JP2011130751A - Skin color-controlling factor - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、肌色の制御に関わる因子に関する。 The present invention relates to factors related to skin color control.
従来、主に美容の目的から、アジア圏を中心に皮膚美白剤の開発が盛んに行われてきた。 Conventionally, skin whitening agents have been actively developed mainly in Asia for the purpose of beauty.
皮膚色は非常に多様であるが、その違いは主に皮膚中のメラノサイトにおけるメラニン産生量の違いによって生じるとされている。皮膚色は色素細胞（メラノサイト）中のメラノソームと呼ばれる細胞小器官中でつくられたメラニンが、表皮の大部分を構成するケラチノサイトへと転送されて表皮全体へと広がることによって形成される（非特許文献１〜３参照）。 The skin color is very diverse, but the difference is mainly caused by the difference in melanin production in the melanocytes in the skin. Skin color is formed by melanin produced in organelles called melanosomes in pigment cells (melanocytes) being transferred to keratinocytes that make up the majority of the epidermis and spreading throughout the epidermis (non-patented) References 1-3).
生体内において、メラニンは前駆体であるチロシンから生合成される。チロシンは、チロシナーゼの作用によりドーパに変換され、ドーパはさらに、やはりチロシナーゼの作用によりドーパキノンへと変換される。このドーパキノンは、中間物質を介した後、メラニンへと生合成される。メラニン生合成に関わる酵素であるチロシナーゼに変異が生じると、皮膚、毛髪のメラニン色素の形成が異常となることが報告されている（非特許文献４）。チロシナーゼはチロシンヒドロキシラーゼ活性、ドーパオキシダーゼ活性及びＤＨＩ活性を有し、チロシンを前駆体としたメラニン合成反応を触媒する。 In vivo, melanin is biosynthesized from tyrosine, a precursor. Tyrosine is converted to dopa by the action of tyrosinase, and dopa is further converted to dopaquinone by the action of tyrosinase. This dopaquinone is biosynthesized into melanin via an intermediate substance. It has been reported that when a mutation occurs in tyrosinase, an enzyme involved in melanin biosynthesis, the formation of melanin pigments in the skin and hair becomes abnormal (Non-patent Document 4). Tyrosinase has tyrosine hydroxylase activity, dopa oxidase activity and DHI activity, and catalyzes a melanin synthesis reaction using tyrosine as a precursor.
従来、皮膚美白剤の開発のため、チロシナーゼの酵素活性を阻害してメラニン産生を抑制する作用のある物質が探索されてきた。これまでに、アスコルビン酸、アルブチン、コウジ酸等に当該作用があることが報告されている（例えば、非特許文献５）。 Conventionally, for the development of a skin lightening agent, a substance having an action of inhibiting the enzyme activity of tyrosinase and suppressing melanin production has been searched. So far, it has been reported that ascorbic acid, arbutin, kojic acid and the like have the action (for example, Non-Patent Document 5).
しかし、これらの物質のメラニン産生抑制効果は十分とはいえず、皮膚美白剤として十分に満足できるものではなかった。 However, the melanin production inhibitory effect of these substances is not sufficient, and it was not fully satisfactory as a skin lightening agent.
本発明は、肌色の制御に関わる遺伝子、及び当該遺伝子を利用した肌色制御方法を提供する。 The present invention provides a gene involved in skin color control and a skin color control method using the gene.
本発明者は、メラノサイトにおけるメラニン産生量の違いを生み出す因子を明らかとするため、皮膚メラノサイトを用いた網羅的遺伝子発現解析を行い、皮膚色によって発現量に違いが認められるいくつかの遺伝子を見出した。さらに本発明者は、これらの遺伝子についてｓｉＲＮＡを用いた遺伝子ノックダウンを行い、これらの遺伝子が皮膚のメラニン産生に関与していることを見出し、本発明を完成した。 The present inventor conducted a comprehensive gene expression analysis using skin melanocytes in order to clarify the factors that cause differences in the amount of melanin production in melanocytes, and found several genes whose expression levels differ depending on skin color. It was. Furthermore, the present inventor performed gene knockdown using siRNA for these genes, and found that these genes are involved in melanin production in the skin, thereby completing the present invention.
