RU2751353C1

RU2751353C1 - Method for obtaining decellularised matrix of amniotic membrane for further reconstruction of tissue defects

Info

Publication number: RU2751353C1
Application number: RU2020124830A
Authority: RU
Inventors: Александр Сергеевич Самойлов; Татьяна Алексеевна Астрелина; Валентин Андреевич Брумберг; Виталий Андреевич Брунчуков; Ирина Владимировна Кобзева; Татьяна Федоровна Маливанова; Александр Станиславович Осташкин
Priority date: 2020-07-27
Filing date: 2020-07-27
Publication date: 2021-07-13

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: invention relates to medicine, particularly to biomedicine, namely to regenerative medicine and transplantology, tissue engineering, for obtaining a decellularised matrix of the amniotic membrane for further reconstruction of tissue defects due to thermal, chemical and radiation burns, ulcers, etc. The method for obtaining a decellularised matrix of the amniotic membrane for further reconstruction of tissue defects as a coating with intact structural components of the extracellular matrix includes the following: the donor placenta is transferred to a laminar flow cabinet of the biological hazard class II, the internal fetal amniotic membrane is separated from the chorion, wherein approximately 300 cm² of the amniotic membrane is isolated from one placenta. The isolated fragments of the amnion with the area of 50 cm² are thoroughly washed from blood in a phosphate-buffered saline solution with the addition of 250 U/ml of penicillin and 250 mcg/ml of streptomycin three times within 24 hours, the solution is replaced every 3 hours. The isolated fragments of the amniotic membrane with the area of 50 cm² are then subjected to detergent-enzymatic decellularisation using: (1) 0.5% sodium deoxycholate + 0.5% TritonX100 - 24 hours, 400 rpm; (2) 0.05% Trypsin-EDTA - 1 hour, 200 rpm; (3) DMEM, 10% FBS, 1% penicillin-streptomycin - 24 hours, 400 rpm; (4) 300 U/ml DNAse I, 40 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl₂, 10 mM NaCl - 16 hours, 400 rpm; (5) PBS, 1% penicillin-streptomycin - 48 hours, 400 rpm. The matrix is then analysed for the presence/absence of cell nuclei or shadow nuclei, the integrity of the main components of the extracellular matrix (collagen, laminin, fibronectin) and the level of the residual genomic DNA.

EFFECT: obtained is decellularised matrix of the amniotic membrane not causing inflammatory fibrosis and macrophage-lymphocytic infiltration, for the purpose of healing the affected surface by increasing the reparative and immune processes, restoring trophicity, remodeling fibrous connective tissue.

1 cl

Description

Изобретение относится к области медицины, в частности к биомедицине, а именно к регенеративной медицине и трансплантологии, тканевой инженерии для получения бесклеточного матрикса амниотической мембраны для последующей реконструкции дефектов тканей вследствие термических, химических и радиационных ожогов, язв и др., в качестве покрытия с сохранными структурными компонентами внеклеточного матрикса не вызывающего воспалительного фиброза и макрофагально-лимфоцитарной инфильтрации с целью заживления пораженной поверхности за счет повышения репаративных и иммунных процессов, восстановления трофики, ремоделирования фиброзной, соединительной ткани и может быть использовано в научных и лечебных учреждениях.The invention relates to medicine, in particular to biomedicine, namely to regenerative medicine and transplantology, tissue engineering to obtain a cell-free matrix of the amniotic membrane for the subsequent reconstruction of tissue defects due to thermal, chemical and radiation burns, ulcers, etc., as a coating with intact structural components of the extracellular matrix that does not cause inflammatory fibrosis and macrophage-lymphocytic infiltration in order to heal the affected surface by increasing reparative and immune processes, restoring trophism, remodeling fibrous, connective tissue and can be used in scientific and medical institutions.

Актуальность предлагаемого способа определяется необходимостью хирургической реконструкции поврежденных участков при полученной травме, вследствие термических, химических и радиационных ожогов, язв и др. Подобная реконструкция дефектов тканей имеет существенные ограничения, связанные с недостаточным количеством покрывного материла, пригодного для реконструкции. Для решения проблем трансплантации покрывного материала существуют подходы регенеративной медицины и тканевой инженерии.The relevance of the proposed method is determined by the need for surgical reconstruction of damaged areas with an injury, due to thermal, chemical and radiation burns, ulcers, etc. Such a reconstruction of tissue defects has significant limitations associated with an insufficient amount of covering material suitable for reconstruction. Regenerative medicine and tissue engineering approaches exist to solve the problems of covering material transplantation.

Амниотическая мембрана используется, в качестве биологического покрывного материла, для лечения ожоговых ран и язв, преимущественно в трансплантологии и офтальмологии для лечения окулярного пемфигоида и синдрома Стивенса - Джонсона; Помимо ольфтамологии, амниотическая мембрана широко используется в лечении кожных заболеваний - хронических язв, некротизирующего фасциита, буллезного эпидермолиза и т.д. Известно, что клетки амниотической мембран обладают низкой иммуногенностью и не экспрессируют HLA-DR. Однако, M. Kubo и соавт. утверждают, что фибробласты амниотической мембраны могут экспрессировать антигены II класса при проведении иммуногистохимической реакции с антителом BL-IA/6. [Kubo М., Sonoda Y., Muramatsu R., Usui M. Immunogenicity of human amniotic membrane in experimental xenotransplantation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2001 Jun; 42(7): 1539-46].The amniotic membrane is used as a biological covering material for the treatment of burn wounds and ulcers, mainly in transplantology and ophthalmology for the treatment of ocular pemphigoid and Stevens-Johnson syndrome; In addition to olftamology, the amniotic membrane is widely used in the treatment of skin diseases - chronic ulcers, necrotizing fasciitis, epidermolysis bullosa, etc. It is known that amniotic membrane cells have low immunogenicity and do not express HLA-DR. However, M. Kubo et al. state that amniotic membrane fibroblasts can express class II antigens when carrying out an immunohistochemical reaction with the BL-IA / 6 antibody. [Kubo M., Sonoda Y., Muramatsu R., Usui M. Immunogenicity of human amniotic membrane in experimental xenotransplantation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2001 Jun; 42 (7): 1539-46].

