherin, and at least one of an antibody of Cadherin 11 or N-cadherin as an active ingredient. have.

본 발명의 구현예들에 따른 상기 조성물은 피부 외용제 조성물일 수 있으며, 화장료 조성물, 약학 조성물 또는 식품 조성물일 수 있다.The composition according to embodiments of the present invention may be a composition for external application for skin, and may be a cosmetic composition, a pharmaceutical composition, or a food composition.

또한, 본 발명의 구현예들은 상기와 같은 조성물을 포함하는 피부 개선 키트를 제공할 수 있으며, 상기 피부 개선 키트는 본 발명의 조성물의 피부 미백, 과색소침착증 개선, 피부 주름생성 완화 또는 방지, 항노화 등의 피부 개선 용도 및 효과를 기재한 설명서를 더 포함할 수 있다.In addition, embodiments of the present invention may provide a skin improvement kit comprising the composition as described above, and the skin improvement kit is the skin whitening, hyperpigmentation improvement, skin wrinkle formation alleviation or prevention of the composition of the present invention. It may further include a description describing the use and effect of improving skin such as aging.

본 발명의 다른 구현예들은 상기와 같은 캐드헤린 11 및 N-캐드헤린 중 하나 이상의 발현을 억제시키는 물질을 스크리닝하기 위한 피부 개선 물질 스크리닝 시스템으로서, 섬유아세포(fibroblast), 각질형성세포(keratinocyte) 및 멜라닌 생성세포(melanocyte) 중 2종 이상의 공배양물을 포함하는 피부 개선 물질 스크리닝 시스템을 제공할 수 있다. 일 구현 예로서 상기 피부 개선 물질 스크리닝 시스템은 섬유아세포와 멜라닌생성세포의 공배양물 또는 섬유아세포, 각질형성세포 및 멜라닌 생성세포의 공배양물을 포함할 수 있다. 보다 구체적으로는 섬유아세포와 멜라닌생성세포의 공배양물은 섬유아세포와 멜라닌생성세포를 30:1~1:1의 세포 수 비율로 공배양한 것일 수 있다. 섬유아세포, 각질형성세포 및 멜라닌 생성세포의 공배양물은 30:30:1 ~ 1:1:1의 세포 수 비율로 공배양한 것일 수 있다. 상기 비율을 피부 생리학적으로 유의미한 범위를 나타낸 것이며, 흑자, 검버섯, 기미와 같이 과색소침착증이 일어난 피부의 경우 멜라닌 생성세포 수가 증가하게 된다.Other embodiments of the present invention are a skin improvement material screening system for screening a substance that inhibits the expression of one or more of Cadherin 11 and N-cadherin as described above, including fibroblasts, keratinocytes, and It is possible to provide a skin improvement material screening system including two or more co-cultures of melanocytes. As an embodiment, the skin improvement material screening system may include a co-culture of fibroblasts and melanogenic cells, or a co-culture of fibroblasts, keratinocytes, and melanogenic cells. More specifically, the co-culture of fibroblasts and melanogenic cells may be obtained by co-culture of fibroblasts and melanogenic cells at a cell number ratio of 30:1 to 1:1. The co-culture of fibroblasts, keratinocytes, and melanogenic cells may be co-cultured at a cell number ratio of 30:30:1 to 1:1:1. The above ratio shows a range of skin physiologically significant, and in the case of skin with hyperpigmentation such as black spots, age spots, and spots, the number of melanogenic cells increases.

본 발명의 일 구현예로서 상기 섬유아세포 및 각질형성세포 중 하나 이상의 세포는 캐드헤린11(Cadherin 11) 과발현(overexpression) 세포를 포함할 수 있으며, 상기 섬유아세포, 각질형성세포 및 멜라닌 생성세포 중 하나 이상의 세포는 N-캐드헤린(N-cadherin) 과발현 세포를 포함할 수 있다. 일 구현예로서 상기 섬유아세포, 각질형성세포 및 멜라닌 생성세포 중 하나 이상의 세포는 인간, 마우스, 기니아피그, 닭 및 돼지 중에서 선택된 하나 이상에서 유래한 세포를 포함할 수 있다. As an embodiment of the present invention, at least one of the fibroblasts and keratinocytes may include a Cadherin 11 overexpression cell, and one of the fibroblasts, keratinocytes and melanogenic cells The above cells may include N-cadherin overexpressing cells. In one embodiment, at least one of the fibroblasts, keratinocytes and melanogenic cells may include cells derived from at least one selected from human, mouse, guinea pig, chicken, and pig.

또한, 본 발명의 일 구현예로서, 상기 피부 개선 물질 스크리닝 시스템은 인서트(insert)를 포함하는 챔버를 포함할 수 있으며, 상기 공배양물의 세포 중 하나 이상은 상기 챔버내 인서트의 내부에서 배양된 것일 수 있다. 일 구현예로서 상기 피부 개선 물질 스크리닝 시스템은 섬유아세포와 멜라닌생성세포의 공배양시 멜라닌생성세포를 인서트내부에서 배양할 수 있다. 또는 섬유아세포, 각질형성세포 및 멜라닌 생성세포의 공배양시 각질형성세포 및 멜라닌생성세포를 인서트 내부에서 배양할 수 있다.In addition, as an embodiment of the present invention, the skin improvement material screening system may include a chamber including an insert, and at least one of the cells of the co-culture is cultured inside the insert in the chamber. I can. As an embodiment, the skin-improving material screening system may cultivate the melanogenic cells inside the insert when the fibroblasts and melanogenic cells are co-cultured. Alternatively, when co-culturing fibroblasts, keratinocytes, and melanogenic cells, keratinocytes and melanogenic cells may be cultured inside the insert.

상기와 같은 시스템은 실제 피부와 유사한 생리적, 화학적 특징을 가지므로, 피부 개선 물질을 생체외(in vitro)에서도 효과적으로 스크리닝할 수 있으며, 이로써 피부 미백 또는 과색소침착증을 개선하거나 피부 노화를 방지 또는 개선하는 물질을 선별할 수 있다. Since the above system has physiological and chemical characteristics similar to those of real skin, it can effectively screen skin improvement substances in vitro, thereby improving skin whitening or hyperpigmentation, or preventing or improving skin aging. You can select the material that you want.

본 발명의 또다른 구현예들은 상기 피부 개선 물질 스크리닝 시스템의 공배양물에 후보물질을 처리하는 단계, 및 캐드헤린11 및 N-캐드헤린 중 하나 이상의 발현 변화를 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 개선 물질의 스크리닝 방법을 제공할 수 있다. 또한, 일 구현예로서 상기 발현 변화를 측정하는 단계 이후, 캐드헤린11 및 N-캐드헤린 중 하나 이상의 발현을 감소시킨 물질을 피부 개선 물질로 판단하는 단계를 더 포함할 수 있다. 일 구현예로서 상기 발현 변화를 측정하는 단계의 측정방법은 상기 캐드헤린11 및 N-캐드헤린 중 하나 이상의 발현 변화를 측정할 수 있는 것이라며 제한되지 않으나, 예를 들면 RT(Real time)-PCR, 웨스턴 블랏(western blot), 면역형광염색(Immunofluorescence staining) 및 면역침강(Immunoprecipitation) 중 하나 이상의 방법을 포함할 수 있다.
Still another embodiment of the present invention comprises the step of treating a candidate substance in a co-culture of the skin improvement substance screening system, and measuring a change in expression of at least one of cadherin 11 and N-cadherin. A method for screening skin improvement substances can be provided. In addition, as an embodiment, after the step of measuring the expression change, a step of determining a substance having reduced expression of at least one of cadherin 11 and N-cadherin as a skin improvement substance may be further included. As an embodiment, the measurement method of the step of measuring the expression change is not limited as being capable of measuring the expression change of one or more of the cadherin 11 and N-cadherin, for example, RT (Real time)-PCR, Western blot (western blot), immunofluorescence staining (Immunofluorescence staining) and may include one or more methods of immunoprecipitation (Immunoprecipitation).

이하, 실험예, 실시예 및 비교예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 아래 실험예, 실시예 및 비교예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 그에 의해 제한되는 것은 아니다.
Hereinafter, the configuration and effects of the present invention will be described in more detail with reference to experimental examples, examples and comparative examples. However, the following experimental examples, examples, and comparative examples are provided for illustrative purposes only to aid understanding of the present invention, and the scope and scope of the present invention are not limited thereto.

이때, 하기 실험들에 사용된 공통적인 실험방법을 구체적으로 설명하면 하기와 같다.
In this case, a detailed description of the common experimental method used in the following experiments is as follows.