すなわち、本発明は、以下に係るものである。
（１）ＰＲＫＣＢ１、ＨＩＰＫ２、ＧＲＢ１０、ＦＫＢＰ５、ＳＮＸ９、ＬＩＭＤ１、ＭＹＯ１Ｄ、ＮＭＥ７、ＣＤＫＮ１Ａ、ＡＴＰ２Ａ２、ＴＩＭＰ３、ＣＳＰＧ４及びＤＣＡＭＫＬ１からなる群から選択され、チロシナーゼ活性の制御に関わることを特徴とする、肌色制御遺伝子。
（２）ＰＲＫＣＢ１、ＨＩＰＫ２、ＧＲＢ１０、ＦＫＢＰ５、ＳＮＸ９、ＬＩＭＤ１、ＭＹＯ１Ｄ、ＮＭＥ７及びＣＤＫＮ１Ａからなる群から選択され、発現によってチロシナーゼ活性が増強することを特徴とする、（１）記載の遺伝子。
（３）ＡＴＰ２Ａ２、ＴＩＭＰ３、ＣＳＰＧ４及びＤＣＡＭＫＬ１からなる群から選択され、発現によってチロシナーゼ活性が低下することを特徴とする、（１）記載の遺伝子。
（４）（１）記載の遺伝子のうちの少なくとも１の発現を変化させることを特徴とする、肌色制御方法。
（５）細胞に被験物質を投与する工程と、当該細胞における（１）記載の遺伝子のうちの少なくとも１の発現の変化を測定する工程とを含む、肌色制御剤のスクリーニング方法。
That is, the present invention relates to the following.
(1) Skin color control gene selected from the group consisting of PRKCB1, HIPK2, GRB10, FKBP5, SNX9, LIMD1, MYO1D, NME7, CDKN1A, ATP2A2, TIMP3, CSPG4 and DCAMKL1, and is related to the control of tyrosinase activity .
(2) The gene according to (1), wherein the gene is selected from the group consisting of PRKCB1, HIPK2, GRB10, FKBP5, SNX9, LIMD1, MYO1D, NME7 and CDKN1A, and tyrosinase activity is enhanced by expression.
(3) The gene according to (1), wherein the gene is selected from the group consisting of ATP2A2, TIMP3, CSPG4, and DCAMKL1, and tyrosinase activity is reduced by expression.
(4) A skin color control method, wherein the expression of at least one of the genes according to (1) is changed.
(5) A screening method for a skin color control agent, comprising a step of administering a test substance to a cell and a step of measuring a change in expression of at least one of the genes described in (1) in the cell.
本発明は、メラニン産生量の違いを生み出す因子を制御することにより、より効果的に皮膚色を改変する技術を提供する。また、本発明は、メラニン産生量の違いを生み出す因子を制御することにより、メラニンの産生を抑制する美白剤、またはメラニンの産生を促進するタンニング剤をスクリーニングする方法を提供する。 The present invention provides a technique for modifying skin color more effectively by controlling a factor that produces a difference in melanin production. The present invention also provides a method of screening for a whitening agent that suppresses melanin production or a tanning agent that promotes melanin production by controlling a factor that produces a difference in melanin production.
本発明は、ＰＲＫＣＢ１、ＨＩＰＫ２、ＧＲＢ１０、ＦＫＢＰ５、ＳＮＸ９、ＬＩＭＤ１、ＭＹＯ１Ｄ、ＮＭＥ７、ＣＤＫＮ１Ａ、ＡＴＰ２Ａ２、ＴＩＭＰ３、ＣＳＰＧ４及びＤＣＡＭＫＬ１からなる群から選択される肌色制御遺伝子を提供する。上記に列挙した遺伝子は、ＮＣＢＩデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim）に登録されている。 The present invention provides a skin color control gene selected from the group consisting of PRKCB1, HIPK2, GRB10, FKBP5, SNX9, LIMD1, MYO1D, NME7, CDKN1A, ATP2A2, TIMP3, CSPG4 and DCAMKL1. The genes listed above are registered in the NCBI database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim).
これらの遺伝子は、本発明者による皮膚メラノサイトにおける網羅的遺伝子発現解析の結果、皮膚色の異なる人種間で発現の違いが見られた遺伝子である。すなわち、これらの遺伝子の発現量は、黒色人種と白色人種間で異なっている。 As a result of comprehensive gene expression analysis in skin melanocytes by the present inventor, these genes are genes in which differences in expression were observed among races with different skin colors. That is, the expression levels of these genes differ between black and white races.
