RU2702833C1 - Штамм вируса гриппа A/HK/HK/6:2/2016 (H9N2) для получения инактивированных и живых гриппозных вакцин - Google Patents
Штамм вируса гриппа A/HK/HK/6:2/2016 (H9N2) для получения инактивированных и живых гриппозных вакцин Download PDFInfo
- Publication number
- RU2702833C1 RU2702833C1 RU2018145879A RU2018145879A RU2702833C1 RU 2702833 C1 RU2702833 C1 RU 2702833C1 RU 2018145879 A RU2018145879 A RU 2018145879A RU 2018145879 A RU2018145879 A RU 2018145879A RU 2702833 C1 RU2702833 C1 RU 2702833C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- virus
- strain
- influenza
- viruses
- reassortant
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой Influenzavirus А, подтип H9N2, штамм А/HK/HK/6:2/2016 (H9N2), депонированный в Государственную коллекцию вирусов ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России под №2884, для производства инактивированных и живых гриппозных вакцин против потенциально пандемического вируса гриппа A/H9N2. Изобретение позволяет усилить защитные действия вакцин против пандемического вируса гриппа А подтипа Н9. 3 ил., 5 табл., 5 пр.
Description
Изобретение относится к области медицинской биотехнологии и предназначено для получения моно- или поливалентных инактивированных (ИГВ) и живых (ЖГВ) гриппозных вакцин в целях иммунизации населения против потенциально пандемических вирусов гриппа А подтипа Н9. Полученный вакцинный штамм относится к семейству Orthomyxoviridae, род Influenza virus А.
Вирусы гриппа, циркулирующие среди животных, создают угрозу здоровью человека в случае непосредственного инфицирования и еще большую - при реассортации с вирусами человека, часто приводящей к возникновению особо патогенных вирусов с новыми антигенными свойствами.
Большинство вирусов диких птиц циркулируют и среди домашней птицы, вызывая у них заболевания разной степени тяжести, представляя угрозу для человека. Вирусы подтипа A/H9N2, как правило, являются вирусами с низкой патогенностью, вызывающие легкое и умеренное заболевание. Однако коинфекция с другими патогенами вызывает случаи тяжелых заболеваний и смертельные исходы [Dong G. et al., 2011]. Вирус A/H9N2 впервые был выделен из индейки в Висконсине в 1966 году [Gao Н. et al., 2015]. Начиная с 1990х вирус укоренился в странах Азии, Ближнего Востока и Северной Африки [Gu М., 2017]. На текущий момент вирус был детектирован у множества видов диких и домашних птиц во многих странах по всему миру и считается самым распространенным подтипом вируса гриппа среди домашней птицы [Li X. et al., 2018; Alexander D.J., 2007]. Вирусы подтипа A/H9N2 были обнаружены и у свиней, в организме которых может произойти реассортация с другими подтипами вирусов гриппа, что приведет к появлению потенциально пандемических вариантов вируса.
Также зарегистрированы случаи поражения людей вирусом подтипа A/H9N2 [Xu С. et al., 2018]. Генетический анализ вирусов подтипа A/H9N2, выделенных от домашней птицы, показал, что вирусы способны связываться и с α-2-6 сиалозидами, которые являются рецепторами человеческого типа, а также способны передаваться воздушно-капельным путем между хорьками, что является предпосылкой к передаче вируса от человека к человеку [Li X. et al., 2014]. Кроме того, недавние исследования показали, что вирусы A/H9N2 являются донором сегментов внутренних белков для таких высокопатогенных вирусов как A/H5N1, A/H7N9, A/H5N6 и A/H10N8 [Gu М., 2017; Wei Y., 2016]. Таким образом, распространение низкопатогенного вируса A/H9N2 у разных хозяев способствует появлению новых вариантов высокопатогенных вирусов. По всем этим факторам, а также из-за отсутствия иммунитета у популяции людей к вирусу данного подтипа, вирус A/H9N2 имеет пандемический потенциал [Longping V.Т. et al., 2014]
Необходимость разработки противопандемических мер, в том числе и для борьбы с вирусами птичьего гриппа, отражена в приказе Роспотребнадзора РФ [Приказ №40 от 28.12.2004]. В «Глобальном плане ВОЗ по подготовке к борьбе с гриппом» до начала пандемии национальным органам рекомендуется испытывать и лицензировать пандемические вакцины, а также поддерживать развитие производства и обмена прототипами сезонных и пандемических вакцин, для возможного целевого их применения. В связи с этим актуальными являются исследования по подготовке вакцинных препаратов против вирусов гриппа подтипов A/H9N2, а также испытания этих вакцинных препаратов на животных моделях.