세포의 배양Cell culture

하기 실험들에서는 여성의 얼굴 피부에 있는 기미조직이나 제왕절개로부터 얻은 피부 조직 및 남성의 환상절제술(포경수술)로부터 얻은 포피 조직을 세포배양을 위한 시료로 하였다. 상기 피부조직에서 얻은 세포에 제한되지 않으며, 예를 들면 인비트로젠(Invitrogen)에서 구입한 세포를 사용할 수 있다. In the following experiments, melasma tissue in the skin of a woman's face, skin tissue obtained from a cesarean section, and foreskin tissue obtained from a male annulotomy (circumcision) were used as samples for cell culture. It is not limited to cells obtained from the skin tissue, for example, cells purchased from Invitrogen can be used.

그 다음 상기 시료를 표피를 진피로부터 분리하고, 각 표피세포들의 현탁액을 준비하였다. 구체적으로, 각질형성세포들은 BPE (bovine pituitary extract), BI(bovine insulin), 히드로코르티손(hydrocortisone), 인간상피세포성장인자 및 BT(bovine transferring, #S-001-5; Invitrogen)가 보충된 에피라이프 배지(EpiLife Medium, #M-EPI-500-CA; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에 넣어 배양하였다. 멜라닌생성세포는 BPE, 소태아혈청(fetal bovine serum), BI, 히드로코르티손, bFGF, BT, 헤파린(heparin) 및 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(phorbol 12-myristate 13-acetate, Invitrogen)가 보충된 배지 254(Medium 254, Invitrogen)에서 배양하였다. 섬유아세포는 10% 소태아혈청(Gibco/BRL), 100μm/L 페니실린(Gibco/BRL) 및 0.1 mg/ml 스트렙토마이신(Gibco/BRL)이 보충된 DMEM (Gibco/BRL, Grand Island, NY)에 표피 세포를 넣어 배양하였다.
Then, the sample was separated from the epidermis from the dermis, and a suspension of each epidermal cell was prepared. Specifically, keratinocytes are epithelial cells supplemented with BPE (bovine pituitary extract), BI (bovine insulin), hydrocortisone, human epithelial growth factor, and BT (bovine transferring, #S-001-5; Invitrogen). Life medium (EpiLife Medium, #M-EPI-500-CA; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) and cultured. Melanogenic cells include BPE, fetal bovine serum, BI, hydrocortisone, bFGF, BT, heparin and phorbol 12-myristate 13-acetate, Invitrogen. It was cultured in supplemented medium 254 (Medium 254, Invitrogen). Fibroblasts were in DMEM (Gibco/BRL, Grand Island, NY) supplemented with 10% fetal bovine serum (Gibco/BRL), 100 μm/L penicillin (Gibco/BRL) and 0.1 mg/ml streptomycin (Gibco/BRL). Epidermal cells were put and cultured.

공배양Co-culture 시스템 system

공배양 실험에서는 세가지 종류의 스크리닝 시스템을 제조하여 사용하였다. 첫번째 스크리닝 시스템은 섬유아세포 및 멜라닌 생성세포를 DMEM내에서 2:1의 비율로 혼합하여 제조하였다. 두번째 스크리닝 시스템은 섬유아세포를 10%FBS가 보충된 DMEM내 바깥 배양 용기(dish)에 심고, 그 안쪽에 위치한 바이오코트(biocoat) 세포 배양 인서트(collagen type I, 6-well, 0.45㎛, Becton Dickinson, Bedford, MA, USA)에 멜라닌 생성세포를 심어 제조하였다. 세번째 스크리닝시스템은 인서트를 뒤집어서 섬유아세포를 인서트 멤브레인의 외측에 심어 하루간 둔 다음, 다시 인서트를 뒤집어서 각질형성세포 및 멜라닌 생성세포, 또는 멜라닌 생성세포만을 인서트 멤브레인의 내측에 심었다. 각질형성세포 및 멜라닌 생성세포를 모두 사용하는 경우는 각질형성세포 배양배지 및 멜라닌 생성세포 배양배지를 9:1의 비율로 혼합한 혼합물을 제조하여 사용하였다.
In the co-culture experiment, three types of screening systems were prepared and used. The first screening system was prepared by mixing fibroblasts and melanogenic cells in DMEM at a ratio of 2:1. In the second screening system, fibroblasts are planted in an outer culture dish (dish) in DMEM supplemented with 10% FBS, and a biocoat cell culture insert (collagen type I, 6-well, 0.45㎛, Becton Dickinson) located inside. , Bedford, MA, USA) was prepared by planting melanogenic cells. In the third screening system, the insert was turned over and fibroblasts were planted on the outside of the insert membrane for one day, and then the insert was turned over and only keratinocytes, melanogenic cells, or melanogenic cells were planted on the inner side of the insert membrane. When both keratinocytes and melanogenic cells were used, a mixture of keratinocyte culture medium and melanogenic cell culture medium in a ratio of 9:1 was prepared and used.

마이크로 Micro RNARNA 유사체/억제제의 트랜스 Trans analogs/inhibitors 펙션Pection

대조군 마이크로RNA 유사체(Dhmarcon Research, Lafayette, CO) 또는 인간 miR-675 유사체(Dhmarcon Research, Lafayette, CO)는 세포들에 TransIT-siQUEST 트랜스펙션 시약(Mirus, PanVera, Madison, WI)를 사용하여 제조자의 프로토콜에 따라 트랜스펙션하였다.
Control microRNA analogues (Dhmarcon Research, Lafayette, CO) or human miR-675 analogues (Dhmarcon Research, Lafayette, CO) were manufactured using TransIT-siQUEST transfection reagent (Mirus, PanVera, Madison, WI) in cells. Transfection according to the protocol of.

캐드헤린11의Cadherin 11 과발현 및 발현감소 유도 Induction of overexpression and decrease in expression

캐드헤린11의 과발현은 제조자의 프로토골에 따라 Lipofectamine 2000을 사용하여 캐드헤린11 유전자를 포함하는 pCMV를 세포에 트랜스펙션하여 유도하였다. 캐드헤린11의 발현감소는 제조자의 프로토콜에 따라 TransIT-siQUEST 트랜스펙션 시약(Mirus)을 사용하여 인간 캐드헤린11의 siRNA 또는 음성대조군(ON-TARGETplus SMARTpool or Non-targeting siRNA; Dharmacon) 100 nM 또는 50 nM를 6-웰 플레이트내 배양된 세포에 트랜스펙션하여 유도하였다.
Cadherin 11 overexpression was induced by transfecting cells with pCMV containing the cadherin 11 gene using Lipofectamine 2000 according to the manufacturer's protocol. Reduction of Cadherin 11 expression was performed using TransIT-siQUEST transfection reagent (Mirus) according to the manufacturer's protocol, using human Cadherin 11 siRNA or negative control (ON-TARGETplus SMARTpool or Non-targeting siRNA; Dharmacon) 100 nM or 50 nM was induced by transfection into cells cultured in 6-well plates.

면역조직화학(Immunohistochemistry ( immunohistochemistryimmunohistochemistry ))

실험결과의 분석방법으로서, 면역형광염색을 위하여는 탈파라핀(deparaffinization) 및 재수화(rehydration) 후 측정부분을 3%소혈청알부민과 함께 전보온(preincubation)하였다. 이중 염색을 위하여는 배양된 세포 또는 측정부분을 항-캐드헤린11 항체 및 1:200 알렉사 플루오르 라벨된 고트 안티-래빗 IgG(Alexa Fluor-labeled goat anti-rabbit IgG, 488; Molecular Probes, Eugene, OR, USA)과 반응시킨 후 연속적으로 안티-케라틴14항체 및 알렉사 플루오르 라벨된 고트 안티-마우스 IgG(Alexa Fluor-labeled goat anti-mouse IgG, 594; Molecular Probes)과 반응시켰다. 세포핵은 Hoechst 33258 (Sigma-Aldrich)로 대비염색하였다. 염색된 시료들은 이미지 분석 시스템(CellSense standard 1.7.1; Olympus Optical Co., Tokyo, Japan)으로 측정하였다. As an analysis method of the experimental results, for immunofluorescence staining, the measured part was preincubated with 3% bovine serum albumin after deparaffinization and rehydration. For double staining, cultured cells or measurement parts were treated with anti-cadherin 11 antibody and 1:200 Alexa fluor-labeled goat anti-rabbit IgG (Alexa Fluor-labeled goat anti-rabbit IgG, 488; Molecular Probes, Eugene, OR). , USA) and subsequently reacted with anti-keratin 14 antibody and Alexa Fluor-labeled goat anti-mouse IgG (Alexa Fluor-labeled goat anti-mouse IgG, 594; Molecular Probes). Cell nuclei were counter-stained with Hoechst 33258 (Sigma-Aldrich). The stained samples were measured with an image analysis system (CellSense standard 1.7.1; Olympus Optical Co., Tokyo, Japan).

