RU2704489C1

RU2704489C1 - Method for production of cell-free matrix of derma for further reconstruction of extensive defects of soft tissues

Info

Publication number: RU2704489C1
Application number: RU2018143694A
Authority: RU
Inventors: Александр Сергеевич Самойлов; Татьяна Алексеевна Астрелина; Валентин Андреевич Брумберг; Ирина Владимировна Кобзева; Александр Станиславович Осташкин; Владимир Сергеевич Рудаков
Priority date: 2018-12-10
Filing date: 2018-12-10
Publication date: 2019-10-29

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: invention refers to medicine, particularly to biomedicine, and can be used in organ transplantation and tissue engineering for reconstruction of soft tissue defects. Method for producing decellularised cutaneous flaps involves using a perfusion module to be integrated into Ebers Teb 500 bioreactor assembled from two different-volume reservoirs interconnected by tubes and luer-fitings. Flap placed into the perfusion module is treated as follows: flap is washed by perfusion with 250 ml of PBS with antibiotics addition during a day; then skin flap is successively washed in solutions of 0.5 M NaCl, 1M NaCl and sterile purified water. After washing, the skin flap is treated with solution of 0.25 % trypsin – EDTA on a platform shaker in the working space of the bioreactor EBERS TEV 500 or incubator at 37 °C at rate of 500–600 rpm. Further, the flap is washed successively in sterile purified water and 100 % isopropyl alcohol. That is followed by placing a fixed flap into the perfusion module and perfusing 250 ml of fresh filtered solution of 1 % of 4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol (TritonX100) and 0.8 % sodium deoxycholate (NaDOC) for 45 hours , at that, after 24 hours, the solution is replaced with fresh solution and for perfusion washing, the perfusion module is not disassembled, and the dried perfusate reservoir is poured with 200-250 ml of sterile water with addition of 0.3 % sodium azide and 1 % ampicillin sodium, perfusion is carried out for 48 hours with three replacements for each day. After the perfusion is stopped, the flap is washed with 40 % ethanol, then the flap is perfused at rate of 20 ml/min for two hours. After perfusion, the flap is transferred into a new container filled with 125 ml of 70 % ethanol by +4 °C and stored for a day, and then flap is preserved in 200–250 ml of 7.14 % DMSO and 7.14 % PVP in DMEM and stored at temperature of -80 °C.

EFFECT: method enables complete removal of nuclei in all skin layers, including adipocyte nuclei, removal of molecules, which are antigenic determinants, absence of MHC-1 expression.

1 cl, 1 ex

Description

Изобретение относится к области медицины, в частности, к биомедицине, а именно к органной трансплантации, тканевой инженерии и может быть использовано на лабораторных животных в научных учреждениях.The invention relates to medicine, in particular to biomedicine, namely to organ transplantation, tissue engineering and can be used on laboratory animals in scientific institutions.

Актуальность предлагаемого способа определяется необходимостью хирургической реконструкции поврежденных участков с использованием аутологичных лоскутов мягких тканей при полученной травме, вследствие обширных термических, химических и радиационных ожогов, хирургических вмешательств (например, при резекции опухолей), повторного донорства. Однако, подобная реконструкция обширных дефектов мягких тканей хоть и эффективна, но имеет существенные ограничения, связанные с недостаточным количеством аутологичных лоскутов мягких тканей, пригодных для реконструкции, с морбидностью донорского участка. Морбидность донорского участка может быть вызвана травмами, множественными вмешательствами, обширной резекцией.The relevance of the proposed method is determined by the need for surgical reconstruction of damaged areas using autologous soft tissue grafts in case of injury, due to extensive thermal, chemical and radiation burns, surgical interventions (for example, with tumor resection), repeated donation. However, such reconstruction of extensive soft tissue defects, although effective, has significant limitations associated with an insufficient number of autologous soft tissue flaps suitable for reconstruction and the morbidity of the donor site. Morbidity of the donor site can be caused by injuries, multiple interventions, extensive resection.

Для решения проблем аутологичной трансплантации лоскутов мягких тканей существуют подходы регенеративной медицины и тканевой инженерии.To solve the problems of autologous transplantation of soft tissue flaps, approaches of regenerative medicine and tissue engineering exist.

К первой группе можно отнести способы замещения обширных дефектов мягких тканей с использованием композитных васкуализированных аллотрансплантатов, что является рутинной процедурой в современной клинической дерматопластике и реконструктивной хирургии (J.T. Shores, G. Brandacher, W.P. Lee, Hand and upper extremity transplantation: an update of outcomes in the worldwide experience, Plast. Reconstr. Surg. 135, 2015); так, например, известны более 100 случаев успешной аллотрансплантации мягких тканей с замещением дефектов в самых различных участках, в частности, в лицевой области (М. Kueckelhaus, S. Fischer, М. Seyda, Е.М. Bueno, М.А. Aycart, М. Alhefzi, A. ElKhal, В. Pomahac, S.G. Tullius, Vascularized composite allotransplantation: current standards and novel approaches to prevent acute rejection and chronic allograft deterioration, Transpl. Int. (2015)). Однако, нельзя не отметить, что выживание композитных аллотрансплантатов без развития реакции отторжения определяется характером иммунодепрессивной медикации, которая несет риск развития неоплазм, оппортунистических инфекций и конечной органной токсичности (М. Siemionow, Т. Ortak, D. Izycki, R. Oke, В. Cunningham, R. Prajapati, J.E. Zins, Induction of tolerance in composite-tissue allografts, Transplantation 74 (2002). Кроме того, в частном случае, получение функционального васкуализированного кожного аллотрансплантата с проводящей сосудистой ножкой крайне сложная задача с хирургической точки зрения, и не имеет практического применения в клинической практике.The first group includes methods for replacing extensive soft tissue defects using composite vascularized allografts, which is a routine procedure in modern clinical dermatoplasty and reconstructive surgery (JT Shores, G. Brandacher, WP Lee, Hand and upper extremity transplantation: an update of outcomes in the worldwide experience, Plast. Reconstr. Surg. 135, 2015); for example, more than 100 cases of successful allotransplantation of soft tissues with the replacement of defects in a variety of areas, in particular in the facial region (M. Kueckelhaus, S. Fischer, M. Seyda, E.M. Bueno, M.A. Aycart, are known , M. Alhefzi, A. ElKhal, B. Pomahac, SG Tullius, Vascularized composite allotransplantation: current standards and novel approaches to prevent acute rejection and chronic allograft deterioration, Transpl. Int. (2015)). However, it should be noted that the survival of composite allografts without the development of a rejection reaction is determined by the nature of immunosuppressive medication, which carries the risk of developing neoplasms, opportunistic infections and ultimate organ toxicity (M. Siemionow, T. Ortak, D. Izycki, R. Oke, B. Cunningham, R. Prajapati, JE Zins, Induction of tolerance in composite-tissue allografts, Transplantation 74 (2002) .In addition, in the particular case, obtaining a functional vascularized skin allograft with a conducting vascular pedicle is an extremely difficult task from a surgical point of view, and It has no practical application in clinical practice.

Ко второй группе условно можно отнести способы замещения обширных дефектов кожи/мягких тканей посредством бесклеточных матриксов синтетического/полусинтетического происхождения. Большинство из них - это коммерчески доступные запатентованные клинические изделия, либо одобренные Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (Food and Drug Administration - FDA), либо проходящие I или II фазу клинических испытаний. Так, например, GraftJacket® (продукт компании Wright Medical Technology), представляет собой донорский лоскут кожи, с которого удаляют эпидермис и клеточные компоненты, с сохранением коллагена, эластина, протеогликанов, который подвергают кросс - сшиванию и криоконсервируют (Turner, Badylak, 2015). Другим более известным продуктом является Integra™ - синтетический заменитель кожного лоскута состоящий из поперечно - сшитых волокон бычьего коллагена и хондроитина6 - сульфата с инкорпорированной силиконовой мембраной, одобренный FDA в апреле 2001 г. и предназначенный для лечения термических ожогов (L.E. Dickinson, Front Physiol. 2016; 7: 341.). Также одобренный FDA, Promogran™ - это коллаген - содержащее покрытие для ран, в композицию которого включены замороженный - высушенный коллаген (55%) и оксигенированная целлюлоза; отмечается, что данное изделие абсорбирует раневой экссудат с формированием биодеградируемого геля (https://www.accessdata.fda.gov/cdrh_docs/pdf6/k061060.pdf). Очевидно, что недостатком вышеприведенных биомедицинских изделий является их структура, которая обусловливает регенерацию главным образом поверхностных ран; кроме того, в частности для Integra общеизвестно, что силиконовая мембрана в составе матрикса отслаивается и таким образом потенциально может возникнуть необходимость в дополнительном покрытии для регенерации эпидермиса. В целом данный вид биомедицинских изделий предназначен для лечения косметических ран и дефектов, в случае обширного дефекта может быть применен лишь в конечной стадии лечения. Сложность в реализации данных биомедицинских изделий связана с риском наличия трансмиссивных вирусных заболеваний при использовании компонентов внеклеточного матрикса (ВКМ) животного происхождения в качестве исходных материалов, именно поэтому строгость их регуляции значительно выше по сравнению с матриксами, полученными способом децеллюляризации. В этом заключается одно из преимуществ метода децеллюляризации, который будет рассмотрен ниже.The second group can conditionally include methods for replacing extensive skin / soft tissue defects by means of cell-free matrices of synthetic / semisynthetic origin. Most of them are commercially available patented clinical products, either approved by the Food and Drug Administration (FDA) or undergoing Phase I or II clinical trials. For example, GraftJacket® (a product of Wright Medical Technology) is a donor skin flap from which the epidermis and cellular components are removed, with the preservation of collagen, elastin, proteoglycans, which are cross-linked and cryopreserved (Turner, Badylak, 2015) . Another better known product is Integra ™, a synthetic skin flap substitute consisting of cross-linked bovine collagen fibers and chondroitin 6 sulfate with an incorporated silicone membrane, approved by the FDA in April 2001 and used to treat thermal burns (LE Dickinson, Front Physiol. 2016. ; 7: 341.). Also approved by the FDA, Promogran ™ is a collagen-containing wound dressing that includes frozen-dried collagen (55%) and oxygenated cellulose; it is noted that this product absorbs wound exudate with the formation of a biodegradable gel (https://www.accessdata.fda.gov/cdrh_docs/pdf6/k061060.pdf). Obviously, the disadvantage of the above biomedical products is their structure, which determines the regeneration of mainly superficial wounds; in addition, in particular for Integra, it is well known that the silicone membrane in the matrix peels off and thus, an additional coating for the epidermis regeneration may potentially arise. In general, this type of biomedical products is intended for the treatment of cosmetic wounds and defects; in case of an extensive defect, it can be used only at the final stage of treatment. The difficulty in implementing these biomedical products is associated with the risk of the presence of vector-borne viral diseases when using components of the extracellular matrix (VKM) of animal origin as starting materials, which is why their regulation is much higher than the matrices obtained by the method of decellularization. This is one of the advantages of the method of decellularization, which will be discussed below.

К третьей группе также условно относится реконструкция дефектов мягких тканей посредством матриксов, полученных в результате детергентно-ферментативной децеллюляризации, т.е. процесса удаления ядерных элементов, цитозольных и мембранных белков с помощью комбинации осмотического лизиса, сочетания ионных/неионных детергентов (пермеабилизация мембран, денатурация белков, разрушение хроматина и ДНК), ферментативного расщепления (трипсин - EDTA, неспецифическая эндонуклеаза бензоаза, ДНКаза I из бычьей поджелудочной железы, папаин, и т.д.), также могут использоваться токсины, блокирующие отдельные фазы клеточного цикла (латрункулин В), циклов размораживания - замораживания и т.д.The third group also conditionally refers to the reconstruction of soft tissue defects by means of matrices obtained as a result of detergent-enzymatic decellularization, i.e. the process of removing nuclear elements, cytosolic and membrane proteins using a combination of osmotic lysis, a combination of ionic / nonionic detergents (permeabilization of membranes, protein denaturation, destruction of chromatin and DNA), enzymatic cleavage (trypsin - EDTA, non-specific endonuclease benzoase, DNase I from bovine pancreas , papain, etc.), toxins can also be used that block individual phases of the cell cycle (latrunculin B), defrost-freeze cycles, etc.

Одобренный FDA и уже зарекомендовавший в зарубежной клинической практике биомедицинский продукт DermACELL® (LifeNet Health, US Patent 6,743,574) является человеческим кожным аллотрансплантатом полученным по технологии MATRACELL®, оригинально разработанной для сердечно - сосудистых аллотрансплантатов.Approved by the FDA and already recommended in foreign clinical practice, the biomedical product DermACELL® (LifeNet Health, US Patent 6,743,574) is a human skin allograft obtained using MATRACELL® technology, originally developed for cardiovascular allografts.