Известен способ обработки амниотической мембраны, который заключается в ее криоконсервации с последующей оценкой биосовместимости посредством имплантации в иммуннонепривилегированную область (глазной лимб, капсула почки) и в неиммунопривилегированную область (роговица) [Kubo М., Sonoda Y., Muramatsu R., Usui M. Immunogenicity of human amniotic membrane in experimental xenotransplantation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2001 Jun; 42(7): 1539-46]. С целью криоконсервации амниотическую мембрану аккуратно отделяют от хориона и нарезают на кусочки 5 см². Фрагменты амниотической мембраны промывают последовательно в 0.5 М, 1.0 М и 1.5 М DMSO и замораживают в 1.5 М DMSO при -80°С. При окрашивании препаратов криоконсервированной амниотической мембраны антителами к тяжелой и легкой цепям антигена МНС I класса выявляют положительную реакцию для эпителиальных клеток, мезенхимальных клеток и фибробластов. Таким образом, для амниотической мембраны характерна сильновыраженная экспрессия молекул МНС I класса, которая сохраняется после криоконсервации и в течение 6 месяцев во время хранения. Авторы оценили биосовместимости амниотической мембраны при лимбальной, интракорнеальной и гетеротипической имплантации (капсула почки). При имплантации криоконсервированного амниона в область глазного лимба крысам линии Левис наблюдали умеренную клеточную инфильтрацию, однако сам трансплантат был частично сохранен. Иммуногистохимический анализ через 1 неделю после операции показал, что имплантированный амнион был инфильтрирован главным образом CD4+-лимфоцитами. Таким образом, криоконсервированный трансплантат амниотической мембраны обладает относительной иммуногенностью при имплантации в иммунонепривилегированную область; ввиду того, что клетки практически всех трех слоев амниона экспрессируют HLA антигены класса Ia, которые являются антиген-презентирующими клетками Т-лимфоцитам глазного лимба. Однако, авторы показали, что при всех интракорнеальных ксенотрансплантациях амниотической мембраной отсутствовала иммунная реакция или Т-клеточная инфильтрация и ксенотрансплантаты сохраняли полную прозрачность при длительном наблюдении. При трансплантации амниона под почечную капсулу только несколько клеток хозяина инфильтрировали строму амниона, в отличие от криоконсервированных кожных ксенотрансплантатов, которые содержали большое количество HLA-DR - позитивных дендритных клеток кожи, в частности клеток Лангерганса. К недостаткам этого способа относится наличие после криоконсервации и размораживания живых клеток (фибробластов) в глубоких слоях амниона (компактный и спонгиозный слои), что при гетеротопической имплантации или трансплантации в иммунонепривилегированную область реципиента приводит к воспалительной инфильтрации. Амниотическая мембрана содержит существенно меньше фибробластов, экспрессирующих антиген II класса гистосовместимости и экспрессирует Fas лиганд (Fas L) - положительные мезенхимальные клетки в строме, который препятствует инфильтрации трансплантата лимфоцитами. Экспрессия антигена класса Ib (HLA-G и HLA-E) также характерна для клеток амниона; кроме этого, отмечается, что растворимая форма HLA-G (важный иммуносупрессивный фактор) секретируется эпителиальными клетками амиона и содержится в амниотической жидкости. Манифестация клетками амниона HLA-G может быть задействована в иммунологической толерантности: во-первых, HLA-G может играть роль толерогенного пептида, и соответственно, лимфоциты или дендритные клетки хозяина могут инактироваться связыванием HLA-G с ингибиторными рецепторами.There is a known method of processing the amniotic membrane, which consists in its cryopreservation with subsequent assessment of biocompatibility by implantation in the immunoprivileged area (ocular limbus, kidney capsule) and in the non-immunoprivileged area (cornea) [Kubo M., Sonoda Y., Muramatsu R., Usui M. Immunogenicity of human amniotic membrane in experimental xenotransplantation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2001 Jun; 42 (7): 1539-46]. For the purpose of cryopreservation, the amniotic membrane is carefully separated from the chorion and cut into 5 cm ² pieces. Amniotic membrane fragments are washed sequentially in 0.5 M, 1.0 M and 1.5 M DMSO and frozen in 1.5 M DMSO at -80 ° C. When the preparations of the cryopreserved amniotic membrane are stained with antibodies to the heavy and light chains of the MHC class I antigen, a positive reaction is detected for epithelial cells, mesenchymal cells and fibroblasts. Thus, the amniotic membrane is characterized by a strong expression of class I MHC molecules, which persists after cryopreservation and for 6 months during storage. The authors evaluated the biocompatibility of the amniotic membrane during limbal, intracorneal and heterotypic implantation (kidney capsule). When the cryopreserved amnion was implanted into the ocular limbus in Lewis rats, moderate cellular infiltration was observed, but the graft itself was partially preserved. Immunohistochemical analysis 1 week after surgery showed that the implanted amnion was infiltrated mainly with CD4 + lymphocytes. Thus, a cryopreserved amniotic membrane graft is relatively immunogenic when implanted into an immuno-privileged region; due to the fact that cells of practically all three layers of the amnion express HLA antigens of class Ia, which are antigen-presenting cells to T-lymphocytes of the optic limbus. However, the authors showed that in all intracorneal xenografts with amniotic membrane, there was no immune response or T-cell infiltration, and the xenografts retained complete transparency during long-term observation. When the amnion was transplanted under the renal capsule, only a few host cells infiltrated the amnion stroma, in contrast to cryopreserved skin xenografts, which contained a large number of HLA-DR - positive dendritic skin cells, in particular Langerhans cells. The disadvantages of this method include the presence after cryopreservation and thawing of living cells (fibroblasts) in the deep layers of the amnion (compact and spongy layers), which, during heterotopic implantation or transplantation into the immuno-privileged area of the recipient, leads to inflammatory infiltration. The amniotic membrane contains significantly fewer fibroblasts expressing the histocompatibility class II antigen and expresses the Fas ligand (Fas L) - positive mesenchymal cells in the stroma, which prevents the infiltration of the graft by lymphocytes. Expression of class Ib antigen (HLA-G and HLA-E) is also characteristic of amnion cells; in addition, it is noted that the soluble form of HLA-G (an important immunosuppressive factor) is secreted by amion epithelial cells and is contained in the amniotic fluid. The manifestation of HLA-G amnion cells can be involved in immunological tolerance: firstly, HLA-G can play the role of a tolerogenic peptide, and accordingly, lymphocytes or host dendritic cells can be inactivated by the binding of HLA-G to inhibitory receptors.

