RU2700407C1

RU2700407C1 - Method of treating tumor and inflammatory diseases using photodynamic therapy

Info

Publication number: RU2700407C1
Application number: RU2018127004A
Authority: RU
Inventors: Михаил Тимофеевич Александров; Валентина Николаевна Олесова; Егор Евгеньевич Олесов; Елена Валерьевна Глазкова; Инна Сергеевна Лашко; Александр Федорович Степанов; Анастасия Николаевна Калинина; Александр Яковлевич Лернер; Дмитрий Викторович Мартынов; Роман Семенович Заславский; Александр Сергеевич Иванов; Константин Владимирович Шматов; Погос Иванович Катунян; Александр Юрьевич Семёнов; Валерий Григорьевич Германов; Александр Сергеевич Румянцев; Андрей Руальдович Дрогин; Геворк Генрикович Тарасов; Владимир Михайлович Зуев; Диана Владиславовна Прикуле
Original assignee: Михаил Тимофеевич Александров; Валентина Николаевна Олесова
Priority date: 2018-07-23
Filing date: 2018-07-23
Publication date: 2019-09-16

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: invention refers to medicine, namely to diagnostics and photodynamic therapy, and can be used for treating tumorous and inflammatory diseases with application of photodynamic therapy (PDT). PDT is used with the preparation based on a chlorophyll-containing photosensitizer, wherein the photosensitizer is activated outside the body by exposing the preparation to a wave energy source and introducing the treated preparation into the patient's body. If the photosensitizer is activated outside the body, the preparation is additionally enriched with oxygen by bubbling and/or adding an oxygen-containing compound. Wave energy source is exposed to a power density of not less than 10 mWt / cm² and radiation dose of not less than 0.02 J per 1 ml of preparation. Before administering the preparation, individual patient's parameters of the photodynamic therapy are determined, including the concentration of the photosensitizer in the preparation and its activation parameters. Determination of individual parameters of the PDT involves: taking microbore-containing substrate samples of a patient, treating substrate samples with preparations characterized by different photosensitizer content and activation parameters thereof, - exposure of non-fluorescent detergent samples and determination of nephelometric indices of samples before and after exposure to non-fluorescent detergent, wherein for PDT using a preparation corresponding to a sample with the highest ratio of nephelometric index after exposure to nephelometric index before exposure, or - analysis of growth inhibition area of corresponding microbes when exposed to samples of the preparation, characterized by different content of photosensitizer and parameters of its activation, wherein for PDT using a preparation corresponding to the sample with the highest growth inhibition zone of said microbes. PDT involves periodical control of accumulation of a photosensitizer in patient's tissues by evaluating fluorescence intensity of a pathological object by direct external or endoscopic examination of tissues, or by an individual normalized fluorescence index of blood plasma. Administration of the preparation is terminated after the fluorescence intensity essentially ceases to change or reaches a value not less than 1.5 times greater than the fluorescence intensity of the intact tissues.

EFFECT: method provides a highly effective complex diagnostic, therapeutic and rehabilitation method for various types of inflammatory or tumorous diseases by using PDT using a preparation based on a chlorophyll-containing sensitizer, higher efficacy and selectivity of the photosensitizer action on the affected cells, reduced time of recovery of the involved organs and tissues, reduced toxic load on the unaffected tissues and organs, possibility to control the treatment and rehabilitation process, introduction of necessary changes.

7 cl, 2 tbl, 4 ex

Description

Изобретение относится к способам диагностики и лечения заболеваний, связанных с накоплением порфиринов, в частности заболеваний микробной и неопластической природы (опухолевые, воспалительные и т.д.), с применением фотодинамической терапии (ФДТ).The invention relates to methods for diagnosing and treating diseases associated with the accumulation of porphyrins, in particular diseases of a microbial and neoplastic nature (tumor, inflammatory, etc.), using photodynamic therapy (PDT).

Уровень техникиState of the art

Порфирины - промежуточные продукты на пути биосинтеза простетических групп хромопротеинов. Конечный продукт биосинтеза представляет собой комплекс протопорфирина IX с металлами; одним из наиболее распространенных является гем со включенным в центре молекулы железом (II). Гем обнаружен у всех организмов, за исключением анаэробных клостридий и молочнокислых бактерий. В организме человека синтез гема осуществляется во всех аэробных клетках и наиболее интенсивен в клетках печени и костного мозга. Двухвалентное железо в составе гема связывает молекулу кислорода, что позволяет ему выполнять транспорт и хранение кислорода и выступать посредником в аэробных процессах.Porphyrins are intermediates in the biosynthesis of prosthetic groups of chromoproteins. The final biosynthesis product is a complex of protoporphyrin IX with metals; One of the most common is heme with iron (II) incorporated in the center of the molecule. Hem is found in all organisms, with the exception of anaerobic clostridia and lactic acid bacteria. In the human body, heme synthesis is carried out in all aerobic cells and is most intense in the cells of the liver and bone marrow. Ferrous iron in the heme binds an oxygen molecule, which allows it to transport and store oxygen and act as an intermediary in aerobic processes.