Известен способ получения матрикса дермы человека по технологии MATRACELL®, использованный в статье M.A. Moore с соавт. «Decellularization of human dermis using non-denaturing anionic detergent and endonuclease: a review» (Cell Tissue Bank. 2015; 16(2): 249-259.) и заключающийся в том, что: 1) обрабатываемый кожный лоскут (дерма) выдерживается в растворе анионного детергента N - лауроил саркозината, (NLS), рекомбинантной неспецифичной нуклеазы бензоазы и в смеси антибиотиков (с добавлением полимиксина В, ванкомицина и линкомицина); 2) лоскут дермы тщательно отмывается от децелляризирующих агентов, что достигается за счет циркуляции промывочной жидкости через сорбент - анионобменник и второй гидрофобный сорбент, тем самым циркулирующий перфузат постоянно обновляется; 3) затем дермальный лоскут обрабатывается многоатомном спирте, вытесняющем воду, например, в глицерине (US Patents 6,293,970(2001); 6,544,289(2003); 6,569,200(2003); 7,063,726 (2006)), до конечной упаковки и 4) полученный бесклеточный матрикс дермы проходит терминальную стерилизацию при низкой температуре, облучение также проводят при низкой дозе гамма - излучения. Отмечается, что приведенная в данном способе терминальная стерилизация приводит к уровню стерильности равному 1×10^-6, что соответствует ожидаемому значению для биомедицинского изделия и инактивирует вирусы. Результаты гистологических исследований показали как полное отсутствие ядер клеток на всей глубине дермы, так и отсутствие МНС - I позитивных клеток. С использованием набора для определения содержания двухцепочечной ДНК Quant-iT™ PicoGreen® dsDNA было установлено, что редукция содержания ДНК в образце после децеллюляризации составила более 97%. Сила удерживания шва (сила, при которой шовный материал может разорвать образец) кожного матрикса полученного в данном способе была достоверно выше (около 130Н) чем у GraftJacket (кожный аллотрансплантат, обрабатываемый сшивающими агентами и криоконсервированный).A known method of producing a matrix of human dermis using MATRACELL® technology, used in the article by MA Moore et al. “Decellularization of human dermis using non-denominating anionic detergent and endonuclease: a review” (Cell Tissue Bank. 2015; 16 (2): 249-259.) And that: 1) the processed skin flap (dermis) is maintained in a solution of anionic detergent N - lauroyl sarcosinate, (NLS), recombinant nonspecific benzoase nuclease and in a mixture of antibiotics (with the addition of polymyxin B, vancomycin and lincomycin); 2) the dermis flap is thoroughly washed from the decellularizing agents, which is achieved due to the circulation of the washing fluid through the sorbent - anion exchanger and the second hydrophobic sorbent, thereby the circulating perfusate is constantly updated; 3) then the dermal flap is treated with polyhydric alcohol displacing water, for example, in glycerol (US Patents 6,293,970 (2001); 6,544,289 (2003); 6,569,200 (2003); 7,063,726 (2006)), until the final packaging and 4) the obtained cell-free dermal matrix undergoes terminal sterilization at low temperature, radiation is also carried out at a low dose of gamma radiation. It is noted that the terminal sterilization described in this method leads to a sterility level of 1 × 10 ^-6 , which corresponds to the expected value for a biomedical product and inactivates viruses. The results of histological studies showed both the complete absence of cell nuclei throughout the depth of the dermis, and the absence of MHC - I positive cells. Using the Quant-iT ™ PicoGreen® dsDNA double-stranded DNA kit, it was found that the reduction in DNA content in the sample after decellularization was more than 97%. The suture retention force (the force at which the suture can break the sample) of the skin matrix obtained in this method was significantly higher (about 130 N) than that of GraftJacket (a skin allograft treated with cross-linking agents and cryopreserved).

Таким образом, несомненными достоинствами данного способа являются: 1 Эффективное, минимизированное расходование реагентов; 2) соответствие получаемого матрикса основным критериям биосовместимости; 3) фактически полное удаление остаточного детергента за счет постоянного обновления промывочного раствора. К недостаткам данного метода относится в первую очередь то, что технология MATRACELL изначально разрабатывалась для сердечно-сосудистых аллографтов, т.е. для тонких тканей, поэтому применительно к лечению глубоких дефектов мягких тканей может дать неудовлетворительные результаты. В способе отсутствуют этапы экстракции полярных и неполярных липидов, дегидратации - регидратации. Не указывается в способе, какой тип низкотемпературной обработки предшествовал терминальной стерилизации матрикса (криоконсервация/гипотермическая консервация).Thus, the undoubted advantages of this method are: 1 Effective, minimized consumption of reagents; 2) compliance of the resulting matrix with the main biocompatibility criteria; 3) virtually complete removal of residual detergent due to the constant updating of the washing solution. The disadvantages of this method primarily include the fact that the MATRACELL technology was originally developed for cardiovascular allografts, i.e. for thin tissues, therefore, in relation to the treatment of deep soft tissue defects can give unsatisfactory results. In the method there are no stages of extraction of polar and nonpolar lipids, dehydration - rehydration. It is not indicated in the method what type of low-temperature treatment preceded the terminal sterilization of the matrix (cryopreservation / hypothermic preservation).

Известен также способ получения бесклеточного дермального матрикса, который заключается в том, что дерму толщиной 0,2-0,3 мм помещают в 30%-ный раствор карбамида с добавлением хлористого кальция до концентрации 0,5%. Соотношение объемов дермы и раствора карбамида от 1:3. Дерму в растворе карбамида выдерживают 24 часа при +4°С. После этого дермальный матрикс переносят в 20%-ный раствор карбамида и выдерживают в нем 1 час при комнатной температуре при периодическом встряхивании. Полученный бесклеточный дермальный матрикс может быть сразу использован для пересадки или помещен на консервацию с помощью любого метода, применяемого для сохранения кожи для последующей пересадки (Денисов В.М. (RU), Анфимов П.Е. (RU), Ряскова Е.А. ГУ "Нижегородский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии", №2240809).There is also a method of producing a cell-free dermal matrix, which consists in the fact that the dermis with a thickness of 0.2-0.3 mm is placed in a 30% urea solution with the addition of calcium chloride to a concentration of 0.5%. The ratio of the volumes of the dermis and the urea solution is from 1: 3. The dermis in the urea solution can withstand 24 hours at + 4 ° C. After that, the dermal matrix is transferred into a 20% urea solution and incubated for 1 hour at room temperature with periodic shaking. The obtained cell-free dermal matrix can be immediately used for transplantation or placed on preservation using any method used to preserve the skin for subsequent transplantation (Denisov V.M. (RU), Anfimov P.E. (RU), Ryaskova EA State Institution "Nizhny Novgorod Research Institute of Traumatology and Orthopedics", No. 2240809).

К недостаткам способа относится потенциально высокая цитотоксичность, поскольку дерма не отмывалась от карбамида, кроме того в способе не приведен анализ качества полученного матрикса; кроме того, используемая толщина матрикса (200-300 мкм) позволяет использовать его лишь для устранения косметических дефектов на конечной стадии регенерации трансплантированного лоскута. К преимуществам способа можно отнести его простоту.The disadvantages of the method include a potentially high cytotoxicity, since the dermis was not washed from urea, in addition, the method does not provide an analysis of the quality of the obtained matrix; in addition, the used matrix thickness (200-300 microns) allows it to be used only to eliminate cosmetic defects at the final stage of transplanted flap regeneration. The advantages of the method include its simplicity.

Известен многоэтапный способ изготовления дермального матрикса, позволяющий добиться отслоения эпидермиса (Хубутия М.Ш. (RU), Андреев Ю.В. (RU), Боровкова Н.В. (RU). «Способ изготовления дермального матрикса», и др. ГБУЗ НИИ скорой помощи им. Н.В. Склифосовского. Патент РФ №2524619) и состоящий из следующих этапов:Known multi-stage method for the manufacture of dermal matrix, allowing to achieve exfoliation of the epidermis (Khubutia M.Sh. (RU), Andreev Yu.V. (RU), Borovkova N.V. (RU). "Method for the manufacture of dermal matrix", and other GBUZ Research Institute of Emergency Care named after N.V. Sklifosovsky, RF Patent No. 2524619) and consisting of the following steps:

(1) Забор кожи человека, посредством использования дерматома, от донора-трупа, толщиной до 1 мм. Операцию по забору кожи проводят в операционной дерматомом по стандартной методике с соблюдением правил асептики и антисептики;(1) The collection of human skin, through the use of a dermatome, from a corpse donor, up to 1 mm thick. The skin sampling operation is carried out in the operating dermatome according to the standard procedure in compliance with aseptic and antiseptic rules;

(2) Сразу после заготовки биологический материал помещают в стерильную емкость, содержащую водный раствор антибиотика широкого спектра действия. С сохранением стерильности емкость герметично закрывают. Биоматериал хранят при -40°С до получения результатов патологоанатомического исследования донора, исследования биологической безопасности тканей донора.(2) Immediately after harvesting, the biological material is placed in a sterile container containing an aqueous solution of a broad-spectrum antibiotic. While maintaining sterility, the container is hermetically sealed. The biomaterial is stored at -40 ° C until the results of the pathological study of the donor, the study of the biological safety of donor tissues.

(3) Лоскут кожи, с сохранением стерильности, упаковывают в индивидуальный стерильный пакет для криоконсервирования объемом 500 или 1000 мл. Объем криопакета выбирается в зависимости от размера биоматериала. Криопакет запаивают и ваакуумизируют.(3) The skin flap, while maintaining sterility, is packaged in an individual sterile cryopreservation bag with a volume of 500 or 1000 ml. The volume of the cryopackage is selected depending on the size of the biomaterial. Cryopack sealed and vacuumized.

(4) Кожу замораживают до -96°С в течение 15 минут, размораживают до +37°С в течение 5 минут. Цикл замораживания-размораживания повторяют троекратно.(4) The skin is frozen to -96 ° C for 15 minutes, thawed to + 37 ° C for 5 minutes. The freeze-thaw cycle is repeated three times.

(5) В криопакет объемом 500 мл вносят 250 мл и объемом 1000 мл вносят 400 мл стерильного 1,8 М раствора NaCl и помещают при комнатной температуре на орбитальный перемешиватель со скоростью вращения 250 об/мин до отделения эпидермиса. Контроль проводят каждые 2 часа.(5) 250 ml is added to a 500 ml cryopack and 400 ml of a sterile 1.8 M NaCl solution is added to a 1000 ml volume and placed at room temperature on an orbital stirrer at a speed of 250 rpm until the epidermis is separated. Monitoring is carried out every 2 hours.

(6) После отслоения эпидермиса дерму с сохранением стерильности перемещают в стерильную емкость объемом 400 мл (не более 2 лоскутов в одну емкость). Емкость стерильно и герметично закрывают.(6) After exfoliation of the epidermis, the dermis, while maintaining sterility, is transferred to a sterile container with a volume of 400 ml (no more than 2 flaps in one container). The container is sterile and hermetically sealed.

(7) В емкость с дермой вносят 250-300 мл 0,2% раствора SDS. Емкость стерильно и герметично закрывают, помещают при комнатной температуре на орбитальный перемешиватель со скоростью вращения 250 об/мин в 1 час. В завершении этапа децеллюляризации раствор SDS удаляют из емкости.(7) 250-300 ml of 0.2% SDS solution are added to the derma container. The container is sterile and hermetically sealed, placed at room temperature on an orbital stirrer with a rotation speed of 250 rpm for 1 hour. At the end of the decellularization step, the SDS solution is removed from the vessel.

(8) В емкость с биоматериалом с сохранением стерильности вносят 250 мл стерильного физиологического раствора и помещают при комнатной температуре на орбитальный перемешиватель со скоростью вращения 250 об/мин. Каждые 10 минут проводят смену раствора в полном объеме в течение 1 часа.(8) In a container with biomaterial with preservation of sterility, 250 ml of sterile physiological saline is added and placed at room temperature on an orbital stirrer with a rotation speed of 250 rpm. Every 10 minutes, the solution is completely changed for 1 hour.

(9) После 6 смены раствора емкость с биоматериалом заполняют стерильным физиологическим раствором и помещают при комнатной температуре на орбитальный перемешиватель со скоростью вращения 220 об/мин раствором на 12 часов(9) After 6 solution changes, the container with biomaterial is filled with sterile physiological saline and placed at room temperature on an orbital stirrer with a rotational speed of 220 rpm with a solution for 12 hours

(10) Из готовой партии ДМ берут, для проведения контроля качества, 3 образца размером 1*1 см и 1 образец длиной не менее 6 см и шириной не менее 1 см. Контроль проводят по следующим параметрам: технический, бактериологический, морфологический, биосовместимость.(10) For the quality control, 3 samples are taken from the finished batch of DM for the size of 1 * 1 cm and 1 sample at least 6 cm long and at least 1 cm wide. The control is carried out according to the following parameters: technical, bacteriological, morphological, biocompatibility.

(11) Дермальный матрикс, с сохранением стерильности, упаковывают в индивидуальный стерильный криопакет объемом 500 или 1000 мл. Криопакет выбирается в зависимости от размера матрикса. Криопакет запаивают и ваакуумизируют, маркируют и указывают: код донора-трупа, дату изготовления, срок годности, геометрические размеры, заключение о результатах контроля качества дермального матрикса. Упакованные дермальные матриксы хранят при температуре -80°С° в течение срока годности (1 год).(11) The dermal matrix, while maintaining sterility, is packaged in an individual sterile cryopackage with a volume of 500 or 1000 ml. Cryopackage is selected depending on the size of the matrix. The cryopackage is sealed and vacuumized, labeled and indicated: donor-corpse code, manufacturing date, expiration date, geometric dimensions, conclusion on the results of quality control of the dermal matrix. Packed dermal matrices are stored at a temperature of -80 ° C ° for an expiration date (1 year).

К недостаткам данного способа можно отнести то обстоятельство, что при циклическом замораживании - размораживании авторы помещают дерму в криопакет, при этом замораживание происходит в отсутствии криопротекторов. Использование внутриклеточных криопротекторов для децеллюляризации не является обязательным, однако, в отсутствии экстрацеллюлярных криопротекторов из-за формирования внеклеточных кристаллов льда происходит не только гибель клеток, но и разрушение внеклеточного матрикса, его разволокнение вплоть до удаления отдельных слоев, гомогенизация. Кроме того, для участка дермы толщиной до 1 мм упоминаемые в способе объемы растворов избыточны. Данный способ теоретически можно применить для децеллюляризации композитного кожного лоскута, изъятого с комплексом прилегающих тканей: жировой ткани, прилегающих сосудов, мыщц и нервов, однако он будет недостаточно эффективен, поскольку этапы экстракции, расщепления жира и последовательной регидратации - дегидртации отсутствуют. К достоинствам данного способа следует отнести то, что он позволяет добиться отслаивания в случае обработки композитных, сложных тканей, но применительно к тонким тканям может вызвать повреждения и гомогенизацию волокон внеклеточного матрикса. Кроме того, в способе хорошо проработаны процедуры маркировки и контроля кожного лоскута.The disadvantages of this method include the fact that during cyclic freezing and thawing, the authors place the dermis in a cryopackage, while freezing occurs in the absence of cryoprotectants. The use of intracellular cryoprotectants for decellularization is not necessary, however, in the absence of extracellular cryoprotectants due to the formation of extracellular ice crystals, not only cell death occurs, but also the destruction of the extracellular matrix, its decomposition up to the removal of individual layers, homogenization. In addition, for a section of the dermis up to 1 mm thick, the solution volumes mentioned in the method are redundant. This method can theoretically be used to decellularize a composite skin flap removed with a complex of adjacent tissues: adipose tissue, adjacent vessels, muscles and nerves, however, it will not be effective enough, since there are no stages of extraction, splitting of fat and sequential rehydration - dehydration. The advantages of this method include the fact that it allows peeling in the case of processing composite, complex tissues, but with respect to thin tissues it can cause damage and homogenization of extracellular matrix fibers. In addition, the method has well-developed procedures for marking and monitoring the skin flap.