Известен способ получения лиофилизированных и криоконсервированных образцов амниотической мембраны [

МТ,

MJ,

R, Vieites B, Gude F, Silva MT, Couceiro J. Effects of lyophilization on human amniotic membrane. Acta Ophthalmol. 2009 Jun; 87(4): 396-403. doi: 10.1111/j.1755-3768.2008.01261.x.]. Экстраплацентарные зародышевые оболочки тщательно промывают от кровяных сгустков изотоническим раствором. Делают аккуратный неострый надрез и отделяют амниотическую мембрану от хориона, которую промывают несколько раз раствором антибиотиков - антимикотиков (10000 ЕД./мл, стрептомицин 50 мкг/мл и амфотерицин 2,5 мкг/мл). Затем амниотическую мембрану накладывают эпителиальной стороной вверх на нитроцеллюлозный фильтр и нарезают на куски 16 см². Часть образцов амниотической мембраны лиофилизируют и хранят в закрытом контейнере при комнатной температуре. Криоконсервированные образцы получают следующим образом: амнион помещают в среду содержащую эктрацеллюлярный криопротектор (DMEM и глицерин в соотношении 1:1) и хранят при -80°С. Криоконсервированные и лиофилизированные образцы хранят в течение одного месяца, при этом перед использованием криоконсервированные образцы размораживают при комнатной температуре, а лиофильно высушенные заливают изотоническим раствором для регидратации. Преимуществом данного способа является простота получения лиофильно высушенных образцов которые в дальнейшем могут использованы для получения гидрогелей амниотической мембраны. К недостаткам подобного способа можно отнести: 1)ухудшение структурной целостности криоконсервированных и лиофильно высушенных амнионов по сравнению с нативными образцами; так, например, гистологические препараты криоконсервированных амнионов характеризуются наличием плотно фиксированного на толстой базальной мембране слоя кубического эпителия с минимальной вакуолярной альтерацией, в то время как на препаратах лиофильно высушенного амниона вакуолярная альтерация (внутриклеточный отек) выражена в большей степени, при этом слой кубических эпителиальных клеток сохранен, однако наблюдается его стратификация наряду с бесклеточными участками, для стромы лиофильно высушенных препаратов амнион характерен эдематоз; 2) ухудшение биохимических свойств - в частности показано, что содержание тотального белка в экстрактах лиофильно высушенных препаратов амниона достоверно ниже, чем у нативных образцов, кроме того, содержание ростовых факторов bFGF и KGF у обработанных образцов амниона ниже по сравнению с нативными. Интересно, что уровень эпидермального фактора роста в лиофильно высушенных и криоконсервированных препаратах выше, чем у экстрактов нативного амниона; это объясняется тем, что этот фактор может выделяться в раствор при разрушении эпителиальных клеток; 3) препараты лиофильно высушенной амниотической мембраны содержат патологически измененные ядра клеток с вакуолярной альтерацией, потенциально способные индуцировать реакцию «трансплантат против хозяина».A known method of obtaining lyophilized and cryopreserved samples of the amniotic membrane [

MT,

MJ,

R, Vieites B, Gude F, Silva MT, Couceiro J. Effects of lyophilization on human amniotic membrane. Acta Ophthalmol. 2009 Jun; 87 (4): 396-403. doi: 10.1111 / j.1755-3768.2008.01261.x.]. Extraplacental embryonic membranes are thoroughly washed from blood clots with isotonic solution. A neat, non-sharp incision is made and the amniotic membrane is separated from the chorion, which is washed several times with a solution of antibiotics - antimycotics (10,000 U / ml, streptomycin 50 μg / ml and amphotericin 2.5 μg / ml). The amniotic membrane is then placed epithelial side up on a nitrocellulose filter and cut into 16 cm ² pieces. A portion of the amniotic membrane samples are lyophilized and stored in a closed container at room temperature. Cryopreserved samples are prepared as follows: the amnion is placed in a medium containing an extracellular cryoprotectant (DMEM and glycerol in a ratio of 1: 1) and stored at -80 ° C. Cryopreserved and lyophilized samples are stored for one month, while before use, cryopreserved samples are thawed at room temperature, and lyophilized ones are poured with isotonic solution for rehydration. The advantage of this method is the simplicity of obtaining freeze-dried samples, which can later be used to obtain amniotic membrane hydrogels. The disadvantages of this method include: 1) deterioration of the structural integrity of cryopreserved and freeze-dried amnions in comparison with native samples; for example, histological preparations of cryopreserved amnions are characterized by the presence of a layer of cubic epithelium tightly fixed on the thick basement membrane with minimal vacuolar alteration, while on preparations of freeze-dried amnion vacuolar alteration (intracellular edema) is more pronounced, with a layer of cubic epithelial cells preserved, however, its stratification is observed along with acellular areas; for the stroma of freeze-dried preparations, amnion is characterized by edematosis; 2) deterioration of biochemical properties - in particular, it has been shown that the content of total protein in extracts of freeze-dried amnion preparations is significantly lower than in native samples, in addition, the content of growth factors bFGF and KGF in treated amnion samples is lower than in native samples. Interestingly, the level of epidermal growth factor in freeze-dried and cryopreserved preparations is higher than in extracts of native amnion; this is due to the fact that this factor can be released into the solution during the destruction of epithelial cells; 3) preparations of freeze-dried amniotic membrane contain pathologically altered cell nuclei with vacuolar alteration, potentially capable of inducing a graft-versus-host reaction.