上記遺伝子の発現は、チロシナーゼ蛋白質発現との間に相関関係を有する。チロシナーゼは、細胞におけるチロシンからのドーパの生合成にチロシンハイドロオキシラーゼとして作用し、またドーパオキシダーゼとしてドーパからのドーパキノンの生合成に働く酵素である。生合成されたドーパキノンは、中間物質を介した後、メラニンへと生合成される。すなわち、チロシナーゼの活性は、細胞のメラニン合成に深く寄与している。したがって、上記遺伝子の発現を変化させることによって、チロシナーゼの発現を制御することができ、それによってメラニン産生を制御し、結果として皮膚色を制御することができる。上記遺伝子の人種間での発現の差異やチロシナーゼ発現との相関性は、これまで知られておらず、上記遺伝子と皮膚色との関連性は本発明者によって初めて見出された。すなわち、上記遺伝子は、新規な肌色制御遺伝子である。 The gene expression has a correlation with tyrosinase protein expression. Tyrosinase is an enzyme that acts as a tyrosine hydroxylase on the biosynthesis of dopa from tyrosine in the cell, and acts on the biosynthesis of dopaquinone from dopa as dopa oxidase. Biosynthesized dopaquinone is biosynthesized into melanin after passing through an intermediate substance. That is, the activity of tyrosinase contributes deeply to cellular melanin synthesis. Therefore, by changing the expression of the gene, tyrosinase expression can be controlled, thereby controlling melanin production and consequently skin color. The difference in expression of the above genes among races and the correlation with tyrosinase expression have not been known so far, and the association between the above genes and skin color was first found by the present inventors. That is, the above gene is a novel skin color control gene.
後記実施例に例示するように、上記遺伝子のうち、ＰＲＫＣＢ１、ＨＩＰＫ２、ＧＲＢ１０、ＦＫＢＰ５、ＳＮＸ９、ＬＩＭＤ１、ＭＹＯ１Ｄ、ＮＭＥ７又はＣＤＫＮ１Ａの発現を抑制した場合、細胞のドーパオキシダーゼ活性（すなわちチロシナーゼ活性）が低下する。すなわち、これらの遺伝子が発現すれば、細胞のチロシナーゼ活性が増強し、結果としてメラニン産生が促進される。したがって、これらの遺伝子は、皮膚色を褐色化する遺伝子である。 As exemplified in Examples below, among the above genes, when the expression of PRKCB1, HIPK2, GRB10, FKBP5, SNX9, LIMD1, MYO1D, NME7, or CDKN1A is suppressed, the cellular dopa oxidase activity (ie, tyrosinase activity) decreases. To do. That is, if these genes are expressed, the tyrosinase activity of the cells is enhanced, and as a result, melanin production is promoted. Therefore, these genes are genes that brown the skin color.
また後記実施例に例示するように、上記遺伝子のうち、ＡＴＰ２Ａ２、ＴＩＭＰ３、ＣＳＰＧ４又はＤＣＡＭＫＬ１の発現を抑制した場合、細胞のドーパオキシダーゼ活性（すなわちチロシナーゼ活性）が増強する。すなわち、これらの遺伝子が発現すれば細胞のチロシナーゼ活性は低下し、結果としてメラニン産生が抑制される。したがって、これらの遺伝子は、皮膚色を明るくする遺伝子である。 Further, as exemplified in the examples described later, when the expression of ATP2A2, TIMP3, CSPG4 or DCAMKL1 is suppressed among the above genes, the cell dopa oxidase activity (that is, tyrosinase activity) is enhanced. That is, if these genes are expressed, the tyrosinase activity of the cells decreases, and as a result, melanin production is suppressed. Therefore, these genes are genes that lighten the skin color.