К четвертой группе методов реконструкции обширных дефектов можно отнести применение для этой цели децеллюляризированных дермальных матриксов, заселенных аутологичными кератиноцитами/фибробластами или аллогенными мезенхимальных стромальных клеток. Примером коммерческой реализации биомедицинских клеточных продуктов подобного типа может являться Apligraf® - матрикс из коллагена I типа, заселенный человеческими неонатальными фибробластами и кератиноцитами. Отмечается что, несмотря на то, что фибробласты и кератиноциты в составе Apligraf утрачивают жизнеспособность после 6 недель при трансплантации (Hu et al., 2006), тем не менее они крайне важны для стимуляции пролиферации и дифференцировки вследствие секреции ими ростовых факторов (Falanga et al., 2002). Apligraf был первым аллогенным биомедицинским клеточным продуктом, одобренным FDA в 1998 году и разрешенным для лечения венозных трофических язв.The fourth group of methods for reconstructing extensive defects includes the use of decellularized dermal matrices populated by autologous keratinocytes / fibroblasts or allogeneic mesenchymal stromal cells for this purpose. An example of the commercialization of biomedical cell products of this type can be Apligraf® - a matrix of type I collagen populated by human neonatal fibroblasts and keratinocytes. It is noted that, despite the fact that the fibroblasts and keratinocytes in Apligraf lose their viability after 6 weeks during transplantation (Hu et al., 2006), they are nevertheless extremely important for stimulating proliferation and differentiation due to their secretion of growth factors (Falanga et al ., 2002). Apligraf was the first allogeneic biomedical cell product approved by the FDA in 1998 and approved for the treatment of venous trophic ulcers.

Известен способ получения комбинированного трансплантата дермального матрикса (патент на изобретение №2526813. Хубутия М.Ш., Боровкова Н.В. (RU), Филиппов О.П. (RU) и др. Комбинированный трансплантат дермального матрикса с мезенхимальными мультипотентными стромальными клетками, способ его получения и способ лечения ран с его использованием. ГБУЗ НИИ скорой помощи имени Н.В. Склифосовского, 2014.) Этот способ состоит из трех этапов, каждый из которых заключается в следующем:A known method of producing a combined transplant of a dermal matrix (patent for the invention No. 2526813. Khubutia M.Sh., Borovkova N.V. (RU), Filippov O.P. (RU) and others. A combined transplant of a dermal matrix with mesenchymal multipotent stromal cells, Method for its preparation and method for treating wounds with its use GBUZ Research Institute of Emergency Medicine named after N.V. Sklifosovsky, 2014.) This method consists of three stages, each of which consists of the following:

- (1) получение дермального матрикса, который изготавливают из расщепленной кожи человека, заготовленной от донора-трупа, толщиной до 1 мм. Забор кожного лоскута производится в операционной при помощи дискового дерматома с соблюдением правил асептики и антисептики.- (1) obtaining a dermal matrix, which is made from split human skin, prepared from a corpse donor, up to 1 mm thick. A skin flap is taken in the operating room using a disk dermatome in compliance with aseptic and antiseptic rules.

Изготовление дермального матрикса (ДМ) разделено на 3 этапа: разделение дермы и эпидермиса, девитализация дермы, обеспечение биосовместимости матрикса.The manufacture of the dermal matrix (DM) is divided into 3 stages: the separation of the dermis and epidermis, dermalization of the dermis, ensuring the biocompatibility of the matrix.

- (2) получение аутологичных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга.- (2) obtaining autologous mesenchymal stromal bone marrow cells.

У пациента под местной анестезией или наркозом в условиях операционной с соблюдением правил асептики и антисептики из крыла подвздошной кости забирают костный мозг объемом 20-40 мл. На градиенте плотности Лимфолит р=1.077 выделяют ядросодержащие клетки. Клетки помещают в культуральные флаконы для получения пластикадгезивных клеток. Прикрепившиеся к пластику клетки культивируют 3-4 пассажа в среде ДМЕМ с добавлением 10% бычьей фетальной сыворотки, для получения культуры мезенхимальных стромальных клеток. После третьего пассажа в суспензии ММСК определяют фенотип и количество поврежденных клеток. Клеточный материал пригоден для изготовления комбинированного трансплантата в том случае, если он биобезопасен, содержит 80-95% неповрежденных клеток и более 80% клеток с фенотипом CD105⁺CD90⁺CD45^-CD34^-. При подтверждении культуры принадлежности к мезенхимальным стромальным клеткам, из нее готовят суспензию в культуральной среде ДМЕМ, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки с концентрацией клеток не менее 1 млн/мл. Для применения используют 1 млн мезенхимальных стромальных клеток на 5 см² ДМ.Bone marrow volume of 20-40 ml is taken from a patient under local anesthesia or anesthesia in the operating room in compliance with aseptic and antiseptic rules of the ilium wing. On the density gradient Lympholite p = 1.077, nucleated cells are isolated. Cells are placed in culture bottles to obtain plastic adhesive cells. Cells attached to the plastic are cultured 3-4 passages in DMEM medium with the addition of 10% bovine fetal serum to obtain a culture of mesenchymal stromal cells. After the third passage in the MMSC suspension, the phenotype and the number of damaged cells are determined. Cellular material is suitable for the manufacture of a combined graft if it is biosafety, contains 80-95% of intact cells and more than 80% of cells with the phenotype CD105 ⁺ CD90 ⁺ CD45 ^- CD34 ^- . When confirming the culture of belonging to mesenchymal stromal cells, a suspension is prepared from it in a DMEM culture medium containing 10% fetal bovine serum with a cell concentration of at least 1 million / ml. For use, 1 million mesenchymal stromal cells per 5 cm ² DM are used.

- (3) создание комбинированного трансплантата ДМ с мезенхимальных стромальных клеток.- (3) creation of a combined DM transplant with mesenchymal stromal cells.

В условиях культурального блока с обеспечением стерильности трансплантат ДМ площадью 25-30 см² помещают в стерильную чашку Петри, соответствующего размера. В чашку Петри на ДМ пипеткой наносят суспензию мезенхимальных стромальных клеток в концентрации 1 млн/мл, из расчета 1 млн мезенхимальных стромальных клеток на 5 см² ДМ (например, 5 мл суспензии, содержащей не менее 5-6 млн мезенхимальных стромальных клеток). Для колонизации ДМ мезенхимальных стромальных клеток трансплантат помещают в CO2-инкубатор при температуре 37°С и 5% концентрации CO2 в воздухе на 24 часа. Клеточный компонент оценивают витальным окрашиванием флуоресцентным красителем. С сохранением стерильности на пипеткой наносят стерильный флуоресцентный краситель, окрашивающий живые клетки без их повреждения. С помощью флуоресцентного микроскопа подсчитывают количество прикрепившихся клеток, содержащий на своей поверхности 750-1500 тыс. клеток на 1 см².Under the conditions of the culture block, ensuring sterility, the DM transplant with an area of 25-30 cm ^{2 is} placed in a sterile Petri dish of the appropriate size. A suspension of mesenchymal stromal cells at a concentration of 1 million / ml is applied to a Petri dish on a DM with a pipette, based on 1 million mesenchymal stromal cells per 5 cm ² DM (for example, 5 ml of a suspension containing at least 5-6 million mesenchymal stromal cells). To colonize DM mesenchymal stromal cells, the graft is placed in a CO2 incubator at a temperature of 37 ° C and 5% concentration of CO2 in air for 24 hours. The cellular component is evaluated by vital staining with a fluorescent dye. While maintaining sterility, a sterile fluorescent dye is applied to the pipette to stain living cells without damaging them. Using a fluorescence microscope, the number of adherent cells is counted, containing 750-1500 thousand cells per cm ² on its surface.

К преимуществам данного способа следует отнести то, что в результате получается комбинированный кожный трансплантат, состоящий из аутологичного/аллогенного дермального матрикса и аутологичных мезенхимальных стромальных клеток, который при имплантации потенциально будет способствовать усиленной васкуляризации и регенерации раны ввиду секреции мезенхимальных стромальных клеток ростовых факторов и цитокинов, в частности, IL-1β и IL-6 в то время как в результате децеллюляризации ростовые факторы не сохраняются. Альтернативная технология, при которой в результате двухфазного электроспининга смешиваются растворы биоразлагаемого полимера с ростовым фактором, также позволяет получить комбинированный трансплантат, однако ее доступность сильно ограничена и сам метод требует тщательного моделирования. Кроме того, к недостаткам данного способа можно отнести необходимость точного расчета площади матрикса, что не всегда представляется возможным, особенно в том случае если изымается участок дермы вместе с жировой клетчаткой. Следует также обратить внимание на то, что культивирование матрикса толщиной до 1 мм с целью колонизации в данном способе проводится всего 24 часа, что связано с тем, что культивирование проходит на двумерной поверхности, и в этих условиях насыщение объемного матрикса культуральной средой было бы ограничено его поверхностью, но не срединной частью. Именно поэтому при заселении матриксов с низким отношением поверхность/объем такой способ не используется.The advantages of this method include the fact that the result is a combined skin graft consisting of an autologous / allogeneic dermal matrix and autologous mesenchymal stromal cells, which, when implanted, will potentially contribute to enhanced vascularization and wound regeneration due to the secretion of mesenchymal stromal cells of growth factors and cytokines, in particular, IL-1β and IL-6 while growth factors are not retained as a result of decellularization. An alternative technology, in which biodegradable polymer solutions with a growth factor are mixed as a result of two-phase electrospinning, also makes it possible to obtain a combined transplant, however, its availability is very limited and the method itself requires careful modeling. In addition, the disadvantages of this method include the need for accurate calculation of the area of the matrix, which is not always possible, especially if the dermis is removed along with fatty tissue. It should also be noted that the cultivation of a matrix up to 1 mm thick for the purpose of colonization in this method takes only 24 hours, due to the fact that the cultivation takes place on a two-dimensional surface, and under these conditions, the saturation of the bulk matrix with the culture medium would be limited to surface, but not the middle part. That is why when populating matrices with a low surface / volume ratio, this method is not used.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому способу является способ получения получения бесклеточного матрикса дермы, описанный в статье Q. Zhang с соавт. «Decellularized skin/adipose tissue flap matrix for engineering vascularized composite soft tissue flaps» (Acta Biomaterialia Vol. 35, 2016, 166-184). Отличительные особенности способа - это: (1) использование перфузионной системы, представленной цифровым приводом - дозатором Masterflex L/S (Cole-Parmer, Vernon Hills, IL), (2) для создания децеллюляризированного матрикса изымали участки кожи крыс Fischer 344 возрастом от 8 до 10 недель, площадью 2*4 см² из паховой области, вместе с прилежащей подкожной клетчаткой, нервами и проводящими сосудами - так, были выделены сообщающиеся с изъятым лоскутом наджелудочная и бедренная артерии, бедренный нерв, а также бедренная вена. Каннюлировали именно бедренную артерию ввиду ее большей доступности; каннюляцию проводили использованием периферического катетера 24G и затем орошали лоскут физиологическим раствором до полного отмывания от резидуальной крови; (3) для проведения детергентно-ферментативной децеллюляризации использовали многоэтапный лизис полярных и неполярных липидов, а также последовательную серию дегидратации - регидратации ткани:Closest to the technical nature of the proposed method is a method of obtaining cell-free matrix of the dermis, described in the article Q. Zhang et al. “Decellularized skin / adipose tissue flap matrix for engineering vascularized composite soft tissue flaps” (Acta Biomaterialia Vol. 35, 2016, 166-184). Distinctive features of the method are: (1) the use of a perfusion system represented by a digital drive - a Masterflex L / S dispenser (Cole-Parmer, Vernon Hills, IL), (2) skin sections of Fischer 344 rats aged 8 to 8 were removed to create a decellularized matrix 10 weeks, with an area of 2 * 4 cm ² from the inguinal region, together with the adjacent subcutaneous tissue, nerves and conducting vessels - so, the pancreas and femoral arteries, the femoral nerve, and the femoral vein communicating with the removed flap were isolated. The femoral artery was cannulated because of its greater accessibility; cannulation was performed using a 24G peripheral catheter and then the flap was irrigated with saline until complete washing off of the residual blood; (3) for detergent-enzymatic decellularization, multistep lysis of polar and nonpolar lipids was used, as well as a sequential series of dehydration - tissue rehydration:

- Кожные лоскуты замораживали при -80°С и размораживали при комнатной температуре 3 раза. Во всех лоскутах катетеризировали бедренную артерию, после чего с помощью перистальтических трубок и люэр-коннекторов катетер соединяли с цифровым приводом - дозатором MasterFlex L/S и перфузировали кожный лоскут в течение 24 часов стерильной водой со скоростью 2 мл/мин.- Skin flaps were frozen at -80 ° C and thawed at room temperature 3 times. In all flaps, the femoral artery was catheterized, after which, using peristaltic tubes and luer connectors, the catheter was connected to a digital drive - the MasterFlex L / S dispenser and the skin flap was perfused for 24 hours with sterile water at a rate of 2 ml / min.