Известен способ получения экстракта амниотической мембраны для лечения щелочных ожогов роговицы у кроликов [Мальцев Д.С., Рудько А.С., Куликов А.Н., Черныш В.Ф. Влияние экстракта амниотической мембраны на эпителизацию и неоваскуляризацию в моделях повреждения роговицы // ТМЖ. 2018. №2 (72)]. В соответствии с этим способом экстраплацентарные оболочки получают через 4 часа после кесарева сечения, аккуратно отделяют амнион от хориона в стерильных условиях и трижды промывают раствором Хэнкса. Амниотическую мембрану массой 5 г измельчают до фрагментов размером 2-3 мм. Измельченную массу смешивают с кварцевым песком (размер частиц 0,1 мм) и гомогенизируют ручным способом с использованием ступки и пестика. Далее эмульсию амниотической мембраны суспенидируют в физиологическом растворе (20 мл) и центрифугируют при 2000 об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость, не содержащую визуально различимых частиц, отделяют от осадка и фильтруют через бактериальный фильтр с диаметром пор 0,22 мкм. Затем аликвоты отфильтрованного экстракта разливают в одноразовые флаконы-капельницы в стерильных условиях и хранят до использования при -20°С. Моделирование щелочных ожогов роговицы и лимба (площадь 50%, сектор ожога 180°С) проводят на половозрелых кроликах весом 2,5-3 кг, при этом щелочные ожоги роговицы и лимба наносят путем нанесения на поверхность роговицы аппликаторов изготовленных из фильтровальной бумаги, пропитанных 1,0N раствором NaOH. При этом время аппликации для обоих глаз составляет 1 мин. Далее проводят инсталляцию в опытный глаз экстракта амниотической мембраны 4 раза в сутки в течение 30 суток, в контрольный - 0,4% раствора гентамицина. В ходе наблюдения регулярно оценивают площадь эпителизации и неоваскуляризации роговицы, при этом результаты регистрируют на 1, 3, 7, 21 и 30-е сутки после ожога при окрашивании глазной поверхности 1% флюоресцеином натрия. Преимуществом данного способа является увеличение зоны эпителизации обожженной стромы роговицы при использовании экстракта амниотической мембраны, при этом полную эпителизацию роговицы отмечают на 30-е сутки после создания щелочного ожога с сохранением эпителиопатии. Недостатком данного способа является непрактичность использования частиц кварцевого песка для гомогенизации амниотической мембраны, которые требуют тщательного удаления, и, кроме того, отмечается сохранение эпителиопатии на 30-е сутки после инсталляции в пораженный глаз экстракта амниотической мембраны.A known method of obtaining an extract of the amniotic membrane for the treatment of alkaline corneal burns in rabbits [Maltsev DS, Rudko AS, Kulikov AN, Chernysh V.F. Effect of amniotic membrane extract on epithelialization and neovascularization in models of corneal injury // TMZh. 2018. No. 2 (72)]. In accordance with this method, extraplacental membranes are obtained 4 hours after cesarean section, the amnion is carefully separated from the chorion under sterile conditions and washed three times with Hanks solution. An amniotic membrane weighing 5 g is crushed to fragments 2-3 mm in size. The crushed mass is mixed with quartz sand (particle size 0.1 mm) and manually homogenized using a mortar and pestle. Next, the amniotic membrane emulsion is suspended in saline (20 ml) and centrifuged at 2000 rpm for 10 minutes. The supernatant liquid, which does not contain visually distinguishable particles, is separated from the sediment and filtered through a bacterial filter with a pore diameter of 0.22 μm. Then, aliquots of the filtered extract are dispensed into disposable dropper vials under sterile conditions and stored at -20 ° C until use. Modeling of alkaline burns of the cornea and limbus (area 50%, burn sector 180 ° C) is carried out on sexually mature rabbits weighing 2.5-3 kg, while alkaline burns of the cornea and limbus are applied by applying applicators made of filter paper impregnated with 1 , 0N NaOH solution. In this case, the application time for both eyes is 1 min. Then, the amniotic membrane extract is installed into the experimental eye 4 times a day for 30 days, in the control eye - 0.4% gentamicin solution. During the observation, the area of epithelialization and neovascularization of the cornea is regularly assessed, and the results are recorded on the 1st, 3rd, 7th, 21st and 30th days after the burn when the ocular surface is stained with 1% sodium fluorescein. The advantage of this method is an increase in the epithelialization zone of the burnt corneal stroma when using an extract of the amniotic membrane, while complete epithelialization of the cornea is noted on the 30th day after the creation of an alkaline burn with the preservation of epitheliopathy. The disadvantage of this method is the impracticality of using particles of quartz sand for homogenization of the amniotic membrane, which require careful removal, and, in addition, the preservation of epitheliopathy is noted on the 30th day after installation of the amniotic membrane extract into the affected eye.