멜라노좀의Melanosomal 이동 분석 Move analysis

멜라노좀의 각질형성세포로의 이동에 대한 정량분석은 유세포분석기(Flowcytometry)를 사용하였다. 구체적으로, 세포들을 2%파라포르말데히드(paraformaldehyde)에 10분간 고정시킨다음 BD PhosFlow Perm/Wash Buffer I (BD Biosciences, San Jose, CA, USA)를 포함하는 PBS로 10분간 세척하였다. 그 다음, FITC-콘쥬게이티드 고트(goat) 안티-TYRP-1 (1 g per 1 x 106 cells; Santa Cruz Biotechnology) 및 PE-콘쥬게이티드 마우스(mouse) 안티-사이토케라틴 14 (1:10; BD Biosciences)와 함께 실온에서 30분 동안 배양하였다. 배양된 세포를 다시 PBS로 세척하여 유세포분석을 준비하였다. 라벨링된 세포들을 CXP 소프트웨어(Beckman Coulter)를 사용하여 CytomicsTM FC500 유세포 분석기(Beckman Coulter, Hialeah, Fla., USA)로 분석하였으며,멜라노좀 이동 효율값은 사이토케라틴 14-포지티브 세포 및 TYRP-1-포지티브 세포들의 숫자를 사이토케라닌 11-포지티프 세포들의 총 숫자로 나누어 얻었다.
The quantitative analysis of the migration of melanosomes to keratinocytes was performed using a flow cytometry. Specifically, the cells were fixed in 2% paraformaldehyde for 10 minutes, and then washed for 10 minutes with PBS containing BD PhosFlow Perm/Wash Buffer I (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Then, FITC-conjugated goat anti-TYRP-1 (1 g per 1 x 106 cells; Santa Cruz Biotechnology) and PE-conjugated mouse anti-cytokeratin 14 (1:10; BD Biosciences) at room temperature for 30 minutes. The cultured cells were washed again with PBS to prepare for flow cytometry. Labeled cells were analyzed by CytomicsTM FC500 flow cytometer (Beckman Coulter, Hialeah, Fla., USA) using CXP software (Beckman Coulter), and melanosomal migration efficiency values were cytokeratin 14-positive cells and TYRP-1-positive cells. The number of cells was obtained by dividing the total number of cytokeranine 11-positif cells.

리얼타임Real time RTRT -- PCRPCR 분석 analysis

성숙 miRNA의 발현을 hsa-mir-675에 특정된 택맨(Taqman) 마이크로RNA 분석기(Applied Biosystems)를 사용하여 분석하였다. 택맨 마이크로RNA 분석은 리얼타임 RT-qPCR에 의한 miRNA정량을 위해 사용하였으며, 이때 리얼타임 qPCR은 택맨 유니버설 마스터 믹스(TaqMan universal master mix) 를 사용하여 수행하였고, U18은 정상화를 위한 하우스키핑(housekeeping) 유전자로서 사용하였다(Roche, Mannheim, Germany). Expression of mature miRNA was analyzed using a Taqman microRNA analyzer (Applied Biosystems) specific to hsa-mir-675. Taqman microRNA analysis was used for miRNA quantification by real-time RT-qPCR, and in this case, real-time qPCR was performed using TaqMan universal master mix, and U18 was housekeeping for normalization. It was used as a gene (Roche, Mannheim, Germany).

GAPDH에 대한 mRNA의 양은 Light Cycler real-time PCR (Roche, Mannheim, Germany)을 정량 사용하여 리얼타임 PCR에 의해 측정하였으며, 이때 사용한 프라이머는 다음과 같다.The amount of mRNA for GAPDH was measured by real-time PCR using Light Cycler real-time PCR (Roche, Mannheim, Germany) quantitatively, and the primers used at this time are as follows.

CDH11 5'-GGCAGGCTCAGAACAGAAAG-3'(forward, 서열번호 1)CDH11 5'-GGCAGGCTCAGAACAGAAAG-3' (forward, SEQ ID NO: 1)

5'-CTACCAGATCATTGTTCTTC-3'(reverse, 서열번호 2)5'-CTACCAGATCATTGTTCTTC-3' (reverse, SEQ ID NO: 2)

GAPDH 5'-TCCACTGGCGTCTTCACC-3'(forward, 서열번호 3)GAPDH 5'-TCCACTGGCGTCTTCACC-3' (forward, SEQ ID NO: 3)

5'-GGCAGAGATGATGACCCTTT-3'(reverse, 서열번호 4).
5'-GGCAGAGATGATGACCCTTT-3' (reverse, SEQ ID NO: 4).

웨스턴Western 블랏Blot 분석( analysis( WesternWestern blotblot analysisanalysis ))

추출된 동량의 단백질(20 mg)을 10% SDS-PAGE를 사용하여 분해하고, 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 이동시켰다. 상기 막을 포스포르(phosphor)-ERK, ERK, 포스포(phosphor)-CREB, CREB, 포스포(phosphor)-AKT, AKT, 포스포(phosphor)-Rac1, Rac1, 베타-카테닌(beta-catenin, rabbit polyclonal; Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA), 티로시나제(tyrosinase), 콜라겐I(goat polyclonal; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), 캐드헤린11, PAR-2, Twist, MMP-1, MMP-2, Integrina2 (rabbit polyclonal; Santa Cruz Biotechnology), WNT3A, E-cadherin(mouse monoclonal; Santa Cruz Biotechnology), N-캐드헤린(Abcam, Cambridge, UK) 대한 항체에 안티-래빗 또는 안티-마우스 겨자무과산화효소(horseradish peroxidase)-콘쥬게이트된 항체들(Santa Cruz Biotechnology)과 함께 배양시켰다. 그 다음, 강화된 화학발광 용액(enhanced chemiluminescence solution, Thermo, Rockford, IL, USA)으로 처리하였다. 신호들은 이미지 리더(LAS-3000; Fuji Photo Film, Tokyo, Japan)로 캡쳐하였다. 각 래인(lane)에 로드되는 단백질의 양을 모니터하기 위하여, 멤브레인들을 마우스 단일클론항체 안티 -β-액틴 항체(mouse monoclonal anti-β-actin antibody, Sigma, St. Louis, MO, USA)로 다시 프로브(probe)하고, 상술된 과정을 다시 처리하였다. 그리고 단백질 밴드를 덴시토메트리(densitometry)에 의해 분석하였다.
The same amount of the extracted protein (20 mg) was digested using 10% SDS-PAGE and transferred to a nitrocellulose membrane. The membrane was formed with phosphor-ERK, ERK, phosphor-CREB, CREB, phosphor-AKT, AKT, phosphor-Rac1, Rac1, beta-catenin, rabbit polyclonal; Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA), tyrosinase, collagen I (goat polyclonal; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), Cadherin 11, PAR-2, Twist, MMP-1 , MMP-2, Integrina2 (rabbit polyclonal; Santa Cruz Biotechnology), WNT3A, E-cadherin (mouse monoclonal; Santa Cruz Biotechnology), anti-rabbit or anti-mouse against antibodies to N-cadherin (Abcam, Cambridge, UK) Mustard radish peroxidase (horseradish peroxidase)-was incubated with conjugated antibodies (Santa Cruz Biotechnology). Then, it was treated with an enhanced chemiluminescence solution (Thermo, Rockford, IL, USA). Signals were captured with an image reader (LAS-3000; Fuji Photo Film, Tokyo, Japan). To monitor the amount of protein loaded into each lane, the membranes were reconstituted with a mouse monoclonal anti-β-actin antibody (Sigma, St. Louis, MO, USA). After the probe (probe), the above-described process was processed again. And the protein band was analyzed by densitometry.