上記遺伝子の発現を変化させることによって、皮膚の色を制御することができる。したがって、本発明は、ＰＲＫＣＢ１、ＨＩＰＫ２、ＧＲＢ１０、ＦＫＢＰ５、ＳＮＸ９、ＬＩＭＤ１、ＭＹＯ１Ｄ、ＮＭＥ７、ＣＤＫＮ１Ａ、ＡＴＰ２Ａ２、ＴＩＭＰ３、ＣＳＰＧ４及びＤＣＡＭＫＬ１からなる群から選択される肌色制御遺伝子のうちの少なくとも１の発現を変化させることを特徴とする、肌色制御方法を提供する。 The skin color can be controlled by changing the expression of the gene. Therefore, the present invention changes the expression of at least one of the skin color control genes selected from the group consisting of PRKCB1, HIPK2, GRB10, FKBP5, SNX9, LIMD1, MYO1D, NME7, CDKN1A, ATP2A2, TIMP3, CSPG4 and DCAMKL1. The present invention provides a skin color control method.
本発明の肌色制御方法においては、上記遺伝子のうちの少なくとも１の発現を、当該分野で通常使用される任意の手段で変化させればよい。遺伝子発現を変化させる手段は特に限定されない。例えば、遺伝子発現を変化させる手段としては、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はｓｉＲＮＡによる遺伝子ノックダウン、特異的プロモーターによる標的遺伝子の転写活性化、ベクターを用いた外部からの遺伝子の挿入、等が挙げられる。 In the skin color control method of the present invention, the expression of at least one of the above genes may be changed by any means commonly used in the art. The means for changing gene expression is not particularly limited. For example, means for changing gene expression include gene knockdown with antisense oligonucleotides or siRNA, transcriptional activation of target genes with specific promoters, insertion of genes from the outside using vectors, and the like.
本発明の肌色制御方法の一態様においては、ＰＲＫＣＢ１、ＨＩＰＫ２、ＧＲＢ１０、ＦＫＢＰ５、ＳＮＸ９、ＬＩＭＤ１、ＭＹＯ１Ｄ、ＮＭＥ７及びＣＤＫＮ１Ａのうちの少なくとも１の発現を抑制することによって、細胞のチロシナーゼ活性を低下させ、皮膚色を明るくする。別の態様においては、同じ遺伝子の発現を増強することによって、細胞のチロシナーゼ活性を増強させ、皮膚色を褐色化する。 In one aspect of the skin color control method of the present invention, by suppressing the expression of at least one of PRKCB1, HIPK2, GRB10, FKBP5, SNX9, LIMD1, MYO1D, NME7, and CDKN1A, the cellular tyrosinase activity is reduced, Lighten skin color. In another embodiment, enhancing the expression of the same gene increases the tyrosinase activity of the cells and browns the skin color.
本発明の肌色制御方法のさらに別の態様においては、ＡＴＰ２Ａ２、ＴＩＭＰ３、ＣＳＰＧ４及びＤＣＡＭＫＬ１のうちの少なくとも１の発現を抑制することによって、細胞のチロシナーゼ活性を増強させ、皮膚色を褐色化する。なお別の態様においては、同じ遺伝子の発現を増強することによって、細胞のチロシナーゼ活性を低下させ、皮膚色を明るくする。 In still another aspect of the skin color control method of the present invention, the expression of at least one of ATP2A2, TIMP3, CSPG4, and DCAMKL1 is suppressed to enhance the tyrosinase activity of the cells and brown the skin color. In yet another embodiment, enhancing the expression of the same gene reduces cellular tyrosinase activity and lightens the skin color.
本発明の肌色制御遺伝子の発現を変化させる物質はまた、皮膚の色を制御することができる物質である。したがって、本発明は、ＰＲＫＣＢ１、ＨＩＰＫ２、ＧＲＢ１０、ＦＫＢＰ５、ＳＮＸ９、ＬＩＭＤ１、ＭＹＯ１Ｄ、ＮＭＥ７、ＣＤＫＮ１Ａ、ＡＴＰ２Ａ２、ＴＩＭＰ３、ＣＳＰＧ４及びＤＣＡＭＫＬ１からなる群から選択される肌色制御遺伝子のうちの少なくとも１の発現の変化を測定することを特徴とする、肌色制御剤のスクリーニング方法を提供する。 The substance that changes the expression of the skin color control gene of the present invention is also a substance that can control skin color. Therefore, the present invention provides a change in the expression of at least one of the skin color control genes selected from the group consisting of PRKCB1, HIPK2, GRB10, FKBP5, SNX9, LIMD1, MYO1D, NME7, CDKN1A, ATP2A2, TIMP3, CSPG4 and DCAMKL1. A method for screening a skin color control agent is provided.