Другой значимый порфириновый пигмент - магнийсодержащий хлорофилл, который является ключевым элементом фотосинтеза. Считают, что фотосинтез возник у анаэробных бактерий. Способные к дыханию гетеротрофные микроорганизмы, произошедшие от предков, синтезировавших порфирины стали использовать порфиринсодержащие белки как переносчиков электронов (например, цитохромы) при анаэробном окислении веществ субстрата. Затем, присутствие порфиринов, используемых в дыхательной цепи преадаптировало клетки для фотосинтеза благодаря тому, что большинство из них поглощает видимый свет.Таким образом, можно с уверенностью сказать, что порфирины -неотъемлемая часть метаболизма как гетеротрофных, так и фотосинтезирующих бактерий, участвующая в получении энергии. Наконец, существует еще одна важная, сходная с порфиринами структура - витамин В12 (кобаламин). Ни животные, ни растения не способны синтезировать витамин В12. Продукция его доступна лишь микроорганизмам - бактериям, актиномицетам, сине-зеленым водорослям. Кобаламин служит источником образования двух коферментов: дезоксиаденозилкобаламина в митохондриях и метилкобаламина в цитоплазме. Первый участвует в метаболизме жирных кислот с нечетным числом углеродных атомов и аминокислот с разветвленной углеводородной цепью; второй участвует в образовании метионина из гомоцистеина и в превращениях производных фолиевой кислоты, необходимых для синтеза нуклеотидов, что делает кобаламин незаменимым для делящихся клеток.Another significant porphyrin pigment is magnesium-containing chlorophyll, which is a key element of photosynthesis. It is believed that photosynthesis arose in anaerobic bacteria. Respiratory heterotrophic microorganisms descended from ancestors synthesizing porphyrins began to use porphyrin-containing proteins as electron carriers (e.g., cytochromes) during anaerobic oxidation of substrate substances. Then, the presence of porphyrins used in the respiratory chain preadapted cells for photosynthesis due to the fact that most of them absorb visible light. Thus, it can be said with confidence that porphyrins are an integral part of the metabolism of both heterotrophic and photosynthetic bacteria, which is involved in energy production . Finally, there is another important structure similar to porphyrins - vitamin B12 (cobalamin). Neither animals nor plants are able to synthesize vitamin B12. Its products are available only to microorganisms - bacteria, actinomycetes, blue-green algae. Cobalamin is the source of the formation of two coenzymes: deoxyadenosylcobalamin in mitochondria and methylcobalamin in the cytoplasm. The first is involved in the metabolism of fatty acids with an odd number of carbon atoms and branched chain hydrocarbon amino acids; the second is involved in the formation of methionine from homocysteine and in the conversion of folic acid derivatives necessary for the synthesis of nucleotides, which makes cobalamin indispensable for dividing cells.

Несмотря на столь важные функции порфиринсодержащих белков и их широкую распространенность, стоит еще раз упомянуть, что сами порфирины, за исключением протопорфирина, являются побочными продуктами, которые покидают путь биосинтеза вследствие необратимого окисления соответствующего порфириногена, и не несут никакой физиологической функции, но приобретают, в отличие от своих предшественников, окраску и способность к флуоресценции.Despite the important functions of porphyrin-containing proteins and their wide distribution, it is worth mentioning once again that porphyrins themselves, with the exception of protoporphyrin, are by-products that leave the biosynthesis pathway due to the irreversible oxidation of the corresponding porphyrinogen and do not carry any physiological function, but acquire unlike its predecessors, color and fluorescence ability.