Известен способ покрытия полнослойных ран в нижней трети носа с использованием бесклеточной амниотической мембраны [Xue SL, Liu К, Parolini О, Wang Y, Deng L, Huang YC. Human acellular amniotic membrane implantation for lower third nasal reconstruction: a promising therapy to promote wound healing. Burns Trauma. 2018; 6: 34].. Сначала при получении плацент от рожениц с информированным согласием выделяют амниотическую мембрану, которую несколько раз промывают стерильной водой. Далее проводят серологический скрининг для выявления ВИЧ 1, сифилиса, гепатита В и С. Свежую амниотическую мембрану погружают в раствор метанола и хлороформа, промывают стерильной дистиллированной водой и перфузируют додецилсульфатом натрия в дистиллированной воде в течение как минимум 5 часов. Далее погружают амнион в 0,25% трипсин на 6 часов и затем промывают физиологическим раствором. После амнион высушивают в сухом виде под вакуумом, нарезают на фрагменты 1 см², упаковывают в герметичный пассаж и стерилизуют гамма-излучением. Бесклеточный препарат амниотической мембраны хранят при комнатной температуре и изымают перед началом операции. При этом перед операцией пациент получает местную анестезию с помощью 0,1% лидокаина в положении супинации, затем поверхность раны разрезают скальпелем 15 с целью создания доступа к подкожным тканям, и с использованием влажной марли проводят гемостаз. При этом в опытной группе бесклеточный препарат амниотической мембраны сначала нарезают на кусочки (2*2 мм), накладывают на дно и стенку дефекта, после чего рану закрывают вазелиновой марлевой повязкой и сверху накладывают сухую повязку. В контрольной группе раневую поверхность закрывают без разрезания с использованием вазелиновой марлевой повязки и далее накладывают сухую марлю. Повязку меняют через день после операции и далее проводят замену каждые два дня до образования струпа. Преимуществом данного способа является снижение времени установления гемостаза при закрытии раневой поверхности с использованием децеллюляризированного лоскута амниотической мембраны. Дополнительно, бесклеточная амниотическая мембрана способствует исчезновению болевого синдрома после операции. Кроме того, при сравнении с контрольной группой, децеллюляризированная амниотическая мембрана ускоряет образование (4,75 суток) и сход струпа (6,70 суток) в постоперационном периоде. Закрытие глубокой раны с использованием децеллюляризированного препарата амниотической мембраны приводит к снижению возникновения кровотечений, инфицирования и образования рубцовой ткани. К недостаткам данного способа можно отнести использование высокотоксичных агентов (метанол и хлороформ), потенциально способных разрушить структуру амниотической мембраны, вызывающих ее расслоение и вакуолярную альтерацию клеток амниона. Кроме того погружение амниотической мембраны в раствор 0,25% трипсина приводит к ее разрушению, заметному даже на макроскопическом уровне, и к драматическому ухудшению механических свойств, что обусловливает разрыв мембраны при ее ушивании к раневой поверхности.A known method of covering full-thickness wounds in the lower third of the nose using acellular amniotic membrane [Xue SL, Liu K, Parolini O, Wang Y, Deng L, Huang YC. Human acellular amniotic membrane implantation for lower third nasal reconstruction: a promising therapy to promote wound healing. Burns Trauma. 2018; 6: 34] .. First, when receiving placentas from women in labor with informed consent, the amniotic membrane is isolated, which is washed several times with sterile water. Next, serological screening is performed to detect HIV 1, syphilis, hepatitis B and C. Fresh amniotic membrane is immersed in a solution of methanol and chloroform, washed with sterile distilled water and perfused with sodium dodecyl sulfate in distilled water for at least 5 hours. Next, the amnion is immersed in 0.25% trypsin for 6 hours and then washed with saline. After the amnion is dried in a dry form under vacuum, cut into fragments of 1 cm ² , packed in a sealed passage and sterilized by gamma radiation. The cell-free preparation of the amniotic membrane is stored at room temperature and removed prior to surgery. In this case, before the operation, the patient receives local anesthesia with 0.1% lidocaine in the supination position, then the surface of the wound is cut with a 15 scalpel in order to create access to the subcutaneous tissues, and hemostasis is performed using wet gauze. In this case, in the experimental group, the acellular preparation of the amniotic membrane is first cut into pieces (2 * 2 mm), applied to the bottom and wall of the defect, after which the wound is closed with a vaseline gauze bandage and a dry bandage is applied on top. In the control group, the wound surface is closed without cutting using a vaseline gauze bandage, and then dry gauze is applied. The bandage is changed one day after the operation and then the bandage is changed every two days until the scab forms. The advantage of this method is to reduce the time to establish hemostasis when closing the wound surface using a decellularized amniotic membrane flap. Additionally, the acellular amniotic membrane promotes pain relief after surgery. In addition, when compared with the control group, the decellularized amniotic membrane accelerates the formation (4.75 days) and descent of the scab (6.70 days) in the postoperative period. Closing a deep wound using a decellularized amniotic membrane preparation reduces bleeding, infection, and scar tissue formation. The disadvantages of this method include the use of highly toxic agents (methanol and chloroform), potentially capable of destroying the structure of the amniotic membrane, causing its stratification and vacuolar alteration of amnion cells. In addition, immersion of the amniotic membrane in a 0.25% trypsin solution leads to its destruction, noticeable even at the macroscopic level, and to a dramatic deterioration in mechanical properties, which causes the membrane to rupture when it is sutured to the wound surface.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому способу является способ применения порошка и гидрогеля амниотической мембраны для лечения полнослойных кожных ран у свиней [S.S. Murphy., A. Nelson, R. Sunnon, A. Atala. Amnion Membrane Hydrogel and Amnion Membrane Powder Accelerate Wound Healing in a Full Thickness Porcine Skin Wound Model. STEM CELLS Translational Medicine. (2019)]. С целью получения порошка амниотической мембраны плаценту сначала отмывают физраствором от кровяных сгустков, затем амниотическую отделяют от хориона ножницами или пинцетом, далее амнион нарезают на участки 5*5 см², после чего 5 раз промывают 0,9% NaCl и затем один раз - стерильной очищенной бидистиллированной водой. Далее амнион помещают в конические пробирки и замораживают на -80°. Замороженную ткань затем переносят в стеклянные флаконы для лиофильной сушки и лиофилизируют, полученный при этом лиофилизат далее подвергают измельчению до тонкодисперсной пудры с помощью криомельницы. Далее полученную пудру разносят в стерильные флаконы из боросиликатного стекла и стерилизуют гамма-излучением в дозе 10-12 кГр, после стерилизации порошок амниотической мембраны хранят на -80°С. При этом гидрогель был получен следующим образом: 220 мг стерильного порошкообразного амниона и 22 мг пепсина добавляют в 15 мл пробирку, далее растворяют в 10 мл 0,01 н. соляной кислоты. Кислый гидролиз матрикса амниона проводят в течение двух суток при 37°С. Далее переваренный продукт центрифугируют при 4500 об./мин в течение 10 минут. После чего супернатант удаляют и переносят в новую 15 мл пробирку. Раствор нейтрализуют NaOH до рН=7. Далее используют набор для получения гидрогеля из тиол-модифицированного гиалуронана, желатина и гепарина, при этом смешивают Heprasil (натриевая соль гиалуроновой кислоты, содержащая тиол-функциональную группу с добавлением тиол модифицированного гепарина), Gelin-S® (желатин с тиольной группой) и кросс-сшивающий агент Extralink® (полиэтиленгликольдиакрилат) в соотношении 2:2:1, после чего смешивают гидрогель с раствором переваренной амниотической мембраны в соотношении 1:1. Формирование гидрогеля индуцируют при облучении источником УФ (длина волны 365 нм, мощность 18 Вт/см²) на расстоянии 3 см от образца до источника. С целью моделирования полнослойных кожных ран используют шестерых йоркширских свиней, свободных от видоспецифических патогенов, которые проходят карантин в течение 2 недель. Далее животных наркотизиуруют кетамином, ксилазином и ацепромазином, при этом наркоз поддерживают ингаляцией изофлюрана. Далее животных бреют в области спины, фиксируют и размещают в дорсальной позиции. Расчерчивают 8 квадратов в дорсальной области площадью 4*4 см² каждый с целью четкого обозначения границ раны. Кожу промывают мыльной водой и дезинфицируют β-йодином и 70% спиртом. В областях спины, груди и поясницы делают полнослойные разрезы кожи вплоть до поперечно-полосатой мускулатуры подкожной клетчатки, с удалением всех вышележащих слоев кожи. Далее распределяют животных на 6 экспериментальных групп: гидрогель амниотической мембраны, порошок, фотополимеризующийся гидрогель, GraftJacket (децеллюлялизированный лоскут кожи человека), AmnioGraft (криоконсервированный листок амниотической мембраны) и контроль (стандартное наложение на рану повязки). Наблюдение за животными проводят в течение 28 дней, при этом в ходе наблюдения два раза в неделю регистрируют площадь раны и реэпителизацию. Животных выводят из эксперимента введением летальной дозы пентобарбитала внутривенно, изымают кожу в местах наложения покрытий. Закрытие ран и эпителизацию измеряют на дни 0, 4, 7, 11, 14, 18, 21, 24 и 28 путем обработки изображений в ImageJ, при которой площадь открытой раны и эпителизация выражаются цветом и текстурой залечивающейся раны. Уменьшение площади раневой поверхности (контракция) выражают как относительное значение начальной площади, ограниченной расчерченным квадратом (до создания раны) против площади квадрата в день наблюдения. К преимуществам данного способа относится эффективность применения гидрогеля и порошка из амниотической мембраны в закрытии полнослойных кожных ран у группы с имплантированным гидрогелем из амниотической мембраны характеризовалась самой маленькой площадью раневой поверхности и значительным улучшением регенерации по сравнению с группой с имплантированным фотополимеризуемым гидрогелем, заметным на 11 день (44,7% против 80,9%), 14 (25.3% против 49.5%) и 18 сутки (15.0% vs. 34.5%; р<.05), в то время как у группы с имплантированным подкожно порошком амниона площадь раны была наименьшей после гидрогеля, и значительно ниже по сравнению контроля с наложением повязки на 18 (22.5% против 32.4%) и 24 сутки (3.6% против 14.1%; р<.05). Недостатком данного способа относится неспособность гидрогеля из амниотической мембраны к самостоятельному желированию из-за низкого содержания коллагена I типа [