本発明のスクリーニング方法は、細胞に被験物質を投与する工程と、当該細胞における本願発明の肌色制御遺伝子のうちの少なくとも１の発現の変化を測定する工程とを含む。被験物質を添加する細胞は、チロシナーゼ発現能を有する限り特に限定されないが、培養細胞が好ましく、培養ヒト細胞がより好ましい。また好ましくは、細胞は皮膚細胞であり、より好ましくはメラノサイトであり、さらに好ましくはヒト由来培養メラノサイトである。被験物質の種類は特に限定されず、天然物でも合成物でもよく、また単一物質であっても組成物若しくは混合物であってもよい。投与の形態は、被験物質に依存して、任意の形態であり得る。 The screening method of the present invention includes a step of administering a test substance to a cell and a step of measuring a change in expression of at least one of the skin color control genes of the present invention in the cell. The cell to which the test substance is added is not particularly limited as long as it has the ability to express tyrosinase, but is preferably a cultured cell, more preferably a cultured human cell. Preferably, the cell is a skin cell, more preferably a melanocyte, and still more preferably a human-derived cultured melanocyte. The type of the test substance is not particularly limited, and may be a natural product or a synthetic product, and may be a single substance, a composition or a mixture. The form of administration can be any form depending on the test substance.
肌色制御遺伝子の発現は、当該分野で通常使用される任意の遺伝子発現解析方法によって測定することができる。遺伝子発現解析方法としては、例えば、ドットブロット法、ノーザンブロット法、ＲＮアーゼプロテクションアッセイ法、ルシフェラーゼ等によるリポーターアッセイ、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＤＮＡマイクロアレイ、等が挙げられる。 The expression of the skin color control gene can be measured by any gene expression analysis method usually used in the art. Examples of gene expression analysis methods include dot blot method, Northern blot method, RNase protection assay method, reporter assay using luciferase, RT-PCR method, DNA microarray, and the like.
測定した遺伝子発現に基づいて、被験物質の投与による遺伝子発現の変化を評価することができる。例えば、被験物質の投与前後に本発明の肌色制御遺伝子の発現を測定し、必要に応じて発現量を定量化した後、投与前後の結果を比較する。また例えば、被験物質の投与群と、非投与群若しくは対照物質投与群から本発明の肌色制御遺伝子の発現を測定し、必要に応じて発現量を定量化した後、結果を投与群と非投与群、又は投与群と対照物質投与群との間で結果を比較する。遺伝子の発現に影響を及ぼす被験物質は、皮膚色の制御に使用できる肌色制御剤として選択される。 Based on the measured gene expression, changes in gene expression due to administration of the test substance can be evaluated. For example, the expression of the skin color control gene of the present invention is measured before and after the administration of the test substance, the expression level is quantified as necessary, and the results before and after the administration are compared. Alternatively, for example, the expression of the skin color control gene of the present invention is measured from the test substance administration group and the non-administration group or the control substance administration group, and the expression level is quantified as necessary, and the result is not administered to the administration group. The results are compared between the group or the administration group and the control substance administration group. A test substance that affects gene expression is selected as a skin color control agent that can be used to control skin color.
例えば、ＰＲＫＣＢ１、ＨＩＰＫ２、ＧＲＢ１０、ＦＫＢＰ５、ＳＮＸ９、ＬＩＭＤ１、ＭＹＯ１Ｄ、ＮＭＥ７及びＣＤＫＮ１Ａのうちの少なくとも１の発現を抑制する物質は、細胞のチロシナーゼ活性を低下させて皮膚色を明るくする、皮膚色明色化剤(美白剤)として選択される。一方、同じ遺伝子の発現を増強する物質は、細胞のチロシナーゼ活性を増強させて皮膚色を褐色化する、皮膚色褐色化剤（タンニング剤）として選択される。 For example, a substance that suppresses the expression of at least one of PRKCB1, HIPK2, GRB10, FKBP5, SNX9, LIMD1, MYO1D, NME7, and CDKN1A decreases the tyrosinase activity of cells and lightens the skin color Selected as an agent (whitening agent). On the other hand, a substance that enhances the expression of the same gene is selected as a skin color browning agent (tanning agent) that enhances cell tyrosinase activity and browns the skin color.