Как и любые побочные продукты метаболизма порфирины должны быть удалены сначала из клеток в кровь, а затем с мочой и калом из организма. Конечными продуктами катаболизма гема являются циклические тетрапирролы, называемые желчными пигментами, а не порфирины, в то время как у здоровых людей порфирины все же присутствуют в небольших количествах в эритроцитах, моче и кале. Повышение концентрации наблюдается при повреждении клеток или воспалительных процессах, когда повышается проницаемость цитоплазматической мембраны и порфирины, являясь липофильными соединениями, с легкостью мигрируют в окружающие ткани или в соседние клетки.Like any by-products of metabolism, porphyrins must be removed first from the cells into the bloodstream, and then with urine and feces from the body. The end products of heme catabolism are cyclic tetrapyrroles called bile pigments, and not porphyrins, while in healthy people, porphyrins are still present in small amounts in red blood cells, urine, and feces. An increase in concentration is observed with cell damage or inflammatory processes, when the permeability of the cytoplasmic membrane and porphyrins increase, being lipophilic compounds, easily migrate to surrounding tissues or to neighboring cells.

Таким образом, действие на организм человека различных приводящих к повреждению клеток стрессовых факторов, таких как травмы, инфекционные, неинфекционные (опухоли и др.) заболевания, отравления или даже интенсивная физическая нагрузка, будут провоцировать повышение концентрации порфиринов.Thus, the effect on the human body of various stressful factors leading to cell damage, such as trauma, infectious, non-infectious (tumors, etc.) diseases, poisoning, or even intense physical activity, will provoke an increase in the concentration of porphyrins.

Метод ФДТ основан на использовании светочувствительных веществ - фотосенсибилизаторов, которые способны селективно (избирательно) накапливаться в злокачественных, патологически измененных или пораженных вирусами или микробами клетках. При активации фотосенсибилизатора волновым излучением (светом), молекулярный кислород переходит высокоактивную синглетную форму, что запускает цепь окислительных реакций в патологических клетках, приводя к их гибели. Следует отметить, что без присутствия кислородсодержащего препарата реакция ФДТ не происходит.The PDT method is based on the use of photosensitive substances - photosensitizers, which are able to selectively (selectively) accumulate in malignant, pathologically altered or infected cells or viruses. When the photosensitizer is activated by wave radiation (light), molecular oxygen passes a highly active singlet form, which triggers a chain of oxidative reactions in pathological cells, leading to their death. It should be noted that without the presence of an oxygen-containing drug, the PDT reaction does not occur.

Из уровня техники известен способ лечения воспалительных и опухолевых заболеваний методом фотодинамической терапии с использованием фотосенсибилизатора на основе производных хлорофилла (например, препарата «Радахлорин®») (см. патент РФ RU 2345803, 10.02.2009, наиболее близкий аналог). Согласно данному способу фотосенсибилизатор активируют вне организма пациента путем воздействия источниками волновой энергии мощностью 0,1-20000 Вт, в дозе 1-100000 Дж и вводят в организм пациента.The prior art method for the treatment of inflammatory and neoplastic diseases by the method of photodynamic therapy using a photosensitizer based on chlorophyll derivatives (for example, the drug "Radachlorin®") (see RF patent RU 2345803, 02/10/2009, the closest analogue). According to this method, the photosensitizer is activated outside the patient's body by exposure to wave energy sources with a power of 0.1-20000 W, at a dose of 1-100000 J and introduced into the patient's body.

Недостатком известного способа является отсутствие пробоподготовки и надлежащего контроля за активацией фотосенсибилизатора, отсутствие критериев активации препарата вне организма, динамики накопления фотосенсибилизатора в биологических жидкостях, тканях и органах организма в процессе подготовки к ФДТ, во время и после терапии, а также определения оптимальных для каждого пациента параметров проведения ФДТ и объективных критериев реабилитации пациента.The disadvantage of this method is the lack of sample preparation and proper monitoring of the activation of the photosensitizer, the absence of criteria for the activation of the drug outside the body, the dynamics of the accumulation of the photosensitizer in biological fluids, tissues and organs of the body in preparation for PDT, during and after therapy, as well as determining the optimal for each patient PDT parameters and objective criteria for patient rehabilitation.

Раскрытие изобретенияDisclosure of invention

Задачей изобретения является разработка высокоэффективного комплексного физико-химического и/или физико-биологического метода диагностики, лечения и реабилитации опухолевых или воспалительных заболеваний.The objective of the invention is to develop a highly effective integrated physico-chemical and / or physico-biological method for the diagnosis, treatment and rehabilitation of tumor or inflammatory diseases.

Техническим результатом изобретения является повышение эффективности и селективности воздействия фотосенсибилизатора на пораженные клетки, снижение времени восстановления пораженных органов и тканей, снижении токсической нагрузки на непораженные ткани и органы, возможность контроля процесса лечения и реабилитации, внесение необходимых изменений, а также расширение возможностей способа для диагностики и лечения различных типов воспалительных или опухолевых заболеваний.The technical result of the invention is to increase the efficiency and selectivity of the action of the photosensitizer on the affected cells, reduce the recovery time of the affected organs and tissues, reduce the toxic load on the unaffected tissues and organs, control the treatment and rehabilitation process, make the necessary changes, as well as expand the capabilities of the method for diagnosing and treatment of various types of inflammatory or tumor diseases.