, J., Ahearne, М. The impact of decellularization methods on extracellular matrix derived hydrogels. Sci Rep 9, 14933 (2019)], что тем самым обусловливает необходимость использования вспомогательного гидрогеля из тиол-модифицированных гиалуроната натрия, гепарина и желатина с добавлением полиэтиленгликольдиакриалата (PEGDA) в качестве сшивающего агента; использование же вспомогательного гидрогеля для лечения полнослойных кожных ран не приводит к значимому уменьшению площади раневой поверхности по сравнению с обычной повязкой. Кроме того, продукты распада соединений содержащих акрильную группу токсичны, акриламид обладает канцерогенным действием, поэтому биоматериалы на основе акриламида (биочернила, гидрогели) не имеют перспектив для клинического применения.The closest in technical essence to the proposed method is a method of using powder and hydrogel of the amniotic membrane for the treatment of full-thickness skin wounds in pigs [SS Murphy., A. Nelson, R. Sunnon, A. Atala. Amnion Membrane Hydrogel and Amnion Membrane Powder Accelerate Wound Healing in a Full Thickness Porcine Skin Wound Model. STEM CELLS Translational Medicine. (2019)]. In order to obtain a powder of the amniotic membrane, the placenta is first washed with saline from blood clots, then the amniotic membrane is separated from the chorion with scissors or tweezers, then the amnion is cut into sections 5 * 5 cm ² , after which it is washed 5 times with 0.9% NaCl and then once with sterile purified bidistilled water. Next, the amnion is placed in conical tubes and frozen at -80 °. The frozen tissue is then transferred to glass vials for freeze-drying and lyophilized, the resulting lyophilisate then subjected to grinding to a fine powder using a cryo-mill. Next, the resulting powder is distributed into sterile vials of borosilicate glass and sterilized by gamma radiation at a dose of 10-12 kGy, after sterilization, the amniotic membrane powder is stored at -80 ° C. In this case, the hydrogel was obtained as follows: 220 mg of sterile powdered amnion and 22 mg of pepsin are added to a 15 ml test tube, then dissolved in 10 ml of 0.01 N hydrochloric acid. of hydrochloric acid. Acidic hydrolysis of the amnion matrix is carried out for two days at 37 ° C. Next, the digested product is centrifuged at 4500 rpm for 10 minutes. Then the supernatant is removed and transferred to a new 15 ml tube. The solution is neutralized with NaOH to pH = 7. Next, a set is used to obtain a hydrogel from thiol-modified hyaluronan, gelatin and heparin, while mixing Heprasil (sodium salt of hyaluronic acid containing a thiol-functional group with the addition of a thiol-modified heparin), Gelin-S® (gelatin with a thiol group) and cross -crosslinking agent Extralink® (polyethylene glycol diacrylate) in a ratio of 2: 2: 1, after which the hydrogel is mixed with a solution of the digested amniotic membrane in a ratio of 1: 1. The formation of the hydrogel is induced by irradiation with a UV source (wavelength 365 nm, power 18 W / cm ² ) at a distance of 3 cm from the sample to the source. In order to simulate full-thickness skin wounds, six Yorkshire pigs are used, free from species-specific pathogens, which are quarantined for 2 weeks. Then the animals are anesthetized with ketamine, xylazine and acepromazine, while the anesthesia is maintained by inhalation of isoflurane. Then the animals are shaved in the back, fixed and placed in the dorsal position. 8 squares are drawn in the dorsal region with an area of 4 * 4 cm ² each in order to clearly mark the boundaries of the wound. The skin is washed with soapy water and disinfected with β-iodine and 70% alcohol. In the areas of the back, chest and lower back, full-layer skin incisions are made up to the striated musculature of the subcutaneous tissue, with the removal of all overlying skin layers. Then the animals are divided into 6 experimental groups: amniotic membrane hydrogel, powder, photopolymerizable hydrogel, GraftJacket (decellularized human skin flap), AmnioGraft (cryopreserved amniotic membrane leaf) and control (standard dressing on the wound). Observation of the animals is carried out for 28 days, while during the observation, the wound area and re-epithelialization are recorded twice a week. The animals are removed from the experiment by the introduction of a lethal dose of pentobarbital intravenously, and the skin is removed from the places where the coatings are applied. Wound closure and epithelialization are measured on days 0, 4, 7, 11, 14, 18, 21, 24 and 28 by image processing in ImageJ, in which the open wound area and epithelialization are expressed by the color and texture of the healing wound. The reduction in the area of the wound surface (contraction) is expressed as the relative value of the initial area bounded by the drawn square (before the creation of the wound) versus the area of the square on the day of observation. The advantages of this method include the effectiveness of the use of the hydrogel and powder from the amniotic membrane in the closure of full-thickness skin wounds in the group with the implanted hydrogel from the amniotic membrane was characterized by the smallest wound surface area and a significant improvement in regeneration compared with the group with the implanted photopolymerizable hydrogel, noticeable on day 11 ( 44.7% vs. 80.9%), 14 (25.3% vs. 49.5%) and 18 days (15.0% vs. 34.5%; p <.05), while the group with subcutaneously implanted amnion powder had a wound area the smallest after the hydrogel, and significantly lower compared to the control with the application of the dressing at 18 (22.5% versus 32.4%) and 24 days (3.6% versus 14.1%; p <.05). The disadvantage of this method is the inability of the hydrogel from the amniotic membrane to self-gelation due to the low content of type I collagen [