また例えば、ＡＴＰ２Ａ２、ＴＩＭＰ３、ＣＳＰＧ４及びＤＣＡＭＫＬ１のうちの少なくとも１の発現を抑制する物質は、細胞のチロシナーゼ活性を低下増強させて皮膚色を褐色化する、皮膚色褐色化剤（タンニング剤）として選択される。一方、同じ遺伝子の発現を増強する物質は、細胞のチロシナーゼ活性を低下させて皮膚色を明るくする、皮膚色明色化剤(美白剤)として選択される。 In addition, for example, a substance that suppresses the expression of at least one of ATP2A2, TIMP3, CSPG4, and DCAMKL1 is selected as a skin color browning agent (tanning agent) that lowers and enhances cell tyrosinase activity to brown the skin color Is done. On the other hand, substances that enhance the expression of the same gene are selected as skin lightening agents (whitening agents) that lighten the skin color by reducing the tyrosinase activity of the cells.
以下、実施例に基づき本発明をさらに詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail based on examples.
ｓｉＲＮＡによる遺伝子ノックダウン細胞におけるドーパオキシダーゼ活性の測定
（１．ｓｉＲＮＡによる遺伝子ノックダウン）
９６ウェルプレートにヒト新生児包皮由来のメラノサイト１００μｌを１×１０4個／ウェルの細胞密度となるように各ウェルに播種した。培地はＭｅｄｉｕｍ ２５４にＰＭＡを除くＨＭＧＳ（Human Melanocyte Growth Supplement）（いずれもCascade Biologics社製）を添加したものを用いた。
２４時間の培養後、TransIT-TKO（登録商標）Transfection Reagent(Mirus社製)を用いて、メラノサイトに各種ｓｉＲＮＡを終濃度２０ｎＭになるよう導入した。各遺伝子に対するｓｉＲＮＡはいずれもInvitrogen社 Stealth RNAiを用いた。トランスフェクション翌日、Ｍｅｄｉｕｍ ２５４にＰＭＡを除くＨＭＧＳを添加したものにメラノサイト活性化因子エンドセリン−１（ＥＴ−１）、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）、αメラノサイト刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）、ヒスタミン及びプロスタグランジンＥ2（ＰＧＥ2）を加えたものを、それぞれ１００μｌずつ各ウェルに添加した（培地中終濃度で１ｎＭ）。
Measurement of dopa oxidase activity in siRNA knockdown cells (1. gene knockdown with siRNA)
In a 96-well plate, 100 μl of human neonatal foreskin-derived melanocytes were seeded in each well so as to have a cell density of 1 × 10 4 cells / well. The medium used was Medium 254 to which HMGS (Human Melanocyte Growth Supplement) excluding PMA (both manufactured by Cascade Biologics) was added.
After culturing for 24 hours, various siRNAs were introduced into melanocytes at a final concentration of 20 nM using TransIT-TKO (registered trademark) Transfection Reagent (manufactured by Mirus). Invitrogen Stealth RNAi was used as the siRNA for each gene. The day after transfection, medium 254 supplemented with HMGS excluding PMA, melanocyte activator endothelin-1 (ET-1), stem cell growth factor (SCF), α melanocyte stimulating hormone (α-MSH), histamine and prostagland 100 μl of gin E 2 (PGE 2 ) was added to each well (1 nM at a final concentration in the medium).
なお、培地には、以下の添加物も添加されている。
ｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞成長因子） ３ｎｇ／ｍｌ
ＢＰＥ（ウシ脳下垂体抽出液） ０．２体積％
ＦＢＳ（ウシ胎児血清） ０．５体積％
ハイドロコーチゾン ５×１０-4ｍｏｌ／ｍ3
インスリン ５μｇ／ｍｌ
トランスフェリン ５μｇ／ｍｌ
ヘパリン ５μｇ／ｍｌ
In addition, the following additives are also added to the medium.