В настоящее время работы по созданию вакцин против пандемических вирусов гриппа подтипа A/H9N2 ведутся во всем мире, ряд вакцин находятся на различных стадиях доклинических [Desheva Y.A., 2015] и клинических испытаний [Karron R.A.,2009; Atmar R.L., 2011; Aichinger G., 2015; Nicholson K.G., 2009]. Это в основном инактивированные вакцины, полученные на основе штаммов, выделенных от человека. (Табл. 1)
В качестве донора генов внутренних белков для получения реассортанта на основе вируса A/H9N2 мы использовали разработанный в ФГБУ «НИИ гриппа» Минздрава России универсальный донор А/Гонконг/1/68/162/35 (H3N2) [Патент №2511431 от 25.07.2011], который ориентирован на получение реассортантных штаммов как для живой, так и для инактивированной гриппозных вакцин.
Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, было получение реассортанта на основе вируса гриппа A/H9N2 и донора генов внутренних белков A/Гонконг/1/68/162/35(H3N2) методом классической генетической реассортации, для производства инактивированных и живых гриппозных вакцин.
Получение штамма вируса гриппа RA-52 (A/HK/HK/6:2/2016 (H9N2))
Штамм вируса гриппа RA-52 (A/HK/HK/6:2/2016 (H9N2)) получен методом классической генетической реассортации штамма-донора А/Гонконг/1/68/162/35 (H3N2) и потенциально пандемического вируса A/Hong Kong/1073/99 (H9N2). При получении штамма было проведено 12 пассажей в 10-12 дневных развивающихся куриных эмбрионах. Селективными факторами для отбора необходимых клонов являлись пониженная температура (26°С) и присутствие гипериммунной сыворотки к штамму А/Гонконг/1/68/162/35 (H3N2).
Штамм представляет собой реассортант с формулой генома 6:2. Состав генома: 6 генов внутренних и неструктурных белков (РВ2, РВ1, PA, NP, М и NS) от вируса-донора А/Гонконг/1/68/162/35 (H3N2) и 2 гена (НА и NA) от вируса дикого типа.
Подтверждение состава генома было выполнено с использованием рестрикционного анализа ДНК-копий сегментов РНК, полученных с помощью обратно-транскриптазной полимеразно-цепной реакции (ОТ-ПЦР). Полученные с помощью ОТ-ПЦР ДНК-копии сегментов РВ2, РВ1, PA, NP, М и NS вирусов А/Гонконг/1/68/162/35 и A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) (обозначены на фиг. 1 как Н3 и Н9) обрабатывали эндонуклеазами рестрикции Bse3DI, MroNI, Ama87I, PstI, BslFI и BslFI соответственно. Принадлежность NA определяли методом ОТ-ПЦР с типоспецифичными праймерами к различным субтипам. Анализ ДНК-копий сегментов РНК (фиг. 1) показал, что реассортант RA-52 имеет состав генома 6:2.
Антигенное соответствие гемагглютинина родительскому штамму дикого типа у реассортанта RA-52 было подтверждено в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) (табл. 2).
Показано, что вакцинный кандидат RA-52 антигенно идентичен родительскому штамму дикого типа.
Полногеномное секвенирование показало отсутствие у реассортанта RA-52 замен в нуклеотидной последовательности, по сравнению с родительскими штаммами. Нуклеотидные последовательности сегментов реассортанта RA-52 опубликованы в базе данных GISAID под номером EPI_ISL_321099.
Характеристика полученного штамма
Пример 1. Репродуктивные свойства штамма A/HK/HK/6:2/2016 (H9N2) (RA-52).
Штамм вируса гриппа RA-52 тестировали на инфекционную активность путем заражения развивающихся куриных эмбрионов 10-дневного возраста в соответствии с Методическими указаниями 3.3.2.1758-03 "Методы определения показателей качества иммунобиологических препаратов для профилактики и диагностики гриппа". Готовили десятикратные падающие разведения вируссодержащей аллантоисной жидкости. Каждым разведением начиная с 10-4 до 10-10 заражали по 3 куриных эмбриона. Инкубировали 48 часов при температуре 32°С. Наличие вируса определяли в РГА, инфекционную активность вируса рассчитывали по методу Рида и Менча.