- Затем лоскуты перфузировали гипертоническими растворами с возрастающими концентрациями NaCl - 0,5 М в течение 4 часов и 1 М в течение 4 часов, с двукратной заменой раствора. Гипертонический раствор используется практически в любом протоколе децеллюляризации кожного лоскута, поскольку именно в условиях слущивания мембран клеток происходит отделение эпидермиса от собственно дермы.- Then the flaps were perfused with hypertonic solutions with increasing concentrations of NaCl - 0.5 M for 4 hours and 1 M for 4 hours, with a double change of solution. Hypertonic solution is used in almost any protocol for the decellularization of the skin flap, since it is in the conditions of desquamation of cell membranes that the epidermis separates from the dermis itself.

- Лоскуты обрабатывали 0,25% р-ром трипсина - EDTA в течение 2 часов при 37°С, и после остановки лизиса, отмывали от остаточного трипсина дистиллированной водой в течение 1 часа;- The flaps were treated with 0.25% trypsin r-rum - EDTA for 2 hours at 37 ° C, and after stopping the lysis, they were washed from the residual trypsin with distilled water for 1 hour;

- Матриксы выдерживался в 100% изопропаноле в течение ночи при непрерывном встряхивании;- Matrixes were aged in 100% isopropanol overnight with continuous shaking;

- Затем лоскуты перфузировали 1% Triton X100 в течение 2 дней, с заменой раствора на свежий на каждые сутки, промывали в стерильной воде на протяжении двух дней (3 замены в день) и в PBS в течение 24 часов, все этапы промывания проводились с включенным приводом - дозатором.- Then the flaps were perfused with 1% Triton X100 for 2 days, replacing the solution with fresh one for every day, washed in sterile water for two days (3 replacements per day) and in PBS for 24 hours, all washing steps were carried out with drive - dispenser.

- Полученные децеллюляризиованные матриксы дермы с подкожной клетчаткой и проводящими сосудами стерилизовали в 70% этаноле и еще раз промывали в PBS. Хранили матриксы при +4°С в PBS с добавлением 1% пенициллина - стрептомицина.- The obtained decellularized dermal matrices with subcutaneous tissue and conducting vessels were sterilized in 70% ethanol and washed again in PBS. Matrices were stored at + 4 ° C in PBS with the addition of 1% penicillin - streptomycin.

Впоследствии от полученных децеллюляризированных матриксов изымались срезы, которые после заливки в парафин обрабатывались с целью проведения гистологического и иммунногистохимического анализов. Препараты окрашивали гематоксилином - эозином, трихромом по Массону и 4,6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI). Готовые блоки окрашивали с использованием первичных антител на фактор рост эндотелия сосудов (VEGF), основного фактора роста фибробластов (bFGF), MHC-I и ламинина. Удаление клеток также подтверждали определением остаточного содержания ДНК в супернатантах срезов, расщепленных папаином при 60°С. Отмечается, что наблюдалась достоверное снижение количества остаточной ДНК в децеллюляризированной ткани, нормализованное на исходный сухой вес, по сравнению с нативными срезами - до 40 μg/mg в срезе децеллюляризированной дермы и около 50 μg/mg в жировой клетчатке. На изображениях, полученных с помощью SEM, было заметно отсутствие ядер как на срезах со стороны дермы, так и жирового депо, и была выражена трехмерная пористая структура матрикса (пористость составила 83,6±7,8%). Кроме того, наноразмерные волокна ВКМ хорошо сохранились после децеллюляризации, размер волокон - 302,3±90,4 нм).Subsequently, sections were removed from the obtained decellularized matrices, which, after pouring into paraffin, were processed in order to conduct histological and immunohistochemical analyzes. The preparations were stained with hematoxylin - eosin, Masson trichrome and 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Finished blocks were stained using primary antibodies for vascular endothelial growth factor (VEGF), basic fibroblast growth factor (bFGF), MHC-I and laminin. Cell deletion was also confirmed by determining the residual DNA content in the supernatants of the sections digested with papain at 60 ° C. It is noted that there was a significant decrease in the amount of residual DNA in the decellularized tissue, normalized to the initial dry weight, compared to native sections - up to 40 μg / mg in the section of the decellularized dermis and about 50 μg / mg in the fatty tissue. In the images obtained using SEM, there was a noticeable absence of nuclei both on sections from the dermis and the fat depot, and a three-dimensional porous matrix structure was expressed (porosity was 83.6 ± 7.8%). In addition, nanoscale fibers of VKM are well preserved after decellularization, the fiber size is 302.3 ± 90.4 nm).

На изображениях, полученных с помощью конфокальной микроскопии было заметно отсутствие ядер мертвых клеток после 1 и 7 дней культивирования человеческих стволовых клеток из стромально-сосудистой фракции (hADSCs) и эндотелиоцитов вены пупочного канатика (HUVECs) с плотностью посева 2,5*10⁴/см² (матрикс засевали следующим образом: в 200 μl среды суспендированные 2*10⁵ HUVECs в артерию и венозную сосудистую ножку, а суспензию 1*10⁶ hADSCs и 2*10⁵ HUVECs в 1 мл среды инъецировали в 10 точек матрикса, 3 из которых находились в дерме, а 7 = в жировом депо) при двойном окрашивании витальным красителем кальцеином AM и гомодимером этидия -1.Confocal microscopy images showed the absence of dead cell nuclei after 1 and 7 days of culturing human stem cells from the stromal vascular fraction (hADSCs) and umbilical cord vein endotheliocytes (HUVECs) with a density of 2.5 * 10 ⁴ / cm ² (the matrix was seeded as follows: in 2 μl media suspended 2 * 10 ⁵ HUVECs in the artery and venous vascular pedicle, and a suspension of 1 * 10 ⁶ hADSCs and 2 * 10 ⁵ HUVECs in 1 ml of medium were injected into 10 points of the matrix, 3 of which were in the dermis, and 7 = in the fat depot) with double staining ii vital dye calcein AM and ethidium homodimer-1.

К недостаткам данного способа можно отнести длительность самого процесса децеллюляризации и необходимость многократной смены растворов, невозможность экстраполяции способа в клиническую практику ввиду трудоемкости или невозможности изъятия участка дермы с сосудистой ножкой у человека.The disadvantages of this method include the duration of the process of decellularization and the need for multiple changes of solutions, the inability to extrapolate the method into clinical practice due to the complexity or impossibility of removing a portion of the dermis with a vascular pedicle in humans.

Техническим результатом предлагаемого нами способа получения бесклеточного матрикса дермы человека является получение стерильного матрикса с сохранной структурой ВКМ, ядра в котором гистологически не обнаруживаются, имеющего в составе гликозаминогликаны, коллаген, характеризующегося отсутствием экспрессии МНС - 1 на поверхности, пригодного для ксенотрансплантации с целью дальнейшей реконструкции обширных дефектов мягких тканей. Полученный с помощью предложенного нами способа, но животного происхождения матрикс возможного использования для дальнейших этапов тканевой и клеточной инженерии, в частности, для заселения аутологичными фибробластами и кератиноцитами или аллогенными МСК из СВФ, для нанесения дополнительных адгезионных и стабилизирующих покрытий и/или модификации биоразлагаемыми полимерами (поскольку биомеханические свойства матрикса могут быть значительно изменены по сравнению с нативной дермой), а также для криоконсервации и терминальной стерилизации.The technical result of our proposed method for producing a cell-free matrix of the human dermis is to obtain a sterile matrix with a preserved VKM structure, the nuclei in which are not histologically detected, containing glycosaminoglycans, collagen, characterized by the absence of MHC-1 expression on the surface, suitable for xenograft with the aim of further reconstruction of extensive soft tissue defects. The matrix obtained using our proposed method, but of animal origin, can be used for further stages of tissue and cell engineering, in particular, for colonization with autologous fibroblasts and keratinocytes or allogeneic MSCs from SVF, for the application of additional adhesive and stabilizing coatings and / or modifications with biodegradable polymers ( since the biomechanical properties of the matrix can be significantly changed compared to native dermis), as well as for cryopreservation and terminal steril isations.

Указанный технический результат достигается тем, что используют перфузионный модуль, интегрируемый в биореактор EBERS ТЕВ 500, собранный из двух резервуаров различного объема, соединенных между собой с помощью трубок и люэр-фиттингов, при этом лоскут, помещенный в перфузионный модуль, предварительно три раза замороженный - размороженный в 70% изопропиловом спирте с добавлением 3% поливинилпирролидона (PVP), обрабатывают следующим образом:The indicated technical result is achieved by using a perfusion module integrated into the EBERS TEB 500 bioreactor, assembled from two tanks of different volumes, interconnected by tubes and luer fittings, while the flap placed in the perfusion module is frozen three times beforehand - thawed in 70% isopropyl alcohol with the addition of 3% polyvinylpyrrolidone (PVP), treated as follows:

(1) отмывают путем перфузии лоскута 250 мл PBS с добавлением антибиотиков - 0,25% стрептомицина сульфата, 0,25% амикацина сульфата и 0,25% цефтазидима, в течение суток;(1) washed by perfusion of the flap with 250 ml of PBS with the addition of antibiotics - 0.25% streptomycin sulfate, 0.25% amikacin sulfate and 0.25% ceftazidime during the day;

(2) затем кожный лоскут помещают в емкость, заполненную 250 мл 0,5 М NaCl, и встряхивают на шейкере при комнатной температуре со скоростью 500-600 об/мин в течение 2 часов с целью отделения эпидермиса, заменяют раствор на свежий и снова встряхивают в течение 2 часов;(2) then the skin flap is placed in a container filled with 250 ml of 0.5 M NaCl and shaken on a shaker at room temperature at a speed of 500-600 rpm for 2 hours in order to separate the epidermis, replace the solution with a fresh one and shake again within 2 hours;

(3) встряхивают при комнатной температуре со скоростью 500-600 об/мин в 250 мл 1 М NaCl в течение 2 часов, заменяют раствор на свежий и снова встряхивают в течение 2 часов;(3) shake at room temperature at a speed of 500-600 rpm in 250 ml of 1 M NaCl for 2 hours, replace the solution with fresh and shake again for 2 hours;

(4) встряхивают при комнатной температуре со скоростью 500-600 об/мин в 250 мл стерильной очищенной воды в течение 2 часов, заменяют раствор на свежий и снова встряхивают в течение 2 часов;(4) shake at room temperature at a speed of 500-600 rpm in 250 ml of sterile purified water for 2 hours, replace the solution with fresh and shake again for 2 hours;

(5) далее помещают кожный лоскут в емкость с 50 мл 0,25% трипсином - ЭДТА, платформенный шекер размещают в рабочем пространстве биореактора EBERS ТЕВ 500 или инкубатора, имеющего в своей стенке резьбовой порт для дополнительных соединений, и встряхивают при 370С со скоростью 500-600 об/мин в течение 2 часов;(5) then the skin flap is placed in a container with 50 ml of 0.25% trypsin - EDTA, the platform sheker is placed in the working space of the EBERS TEB 500 bioreactor or incubator, which has a threaded port for additional connections in its wall, and is shaken at 370С at a speed of 500 -600 rpm for 2 hours;

(6) затем лоскут помещают в емкость 250 мл очищенной стерильной водой и встряхивают при комнатной температуре со скоростью 500-600 об/мин в течение часа;(6) then the flap is placed in a container of 250 ml of purified sterile water and shaken at room temperature at a speed of 500-600 rpm for an hour;

(7) далее заменяют стерильную воду на 100% изопропиловый спирт и встряхивают при комнатной температуре со скоростью 500-600 об/мин;(7) then replace sterile water with 100% isopropyl alcohol and shake at room temperature at a speed of 500-600 rpm;

(8) затем помещают фиксированный лоскут в перфузионный модуль и проводят перфузию 250 мл свежего профильтрованного раствора 1% 4-(1,1,3,3-тетраметилбутил)фенил-полиэтиленгликоля (коммерческое название - TritonX100) и 0,8% деоксихолата натрия (NaDOC) в течение 45 часов, при этом по истечению 24 часов раствор заменяют на свежий и с целью отмывания от детергентов перфузионный модуль не разбирают, а наливают в осушенный резервуар для перфузата 200-250 мл стерильной воды с добавлением 0,3% азида натрия и 1% ампипиллина натрия, перфузию проводят в течение 48 часов с тремя заменами в течение каждых суток;(8) then place the fixed flap in the perfusion module and perfuse 250 ml of the fresh filtered solution of 1% 4- (1,1,3,3-tetramethylbutyl) phenyl-polyethylene glycol (commercial name - TritonX100) and 0.8% sodium deoxycholate ( NaDOC) within 45 hours, at the end of 24 hours the solution is replaced with a fresh one and, in order to wash detergents from the detergents, the perfusion module is not disassembled, but 200-250 ml of sterile water is added to the drained perfusate tank with the addition of 0.3% sodium azide and 1% sodium ampipillin, perfusion is carried out for 48 hours with three replacements every day;

(9) далее останавливают перфузию, отключают перфузионный модуль от биореактора и переносят модуль ламинарно-потоковый шкаф, сливают отмывочный раствор и в пустой резервуар добавляют 155 мл 40% этилового спирта, затем снова переносят в рабочее пространство биореактора EBERS ТЕВ 500 и перфузируют лоскут со скоростью 20 мл/мин в течение двух часов, и после лоскут переносят в новую емкость, заполненную 125 мл 70% этанола на +40С;(9) then stop the perfusion, disconnect the perfusion module from the bioreactor and transfer the laminar-flow cabinet module, pour out the washing solution and add 155 ml of 40% ethanol to the empty tank, then transfer the EBERS TEB 500 bioreactor to the working space again and perfuse the flap at a speed 20 ml / min for two hours, and after the flap is transferred to a new container filled with 125 ml of 70% ethanol at + 40 ° C;

(10) затем лоскут консервируют в 200-250 мл 7,14% DMSO и 7,14% PVP в DMEM, хранят при температуре -800С.(10) then the flap canned in 200-250 ml of 7.14% DMSO and 7.14% PVP in DMEM, stored at a temperature of -800C.