bFGF (basic fibroblast growth factor) 3 ng / ml
BPE (bovine pituitary extract) 0.2% by volume
FBS (fetal bovine serum) 0.5% by volume
Hydrocortisone 5 × 10 -4 mol / m 3
Insulin 5 μg / ml
Transferrin 5 μg / ml
Heparin 5μg / ml
ｓｉＲＮＡ導入後、５日間培養した後、メラノサイトをＣａ2+及びＭｇ2+を除去したＰｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）で洗浄し、抽出バッファー（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ７．２）、１％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、０．０１％ ＳＤＳ、１００μＭ ＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオライド）、１μｇ／ｍｌ アプロチニン）を２０μｌ／ウェル、ならびにＡｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒ（４％ジメチルホルムアミドを含有する１００ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ（ｐＨ７．１））を２０μｌ／ウェル添加し、４℃、３時間で細胞を可溶化した。 After introduction of siRNA and culturing for 5 days, the melanocytes were washed with Phosphate-buffered saline (PBS) from which Ca 2+ and Mg 2+ had been removed, and extracted buffer (0.1 M Tris-HCL (pH 7.2), 1% Nonidet P-40, 0.01% SDS, 100 μM PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride), 1 μg / ml aprotinin) 20 μl / well, and Assay buffer (100 mM Sodium phosphate-buffered (pH 7) containing 4% dimethylformamide). 1)) was added at 20 μl / well, and the cells were solubilized at 4 ° C. for 3 hours.
（２．ドーパオキシダーゼ活性の測定）
ドーパオキシダーゼ活性（チロシナーゼ活性）を指標として遺伝子発現のメラニン産生への関与を調べた。ドーパオキシターゼ活性測定は、ＭＢＴＨ法（例えば、Winder A.J., Harris H., Eur. J. Biochem., 198:317-326, 1991）を参考に、以下のように行った。
(2. Measurement of dopa oxidase activity)
The involvement of gene expression in melanin production was examined using dopa oxidase activity (tyrosinase activity) as an index. The dopa oxidase activity was measured as follows with reference to the MBTH method (for example, Winder AJ, Harris H., Eur. J. Biochem., 198: 317-326, 1991).
可溶化した細胞溶液の各ウェルに、Ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒを８０μｌ／ウェル、２０．７ｍＭ ＭＢＴＨ（３−メチル−２−ベンゾチアゾリノン ヒドラゾン）溶液を６０μｌ、基質として５ｍＭ Ｌ−ドーパ（Ｌ−ジヒドロキシフェニルアラニン）溶液４０μｌをそれぞれ加え、３７℃で３０〜６０分反応させた後、その呈色反応を４９０ｎｍの吸光度で測定した。 In each well of the solubilized cell solution, Assay buffer is 80 μl / well, 20.7 mM MBTH (3-methyl-2-benzothiazolinone hydrazone) solution is 60 μl, and 5 mM L-dopa (L-dihydroxyphenylalanine) is used as a substrate. After adding 40 μl of each solution and reacting at 37 ° C. for 30 to 60 minutes, the color reaction was measured by absorbance at 490 nm.
結果を表１に示す。なお、ドーパオキシダーゼ活性の値は、Stealth RNAi Negative Controlを導入した場合の吸光度に対する相対値で示している。本発明の肌色制御遺伝子の発現をノックダウンすることにより、細胞のドーパオキシダーゼ活性（チロシナーゼ活性）が変化した。したがって、本発明の肌色制御遺伝子の発現がメラニン産生に影響を及ぼすことが示された。 The results are shown in Table 1. The value of the dopa oxidase activity is shown as a relative value to the absorbance when Stealth RNAi Negative Control is introduced. By knocking down the expression of the skin color control gene of the present invention, the cellular dopa oxidase activity (tyrosinase activity) was changed. Therefore, it was shown that the expression of the skin color control gene of the present invention affects melanin production.
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|---|---|---|---|---|
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-
2009
- 2009-12-25 JP JP2009295607A patent/JP2011130751A/en active Pending
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| WO2013096645A1 (en) * | 2011-12-20 | 2013-06-27 | The Procter & Gamble Company | Human skin sample methods and models for validating hypotheses for mechanisms driving skin pigmentation |
| JP2015505243A (en) * | 2011-12-20 | 2015-02-19 | ザ プロクター アンド ギャンブルカンパニー | Human skin sampling method and model to test hypotheses about the mechanism causing skin pigmentation |
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