루시페라제Luciferase (( LuciferaseLuciferase ) 활성 분석) Activity assay

인간 캐드헤린11 3'UTR을 다음의 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭시켰다.Human Cadherin11 3'UTR was amplified by PCR using the following primers.

forward primer 5'-AAAGCTGCGCACTAGTGAATGCAGAGAGAGGAGAAG-3' (MITF-3UTR-F, 서열번호 5) forward primer 5'-AAAGCTGCGCACTAGTGAATGCAGAGAGAGGAGAAG-3' (MITF-3UTR-F, SEQ ID NO: 5)

reverse primer 5'-ATCCTTTATTAAGCTT TTGGATTTGCAAATGACT-3' (MITF-3UTR-R, 서열번호 6)reverse primer 5'-ATCCTTTATTAAGCTT TTGGATTTGCAAATGACT-3' (MITF-3UTR-R, SEQ ID NO: 6)

증폭된 3UTR을 pMIR-REPORT 루시페라제 벡터(Ambion, Austin, TX)내 루시페라제 유전자의 다운스트림에 복제하였다. 이는 섬유아세포 및 293T내 트랜스펙션을 위해 사용되었다. 그 다음 제조자의 프로토콜에 따라 QuickChange site-directed mutagenesis kit (Stratagene, Lo Jolla, CA)를 사용하여 캐드헤린11 3'UTR의 추측 타겟 사이트에 결실(deletion)을 생성하였다. 세포들을 6-웰 플레이트에서 배영하고, 각 세포들에 레닐라 루시페라제(Renilla luciferase), miR-675 또는 네거티브 컨트롤(Dharmacon, Lafayette, LA) 50 nM를 포함하는 pRL-TK 벡터 (Promega, Madison, WI)와 함께 pMIR-CDH11 또는 pMIR-Mutant를 트랜스펙션하였다. 트랜스펙션에는 리포펙타민(Lipofectamine) 2000(Invitrogen)을 사용하였다. 24시간 후, 반딧불이 및 라닐라 루시페라제 활성을 듀얼-루시페라제 리포터 어세이(Promega)를 사용하여 측정하였다. 트렌스펙션은 3중으로 수행하였으며, 모든 실험들을 세번씩 반복 수행하였다.
The amplified 3'UTR was replicated downstream of the luciferase gene in the pMIR-REPORT luciferase vector (Ambion, Austin, TX). It was used for transfection in fibroblasts and 293T. Then, using the QuickChange site-directed mutagenesis kit (Stratagene, Lo Jolla, CA) according to the manufacturer's protocol, a deletion was created at the speculative target site of Cadherin11 3'UTR. Cells were backstroke in 6-well plates, and pRL-TK vector (Promega, Madison) containing 50 nM of Renilla luciferase, miR-675 or negative control (Dharmacon, Lafayette, LA) in each cell. , WI) and pMIR-CDH11 or pMIR-Mutant were transfected. Lipofectamine 2000 (Invitrogen) was used for transfection. After 24 hours, firefly and Ranilla luciferase activities were measured using a dual-luciferase reporter assay (Promega). Transfection was performed in triplicate, and all experiments were repeated three times.

통계분석Statistical analysis

모든 실험데이터의 통계분석은 스튜던트 t-테스트(Student's t-test)를 사용하여 수행하였으며, 그 결과는 평균± SD값으로 표현되었다. 또한, p 값이 0.05 미만인 경우를 의미있는 값으로 고려하였다.
Statistical analysis of all experimental data was performed using Student's t-test, and the results were expressed as mean±SD values. In addition, the case where the p value was less than 0.05 was considered as a meaningful value.

[실험예 1] MiR-675가 캐드헤린11 발현을 억제시키는지 여부의 확인
[Experimental Example 1] Confirmation of whether MiR-675 inhibits expression of cadherin 11

miRNAmiRNA -675의 Of -675 캐드헤린11Cad Herin 11 발현억제능의Expression inhibitory 확인 Confirm

MiR-675 및 캐드헤린11 3'-UTR(3'-untranslated region, 829 base pairs)간의 6개 및 8개의 염기쌍(base paires)으로 구성된 두개의 상보적인 서열을 발현시켰다. 캐드헤린11 이 miR-675의 직접적인 타겟인지여부를 확인하기 위하여, 캐드헤린11 3'-UTR을 miR-675 유사체(miR-675 mimic, Dhmarcon Research, Lafayette, CO) 또는 비타겟 대조군(non-targeting control miRNA)으로 1차 피부 섬유아세포 및 293T 세포 내로 코트랜스펙션(cotransfection)시켰다. 이때 TransIT-siQUEST 트랜스펙션 시약(Mirus, PanVera, Madison, WI)을 사용하여 트랜스펙션하였다. Two complementary sequences consisting of 6 and 8 base pairs between MiR-675 and 3'-UTR (3'-untranslated region, 829 base pairs) were expressed. In order to confirm whether Cadherin 11 is a direct target of miR-675, Cadherin 11 3'-UTR was used as a miR-675 analog (miR-675 mimic, Dhmarcon Research, Lafayette, CO) or a non-targeting control (non-targeting). control miRNA) into primary skin fibroblasts and 293T cells. At this time, it was transfected using TransIT-siQUEST transfection reagent (Mirus, PanVera, Madison, WI).

그 결과, 도 1a에 나타낸 바와 같이 비타겟 대조군 유전자와 달리, miR-675는 1차 피부 섬유아세포에서 캐드헤린11 루시페라제(luciferase) 활성을 매우 감소시켰다(P = 0.0002). 또한, miR-675는 변이된 캐드헤린11 3'-UTR의 루시페라제 활성은 감소시키지 않았다. 도 1a는 삽입되지 않았지만 293T 세포에서도 동일한 결과가 나타났다. 이로부터, miR-676는 캐드헤린11 의 3'-UTR을 타겟으로 하여 캐드헤린11 발현을 억제시킴을 확인할 수 있다.
As a result, as shown in Fig. 1a, unlike the non-target control gene, miR-675 greatly reduced cadherin 11 luciferase activity in primary skin fibroblasts (P = 0.0002). In addition, miR-675 did not decrease the luciferase activity of mutated cadherin11 3'-UTR. 1A was not inserted, but the same result was also shown in 293T cells. From this, it can be confirmed that miR-676 targets 3'-UTR of cadherin 11 and inhibits cadherin 11 expression.

각질형성세포(Keratinocytes ( KCKC )와 섬유아세포() And fibroblasts ( FBFB )에서의 In) 캐드헤린11Cad Herin 11 단백질 발현 확인 Confirmation of protein expression

배양된 정상 인간 피부 각질형성세포(keratinocytes, KC), 멜라닌 생성세포(melanocytes) 및 섬유아세포(fibroblasts, FB)를 공배양한 후, 캐드헤린11 단백질의 발현여부를 관찰하였다. 이때, 상기 두 세포는 miR-675 유사체 또는 억제제를 트랜스펙션한 것과 하지 않은 것으로 분리하여 실험하였다. After co-culture with cultured normal human skin keratinocytes (KC), melanocytes and fibroblasts (FB), the expression of cadherin 11 protein was observed. At this time, the two cells were tested by separating and not transfecting the miR-675 analog or inhibitor.

그 결과, 도 1b에 나타난 바와 같이 각질형성세포(KC), 및 섬유아세포(FB)에서 캐드헤린11 단백질 발현이 검출되었다. 또한, 도 1c에 나타난 바와 같이, miR-675 유사체를 처리한 섬유아세포(도 1c의 오른쪽 상부 윗줄) 및 각질형성세포 (도 1c의 오른쪽 상부 아랫줄)에서는 miR-675 유사체의 양이 증가함에 따라 캐드헤린11 발현이 감소한데 반해, miR-675 억제제를 트랜스펙션한 경우에는 그 양이 증가함에 따라 섬유아세포 (도 1c의 왼쪽 상부 윗줄) 및 각질형성세포 (도 1c의 왼쪽 상부 아랫줄)에서의 캐드헤린11 발현은 증가하였다. 이상의 웨스턴 블랏 결과를 정량화하여 도 1C 하부에 그래프로 나타내었다. 멜라닌 생성세포에서는 캐드헤린11 이 검출되지 않았다. 도면에 포함하지는 않았으나, miR-675 유사체 또는 억제제를 트랜스펙션한 경우 모두 캐드헤린11 발현량이 변화하지 않았다.
As a result, as shown in Fig. 1b, keratinocytes (KC) and fibroblasts (FB) were detected to express cadherin 11 protein. In addition, as shown in Fig. 1c, as the amount of miR-675 analog increases in fibroblasts (upper right upper row of Fig. 1c) and keratinocytes (lower right upper row of Fig. 1c) treated with miR-675 analogues. While the expression of cadherin 11 decreased, when the miR-675 inhibitor was transfected, the amount increased in fibroblasts (upper left row of Fig. 1c) and keratinocytes (lower left row of Fig. 1c). Cadherin 11 expression of was increased. The above Western blot results were quantified and shown as a graph in the lower part of FIG. 1C. Cadherin 11 was not detected in melanogenic cells. Although not included in the figure, all of the cases of transfection with miR-675 analogues or inhibitors did not change the amount of cadherin 11 expression.