Описание способаMethod Description

После соблюдения всех этапов законодательства РФ проводят забор лоскута кожи с дермой и жиром брюшной стенки кожи по стандартной методике в асептических условиях и помещают в транспортную среду (0,9% физиологический раствор). После удаляют избыточную жировую ткань, от нативного лоскута изымают образцы для приготовления срезов для: (1) рутинной гистологического исследования - окрашивания гематоксилином - эозином, (2) окрашивания по Массону; (3) окрашивание алыдиановым синим на кислые мукополисахариды; (4) для проведения ИГХ с антителами на МНС I; (5) определения уровня ДНК в нг/мг, нормализованного на массу высушенного среза ткани, (6) для определения наличия зрелых адипоцитов и жировых капель в них в способе используют прижизненное окрашивание витальным красителем Oil Red. Образцы для приготовления срезов измают на разной глубине - со стороны дермы и жирового депо, т.к. они морфологически неоднородны, итого взяли 12 срезов.After observing all stages of the legislation of the Russian Federation, a skin flap with dermis and abdominal wall fat is collected according to a standard technique under aseptic conditions and placed in a transport medium (0.9% saline). After the excess adipose tissue is removed, samples are taken from the native flap to prepare sections for: (1) routine histological examination - hematoxylin-eosin staining, (2) Masson staining; (3) staining with alidian blue on acid mucopolysaccharides; (4) for conducting IHC with antibodies to MHC I; (5) determining the level of DNA in ng / mg, normalized to the mass of the dried tissue section, (6) to determine the presence of mature adipocytes and fat droplets in them, the method uses intravital staining with vital dye Oil Red. Samples for the preparation of sections are crushed at different depths - from the dermis and fat depot, because they are morphologically heterogeneous, totaling 12 slices.

После завершения макроскопического осмотра и предварительной обработки лоскут помещают в 100 мл PBS с добавлением 166,6 МЕ/мл гепарина и 100 μg/мл - 100 ед/мл стрептомицина - пенициллина и инкубируют при +4°С в течение 8 час. с целью отмывания биоматериала от резидуальной крови.After completion of the macroscopic examination and pre-treatment, the flap is placed in 100 ml of PBS with the addition of 166.6 IU / ml of heparin and 100 μg / ml - 100 units / ml of streptomycin - penicillin and incubated at + 4 ° C for 8 hours. in order to wash biomaterial from residual blood.

На следующий день готовят 70% р-р изопропилового спирта с добавлением 3% поливинилпирролидона (250 мл) для криоконсервации кожного лоскута при температуре замерзания -29°С, соответственно лоскут можно хранить при температуре -20°С, не вызывая формирования зародышей внеклеточного льда; добавление высокомолекулярного поливинилпирролидона повышает вязкость раствора, что также снижает температуру замораживания. Внутриклеточные криопротекторы не используются т.к. для более эффективной децеллюляризации целесообразно индуцировать хладовой цитолиз, при этом максимально увеличивая время формирования внеклеточных зародышей льда и последующей кристаллизации. С этой целью также можно использовать синтетические ингибиторы нуклеации льда, например, DP-6.The next day, a 70% solution of isopropyl alcohol is prepared with the addition of 3% polyvinylpyrrolidone (250 ml) for cryopreservation of the skin flap at a freezing temperature of -29 ° C, respectively, the flap can be stored at -20 ° C, without causing the formation of extracellular ice nuclei; the addition of high molecular weight polyvinylpyrrolidone increases the viscosity of the solution, which also reduces the freezing temperature. Intracellular cryoprotectants are not used because for more effective decellularization, it is advisable to induce cold cytolysis, while maximizing the formation of extracellular ice nuclei and subsequent crystallization. For this purpose, synthetic ice nucleation inhibitors, for example, DP-6, can also be used.

Затем кожный лоскут помещают в емкость с 250 мл криоконсервирующего раствора, маркируют. В течение 1 часа лоскут выдерживают при температуре +4°С, в течение последующих 3 часов - при температуре -20°С, и переносят с соблюдением теплоизоляции (криоконтейнер с сухим льдом и хладоэлементами на -20°С) в низкотемпературный морозильник при температуре -80°С и хранят не более 6 месяцев. Данная температура хранения была выбрана, поскольку при размораживании позволяет избежать температурного интервала температур от -160°С до -100°С, быстрое размораживание при котором гарантированно приводит к образованию макроскопических фрактур и трещин.Then the skin flap is placed in a container with 250 ml of cryopreservation solution, marked. For 1 hour, the flap is kept at a temperature of + 4 ° С, for the next 3 hours - at a temperature of -20 ° С, and transferred with proper thermal insulation (cryocontainer with dry ice and cold elements at -20 ° С) to a low-temperature freezer at a temperature of - 80 ° C and stored no more than 6 months. This storage temperature was chosen, because during defrosting it allows avoiding the temperature range from -160 ° С to -100 ° С, rapid defrosting at which is guaranteed to lead to the formation of macroscopic fractions and cracks.

Размораживают лоскут в водяной бане при температуре +37°С. Всего проводят три цикла замораживания - размораживания с использованием 70% раствора изопропилового спирта с добавлением 3% поливинилпирролидона (250 мл). Особенностью второго цикла являются ускоренное время замораживания - для этого в криоконтейнер с кожным лоскутом с раствором для криоконсервирования помещают в жидкий азот и оставляют при температуре -80°С до полного испарения азота. Таким образом, L₂N покрывает не всю поверхность лоскута, а создается неравномерный хладовой фронт, в отличие от, простого погружения криопробирки при температуре -180°С. При этом способе неравномерность хладового фронта желательна, поскольку потенциально приводит к хладовому цитолизу. Затем выдерживают при температуре -80°С сам лоскут до его кристаллизации, ввиду того что 70% изопропиловый спирт кристаллизуется гораздо медленнее лоскута (несколько дней, в то время как лоскут при данных условиях - в течение 1,5-2 часов). Размораживают емкость с лоскутом в водяной бане при +37°С.Thaw the flap in a water bath at a temperature of + 37 ° C. In total, three freeze-thaw cycles are carried out using a 70% isopropyl alcohol solution with the addition of 3% polyvinylpyrrolidone (250 ml). A feature of the second cycle is the accelerated freezing time - for this, in a cryocontainer with a skin flap with a solution for cryopreservation, they are placed in liquid nitrogen and left at a temperature of -80 ° C until nitrogen is completely evaporated. Thus, L ₂ N does not cover the entire surface of the flap, but creates an uneven cold front, in contrast to simply dipping a cryovial at a temperature of -180 ° C. In this method, nonuniformity of the cold front is desirable since it potentially leads to cold cytolysis. Then the flap is kept at a temperature of -80 ° C until it crystallizes, due to the fact that 70% isopropyl alcohol crystallizes much more slowly than the flap (several days, while the flap under these conditions lasts for 1.5-2 hours). Defrost a container with a flap in a water bath at + 37 ° C.

Особенностью третьего цикла является медленное размораживание кожного лоскута при комнатной температуре. Преимуществом данного способа криоконсервации является то, что лоскут можно замораживать в одном и том же объеме, не меняя емкость.A feature of the third cycle is the slow thawing of the skin flap at room temperature. The advantage of this method of cryopreservation is that the flap can be frozen in the same volume without changing the capacity.

После третьего размораживания емкость с лоскутом помещают в стерильный контейнер и переносят в ламинарно-потоковый шкаф. Далее дегидратированный и компактированный лоскут тщательно отмывают от изопропилового спирта. Для этого делают следующее:After the third defrosting, the flap container is placed in a sterile container and transferred to a laminar-flow cabinet. Next, the dehydrated and compacted flap is thoroughly washed from isopropyl alcohol. To do this, do the following:

(1) проводят настройку биореактора EBERS Teb 500 - устанавливают начальную температуру 37°С, регулируют газовый состав если в этом есть необходимость;(1) carry out the adjustment of the EBERS Teb 500 bioreactor - set the initial temperature to 37 ° C, adjust the gas composition if necessary;

(2) удалив избыточную жировую ткань, кожный лоскут фиксируют. Нефиксированный лоскут в процессе перфузии за счет потери массы будет подниматься вверх в водном растворе, что потенциально приводит к протечкам в перфузионном контуре. С целью фиксации, иглой от периферического катетера 18G лоскут, повернув на сторону подкожной клетчатки (чтобы избежать повреждения и отрыва дермы), прокалывают сбоку в двух местах, таким образом, иглой продевают всю поверхность клетчатки, и фиксируют места прокола с ближайшими свободными участками клетчатки с помощью нерассасывающегося шовного материала Prolene 2/0 (важно, чтобы нить была достаточно толстой). Отметим, что в данном способе перфузию целесообразно использовать только на определенных этапах процесса децеллюляризации ввиду того, что, не смотря на хорошую химическую устойчивость перистальтических трубок к кислотам и щелочам, ряд агентов, например, кетоны и УВ, могут вызвать деградацию трубок.(2) by removing excess adipose tissue, the skin flap is fixed. An unfixed flap during perfusion due to weight loss will rise up in the aqueous solution, which potentially leads to leaks in the perfusion circuit. In order to fix it, with a needle from a peripheral catheter 18G, the flap is turned on the side of the subcutaneous tissue (to avoid damage and tearing off the dermis), pierced from the side in two places, thus, the entire surface of the fiber is pierced with a needle, and the puncture sites are fixed with the nearest free sections of fiber with using non-absorbable suture material Prolene 2/0 (it is important that the thread is thick enough). Note that in this method it is advisable to use perfusion only at certain stages of the decellularization process due to the fact that, despite the good chemical resistance of the peristaltic tubes to acids and alkalis, a number of agents, for example, ketones and hydrocarbons, can cause tube degradation.

(3) далее собирают модуль децеллюляризации, образованный:(3) then collect the module of decellularization formed by:

- резервуаром для размещения лоскута, он образован бутылью 100 мл с резьбой GL 45 под трехпортовую крышку, крышкой с 3 открытыми колпачками - портами с резьбой портов GL14 - 1 порт под фильтрационную систему, остальные два - для приводящих раствор трубок.- a reservoir for flap placement, it is formed by a 100 ml bottle with GL 45 thread for a three-port lid, a cover with 3 open caps - ports with GL14 port threads - 1 port for a filtration system, the other two are for solution-leading tubes.

Соединив катетер 18G с люэр-переходником 3,2 мм, а переходник, в свою очередь, с трубкой 3*5 мм, лоскут опускают на дно 100 мл стеклянного резервуара и трубку продевают через винт GL14 резьбовой крышки. С целью герметизации на горлышко резервуара одевают уплотнительное кольцо, а в порты вставляют силиконовые уплотнители. Затем одевают порт GL14 на соединенную с катетером трубку и завинчивают на трехпортовой крышке. Чтобы собрать участок модуля, возвращающий избыточный объем обратно в резервуар с перфузатом, сначала берут короткий фрагмент трубки 3*5 мм и продевают в порт GL14 и фиксируют порт с вдетой трубкой на одном из двух свободных винтов крышки. Собирают фильтрационную систему для резервуара с перфузатом, для этого берут красный порт с адаптером под 3-3,2 мм и одевают на него короткий (не более 0,5 см) фрагмент трубки соответствующего диаметра, затем на свободный конец трубки одевают фильтр 0,25 мкм.Having connected the 18G catheter with a 3.2 mm Luer adapter, and the adapter, in turn, with a 3 * 5 mm tube, the flap is lowered to the bottom of 100 ml of the glass reservoir and the tube is threaded through the screw GL14 of the threaded cap. For the purpose of sealing, a sealing ring is put on the neck of the tank, and silicone seals are inserted into the ports. Then put the port GL14 on the tube connected to the catheter and screw on the three-port cover. To collect a section of the module that returns the excess volume back to the perfusion tank, first take a short piece of 3 * 5 mm tube and thread it into the GL14 port and fix the port with the tube in place on one of the two free cover screws. A filtration system is assembled for the perfusion reservoir, for this, take a red port with an adapter for 3-3.2 mm and put on it a short (not more than 0.5 cm) fragment of a tube of the corresponding diameter, then put a 0.25 filter on the free end of the tube microns.

- резервуаром для перфузата, который собирают аналогичным образом, что и резервуар для лоскута, с той разницей, что объем перфузата 250 мл, в то время как вместимость резервуара с лоскутом 100-120 мл. Это важно для непрерывной циркуляции перфузата. Трубка, забирающую перфузат, опускают на дно соответствующей емкости, в то время как трубку возвращающую перфузат практически не опускают до максимального уровня жидкости в резервуаре (250 мл);- a perfusate reservoir, which is assembled in a similar manner to the flap reservoir, with the difference that the perfusate volume is 250 ml, while the reservoir capacity is 100-120 ml. This is important for continuous perfusion circulation. The tube that takes the perfusate is lowered to the bottom of the corresponding container, while the tube that returns the perfusate is practically not lowered to the maximum liquid level in the tank (250 ml);

- далее с помощью системы трубок и люэр-фиттингов, а также перистальтических трубок соединяют две емкости с образованием модуля децеллюляризации. Для этого участок трубки, соединенный с катетером, соединяют с перистальтической трубкой Tygon 2,54 мм с тремя стопперами, с помощью прямых соединителей 3*3 мм или любым другим корректным способом, свободный конец перистальтической трубки соединяют с трубкой 3*5 мм, забирающей перфузат, с помощью прямых соединителей 3*3 мм или любым другим корректным способом (например, использовав трехходовой переключатель, порт (М) которого, соединив с люэр-переходником х штуцер 3,2 мм, можно соединить с перистальтической трубкой, а порт П соединить с силиконовой трубкой 3*5 мм). Затем участок трубки, возвращающей избыточный объем перфузата из емкости с лоскутом, соединяют с соответствующей трубкой, идущей в емкость с перфузатом.- then, using a system of tubes and luer fittings, as well as peristaltic tubes, two tanks are connected to form a decellularization module. To do this, the tube section connected to the catheter is connected to a 2.54 mm Tygon peristaltic tube with three stoppers using direct connectors 3 * 3 mm or in any other correct way, the free end of the peristaltic tube is connected to a 3 * 5 mm tube that takes the perfusion , using direct connectors 3 * 3 mm or in any other correct way (for example, using a three-way switch, the port (M) of which, by connecting with a Luer adapter x 3.2 mm connection, can be connected to a peristaltic tube, and port P is connected to silicone deckhouse 3 * 5 mm). Then, a portion of the tube returning the excess perfusate volume from the flap container is connected to a corresponding tube going to the perfusion bottle container.