Штамм вируса гриппа A/HK/HK/6:2/2016 (H9N2) показал высокую репродуктивную активность в РКЭ. Гемагглютинирующая активность реассортанта RA-52 составила 512-1024 ГАЕ/50 мкл с 0,5% взвесью куриных эритроцитов. Инфекционная активность в РКЭ составила - 8,5 lgЭИД50/0,2 мл.
Пример 2. Вакцинный штамм RA-52 обладает свойствами температурной чувствительности и холодоадаптированности.
Донор А/Гонконг/1/68/162/35 является универсальным, то есть обладает как высокой репродуктивностью, так и маркерами аттенуации - имеет температурочувствительный (ts) и холодоадаптированный (ca) фенотип. Реассортанты на основе донора А/Гонконг/1/68/162/35, также наследуют ts-, ca-фенотип.
Полученный реассортант наследовал от штамма-донора А/Гонконг/1/68/162/35 ts-, ca-фенотип - способность хорошо репродуцироваться при пониженной температуре и почти полную потерю способности к репродукции при повышенной температуре (табл. 3).
RCT (Reproductive capacity at different temperatures) - репродуктивная способность при различных температурах
ts - температурочувствительный фенотип (RCT39 более 5 lgЭИД50/0,2 мл)
ca - холодоадаптированный фенотип (RCT26 не более 3 lgЭИД50/0,2 мл)
Стабильность реассортанта проверяли 5-кратным пассированием при температуре 32°C в системе РКЭ. Степень температурочувствительности и холодоадаптированности, а также уровень репродукции реассортантного штамма не изменялись. Таким образом, реассортантный штамм удовлетворяет требованиям температурочувствительности и холодовой адаптации, предъявляемым к вакцинным штаммам для ЖГВ, и требованиям высокой репродуктивности для ИГВ.
Пример 3. Заявляемый вакцинный штамм RA-52 безопасен для мышей.
Тестирование штамма вируса гриппа RA-52 на специфическую безопасность проводили на линейных белых мышах Balb/c, самках, массой 18-20 г (16 шт.). В исследованиях использовали здоровых животных, на которых ранее не проводили какие-либо испытания. Испытания проводили в соответствии с методическими указаниями МУК 4.1/4.2.588-96.
Мышей инфицировали интраназально в дозе 6,5 lgЭИД50 на мышь, в объеме 50 мкл. В течение периода наблюдения (14 суток) у животных не наблюдалось потери массы тела (фиг. 2) и развития клинических симптомов инфекции. На 3-й и 6-е сутки после заражения у трех мышей проводили забор органов (легкие, носовые ходы) с целью индикации антигена и его накопления. Репродукцию вируса определяли по показателям титрования суспензии органов в культуре клеток MDCK. Результаты приведены в табл. 4.
У мышей, инфицированных штаммом дикого типа, наблюдается репродукция вируса в носовых ходах как на 3-й, так и на 6-е сутки. В легких на 3-й сутки наблюдается высокий уровень репликации вируса. У мышей, инфицированных реассортантным штаммом, наблюдалось наличие вируса только в носовых ходах на 3-й и 6-е сутки, при этом уровень репликации вируса к 6-м суткам заметно снижался. В легких вирус не реплицируется, что подтверждает его аттенуированный фенотип. Полученные данные доказывают специфическую безопасность реассортантного штамма RA-52.
Пример 4. Вакцинный штамм RA-52 является иммуногенным для мышей.
На основе реассортантных штаммов были подготовлены кандидатные вакцинные препараты живой и инактивированной гриппозных вакцин (ЖГВ и ИГВ соответственно). Для получения ЖГВ накопленный вирусный материал реассортантного вируса разводили фосфатно-солевым буфером (ФСБ) до концентрации 6,5 lgЭИД50/50 мкл. ЖГВ вводили интраназально, в объеме 50 мкл. Для получения ИГВ вирусный материал инактивировали 0,02% формалином, затем очищали и концентрировали методом изопикнического центрифугирования в градиенте плотности сахарозы. Содержание гемагглютинина в вакцинном препарате оценивали методом электрофореза в полиакриламидном геле с последующей денситометрией. Доза ИГВ (250 мкл) содержала 10 мкг НА. В качестве адъюванта в одной из групп использовали полиоксидоний (ПО) - 200 мкг на дозу. ИГВ вводили внутримышечно (в верхнюю треть бедра задних конечностей).