, J., Ahearne, M. The impact of decellularization methods on extracellular matrix derived hydrogels. Sci Rep 9, 14933 (2019)], which thus necessitates the use of an auxiliary hydrogel of thiol-modified sodium hyaluronate, heparin and gelatin with the addition of polyethylene glycol diacrylate (PEGDA) as a crosslinking agent; the use of an auxiliary hydrogel for the treatment of full-thickness skin wounds does not lead to a significant decrease in the area of the wound surface in comparison with a conventional dressing. In addition, the decomposition products of compounds containing an acryl group are toxic, acrylamide has a carcinogenic effect, therefore biomaterials based on acrylamide (bio-ink, hydrogels) have no prospects for clinical use.

Техническим результатом предлагаемого нами способа является получение бесклеточного матрикса амниотической мембраны для последующей реконструкции дефектов тканей вследствие термических, химических и радиационных ожогов, язв и др., в качестве покрытия с сохранными структурными компонентами внеклеточного матрикса не вызывающего воспалительного фиброза и макрофагально-лимфоцитарной инфильтрации с целью заживления пораженной поверхности за счет повышения репаративных и иммунных процессов, восстановления трофики, ремоделирования фиброзной, соединительной ткани.The technical result of our proposed method is to obtain a cell-free matrix of the amniotic membrane for subsequent reconstruction of tissue defects due to thermal, chemical and radiation burns, ulcers, etc., as a coating with intact structural components of the extracellular matrix that does not cause inflammatory fibrosis and macrophage-lymphocytic infiltration for the purpose of healing the affected surface due to an increase in reparative and immune processes, restoration of trophism, remodeling of fibrous, connective tissue.

Указанный технический результат достигается тем, что донорскую плаценту переносят в ламинарно-потоковый шкаф биологической II класса биологической опасности, отделяют внутреннюю плодную амниотическую оболочку от хориона, при этом из одной плаценты выделяют примерно 300 см² амниотической мембраны, после чего выделенные фрагменты амниона площадью 50 см² тщательно отмывают от крови в фосфатно-солевом буферном растворе с добавлением 250 ЕД./мл пенициллина и 250 мкг/мл стрептомицина троекратно в течение суток, через каждые 3 часа проводят замену раствора; затем выделенные фрагменты амниотической мембраны площадью 50 см² подвергают детергентно-ферментативной децеллюляризации, используя при этом: (1) 0,5% дезоксихолат натрия + 0,5% TritonX100 - 24 ч, 400 об/мин; (2) 0,05% Трипсин-ЭДТА - 1 ч, 200 об/мин; (3) DMEM, 10% FBS, 1% пенициллин-стрептомицина - 24 ч, 400 об/мин; (4) 300 ЕД/мл ДНКазы I, 40 mM Tris-HCl, 10 тМ MgCl2, 10 тМ NaCl - 16 ч, 400 об/мин; (5) PBS, 1% пенициллина-стрептомицина - 48 ч, 400 об/мин, после чего матрикс анализируют на наличие/отсутствие ядер клеток или теней ядер, сохранность основных компонентов внеклеточного матрикса (коллаген, ламинин, фибронектин) и уровень остаточной геномной ДНК.The specified technical result is achieved by the fact that the donor placenta is transferred into a laminar flow cabinet of biological II class of biological hazard, the internal fetal amniotic membrane is separated from the chorion, while about 300 cm ^{2 of the} amniotic membrane is isolated from one placenta, after which the isolated amnion fragments with an area of 50 cm ^{2 are} thoroughly washed from blood in phosphate-buffered saline with the addition of 250 U / ml of penicillin and 250 μg / ml of streptomycin three times during the day, the solution is replaced every 3 hours; then the isolated fragments of the amniotic membrane with an area of 50 cm ² are subjected to detergent-enzymatic decellularization using: (1) 0.5% sodium deoxycholate + 0.5% TritonX100 - 24 hours, 400 rpm; (2) 0.05% Trypsin-EDTA - 1 hour, 200 rpm; (3) DMEM, 10% FBS, 1% penicillin-streptomycin - 24 h, 400 rpm; (4) 300 U / ml DNase I, 40 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 10 mM NaCl - 16 h, 400 rpm; (5) PBS, 1% penicillin-streptomycin - 48 h, 400 rpm, after which the matrix is analyzed for the presence / absence of cell nuclei or nuclei shadows, the integrity of the main components of the extracellular matrix (collagen, laminin, fibronectin) and the level of residual genomic DNA ...

Режим предлагаемого способа основан на анализе результатов наблюдений за 10 лабораторными животными, которым имплантировали в брюшную область бесклеточных матрикс амниотической мембраны.The mode of the proposed method is based on the analysis of the results of observations of 10 laboratory animals, which were implanted in the abdominal region of the cell-free matrix of the amniotic membrane.