(4) после того, как модуль собран, емкость с перфузатом заполняется 250 мл PBS с добавлением антибиотиков - 0,25% стрептомицина сульфата, 0,25% амикацина сульфата и 0,25% цефтазидима и подключается к биореактору путем закрепления определенного фрагмента перистальтической трубки, ограниченного двумя стопперами, в картриджах перистальтической помпы биореактора.(4) after the module is assembled, the perfusate container is filled with 250 ml of PBS with the addition of antibiotics - 0.25% streptomycin sulfate, 0.25% amikacin sulfate and 0.25% ceftazidime and is connected to the bioreactor by fixing a specific fragment of the peristaltic tube limited by two stoppers in the cartridges of a bioreactor peristaltic pump.

(5) чтобы снизить температуру до комнатной, в ПО биореактора Ebers Teb 500 во вкладке Incubator задают температуру 25°С и открывают стеклянную крышку, чтобы обеспечить теплообмен и снизить температуру. Закрыв крышку, регистрируют значение температуры.(5) to lower the temperature to room temperature, set the temperature of 25 ° C in the Ebers Teb 500 bioreactor software in the Incubator tab and open the glass lid to ensure heat transfer and lower the temperature. Closing the lid, record the temperature value.

(6) в ПО биореактора Ebers Teb 500 во вкладке Pumps выбирают помпу, задают скорость перфузии. Скорость перфузии кожного лоскута PBS с добавлением антибиотиков - 0,25% стрептомицина сульфата, 0,25% амикацина сульфата и 0,25% цефтазидима - 20 мл/мин в течение суток.(6) in the Ebers Teb 500 bioreactor software, in the Pumps tab, select a pump and set the perfusion rate. The perfusion rate of the skin flap PBS with the addition of antibiotics - 0.25% streptomycin sulfate, 0.25% amikacin sulfate and 0.25% ceftazidime - 20 ml / min during the day.

На следующие сутки после завершения промывания кожного лоскута от изопропилового спирта, помпы биореактора останавливают и извлекают модуль децеллюляризации, переносят его в ламинарно-потоковый шкаф. Разборку модуля начинают с подготовки емкости для слива отходов, отсоединяют трубки от резервуаров и осушают их путем растягивания трубок на максимальную длину. Откручивают крышки и забирают до 3 мл перфузата для бакпосева, далее весь оставшийся перфузат сливают в маркированную емкость для отходов, которую используют не более 72 часов. Далее необходимо отделить поверхностный роговой и зернистый слои эпидермиса от шиповатого и базального слоев. Это можно сделать, с одной стороны, посредством дискового дерматома с электрическим приводом, позволяющего получить кожный лоскут толщиной до 0,76 мм, т.к. использование обычных дерматомов, работающих на поступательном принципе, приводит к получению лоскутов неравномерной толщины. С другой стороны, отделения поверхностных слоев эпидермиса можно добиться с помощью химических методов, наиболее из распространенным из которых является выдерживание лоскута в серии гипертонических растворов с увеличивающийся концентрацией, что способствует слущиванию клеток эпидермиса.On the next day after washing the skin flap with isopropyl alcohol, the bioreactor pumps are stopped and the decellularization module is removed, it is transferred to a laminar-flow cabinet. Dismantling of the module begins with the preparation of a container for draining waste, disconnect the tubes from the tanks and drain them by stretching the tubes to the maximum length. Unscrew the lids and take up to 3 ml of perfusate for backseeding, then all the remaining perfusate is poured into a labeled waste container, which is used for no more than 72 hours. Next, it is necessary to separate the superficial horny and granular layers of the epidermis from the prickly and basal layers. This can be done, on the one hand, by means of a disk dermatome with an electric drive, which allows to obtain a skin flap up to 0.76 mm thick, because the use of conventional dermatomes, working on a translational principle, leads to flaps of uneven thickness. On the other hand, separation of the surface layers of the epidermis can be achieved using chemical methods, the most common of which is keeping the flap in a series of hypertonic solutions with increasing concentration, which contributes to desquamation of epidermal cells.

С целью слущивания поверхностных слоев эпидермиса в предлагаемом нами способе кожный лоскут помещают в 250-500 мл емкость, заполненную 250 мл 0,5 М NaCl, ставят емкость с лоскутом на платформенный шейкер Heidolph Vibramax 100. Для фиксации емкости на поверхности шейкера использовали адаптер с прижимными валиками для крепления сосудов и колб любого размера. Для большинства моделей платформенных шейкеров такие адаптеры входят в комплектацию, однако, в том случае, если адаптер отсутствует, можно использовать фрагмент лигатурной проволоки, предварительно замотав оба ее конца винты, выступающие с боковых сторон платформы. После закрепления емкости на платформе задают скорость встряхивания не менее 500-600 об/мин и продолжительность встряхивания - 2 часа. По окончанию 2 часов емкость с лоскутом переносят в ламинарно-потоковый шкаф, сливают р-р 0,5 М NaCl в емкость для отходов н наливают в емкость свежего профильтрованного заранее приготовленного 0,5 М NaCl, снова ставят на платформенный шейкер и после закрепления емкости на платформе задают скорость встряхивания не менее 500-600 об/мин и продолжительность встряхивания - 2 часа. По окончанию 2 часов емкость с лоскутом переносят в ламинарно-потоковый шкаф, сливают р-р 0,5 М NaCl в емкость для отходов н наливают в емкость свежего профильтрованного заранее приготовленного 1 М NaCl. Смену раствора выполняют аналогично и проводят встряхивание при тех же условиях. Таким образом, суммарно лоскут выдерживают в гипертонических растворов до 8 часов, в каждом из двух этапов выдерживания проводят двукратные замены. После завершения промывания в гипертонических растворах берут 3 мл 1 М NaCl и направляют на бактериологический посев.In order to peel the surface layers of the epidermis in our method, the skin flap is placed in a 250-500 ml container filled with 250 ml of 0.5 M NaCl, a container with a flap is placed on the Heidolph Vibramax 100 platform shaker. An adapter with clamping was used to fix the container on the surface of the shaker rollers for attaching vessels and flasks of any size. For most models of platform shakers, such adapters are included in the package, however, if the adapter is missing, you can use a fragment of the ligature wire, after pre-winding both ends of the screws protruding from the sides of the platform. After the container is fixed on the platform, the shaking speed is set to at least 500-600 rpm and the shaking duration is 2 hours. At the end of 2 hours, the container with the flap is transferred to a laminar-flow cabinet, poured with a solution of 0.5 M NaCl into the waste container, poured into a container of freshly filtered pre-prepared 0.5 M NaCl, put on the platform shaker again and after fixing the container on the platform set the shaking speed of at least 500-600 rpm and the duration of shaking - 2 hours. At the end of 2 hours, the flap container was transferred to a laminar-flow cabinet, poured with a solution of 0.5 M NaCl into a waste container, and poured into a container of freshly filtered, pre-prepared 1 M NaCl. The change of solution is performed similarly and shaking is carried out under the same conditions. Thus, in total, the flap is kept in hypertonic solutions for up to 8 hours; in each of the two stages of aging, two replacements are made. After washing in hypertonic solutions, 3 ml of 1 M NaCl is taken and sent to bacteriological culture.

Затем емкость с лоскутом переносят в ламинарно-потоковый шкаф, удаляют отработанный раствор 1 М NaCl и наливают в емкость стерильную очищенную воду, также помещают на шейкер и встряхивают с двукратной заменой.Then the container with a flap is transferred to a laminar-flow cabinet, the spent 1 M NaCl solution is removed and sterile purified water is poured into the container, it is also placed on a shaker and shaken with a double change.

На следующее утро емкость с кожным лоскутом переносят в ламинарно-потоковый шкаф, в емкость для отходов сливают 1 М NaCl и помещают лоскут в 100 мл стерильную емкость, заполненную 50 мл 0,25% Трипсин - ЭДТА. Платформенный шейкер размещают в рабочем пространстве биореактора Ebers Teb 500 или инкубатора, имеющего в своей стенке порт для дополнительных соединений. С резьбового порта снимают крышки и продевают провод для питания прибора. Устанавливают температуру 37°С, при более низкой температуре трипсин будет не активен. Устанавливают емкость с кожным лоскутом на шейкер, фиксируют и оставляют в режиме непрерывного встряхивания не более двух часов, чтобы избежать избыточного лизиса лоскута в трипсине. Для остановки лизиса переносят емкость из рабочего пространства биореактора в ламинарно-потоковой шкаф и сразу извлекают лоскут из емкости с 0,25% трипсином - ЭДТА; в ином случае переносят для остановки лизиса емкость с лоскутом, заполненную 0,25% трипсином - ЭДТА, в холодильник на +4°С или ставят в термоизолированный контейнер с сухим льдом. Крайне важно на данном этапе, чтобы длительное нахождение биоматериала при температуре 37°С в трипсине было исключено.The next morning, a container with a skin flap was transferred to a laminar flow cabinet, 1 M NaCl was poured into a waste container, and the flap was placed in a 100 ml sterile container filled with 50 ml 0.25% Trypsin - EDTA. The platform shaker is placed in the working space of the Ebers Teb 500 bioreactor or incubator, which has a port for additional connections in its wall. Remove the covers from the threaded port and thread the wire to power the device. Set the temperature to 37 ° C, at a lower temperature trypsin will be inactive. Set the container with the skin flap on the shaker, fix it and leave it in continuous shaking mode for no more than two hours to avoid excessive lysis of the flap in trypsin. To stop lysis, transfer the container from the working space of the bioreactor to a laminar-flow cabinet and immediately remove the flap from the container with 0.25% trypsin - EDTA; otherwise, a container with a flap filled with 0.25% trypsin - EDTA is transferred to stop lysis in a refrigerator at + 4 ° C or placed in a thermally insulated container with dry ice. It is extremely important at this stage that the prolonged presence of the biomaterial at a temperature of 37 ° C in trypsin be excluded.

Лоскут помещают в стерильную емкость с очищенной стерильной водой и ставят на платформенный шейкер при комнатной температуре во избежание перегрева прибора при 37°С. Встряхивание проводят при частоте оборотов не менее 500 об/мин в течение часа с целью отмывания кожного лоскута от остаточного трипсина. Далее заменяют стерильную воду на 100% изопропиловый спирт, и встряхивают лоскут в течение ночи.The flap is placed in a sterile container with purified sterile water and placed on a platform shaker at room temperature to avoid overheating of the device at 37 ° C. Shaking is carried out at a speed of at least 500 rpm for an hour to wash the skin flap from residual trypsin. Next, replace sterile water with 100% isopropyl alcohol, and shake the flap overnight.

На следующий день зафиксированный на игле катетера 18G (см. выше в описании способа) кожный лоскут помещают в стерильный стеклянный 100 мл резервуар, собирают перфузионный модуль в алгоритме, аналогичному вышеописанному для данного способа, в резервуар для перфузата заливают 250 мл свежего профильтрованного раствора 1% 4-(1,1,3,3-тетраметилбутил)фенил-полиэтиленгликоля (коммерческое название - TritonX100) и 0,8% деоксихолата натрия (NaDOC).The next day, a 18G catheter fixed on a catheter needle (see above in the description of the method), the skin flap is placed in a sterile 100 ml glass reservoir, the perfusion module is collected in an algorithm similar to that described above for this method, 250 ml of fresh filtered solution of 1% is poured into the perfusion reservoir 4- (1,1,3,3-tetramethylbutyl) phenyl-polyethylene glycol (commercial name - TritonX100) and 0.8% sodium deoxycholate (NaDOC).

В данном в отличие от прототипа было решено отказаться TritonX100 в чистом виде, поскольку эффект этого неионного ПАВ в большей степени выражен для тонких срезов тканей или для тканей с высоким отношением поверхность/объем (солюбилизация мембранных белков, разрушение мебран эукариотических клеток), в то время как использование ионного детергента и липолитического агента деоксихолата натрия куда более актуально для удаления ядер адипоцитов, а также для расщепления триацилглеролов и фосфолипидов мембран жировых клеток.In this, unlike the prototype, it was decided to abandon TritonX100 in its pure form, since the effect of this non-ionic surfactant is more pronounced for thin sections of tissues or for tissues with a high surface / volume ratio (solubilization of membrane proteins, destruction of eukaryotic cell furniture), at that time how the use of an ionic detergent and a lipolytic agent of sodium deoxycholate is much more relevant for the removal of adipocyte nuclei, as well as for the cleavage of triacylglerols and phospholipids of the membranes of fat cells.

Собранный перфузионный модуль подключают к биореактору, скорость перфузии при этом устанавливают равной не менее 20 мл/мин, поскольку при низкой скорости отмывание неэффективно, а сама жировая ткань на данном этапе крайне разрыхлена и гомогенизирована, чтобы вызвать засорение трубок при перфузии. Перфузию проводят в течение 45 часов, при этом по истечению 24 часов раствор заменяют на свежий. Далее с целью отмывания от детергентов перфузионный модуль не разбирают, а наливают в осушенный резервуар для перфузата 200-250 мл стерильной воды с добавлением 0,3% азида натрия и 1% ампипиллина натрия, перфузию проводят в течение 48 часов с тремя заменами в течение каждых суток.The assembled perfusion module is connected to the bioreactor, while the perfusion rate is set to at least 20 ml / min, since washing is not effective at low speed, and the adipose tissue itself is extremely loosened and homogenized at this stage to cause clogging of the tubes during perfusion. Perfusion is carried out for 45 hours, while after 24 hours the solution is replaced with a fresh one. Then, in order to wash off detergents, the perfusion module is not disassembled, but 200–250 ml of sterile water is added to the drained perfusion tank with the addition of 0.3% sodium azide and 1% sodium ampipillin; perfusion is carried out for 48 hours with three replacements each days.