Препараты ЖГВ и ИГВ использовали для иммунизации мышей и исследования иммуногенности. Иммунизация была проведена двукратно с двухнедельным интервалом. Данные по содержанию антигемагглютинирующих антител к вирусам гриппа в сыворотках крови мышей, иммунизированных препаратами ЖГВ и ИГВ RA-52, демонстрируют достоверное (p<0,05) повышение уровня антигемагглютинирующих антител по сравнению с контрольными животными. Среднегеометрический титр (СГТ) антигемагглютинирующих антител в сыворотках после 2й иммунизации ЖГВ, ИГВ и ИГВ + ПО составил 320,139.3 и 367.6 соответственно (фиг. 3).
Полученные данные показывают, что после иммунизации мышей моновакцинами ЖГВ и ИГВ на основе реассортанта RA-52 формируются гемагглютинирующие антитела в титрах, превышающих защитные титры (защитный титр в РТГА ≥ 1:40). Таким образом, и живая и инактивированная моновакцины на основе полученного реассортанта RA-52, являются высоко иммуногенными.
Пример 5. Вакцинный штамм RA-52 обладает протективным действием для мышей.
Степень защиты, которую дают моновакцина ИГВ и ИГВ + ПО на основе реассортанта RA-52, в сравнении с контрольной группой, оценивали на самках мышей линии Balb/c на модели летального заражения. Мышей (по 5 в группе) через 2 недели после последней иммунизации заражали интраназально вирусом дикого типа A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) в дозе 6,5 lgЭДИ50 на мышь. Далее на 3-й сутки после заражения у мышей проводили забор легких с целью индикации антигена и его накопления. Репродукцию вируса определяли по показателям титрования суспензии органов в культуре клеток MDCK. Результаты приведены в табл. 5.
В легких мышей, иммунизированных ИГВ и ИГВ + ПО RA-52, вирус не реплицируется. В противоположность этому, в контрольной группе наблюдается высокий титр вируса в легких мышей. Эти данные свидетельствуют о том, что моновакцина ИГВ на основе реассортанта RA-52 обладает выраженным защитным действием против вируса гриппа A/Hong Kong/1073/99 (H9N2).
Claims (1)
- Influenzavirus А, подтип H9N2, штамм А/HK/HK/6:2/2016 (H9N2), депонированный в Государственную коллекцию вирусов ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России под №2884, для производства инактивированных и живых гриппозных вакцин против потенциально пандемического вируса гриппа A/H9N2.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2018145879A RU2702833C1 (ru) | 2018-12-21 | 2018-12-21 | Штамм вируса гриппа A/HK/HK/6:2/2016 (H9N2) для получения инактивированных и живых гриппозных вакцин |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2018145879A RU2702833C1 (ru) | 2018-12-21 | 2018-12-21 | Штамм вируса гриппа A/HK/HK/6:2/2016 (H9N2) для получения инактивированных и живых гриппозных вакцин |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2702833C1 true RU2702833C1 (ru) | 2019-10-11 |
Family
ID=68280109
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2018145879A RU2702833C1 (ru) | 2018-12-21 | 2018-12-21 | Штамм вируса гриппа A/HK/HK/6:2/2016 (H9N2) для получения инактивированных и живых гриппозных вакцин |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2702833C1 (ru) |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2507256C2 (ru) * | 2012-03-07 | 2014-02-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины" Северо-Западного отделения Российской академии медицинских наук (ФГБУ "НИИЭМ" СЗО РАМН) | Штамм вируса гриппа а/17/mallard/нидерланды/00/95(h7n3) для производства живой и производства инактивированной гриппозных вакцин |
RU2563351C2 (ru) * | 2013-12-30 | 2015-09-20 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение " Институт экспериментальной медицины" (ФГБНУ "ИЭМ" ) | ШТАММ ВИРУСА ГРИППА А/17/Ануи/2013/61 (H7N9) ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ЖИВОЙ ИНТРАНАЗАЛЬНОЙ ГРИППОЗНОЙ ВАКЦИНЫ |
-
2018
- 2018-12-21 RU RU2018145879A patent/RU2702833C1/ru active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2507256C2 (ru) * | 2012-03-07 | 2014-02-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины" Северо-Западного отделения Российской академии медицинских наук (ФГБУ "НИИЭМ" СЗО РАМН) | Штамм вируса гриппа а/17/mallard/нидерланды/00/95(h7n3) для производства живой и производства инактивированной гриппозных вакцин |