기미 피부에서의 Spots on the skin 캐드헤린11Cad Herin 11 RNARNA 발현 Manifestation 증가여부Increase 확인 Confirm

miR-675와 캐드헤린11 발현의 역상관관계를 확인하기 위하여 9명의 기미환자의 피부를 분석한 결과, miR-675양이 감소된 것으로 검출되었다. 또한, 리얼타임 PCR로 분석한 결과, 도 1d에 나타난 바와 같이 다섯명의 환자 샘플에서 정상 피부와 비교하여 과색소침착 피부(hyperpigmented skin)에서 상대적인 캐드헤린11 mRNA 발현량이 증가하였음을 확인할 수 있다. 도 1d의 x축의 3L, 7L, 16L. 19L, 23L이 의미하는 바는 서로 다른 환자를 나타내는 표시이다.As a result of analyzing the skin of 9 melasma patients to confirm the inverse correlation between miR-675 and cadherin 11 expression, it was detected that the amount of miR-675 decreased. In addition, as a result of analysis by real-time PCR, as shown in FIG. 1D, it can be seen that the relative amount of cadherin 11 mRNA expression was increased in hyperpigmented skin compared to normal skin in five patient samples. 3L, 7L, 16L of the x-axis in Fig. 1D. What 19L and 23L mean is a sign that represents different patients.

면역형광법(Immunofluorescence)으로서 면역염색 후 형광현미경으로 분석한 결과, 도 1e에 나타난 바와 같이 나머지 네 환자들의 경우 과색소침착된 표피 및 진피에서의 캐드헤린11 염색정도가 더 강하게 나타남을 확인할 수 있었다. 기미 부위(L)에 정상 피부(N)보다 캐드헤린11 의 단백질 발현이 증가된 것을 알 수 있었다.As a result of analysis with a fluorescence microscope after immunostaining as an immunofluorescence method, it was confirmed that the degree of cadherin 11 staining in the hyperpigmented epidermis and dermis was more intense in the case of the remaining four patients as shown in FIG. 1E. It was found that the protein expression of cadherin 11 was increased in the melasma region (L) than in normal skin (N).

[실험예 2] 섬유아세포에서의 캐드헤린11 발현의 멜라닌 생성 및 멜라노좀의 이동과의 관련성 확인
[Experimental Example 2] Confirmation of the relationship between the expression of cadherin 11 in fibroblasts with melanogenesis and melanosome movement

상기 실험예 1로부터 멜라닌 생성세포와 달리 각질형성세포와 섬유아세포에서는 캐드헤린11 발현이 검출되었고(도 1b), 캐드헤린11 이 각질형성세포내 H19 유전자에서 생성되고 엑소좀내 인접세포로 전달되는 miR-675의 직접적인 타겟임을 확인하였다(도 1a). 또한, 도 1b로부터 각질형성세포와 비교하여 섬유아세포에서 캐드헤린11 발현이 더 높게 나타남을 확인하였다. 이에, 본 실험에서는 섬유아세포에서의 멜라닌 생성에 대한 캐드헤린11 과발현 및 발현감소효과를 확인하는 실험을 실시하였다. Unlike the melanin-producing cells from Experimental Example 1, the expression of cadherin 11 was detected in keratinocytes and fibroblasts (Fig. 1b), and miR that cadherin 11 is generated from the H19 gene in keratinocytes and delivered to adjacent cells in exosomes. It was confirmed that it was a direct target of -675 (FIG. 1A). In addition, it was confirmed from Fig. 1b that the expression of cadherin 11 is higher in fibroblasts compared to keratinocytes. Accordingly, in this experiment, an experiment was conducted to confirm the effect of cadherin 11 overexpression and expression reduction on the production of melanin in fibroblasts.

먼저, 섬유아세포-멜라닌 생성세포의 공배양을 위하여 도 2a에 도시한 바와 같이 단분자막으로된 공배양을 사용하였으며, 하부 챔버의 바닥에서 섬유아세포를 공배양하고 인서트(insert)의 상부에서 멜라닌 생성세포를 공배양하였다. 그리고 상기 인서트의 외측에서 섬유아세포, 내측에서 멜라닌 생성세포를 공배양하였다. 상기 두 종류의 세포가 인서트에서 공배양되는 시스템이 생리학적 관련성이 보다 높으므로, 공배양 후 인서트 내측의 멜라닌 생성세포를 채취하여 분석하였다. 그 결과, 도 2b에 나타난 바와 같이 섬유아세포에서 캐드헤린11 이 과발현되고, 캐드헤린11 siRNA을 처리한 경우는 발현이 감소하였다. First, for co-culture of fibroblast-melanogenic cells, as shown in FIG. 2A, co-culture with a monolayer was used, and fibroblasts were co-cultured at the bottom of the lower chamber, and melanin-producing cells at the top of the insert. Was co-cultured. And fibroblasts on the outside of the insert and melanin-producing cells on the inside were co-cultured. Since the system in which the two types of cells are co-cultured in the insert has a higher physiological relevance, the melanogenic cells inside the insert were collected and analyzed after co-culture. As a result, as shown in Fig. 2b, cadherin 11 was overexpressed in fibroblasts, and when cadherin 11 siRNA was treated, the expression was decreased.

나아가, 도 2c에 나타난 바와 같이 캐드헤린11 의 과발현이 멜라닌 생성 효소인 티로시나제(tyrosinase)와 그 전사인자인 MITF(micropthalmia-associated transcription factor)의 발현뿐만 아니라 멜라노 생성세포로부터 cAMP-반응요소 결합 단백질(responsive-element-binding protein, CREB), ERK(Extracellular signal-regulated kinases) 및 AKT(Protein Kinase B)의 인산화 반응을 현저히 증가시킴을 확인할 수 있었다(P < 0.05). 또한, 상기 섬유아세포에서의 캐드헤린11 의 과발현은 멜라닌 생성 세포내 캐드헤린11 하위 신호 전달인자인 β-카테닌(β-catenin) 및 Wnt3a(Wingless-type MMTV integration site family, member 3a)의 발현을 증가시키고 분해된 섬유아세포에서는 발현을 감소시켰다. 나아가 도 2c에 확인할 수 있는 바와 같이 PI3K 억제제인 LY294002 처리는 캐드헤린11 가 과발현된 섬유아세포에서의 β-카테닌 발현 증가를 억제하였다. 이때 β-카테닌은 다른 세포 부분에서 다르게 작용하므로, 각 부분에서의 β-카테닌 발현을 단분자층으로된 섬유아세포-멜라닌 생성 세포 공배양을 사용하여 측정하였다.Further, as shown in Fig. 2c, overexpression of cadherin 11 is not only the expression of melanin-generating enzyme tyrosinase and its transcription factor, MITF (micropthalmia-associated transcription factor), but also cAMP-reactive element binding protein ( It was confirmed that phosphorylation of responsive-element-binding protein (CREB), extracellular signal-regulated kinases (ERK), and protein kinase B (AKT) was significantly increased (P <0.05). In addition, over-expression of cadherin 11 in the fibroblasts inhibits the expression of β-catenin and Wnt3a (Wingless-type MMTV integration site family, member 3a), which are sub-signal transducers of cadherin 11 in melanogenic cells. Increased and decreased expression in degraded fibroblasts. Further, as can be seen in Fig. 2c, treatment with LY294002, a PI3K inhibitor, suppressed the increase in β-catenin expression in fibroblasts overexpressing cadherin 11. At this time, since β-catenin acts differently in different cell parts, β-catenin expression in each part was measured using a monolayered fibroblast-melanogenic cell co-culture.