Далее проводят финальный этап дегидратации ткани, для чего останавливают перфузию, отключают перфузионный модуль от биореактора и переносят модуль в ламинарно-потоковый шкаф. Сливают отмывочный раствор и в пустой резервуар добавляют 155 мл 40% этилового спирта (готовят из исходного 100 мл 95% этанола), затем снова переносят в рабочее пространство биореактора Ebers ТЕВ 500 и перфузируют лоскут со скоростью 20 мл/мин в течение двух часов, и после лоскут переносят в новую емкость, заполненную 125 мл 70% этанола на +4°С, и в таком виде лоскут может храниться в течение суток.Next, the final stage of tissue dehydration is carried out, for which perfusion is stopped, the perfusion module is disconnected from the bioreactor and the module is transferred to a laminar-flow cabinet. The washing solution is drained and 155 ml of 40% ethanol are added to the empty tank (prepared from the original 100 ml of 95% ethanol), then transferred again to the working space of the Ebers TEB 500 bioreactor and the flap is perfused at a rate of 20 ml / min for two hours, and after the flap is transferred to a new container filled with 125 ml of 70% ethanol at + 4 ° C, and in this form the flap can be stored for a day.

После завершения протокола детергентно-ферментативной децеллюляризации лоскут извлекают из емкости с 125 мл 70% этанола, в условиях ламинарного потока изымают образцы для приготовления срезов для: (1) рутинной гистологического исследования - окрашивания гематоксилином - эозином, (2) окрашивания по Массону; (3) окрашивания альциановым синим на кислые мукополисахариды; (4) для проведения ИГХ с антителами на МНС I; (5) определения уровня ДНК в нг/мг, нормализованного на массу высушенного среза децеллюляризированной/делипидизированной ткани; (6) для определения наличия ядер зрелых адипоцитов и остаточного нейтрального жира в способе используют прижизненное окрашивание витальным красителем Oil Red. Этот метод окрашивания валиден только для свежеприготовленных или замороженных срезов/биоптатов жировой ткани. Образцы для приготовления срезов измают на разной глубине - со стороны дермы и жирового депо, т.к. они морфологически неоднородны, итого взяли 12 срезов. Образцы помещают в 10% забуференный формалин.After completion of the detergent-enzymatic decellularization protocol, the flap is removed from a container with 125 ml of 70% ethanol, samples are taken under laminar flow for preparing sections for: (1) routine histological examination - hematoxylin-eosin staining, (2) Masson staining; (3) staining with alcian blue on acid mucopolysaccharides; (4) for conducting IHC with antibodies to MHC I; (5) determining the level of DNA in ng / mg normalized to the weight of the dried section of the decellularized / delipidized tissue; (6) to determine the presence of mature adipocyte nuclei and residual neutral fat, the method uses intravital staining with the vital dye Oil Red. This staining method is valid only for freshly prepared or frozen sections / biopsy samples of adipose tissue. Samples for the preparation of sections are crushed at different depths - from the dermis and fat depot, because they are morphologically heterogeneous, totaling 12 slices. Samples are placed in 10% buffered formalin.

Отдельно отметим, что в предлагаемом способе после каждого этапа децеллюляризации до 3 мл промывочного раствора или перфузата направляют на бактериологический посев с целью обеспечения контроля стерильности.Separately, we note that in the proposed method, after each stage of decellularization, up to 3 ml of the washing solution or perfusate is sent to bacteriological culture in order to ensure sterility control.

Лоскут консервируют в 200-250 мл криоконсерванта, содержащего 7,14% DMSO и 7,14% PVP в DMEM, при этом в течение часа лоскут выдерживают при температуре +4°С, затем переносят на -20°С и инкубируют при такой температуре до полной кристаллизации среды. С соблюдением термоизоляции лоскут переносят на -80°С и хранят при такой температуре. В предлагаемом способе применяют следующий протокол окрашивания криосрезов жировой ткани красителем Oil Red О (отметим, что для данного протокола требуется альтернативная среда для монтирования срезов):The flap is preserved in 200-250 ml of a cryopreservative containing 7.14% DMSO and 7.14% PVP in DMEM, while the flap is kept at + 4 ° C for an hour, then transferred to -20 ° C and incubated at this temperature until complete crystallization of the medium. In compliance with thermal insulation, the flap is transferred to -80 ° C and stored at this temperature. In the proposed method, the following protocol is used for staining cryosections of adipose tissue with Oil Red O dye (note that this protocol requires an alternative medium for mounting sections):

• Готовят свежие или замороженные срезы жировой ткани; замороженные срезы приготавливают по стандартной методике с погружением блока-формы с иммобилизованным биоптатом/фрагментом ткани (толщиной не более 5 мм) в заливочной среде ОСТ. Далее в 2-метилбутановую ванну с жидким азотом погружают мерный сосуд из нержавеющей стали и ждут пока сосуд охладится, и после блок-форму с иммобилизованным срезом погружают в сосуд заполненный 2-метилбутаном и ждут до тех пор пока блок полностью не затвердеет, и далее переносят его в криостат на -20°С. Блок хранят при -80°С до секционирования.• Prepare fresh or frozen sections of adipose tissue; Frozen sections are prepared according to the standard method with immersion of the block form with an immobilized biopsy specimen / tissue fragment (not more than 5 mm thick) in the OST filling medium. Next, a stainless steel measuring vessel is immersed in a 2-methylbutane bath with liquid nitrogen and waiting for the vessel to cool, and after the block form with an immobilized section, it is immersed in a vessel filled with 2-methylbutane and waiting until the block has completely hardened, and then transferred it to the cryostat at -20 ° C. The block is stored at -80 ° C until sectioning.

• После криосекционирования (температура в криостате поддерживается равной -20°С), получения криосрезов толщиной не более 5 μм, стекла переносят в пропиленгликоль и выдерживают до двух минут;• After cryosection (the temperature in the cryostat is maintained at -20 ° C), cryosections are obtained with a thickness of not more than 5 μm, the glasses are transferred to propylene glycol and kept for up to two minutes;

• Затем стекла инкубируют в растворе Oil Red О до 6 минут.• Then the glasses are incubated in Oil Red O for up to 6 minutes.

• Готовят 85% раствор пропиленгликоля в дистиллированной воде и дифференцируют срез ткани в течение 1 минуты, после чего стекло 2 раза промывают дистиллированной водой;• An 85% solution of propylene glycol in distilled water is prepared and the tissue section is differentiated for 1 minute, after which the glass is washed 2 times with distilled water;

• Выдерживают стекло в гематоксилине до 1-2 минут;• Withstand glass in hematoxylin for up to 1-2 minutes;

• Тщательно промывают стекло под проточной водой;• Thoroughly rinse the glass under running water;

• Промывают стекло 2 раза дистилированной водой;• Wash the glass 2 times with distilled water;

• Стекло покрывают с использованием водной среды для монтирования. Результаты проведенных гистологических исследований показали, что полученный в результате децеллюляризированный кожный лоскут,- характеризующийся: 1) отсутствием ядер клеток во всех слоях, гомогенизацией эпидермиса, с трудом различимыми тенями клеток, разволокнением и гомогенизацией подлежащей дермы; 2) присутствием кислых мукополисахаридов и гликозаминогликанов в децеллюляризованным лоскуте, однако их содержание было существенно ниже по сравнению с нативной тканью, что оценивали по интенсивности окрашивания срезов нативного и децеллюляризированного срезов дермы альциановым синим; 3) частичными разволокнением и гомогенизацией коллагеновых волокон; 4) отсутствием ядер адипоцитов и капель нейтрального жира в децеллюляризированном лоскуте; 5) отсутствием экспрессии на поверхности матрикса МНС I класса; 6) содержанием остаточной геномной двуцепочечной ДНК составило 20 ng/mg, нормализованное на сухой вес децеллюляризированного лоскута. Положительный эффект способа.• Glass is coated using an aqueous mounting medium. The results of histological studies showed that the resulting decellularized skin flap is characterized by: 1) the absence of cell nuclei in all layers, homogenization of the epidermis, hardly distinguishable cell shadows, razvolnenie and homogenization of the underlying dermis; 2) the presence of acid mucopolysaccharides and glycosaminoglycans in the decellularized flap, however, their content was significantly lower compared to the native tissue, which was estimated by the intensity of staining of the slices of the native and decellularized dermal sections with alcian blue; 3) partial fragmentation and homogenization of collagen fibers; 4) the absence of adipocyte nuclei and drops of neutral fat in a decellularized flap; 5) the lack of expression on the surface of the matrix MHC class I; 6) the residual genomic double-stranded DNA content was 20 ng / mg, normalized to the dry weight of the decellularized flap. The positive effect of the method.

Способ позволяет получить децеллюляризированные кожные лоскуты, характеризующееся: 1) отсутствием ядер клеток во всех слоях, гомогенизацией эпидермиса, с трудом различимыми тенями клеток, разволокнением и гомогенизацией подлежащей дермы; 2) присутствием кислых мукополисахаридов и гликозаминогликанов в децеллюляризованным лоскуте; 3) частичными разволокнением и гомогенизацией коллагеновых волокон; 4) отсутствием ядер адипоцитов и капель нейтрального жира; 5) отсутствием экспрессии на поверхности матрикса МНС I класса; 6) содержанием остаточной геномной двуцепочечной ДНК составило 20 ng/mg, нормализованное на сухой вес фрагмента ткани.The method allows to obtain decellularized skin flaps characterized by: 1) the absence of cell nuclei in all layers, homogenization of the epidermis, hardly distinguishable cell shadows, razvolennost and homogenization of the underlying dermis; 2) the presence of acid mucopolysaccharides and glycosaminoglycans in a decellularized flap; 3) partial fragmentation and homogenization of collagen fibers; 4) the absence of adipocyte nuclei and drops of neutral fat; 5) the lack of expression on the surface of the matrix MHC class I; 6) the residual genomic double-stranded DNA content was 20 ng / mg, normalized to the dry weight of a tissue fragment.

Пример осуществления способаAn example of the method

Пример 1.Example 1

После забора кожи, обрабатывают следующим образом:After collecting the skin, process as follows:

(1) удаляют транспортную среду, избыточную жировую ткань, при этом от нативного лоскута изымают образцы для приготовления срезов для комплексного гистологического анализа и определения геномной двуцепочечной ДНК(1) remove the transport medium, excess adipose tissue, while samples are taken from the native flap for preparation of sections for complex histological analysis and determination of genomic double-stranded DNA

(2) после завершения макроскопического осмотра и предварительной обработки лоскут помещают в 100 мл PBS с добавлением 166,6 МЕ/мл гепарина и 100 μg/мл - 100 ед/мл стрептомицина - пенициллина и инкубируют при температуре +4°С в течение 8 часов с целью отмывания биоматериала от резидуальной крови.(2) after completion of the macroscopic examination and pre-treatment, the flap is placed in 100 ml of PBS with the addition of 166.6 IU / ml of heparin and 100 μg / ml - 100 u / ml of streptomycin - penicillin and incubated at + 4 ° C for 8 hours in order to wash biomaterial from residual blood.

(3) на следующий день готовят 70% р-р изопропилового спирта с добавлением 3% поливинилпирролидона (250 мл). 70% р-р изопропилового спирта используют в данном способе для криоконсервации кожного лоскута;(3) the next day, 70% solution of isopropyl alcohol is prepared with the addition of 3% polyvinylpyrrolidone (250 ml). 70% isopropyl alcohol solution is used in this method for cryopreservation of a skin flap;

(4) затем кожный лоскут помещают в с 250-300 мл криоконсервирующего раствора, маркируют. В течение 1 часа лоскут выдерживают при температуре +4°С, в течение последующих 3 часов - при температуре -20°С, и переносят с соблюдением теплоизоляции (криоконтейнер с сухим льдом и хладоэлементами при температуре -20°С) в низкотемпературный морозильник при температуре -80°С, хранение не более 6 месяцев.(4) then the skin flap is placed in with 250-300 ml of cryopreservation solution, marked. For 1 hour, the flap is kept at a temperature of + 4 ° C, for the next 3 hours - at a temperature of -20 ° C, and transferred under thermal insulation (cryocontainer with dry ice and cold elements at a temperature of -20 ° C) to a low-temperature freezer at a temperature -80 ° C, storage no more than 6 months.

(5) размораживают лоскут в водяной бане при температуре +37°С. Всего проводят три цикла замораживания - размораживания с использованием 70% р-ра изопропилового спирта с добавлением 3% поливинилпирролидона (250 мл).(5) thaw the flap in a water bath at a temperature of + 37 ° C. In total, three freezing and thawing cycles are carried out using 70% isopropyl alcohol with the addition of 3% polyvinylpyrrolidone (250 ml).

(6) в ходе третьего, и последнего, цикла замораживания - размораживания проводят медленное размораживание кожного лоскута при комнатной температуре.(6) during the third, and last, freeze-thaw cycle, the skin flap is slowly thawed at room temperature.

(7) после третьего размораживания емкость с лоскутом помещают в стерильный контейнер и переносят в ламинарно-потоковый шкаф. Удалив избыточную жировую ткань, кожный лоскут фиксируют с помощью иглы от катетера 18G.(7) after the third defrosting, the flap container is placed in a sterile container and transferred to a laminar-flow cabinet. By removing excess adipose tissue, the skin flap is fixed with a needle from an 18G catheter.