RU2563351C2 (ru) * | 2013-12-30 | 2015-09-20 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение " Институт экспериментальной медицины" (ФГБНУ "ИЭМ" ) | ШТАММ ВИРУСА ГРИППА А/17/Ануи/2013/61 (H7N9) ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ЖИВОЙ ИНТРАНАЗАЛЬНОЙ ГРИППОЗНОЙ ВАКЦИНЫ |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Bodewes et al. | Vaccination against seasonal influenza A/H3N2 virus reduces the induction of heterosubtypic immunity against influenza A/H5N1 virus infection in ferrets | |
Bodewes et al. | Vaccination with whole inactivated virus vaccine affects the induction of heterosubtypic immunity against influenza virus A/H5N1 and immunodominance of virus-specific CD8+ T-cell responses in mice | |
Davis et al. | The use of nonhuman primates in research on seasonal, pandemic and avian influenza, 1893–2014 | |
Schotsaert et al. | Natural and long-lasting cellular immune responses against influenza in the M2e-immune host | |
AU2010266078B2 (en) | Swine influenza hemagglutinin variants | |
RU2318871C1 (ru) | Штамм вируса гриппа гкв 2389 для получения живой интраназальной и инактивированной гриппозной вакцины | |
Allen et al. | Bivalent H1 and H3 COBRA recombinant hemagglutinin vaccines elicit seroprotective antibodies against H1N1 and H3N2 influenza viruses from 2009 to 2019 | |
Qiu et al. | Cross-protection against European swine influenza viruses in the context of infection immunity against the 2009 pandemic H1N1 virus: studies in the pig model of influenza | |
Su et al. | Effect of the selection pressure of vaccine antibodies on evolution of H9N2 avian influenza virus in chickens | |
Gambaryan et al. | Comparative safety, immunogenicity, and efficacy of several anti‐H5N1 influenza experimental vaccines in a mouse and chicken models (Testing of killed and live H5 vaccine) | |
Tripp et al. | Animal models for evaluation of influenza vaccines | |
Bragstad et al. | Pandemic influenza 1918 H1N1 and 1968 H3N2 DNA vaccines induce cross‐reactive immunity in ferrets against infection with viruses drifted for decades | |
Uno et al. | Multivalent next generation influenza virus vaccines protect against seasonal and pre-pandemic viruses | |
RU2556833C2 (ru) | Аттенуированный холодоадаптированный штамм вируса гриппа а/рr/8/59/m2 (h1n1), предназначенный для получения вакцинных штаммов вируса гриппа в качестве донора аттенуации, вакцинные штаммы вируса гриппа а/59/м2/калифорния/66/2211 (н2n2) и а/59/м2/токио/67/22111 (н2n2) | |
Nurpeisova et al. | Analysis of the efficacy of an adjuvant-based inactivated pandemic H5N1 influenza virus vaccine | |
RU2702834C1 (ru) | Штамм вируса гриппа A/UNL/HK/2:6/2017 (H5N8) для получения инактивированных и живых гриппозных вакцин | |
RU2746274C2 (ru) | Вакцинный штамм вируса гриппа В/60/Колорадо/2017/1 (Линия Виктория) для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей | |
Cox et al. | A cell‐based H7N1 split influenza virion vaccine confers protection in mouse and ferret challenge models | |
CN102361649A (zh) | 流感血凝素和神经氨酸酶变体 | |
RU2664460C1 (ru) | Штамм вируса гриппа A/Shanghai/HK/6:2/2013 (H7N9) для получения инактивированных и живых гриппозных вакцин | |
RU2702833C1 (ru) | Штамм вируса гриппа A/HK/HK/6:2/2016 (H9N2) для получения инактивированных и живых гриппозных вакцин | |
Baz et al. | A single dose of an avian H3N8 influenza virus vaccine is highly immunogenic and efficacious against a recently emerged seal influenza virus in mice and ferrets | |
RU2563351C2 (ru) | ШТАММ ВИРУСА ГРИППА А/17/Ануи/2013/61 (H7N9) ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ЖИВОЙ ИНТРАНАЗАЛЬНОЙ ГРИППОЗНОЙ ВАКЦИНЫ | |
RU2644670C1 (ru) | Штамм вируса гриппа А/Япония/ГК/6:2/2014 (H2N2) для получения инактивированных и живых гриппозных вакцин | |
Bertran et al. | Avian influenza virus and Newcastle disease virus |