그 다음으로, 캐드헤린11 가 유도된 β-카테닌 발현을 공배양의 멤브레인 및 핵 부분에서 검출한 결과, 도 2d에 나타난 바와 같이 β-카테닌의 발현이 캐드헤린11 발현 감소와 함께 감소하였다. 또한, 도 2e에 나타난 바와 같이 안티-캐드헤린11 항체로 면역침강(immunoprecipitation) 분석결과 캐드헤린 siRNA에 의해 캐드헤린11 발현이 감소된 세포내의 β-카테닌 및 Wnt-3A의 결합이 감소된 것으로 나타났다. 마지막으로, 도 2f에 나타난 바와 같이 안티-캐드헤린11 및 안티-β-카테닌 항체들의 캐드헤린11 발현이 감소된 섬유아세포와 공배양한 멜라닌 생성 세포내 β-카테닌의 염색이 더 약한 것으로 나타났다. 이는 캐드헤린11 와 β-카테닌, Wnt3a가 결합함을 의미한다.
Next, as a result of detecting the expression of β-catenin induced by cadherin 11 in the membrane and nuclear portions of the co-culture, the expression of β-catenin decreased with the decrease in the expression of cadherin 11 as shown in FIG. 2D. In addition, as shown in Fig. 2e, as a result of immunoprecipitation analysis with anti-cadherin 11 antibody, it was found that the binding of β-catenin and Wnt-3A in cells in which cadherin 11 expression was reduced by cadherin siRNA was reduced. . Finally, as shown in FIG. 2F, it was found that the staining of β-catenin in melanogenic cells co-cultured with fibroblasts in which cadherin 11 expression of anti-cadherin 11 and anti-β-catenin antibodies was reduced was weaker. This means that cadherin 11, β-catenin, and Wnt3a bind.

[실험예 3] 각질형성세포에서의 캐드헤린11 발현과 멜라닌 생성 및 멜라노좀 이동의 관련성 확인 1
[Experimental Example 3] Confirmation of the relationship between cadherin 11 expression in keratinocytes and melanogenesis and melanosome movement 1

인서트의 내부에 멜라닌 생성 세포 단배양 대신 멜라닌 생성세포-각질 형성 세포를 공배양한 것을 제외하고는 상기 실험예 2와 동일한 공배양 시스템을 이용하여, 캐드헤린11 가 과발현 또는 발현감소된 섬유아세포의 멜라노좀 이동효과를 확인하는 실험을 실시하였다.Using the same co-culture system as in Experimental Example 2, except that the melanogenic cells-keratinocytes were co-cultured instead of the single culture of melanin-producing cells inside the insert, the fibroblasts with overexpression or reduced expression of cadherin 11 were used. An experiment was conducted to confirm the melanosome movement effect.

FACS(Fluorescence activated cell sorter) 분석결과는 공초점형 현미경(confocal microscopy) 분석 결과와 같으므로, 티로시나제-관련 단백질 1(tyrosinase-related protein 1, TYRP1) 및 사이토테라틴 14(cytokeratin 14, K14) 염색 세포에 FACS 분석만을 수행하였다. 그 결과, 도 3a에 나타난 바와 같이 캐드헤린11 가 과발현된 섬유아세포는 TYRP1 및 K14 더블-포지티브(double-positive) 각질형성세포 비율을 매우 증가시킨데 반해(P < 0.05), 캐드헤린11 발현이 감소된 섬유아세포는 상기 비율을 감소시켰다. 즉, 캐드헤린11 의 발현을 증가시킨 각질 형성세포와 멜라닌 생성세포를 공배양하였을 때 멜라노좀(melanosome)의 이동이 증가하였고, 캐드헤린11 의 발현을 감소시켰을 때는 멜라닌 생성 세포에서 각질형성세포로 멜라노좀 이동이 억제되는 것을 확인할 수 있었다.Fluorescence activated cell sorter (FACS) analysis results are the same as those of confocal microscopy analysis, so tyrosinase-related protein 1 (TYRP1) and cytokeratin 14 (K14) stained cells FACS analysis was performed only. As a result, as shown in Figure 3a, fibroblasts overexpressing cadherin 11 significantly increased the ratio of TYRP1 and K14 double-positive keratinocytes (P <0.05), whereas cadherin 11 expression was Reduced fibroblasts decreased this rate. That is, when keratinocytes with increased expression of cadherin 11 and melanocytes were co-cultured, the movement of melanosomes increased, and when the expression of cadherin 11 was decreased, melanocytes were transferred to keratinocytes. It was confirmed that melanosome movement was inhibited.

또한, 웨스턴 블랏(Western blot) 분석을 수행한 결과, 도 3b에 나타난 바와 같이 Rac1(Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1)의 인산화 반응(p-RAC)은 캐드헤린11 의 과발현 및 발현감소에 따라 각각 증가 및 감소하였다. 이에 반해, 멜라노좀 이동의 핵심 단백질인 PAR 2(protease activated receptor 2)의 발현은 캐드헤린11 의 과발현 및 발현감소에 따라 변화하지 않았다. 또한, 도 3b의 하부에 나타난 바와 같이, LY294002는 Rac1 인산화 반응에서 캐드헤린11 의 유도된 증가를 억제하였다. 즉, 캐드헤린11 의 발현을 증가시켰을 때 멜라닌 생성 세포의 세포 돌기(dendrite) 형성에 관여하는 RAC의 활성(인산화)을 증가시킴을 확인할 수 있었다.
In addition, as a result of performing Western blot analysis, as shown in FIG. 3b, the phosphorylation reaction (p-RAC) of Rac1 (Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1) was caused by overexpression and decrease in expression of cadherin 11 Respectively increased and decreased. On the other hand, the expression of PAR 2 (protease activated receptor 2), a key protein for melanosomal migration, did not change with overexpression and decrease in expression of cadherin11. In addition, as shown in the lower part of FIG. 3B, LY294002 inhibited the induced increase of cadherin 11 in Rac1 phosphorylation reaction. That is, it was confirmed that when the expression of cadherin 11 was increased, the activity (phosphorylation) of RAC involved in the formation of dendrite in melanocytes was increased.

[실험예 4] 각질형성세포에서의 캐드헤린11 발현과 멜라닌 생성 및 멜라노좀 이동의 관련성 확인 2
[Experimental Example 4] Confirmation of the relationship between cadherin 11 expression in keratinocytes and melanogenesis and melanosome movement 2

각질형성세포를 단분자층에서 멜라닌 생성세포와 공배양하여, 각질형성세포에서의 캐드헤린11 과발현 및 발현감소 효과를 다시한번 분석하였다.Keratinocytes were co-cultured with melanogenic cells in a single molecule layer, and the effects of cadherin 11 overexpression and expression reduction in keratinocytes were once again analyzed.

상기 실험예 2의 캐드헤린11 이 과발현 또는 발현 감소된 섬유아세포의 결과와 유사하게(도 2b-2f), 각질형성세포에서도 캐드헤린11 유전자 또는 캐드헤린 siRNA를 트렌스펙션한 후 캐드헤린11의 발현량은 캐드헤린11을 과발현시킨 경우 증가하였고, 발현감소시킨 경우 감소하였다(도 4a).Similar to the results of fibroblasts with overexpression or reduced expression of cadherin 11 in Experimental Example 2 (Fig. 2b-2f), keratinocytes also transfected cadherin 11 gene or cadherin siRNA, and then expression of cadherin 11 The amount increased when cadherin 11 was overexpressed, and decreased when the expression was decreased (FIG. 4A).

또한, 각질형성세포에서의 캐드헤린11 과발현은 공배양된 멜라닌 생성 세포 및 각질형성세포로부터 CREB 및 AKT의 인산화 반응뿐만 아니라 멜라닌 생성효소(tyrosinase) 및 MIFT의 발현을 매우 증가시켰다(P < 0.05). 반면, 캐드헤린11 발현 감소는 상기 단백질들을 매우 감소시켰다(도 4ba). 또한, 도 4bb에 나타난 바와 같이, β-카테닌 및 Wnt-3A의 발현은 캐드헤린11 과발현에 의해 증가하고 캐드헤린11 발현감소에 의해 감소하였다. 또한, LY249002 처리는 각질형성세포에서의 캐드헤린11 가 유도된 β-카테닌 발현을 억제하였다. 도 4c에서는 세포질(cytoplasm) 및 핵(nuclear) 부분에서의 β-카테닌 발현이 전체 세포 용균액(total lysate) 내의 β-카테닌과 유사하게 변화하였음을 확인할 수 있다. 도 4d에는 안티-캐드헤린11 항체로 면역 침강한 결과 캐드헤린11 억제제로 캐드헤린11 발현을 감소시켰을 때 β-카테닌 및 Wnt-3A의 결합도 감소하였음을 나타내고 있다.In addition, cadherin 11 overexpression in keratinocytes significantly increased the expression of melaninase and MIFT, as well as phosphorylation of CREB and AKT from co-cultured melanocytes and keratinocytes (P <0.05). . On the other hand, the decrease in cadherin 11 expression significantly reduced the proteins (Fig. 4ba). In addition, as shown in Fig. 4bb, the expression of β-catenin and Wnt-3A was increased by cadherin 11 overexpression and decreased by cadherin 11 expression decreased. In addition, LY249002 treatment inhibited cadherin 11-induced β-catenin expression in keratinocytes. In FIG. 4C, it can be seen that the expression of β-catenin in the cytoplasm and the nuclear part was changed similarly to that of β-catenin in the total lysate. 4D shows that the binding of β-catenin and Wnt-3A was also reduced when the expression of cadherin 11 was reduced with a cadherin 11 inhibitor as a result of immunoprecipitation with anti-cadherin 11 antibody.