Описание предлагаемого способаDescription of the proposed method

Для получения бесклеточных матриксов амниотической мембраны получали плаценту от роженицы с информированным согласием, прошедшей скрининг на ВИЧ, гепатит и сифилис. Далее плаценту переносили в ламинарно-потоковый шкаф биологической II класса биологической опасности, отделяли внутреннюю плодную амниотическую оболочку от хориона. Бесклеточный матрикс амниотической мембраны, полученный детергентно-ферментативным методом децеллюляризации, включающий такие этапы как (1) 0,5% дезоксихолат натрия + 0,5% TritonX100 - 24 ч, 400 об/мин; (2) 0,05% Трипсин-ЭДТА - 1 ч, 200 об/мин; (3) DMEM, 10% FBS, 1% пенициллин-стрептомицина - 24 ч, 400 об/мин; (4) 300 ЕД/мл ДНКазы I, 40 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl₂, 10 тМ NaCl - 16 ч, 400 об/мин; (5) PBS, 1% пенициллина-стрептомицина - 48 ч, 400 об/мин, был проанализирован на наличие /отсутствие ядер клеток или теней ядер, сохранность основных компонентов внеклеточного матрикса (коллаген I типа, ламинин, фибронектин, окрашивание фиксированных срезов тканевого матрикса DAPI) и уровень остаточной геномной ДНК. Далее матрикс имплантировали в брюшную область крысы Wistar, при этом студенистый препарат децеллюляризированной амниотической мембраны 1*1 см² имплантируют подкожно внутрибрюшинно, закрепив ниткой 7-0 к стенке брюшной полости. Наблюдение за лабораторными животными проводили в течение трех месяцев. У лабораторных животных не наблюдали вызывающего воспалительного фиброза и макрофагально-лимфоцитарной инфильтрации в месте имплантации, отмечалось заживление пораженной поверхности за счет повышения репаративных и иммунных процессов, восстановления трофики, ремоделирования фиброзной, соединительной ткани. При гистологическом анализе участка брюшной стенки с закрепленным на ней амнионом обнаруживали фрагмент поперечно-полосатой мышечной ткани с окружающей жировой клетчаткой, наличием небольшого линейной формы участка слабовыраженного фиброза без воспалительной реакции, а также остатками шовного материла с перифокальной лимфоцитарной инфильтрацией. При этом сами экстраплацентарные оболочки на гистологическом препарате не определяются. Для эксперимента выбраны 10 самцов крыс линии Wistar весом 120 г, имеющее ветеринарное свидетельство и прошедшее карантин.To obtain acellular matrices of the amniotic membrane, placenta was obtained from a woman in labor with informed consent, who was screened for HIV, hepatitis and syphilis. Then the placenta was transferred to a laminar flow cabinet of biological II class of biological hazard, the inner fetal amniotic membrane was separated from the chorion. Acellular matrix of the amniotic membrane, obtained by the detergent-enzymatic method of decellularization, including such steps as (1) 0.5% sodium deoxycholate + 0.5% TritonX100 - 24 hours, 400 rpm; (2) 0.05% Trypsin-EDTA - 1 hour, 200 rpm; (3) DMEM, 10% FBS, 1% penicillin-streptomycin - 24 h, 400 rpm; (4) 300 U / ml DNase I, 40 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl ₂ , 10 tM NaCl - 16 h, 400 rpm; (5) PBS, 1% penicillin-streptomycin - 48 h, 400 rpm, was analyzed for the presence / absence of cell nuclei or nuclei shadows, preservation of the main components of the extracellular matrix (type I collagen, laminin, fibronectin, staining of fixed tissue matrix sections DAPI) and the level of residual genomic DNA. Next, the matrix was implanted into the abdominal region of a Wistar rat, while a gelatinous preparation of a decellularized amniotic membrane 1 * 1 cm ^{2 is} implanted subcutaneously intraperitoneally, fixing with a 7-0 thread to the wall of the abdominal cavity. Observation of laboratory animals was carried out for three months. In laboratory animals, no causing inflammatory fibrosis and macrophage-lymphocytic infiltration at the implantation site was observed, healing of the affected surface was noted due to an increase in reparative and immune processes, trophic restoration, remodeling of fibrous, connective tissue. Histological analysis of the area of the abdominal wall with the amnion attached to it revealed a fragment of striated muscle tissue with surrounding fatty tissue, the presence of a small linear form of a site of mild fibrosis without an inflammatory reaction, as well as remnants of suture material with perifocal lymphocytic infiltration. In this case, the extraplacental membranes themselves are not determined on the histological specimen. For the experiment, 10 male Wistar rats weighing 120 g, which had a veterinary certificate and passed quarantine, were selected.

Claims

A method of obtaining a cell-free matrix of the amniotic membrane for the subsequent reconstruction of tissue defects as a coating with intact structural components of the extracellular matrix, characterized in that the donor placenta is transferred to a laminar flow cabinet of class II biological hazard, the internal fetal amniotic membrane is separated from the chorion the placenta secrete about 300 cm ^{2 of the} amniotic membrane, after which the isolated fragments of the amnion with an area of 50 cm ^{2 are} thoroughly washed from the blood in phosphate-buffered saline solution with the addition of 250 U / ml of penicillin and 250 μg / ml of streptomycin three times during the day, every 3 hours the solution is replaced, then the isolated fragments of the amniotic membrane with an area of 50 cm ² are subjected to detergent-enzymatic decellularization using: (1) 0.5% sodium deoxycholate + 0.5% TritonX100 - 24 hours, 400 rpm; (2) 0.05% Trypsin-EDTA - 1 hour, 200 rpm; (3) DMEM, 10% FBS, 1% penicillin-streptomycin - 24 h, 400 rpm; (4) 300 U / ml DNase I, 40 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl ₂ , 10 mM NaCl - 16 h, 400 rpm; (5) PBS, 1% penicillin-streptomycin - 48 h, 400 rpm, after which the matrix is analyzed for the presence / absence of cell nuclei or nuclei shadows, the integrity of the main components of the extracellular matrix (collagen, laminin, fibronectin) and the level of residual genomic DNA ...