(8) далее дегидратированный и компактизированный лоскут тщательно отмывают от изопропилового спирта. Отмывание проводят в 250 мл PBS с добавлением антибиотиков - 0,25% стрептомицина сульфата, 0,25% амикацина сульфата и 0,25% цефтазидима, предварительно собирают перфузионный модуль, и заливают раствор в соответствующую емкость для перфузата, собранный модуль подключают к биореактору Ebers Teb 500 и запускают перфузию лоскута;(8) the dehydrated and compacted flap is then washed thoroughly from isopropyl alcohol. Washing is carried out in 250 ml of PBS with the addition of antibiotics - 0.25% streptomycin sulfate, 0.25% amikacin sulfate and 0.25% ceftazidime, the perfusion module is pre-assembled, and the solution is poured into an appropriate perfusate tank, the assembled module is connected to the Ebers bioreactor Teb 500 and trigger flap perfusion;

(9) На следующие сутки после завершения промывания кожного лоскута от изопропилового спирта, помпы биореактора останавливают и извлекают модуль децеллюляризации, переносят его в ламинарно-потоковый шкаф. Разборку модуля начинают с подготовки емкости для слива отходов, отсоединяют трубки от резервуаров и осушают их путем растягивания трубок на максимальную длину. Откручивают крышки и забирают до 3 мл перфузата для бакпосева, далее весь оставшийся перфузат сливают в маркированную емкость для отходов, которую используют не более 72 часов.(9) The next day after washing the skin flap with isopropyl alcohol, the bioreactor pumps are stopped and the decellularization module is removed, it is transferred to a laminar-flow cabinet. Dismantling of the module begins with the preparation of a container for draining waste, disconnect the tubes from the tanks and drain them by stretching the tubes to the maximum length. Unscrew the lids and take up to 3 ml of perfusate for backseeding, then all the remaining perfusate is poured into a labeled waste container, which is used for no more than 72 hours.

(10) С целью слущивания поверхностных слоев эпидермиса в предлагаемом нами способе кожный лоскут помещают в 250-500 мл емкость, заполненную 250 мл 0,5 М NaCl, ставят емкость с лоскутом на платформенный шейкер Heidolph Vibramax 100. После закрепления емкости на платформе задают скорость встряхивания не менее 500-600 об/мин и продолжительность встряхивания - 2 часа. По окончанию 2 часов емкость с лоскутом переносят в ламинарно-потоковый шкаф, сливают р-р 0,5 М NaCl в емкость для отходов н наливают в емкость свежего профильтрованного заранее приготовленного 0,5 М NaCl, снова ставят на платформенный шейкер и задают скорость встряхивания не менее 500-600 об/мин и продолжительность встряхивания - 2 часа. По окончанию 2 часов емкость с лоскутом переносят в ламинарно-потоковый шкаф, сливают р-р 0,5 М NaCl в емкость для отходов н наливают в емкость свежего профильтрованного заранее приготовленного 1 М NaCl. Смену раствора выполняют аналогично и проводят встряхивание при тех же условиях. Таким образом, суммарно лоскут выдерживают в гипертонических растворов до 8 часов, в каждом из двух этапов выдерживания проводят двукратные замены. После завершения промывания в гипертонических растворах берут 3 мл 1 М NaCl и направляют на бактериологический посев.(10) In order to peel the surface layers of the epidermis in our method, a skin flap is placed in a 250-500 ml container filled with 250 ml of 0.5 M NaCl, a container with a flap is placed on the Heidolph Vibramax 100 platform shaker. After fixing the container on the platform, set the speed shaking at least 500-600 rpm and the duration of shaking - 2 hours. At the end of 2 hours, the container with the flap is transferred to a laminar-flow cabinet, poured with a solution of 0.5 M NaCl into the waste container, poured into a container of freshly filtered pre-prepared 0.5 M NaCl, put back on the platform shaker and set the shaking speed not less than 500-600 rpm and the duration of shaking is 2 hours. At the end of 2 hours, the flap container was transferred to a laminar-flow cabinet, poured with a solution of 0.5 M NaCl into a waste container, and poured into a container of freshly filtered, pre-prepared 1 M NaCl. The change of solution is performed similarly and shaking is carried out under the same conditions. Thus, in total, the flap is kept in hypertonic solutions for up to 8 hours; in each of the two stages of aging, two replacements are made. After washing in hypertonic solutions, 3 ml of 1 M NaCl is taken and sent to bacteriological culture.

(11) На следующее утро емкость с кожным лоскутом переносят в ламинарно-потоковый шкаф, в емкость для отходов сливают 1 М NaCl и помещают лоскут в 100 мл стерильную емкость, заполненную 50 мл 0,25% Трипсин - ЭДТА. Устанавливают емкость с кожным лоскутом на шейкер, фиксируют и оставляют в режиме непрерывного встряхивания не более двух часов, чтобы избежать избыточного лизиса лоскута в трипсине.(11) The next morning, a container with a skin flap was transferred to a laminar-flow cabinet, 1 M NaCl was poured into a waste container, and the flap was placed in a 100 ml sterile container filled with 50 ml 0.25% Trypsin-EDTA. Set the container with the skin flap on the shaker, fix it and leave it in continuous shaking mode for no more than two hours to avoid excessive lysis of the flap in trypsin.

(12) Лоскут помещают в стерильную емкость с очищенной стерильной водой и ставят на платформенный шейкер при комнатной температуре во избежание перегрева прибора при 37°С. Встряхивание проводят при частоте оборотов не менее 500 об/мин в течение часа с целью отмывания кожного лоскута от остаточного трипсина. Далее заменяют стерильную воду на 100% изопропиловый спирт, и встряхивают лоскут в течение ночи.(12) The flap is placed in a sterile container with purified sterile water and placed on a platform shaker at room temperature to avoid overheating of the device at 37 ° C. Shaking is carried out at a speed of at least 500 rpm for an hour to wash the skin flap from residual trypsin. Next, replace sterile water with 100% isopropyl alcohol, and shake the flap overnight.

(13) На следующий день зафиксированный на игле катетера 18G кожный лоскут помещают в стерильный стеклянный 100 мл резервуар, собирают перфузионный модуль в алгоритме, аналогичному вышеописанному для данного способа, в резервуар для перфузата заливают 250 мл свежего профильтрованного раствора 1% 4-(1,1,3,3-тетраметилбутил)фенил-полиэтиленгликоля (коммерческое название - TritonX100) и 0,8% деоксихолата натрия (NaDOC). Перфузию проводят в течение 45 часов, при этом по истечению 24 часов раствор заменяют на свежий. Далее с целью отмывания от детергентов перфузионный модуль не разбирают, а наливают в осушенный резервуар для перфузата 200-250 мл стерильной воды с добавлением 0,3% азида натрия и 1% ампипиллина натрия, перфузию проводят в течение 48 часов с тремя заменами в течение каждых суток.(13) The next day, a skin flap fixed on a 18G catheter needle is placed in a sterile 100 ml glass reservoir, the perfusion module is collected in an algorithm similar to that described above for this method, 250 ml of fresh filtered solution of 1% 4- is poured into the perfusion reservoir (1, 1,3,3-tetramethylbutyl) phenyl-polyethylene glycol (commercial name - TritonX100) and 0.8% sodium deoxycholate (NaDOC). Perfusion is carried out for 45 hours, while after 24 hours the solution is replaced with a fresh one. Then, in order to wash off detergents, the perfusion module is not disassembled, but 200–250 ml of sterile water is added to the drained perfusion tank with the addition of 0.3% sodium azide and 1% sodium ampipillin; perfusion is carried out for 48 hours with three replacements each days.

(14) Далее проводят финальный этап дегидратации ткани, для чего останавливают перфузию, отключают перфузионный модуль от биореактора и переносят модуль в ламинарно-потоковый шкаф. Сливают отмывочный раствор и в пустой резервуар добавляют 155 мл 40% этилового спирта (готовят из исходного 100 мл 95% этанола), затем снова переносят в рабочее пространство биореактора Ebers ТЕВ 500 и перфузируют лоскут со скоростью 20 мл/мин в течение двух часов, и после лоскут переносят в новую емкость, заполненную 125 мл 70% этанола на + температуре 4°С, и в таком виде лоскут может храниться в течение суток.(14) Next, the final stage of tissue dehydration is carried out, for which perfusion is stopped, the perfusion module is disconnected from the bioreactor and the module is transferred to a laminar-flow cabinet. The washing solution is drained and 155 ml of 40% ethanol are added to the empty tank (prepared from the original 100 ml of 95% ethanol), then transferred again to the working space of the Ebers TEB 500 bioreactor and the flap is perfused at a rate of 20 ml / min for two hours, and after the flap is transferred to a new container filled with 125 ml of 70% ethanol at + 4 ° C, and in this form the flap can be stored for a day.

(15) После завершения протокола детергентно-ферментативной децеллюляризации лоскут извлекают из емкости с 125 мл 70% этанола, в условиях ламинарного потока изымают образцы для приготовления срезов для: (1) рутинной гистологического исследования - окрашивания гематоксилином - эозином, (2) окрашивания по Массону; (3) окрашивания альциановым синим на кислые мукополисахариды; (4) для проведения ИГХ с антителами на МНС I; (5) определения уровня ДНК в нг/мг, нормализованного на массу высушенного среза децеллюляризированной/делипидизированной ткани; (6) для определения наличия ядер зрелых адипоцитов и остаточного нейтрального жира в способе используют прижизненное окрашивание витальным красителем Oil Red. Этот метод окрашивания валиден только для свежеприготовленных или замороженных срезов/биоптатов жировой ткани. Образцы для приготовления срезов измают на разной глубине - со стороны дермы и жирового депо, т.к. они морфологически неоднородны, итого взяли 12 срезов. Образцы помещают в 10% забуференный формалин.(15) After completion of the detergent-enzymatic decellularization protocol, the flap is removed from a container with 125 ml of 70% ethanol, samples are taken in order to prepare sections for laminar flow for: (1) routine histological examination - hematoxylin-eosin staining, (2) Masson staining ; (3) staining with alcian blue on acid mucopolysaccharides; (4) for conducting IHC with antibodies to MHC I; (5) determining the level of DNA in ng / mg normalized to the weight of the dried section of the decellularized / delipidized tissue; (6) to determine the presence of mature adipocyte nuclei and residual neutral fat, the method uses intravital staining with the vital dye Oil Red. This staining method is valid only for freshly prepared or frozen sections / biopsy samples of adipose tissue. Samples for the preparation of sections are crushed at different depths - from the dermis and fat depot, because they are morphologically heterogeneous, totaling 12 slices. Samples are placed in 10% buffered formalin.

(16) Лоскут консервируют в 200-250 мл 7,14% DMSO и 7,14% PVP в DMEM, при этом в течение часа лоскут выдерживают при +4°С, затем переносят на температуре -20°С и инкубируют при такой температуре до полной кристаллизации среды. С соблюдением термоизоляции лоскут переносят и хранят при температуре -80°С.(16) The flap was preserved in 200-250 ml of 7.14% DMSO and 7.14% PVP in DMEM, while the flap was kept at + 4 ° C for one hour, then transferred to -20 ° C and incubated at this temperature until complete crystallization of the medium. In compliance with thermal insulation, the flap is transferred and stored at a temperature of -80 ° C.

Claims

A method for producing decellularized skin flaps using detergent-enzymatic decellularization and delipidation by means of a high-performance perfusion system, characterized in that they use a perfusion module integrated into the EBERS TEB 500 bioreactor assembled from two reservoirs of different volumes interconnected using tubes and luer fittings while the flap placed in the perfusion module, pre-frozen three times, thawed in 70% isopropyl alcohol with the addition of 3% watering nilpirrolidona (PVP), was treated as follows:

(1) washed by perfusion of the flap with 250 ml of PBS with the addition of antibiotics - 0.25% streptomycin sulfate, 0.25% amikacin sulfate and 0.25% ceftazidime during the day;

(2) then the skin flap is placed in a container filled with 250 ml of 0.5 M NaCl and shaken on a shaker at room temperature at a speed of 500-600 rpm for 2 hours in order to separate the epidermis, replace the solution with a fresh one and shake again within 2 hours;

(3) shake at room temperature at a speed of 500-600 rpm in 250 ml of 1 M NaCl for 2 hours, replace the solution with fresh and shake again for 2 hours;

(4) shake at room temperature at a speed of 500-600 rpm in 250 ml of sterile purified water for 2 hours, replace the solution with fresh and shake again for 2 hours;

(5) then the skin flap is placed in a container with 50 ml of 0.25% trypsin - EDTA, the platform sheker is placed in the working space of the EBERS TEB 500 bioreactor or incubator, which has a threaded port for additional connections in its wall, and shaken at 37 ° С 500-600 rpm for 2 hours;

(6) then the flap is placed in a container of 250 ml of purified sterile water and shaken at room temperature at a speed of 500-600 rpm for an hour;

(7) then replace sterile water with 100% isopropyl alcohol and shake at room temperature at a speed of 500-600 rpm;

(8) then place the fixed flap in the perfusion module and perfuse 250 ml of fresh filtered solution of 1% 4- (1,1,3,3-tetramethylbutyl) phenyl-polyethylene glycol (commercial name - TritonX100) and 0.8% sodium deoxycholate ( NaDOC) within 45 hours, at the end of 24 hours the solution is replaced with a fresh one and, in order to wash detergents from the detergents, the perfusion module is not disassembled, but 200-250 ml of sterile water is added to the drained perfusate tank with the addition of 0.3% sodium azide and 1% ampicillin sodium, perfusion is carried out for 48 hours with three substitutions within each day;

(9) then stop the perfusion, disconnect the perfusion module from the bioreactor and transfer the laminar-flow cabinet module, pour out the washing solution and add 155 ml of 40% ethanol to the empty tank, then transfer the EBERS TEB 500 bioreactor to the working space again and perfuse the flap at a speed 20 ml / min for two hours, and after the flap is transferred to a new container filled with 125 ml of 70% ethanol at + 4 ° C;

(10) then the flap canned in 200-250 ml of 7.14% DMSO and 7.14% PVP in DMEM, stored at a temperature of -80 ° C.