또한, FACS 분석결과, 각질형성세포에서의 캐드헤린11 과발현은 TYRP1 and K14 더블-포지티브 세포비율을 매우 증가시켰으며(P < 0.05), 캐드헤린11 발현감소는 이를 감소시킨 것으로 나타났다(도 4e). 마지막으로, 웨스턴 블랏 분석결과, 도 4f에 나타난 바와 같이 PAR2과 달리 Rac1의 인산화 반응이 캐드헤린11 과발현에 의해 증가하였으며, 캐드헤린11 발현감소에 의하여는 상기 인산화 반응이 감소한 것으로 나타났다.
In addition, as a result of FACS analysis, it was found that cadherin 11 overexpression in keratinocytes greatly increased the ratio of TYRP1 and K14 double-positive cells (P <0.05), and decreased Cadherin 11 expression decreased it (Fig. 4e). . Finally, as a result of Western blot analysis, unlike PAR2, as shown in FIG. 4F, the phosphorylation reaction of Rac1 was increased by overexpression of cadherin 11, and the phosphorylation reaction was decreased by reduction of cadherin 11 expression.

[실험예 5] 섬유아세포에서 캐드헤린11 의 MMP-1 및 MMP-2 발현 유도 확인
[Experimental Example 5] Confirmation of the induction of MMP-1 and MMP-2 expression of cadherin 11 in fibroblasts

캐드헤린11 은 세포와 세포의 부착 분자이다. 비록 섬유아세포에서의 캐드헤린11 과발현 또는 발현감소가 공배양된 멜라닌 생성 세포의 멜라닌 생성 및 멜라노좀 이동에 영향을 미치지만(도 2a-2f, 도 3a-3b), 직접 또는 거의 직접적으로 세포와 세포간에 접착된 공배양 시스템은 생리적 조건과 달리 상기 결과에 기여한다. 피부 섬유아세포의 캐드헤린11 가 생체내 상피 멜라닌 생성 세포에 기능을 발휘하기 위하여, 손상된 기저막을 통한 섬유아세포 이동 및 섬유아세포 및 멜라닌 생성 세포간의 직접적인 세포-세포 부착이 필요할 수 있다. 콜라겐 분해 효소인 MMP-1(matrix metalloproteinase-1)가 섬유아세포의 이동과 관련이 있고, MMP-2가 기저막을 분해시키므로, MMP-1 및 MMP-2의 발현에 대한 캐드헤린11 의 효과를 분석하는 실험을 실시하였다.Cadherin11 is a cell-cell adhesion molecule. Although cadherin 11 overexpression or reduced expression in fibroblasts affects melanogenesis and melanosomal movement of co-cultured melanogenic cells (Figs. 2a-2f, 3a-3b), directly or almost directly with cells The co-culture system adhered between cells contributes to this result, unlike physiological conditions. In order for cadherin 11 of skin fibroblasts to exert a function on epithelial melanogenic cells in vivo, fibroblast migration through the damaged basement membrane and direct cell-cell adhesion between fibroblasts and melanogenic cells may be required. Since the collagen-degrading enzyme MMP-1 (matrix metalloproteinase-1) is related to the migration of fibroblasts, and MMP-2 degrades the basement membrane, the effect of cadherin 11 on the expression of MMP-1 and MMP-2 was analyzed. The experiment was conducted.

먼저, 웨스트 블랏 분석한 결과 도 5a에 나타난 바와 같이 배양된 섬유아세포내 캐드헤린11 과발현은 MMP-1 및 MMP-2의 발현을 매우 증가시켰고(P<0.05), 캐드헤린11 발현감소는 이를 매우 감소시켰다(P < 0.05). 또한, 과색소침착 피부내 강한 캐드헤린11 발현을 갖는 4명의 환자로부터 면역침강법으로 조직을 분석하여 형광현미경으로 관찰한 결과, 도 5b에 나타난 바와 같이 과색소침착 피부(L)의 기저막내 콜라겐 IV 발현이 정상부위(N)보다 매우 감소된 것으로 나타났다.
First, as a result of West blot analysis, as shown in FIG. 5A, overexpression of cadherin 11 in cultured fibroblasts greatly increased the expression of MMP-1 and MMP-2 (P<0.05), and decrease in cadherin 11 expression is very effective. Decreased (P <0.05). In addition, as a result of analyzing the tissues by immunoprecipitation from 4 patients with strong expression of cadherin 11 in hyperpigmented skin and observing it with a fluorescence microscope, collagen in the basement membrane of hyperpigmented skin (L) as shown in FIG. It was found that IV expression was significantly reduced than that of normal (N).

[실험예 6] 섬유아세포내 캐드헤린11 의 멜라닌 생성 세포내 N-캐드헤린 발현 유도 확인
[Experimental Example 6] Confirmation of induction of N-cadherin expression in melanogenic cells by cadherin 11 in fibroblasts

캐드헤린(CDH)은 인접 세포의 동일한 캐드헤린 종들과의 동종친화성 부착(homophilic adhesion)을 조절하나, 멜라닌 생성세포에서는 캐드헤린11 발현이 검출되지 않았다. 이에, 섬유아세포내 캐드헤린11 과발현 또는 발현감소가 공배양된 멜라닌 생성 세포내 E-캐드헤린 및 N-캐드헤린의 발현에 대하여 갖는 효과를 도 2a에 도시된 섬유아세포-멜라닌 생성 세포 공배양 시스템을 사용하여 분석하였다.Cadherin (CDH) regulates homophilic adhesion of adjacent cells with the same Cadherin species, but Cadherin 11 expression was not detected in melanogenic cells. Thus, fibroblast-melanocyte co-culture system shown in FIG. 2A to have the effect of overexpression or decrease in expression of cadherin 11 in fibroblasts on the expression of E-cadherin and N-cadherin in co-cultured melanin-producing cells Was analyzed using.

먼저, 웨스턴 블랏 분석결과, 도 6a 및 도 6b에 각각 나타난 바와 같이, 섬유아세포내 캐드헤린11 과발현 및 발현감소는 사용된 공배양 시스템과 상관없이 단배양된 섬유아세포뿐만 아니라 공배양된 멜라닌 생성세포에서도 N-캐드헤린 단백질의 발현을 매우 증가 및 감소시켰다(P < 0.05). 구체적으로, N-캐드헤린 발현에 대한 효과는 단분자막으로 된 공배양에서 가장 높게 나타났으며, 그 다음으로 인서트의 외측내 섬유아세포와 공배양순으로 높게 나타났고, 하부 챔버 바닥의 섬유아세포와의 공배양에서 가장 낮았다. 그리고 섬유아세포내 캐드헤린11 과발현 또는 발현감소의 경우 모두 멜라닌 생성세포내 E-캐드헤린 발현은 변화가 없었다. First, as a result of Western blot analysis, as shown in Figs. 6a and 6b, respectively, the overexpression and reduction of cadherin 11 in fibroblasts are not only monocultured fibroblasts, but co-cultured melanin producing cells regardless of the co-culture system used. Also, the expression of N-cadherin protein was greatly increased and decreased (P <0.05). Specifically, the effect on N-cadherin expression was highest in the co-culture with monomolecular membrane, followed by co-culture with fibroblasts inside the outer side of the insert, and co-culture with fibroblasts at the bottom of the lower chamber. It was the lowest in culture. In addition, E-cadherin expression in melanin producing cells was not changed in either case of overexpression or decrease in cadherin 11 in fibroblasts.

캐드헤린11 및 안티-N-캐드헤린 항체들을 사용하여 단분자층의 공배양을 이중 염색한 후 형광현미경으로 관측한 결과, 도 6c 및 6d에 나타난 바와 같이 섬유아세포내 캐드헤린11 과발현시킨 경우 멜라닌 생성세포 및 섬유아세포내 강하게 염색된 N-캐드헤린이 증가한 반면, 캐드헤린11 발현감소시에는 강하게 염색된 N-캐드헤린이 감소하였다. As a result of double staining of the monolayer co-culture using Cadherin 11 and anti-N-cadherin antibodies and observation with a fluorescence microscope, as shown in Figs. 6c and 6d, when Cadherin 11 is overexpressed in fibroblasts, melanogenic cells And strongly stained N-cadherin in fibroblasts increased, whereas strongly stained N-cadherin decreased when cadherin 11 expression was decreased.

안티-캐드헤린11 항체를 사용하여 단분자층의 공배양으로부터 단백질을 면역침강 분석한 결과, 도 6e에 나타난 바와 같이 캐드헤린11 이 발현 감소된 섬유아세포는 결합한 N-캐드헤린을 감소시켰으며, 캐드헤린11 가 공배양된 세포의 E-캐드헤린에 결합하지 않은 것으로 나타났다. 또한, 도 6f에 나타난 바와 같이 섬유아세포내 캐드헤린11 과발현은 E-캐드헤린의 전사 억제인자인 Twist1의 발현을 증가시켰으며, 도 6g에 나타난 바와 같이 N-캐드헤린의 발현감소는 티로시나제 발현내 캐드헤린11 -유도된 증가를 사라지게 했다.As a result of immunoprecipitation analysis of proteins from co-culture of monolayers using an anti-cadherin 11 antibody, fibroblasts with reduced expression of cadherin 11 decreased bound N-cadherin, as shown in FIG. 6e. 11 did not appear to bind to E-cadherin of co-cultured cells. In addition, as shown in Fig. 6f, overexpression of cadherin 11 in fibroblasts increased the expression of Twist1, a transcription inhibitory factor of E-cadherin, and as shown in Fig. 6g, the decrease in expression of N-cadherin is within tyrosinase expression. Cadherin 11-Made the induced increase disappear.

또한, 보이든 챔버 평가(Boyden chamber assay) 결과, 도 6h에 나타난 바와 같이 인서트의 외측내 캐드헤린11 이 과발현된 섬유아세포가 인서트의 내측내 멜라닌 생성세포의 이동을 매우 촉진(p<0.05)하고, 캐드헤린11 발현이 감소된 섬유아세포는 상기 이동을 억제함을 확인할 수 있었다.In addition, as a result of Boyden chamber assay, as shown in Fig. 6h, fibroblasts overexpressing cadherin 11 in the outer side of the insert very promote the movement of melanogenic cells in the inner side of the insert (p<0.05). , It was confirmed that fibroblasts with reduced expression of cadherin 11 inhibit the migration.

[실험예 7] 각질형성세포내 캐드헤린11 의 EMT에 대한 관련성의 확인
[Experimental Example 7] Confirmation of the relevance of cadherin 11 to EMT in keratinocytes

상기 실험예 6의 결과에 나타난 바와 같이 섬유아세포내 캐드헤린11 의 변화는 멜라닌 생성세포의 캐드헤린 발현에 영항을 미치므로, 각질형성 세포내 캐드헤린11 과발현의 E-캐드헤린 및 공배양된 멜라닌 생성 세포의 N-캐드헤린 발현에 대한 효과를 분석하는 실험을 수행하였다.As shown in the results of Experimental Example 6, since the change of cadherin 11 in fibroblasts affects cadherin expression in melanogenic cells, E-cadherin and co-cultured melanin of cadherin 11 overexpression in keratinocytes An experiment was conducted to analyze the effect of the producing cells on the expression of N-cadherin.

그 결과, 도 7a 및 도 7b에 나타난 것과 같이 각질형성세포 단배양(KC) 및 각질형성세포-멜라닌 생성세포의 공배양(KC+MC) 모두에서 N-캐드헤린 발현이 증가하는 동안 E-캐드헤린의 발현이 감소하였다. 또한, 각질형성세포 단배양물 및 공배양물에서 Twist1의 발현이 매우 상향조절되었다(P < 0.05). As a result, as shown in Figs. 7A and 7B, E-CAD while N-cadherin expression increases in both single culture of keratinocytes (KC) and co-culture of keratinocytes-melanogenic cells (KC+MC). Herin expression decreased. In addition, the expression of Twist1 was very upregulated in single cultures and co-cultures of keratinocytes (P <0.05).

<110> Amorepacific corporation Dongguk university industry academic cooperation foundation <120> Skin-improving material controlling expression of cadherin11 or N-cadherin and method for screening the material <130> 14P139/IND <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDH11_forward primer <400> 1 ggcaggctca gaacagaaag 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDH11_reverse primer <400> 2 ctaccagatc attgttcttc 20 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH_forward primer <400> 3 tccactggcg tcttcacc 18 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH_reverse primer <400> 4 ggcagagatg atgacccttt 20 <210> 5 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MITF-3UTR_forward primer <400> 5 aaagctgcgc actagtgaat gcagagagag gagaag 36 <210> 6 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MITF-3UTR_reverse primer <400> 6 atcctttatt aagcttttgg atttgcaaat gact 34 <110> Amorepacific corporation Dongguk university industry academic cooperation foundation <120> Skin-improving material controlling expression of cadherin11 or N-cadherin and method for screening the material <130> 14P139/IND <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDH11_forward primer <400> 1 ggcaggctca gaacagaaag 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDH11_reverse primer <400> 2 ctaccagatc attgttcttc 20 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH_forward primer <400> 3 tccactggcg tcttcacc 18 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH_reverse primer <400> 4 ggcagagatg atgacccttt 20 <210> 5 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MITF-3UTR_forward primer <400> 5 aaagctgcgc actagtgaat gcagagagag gagaag 36 <210> 6 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MITF-3UTR_reverse primer <400> 6 atcctttatt aagcttttgg atttgcaaat gact 34

Claims

A substance that inhibits the expression of Cadherin 11, or
A composition for improving skin comprising a substance that inhibits expression of cadherin 11 and N-cadherin as an active ingredient.

The method of claim 1, wherein the composition is
SiRNA that binds to the mRNA of Cadherin 11;
SiRNA that binds to the mRNA of the cadherin 11 and siRNA that binds to the mRNA of the N-cadherin;
The antibody of Cadherin 11; And
The antibody of Cadherin 11 and the antibody of N-cadherin;
A composition for improving skin comprising at least one of the active ingredients.

The composition for improving skin according to claim 1, wherein the cadherin 11 is a target gene of miRNA-675.

The composition for improving skin according to claim 1, wherein the active ingredient inhibits the production of melanin by melanocytes.

The composition for improving skin according to claim 1, wherein the expression inhibitor of Cadherin 11 is a substance that inhibits the expression of MMP-1 (matrix metalloproteinase-1) and MMP-2 (matrix metalloproteinase-2).

The composition for improving skin according to claim 1, wherein the composition is for skin hyperpigmentation improvement or skin whitening.

The composition for improving skin according to claim 1, wherein the composition is for skin anti-aging.

A skin improvement kit comprising the composition of any one of claims 1 to 7.

Including two or more co-cultures of fibroblasts, keratinocytes, and melanocytes,
At least one of the fibroblasts and keratinocytes is a skin improvement material screening system comprising Cadherin 11 overexpression cells.

delete

[10] The system of claim 9, wherein at least one of the fibroblasts, keratinocytes, and melanogenic cells further comprises N-cadherin overexpressing cells.

The skin improvement material screening system according to claim 9, wherein the skin improvement material screening system comprises a chamber including an insert, and at least one of the cells of the co-culture is cultured inside the insert in the chamber. .

The skin improvement substance screening system according to claim 9, wherein at least one of the fibroblasts, keratinocytes and melanogenic cells is a cell derived from at least one selected from human, mouse, guinea pig, chicken, and pig.

The skin improvement material screening system of claim 9, wherein the skin improvement material is a material that improves skin whitening or hyperpigmentation.

The skin improvement material screening system of claim 9, wherein the skin improvement material is a material that prevents or improves skin aging.

Treating the candidate substance in the co-culture of the skin improvement substance screening system according to any one of claims 9 and 11 to 15; And
Measuring changes in the expression of cadherin 11, or cadherin 11 and N-cadherin;
A method for screening a skin improvement substance comprising a.

The method of claim 16, further comprising the step of determining, after the step of measuring the expression change, a substance having reduced expression of cadherin 11 or cadherin 11 and N-cadherin as a skin improvement substance. Screening method.

The method of claim 16, wherein the step of measuring the expression change is RT (Real time)-PCR, western blot, immunofluorescence staining for the change in expression of the cadherin 11, or cadherin 11 and N-cadherin. (Immunofluorescence staining) and immunoprecipitation (Immunoprecipitation) a method for screening a skin improvement substance comprising the step of measuring by one or more methods.