Указанный технический результат достигается за счет того, что способ лечения заболеваний, связанных с накоплением порфиринов, включает применение фотодинамической терапии с использованием препарата на основе хлорофилл содержащего фотосенсибилизатора, при которой осуществляют предварительное накопление не активированного фотосенсибилизатора в организме и\или активацию фотосенсибилизатора вне организма путем воздействия на препарат источника волновой энергии и последующее введение обработанного препарата в организм пациента. При активации фотосенсибилизатора вне организма дополнительно проводят обогащение препарата кислородом посредством барботирования и/или добавления кислородсодержащего соединения, а воздействие источника волновой энергии осуществляют с плотностью мощности не менее 10 мВт/см² и дозе облучения не менее 0,02 Дж. Перед введением препарата осуществляют определение индивидуальных для пациента параметров фотодинамической терапии, включающих концентрацию фотосенсибилизатора в препарате и параметры его активации. Определение индивидуальных параметров фотодинамической терапии предусматривает два варианта. Первый вариант включает забор проб микробосодержащего субстрата пациента, обработку проб субстрата препаратами, характеризующимися различными содержаниями фотосенсибилизатора и параметрами его активации, воздействие на пробы нефлюоресцирующего детергента и определение нефелометрических индексов проб до и после воздействия нефлюоресцирующего детергента, при этом для фотодинамической терапии используют препарат соответствующий пробе с наибольшим отношением нефелометрического индекса после воздействия к нефелометрическому индексу до воздействия. Второй вариант включает анализ зоны задержки роста соответствующих микробов при воздействии проб препарата, характеризующихся различными содержаниями фотосенсибилизатора и параметрами его активации, при этом для фотодинамической терапии используют препарат, соответствующий пробе с наибольшей зоной задержки роста указанных микробов. Кроме того, в процессе фотодинамической терапии осуществляют периодический контроль накопления фотосенсибилизатора в тканях организма пациента путем оценки интенсивности флюоресценции патологического объекта или путем непосредственного внешнего или эндоскопического исследования тканей, или по индивидуальному нормированному индексу флюоресценции плазмы крови. Введение препарата прекращают после того, как интенсивность флюоресценции перестает по существу изменяться или достигает значения, не менее чем в 1,5 раза превышающего значение интенсивности флюоресценции интактных тканей.This technical result is achieved due to the fact that a method of treating diseases associated with the accumulation of porphyrins involves the use of photodynamic therapy using a chlorophyll-based drug containing a photosensitizer, in which preliminary accumulation of an unactivated photosensitizer in the body and / or activation of the photosensitizer outside the body by exposure on the drug source of wave energy and the subsequent introduction of the treated drug into the patient's body. When activating the photosensitizer outside the body, the drug is additionally enriched with oxygen by sparging and / or adding an oxygen-containing compound, and the wave energy source is exposed with a power density of at least 10 mW / cm ² and an irradiation dose of at least 0.02 J. Before drug administration, individual parameters of photodynamic therapy for the patient, including the concentration of the photosensitizer in the drug and its activation parameters. The determination of the individual parameters of photodynamic therapy provides two options. The first option includes taking samples of the patient's microbial substrate, processing the substrate samples with preparations characterized by different contents of the photosensitizer and its activation parameters, exposing the samples to a non-fluorescent detergent, and determining the nephelometric indices of the samples before and after exposure to the non-fluorescent detergent, using the appropriate sample for photodynamic therapy the highest ratio of the nephelometric index after exposure to the nephelometric index ksu before exposure. The second option includes the analysis of the growth retardation zone of the corresponding microbes when exposed to samples of the drug, characterized by different contents of the photosensitizer and the parameters of its activation, while for photodynamic therapy use the drug corresponding to the sample with the largest growth retardation zone of these microbes. In addition, in the process of photodynamic therapy, the accumulation of the photosensitizer in the patient’s tissues is periodically monitored by assessing the fluorescence intensity of the pathological object or by direct external or endoscopic examination of the tissues, or by an individual normalized plasma plasma fluorescence index. The introduction of the drug is stopped after the fluorescence intensity ceases to essentially change or reaches a value not less than 1.5 times the value of the fluorescence intensity of intact tissues.

Кроме того, предусмотрены частные варианты реализации способа, согласно которым:In addition, there are private options for implementing the method, according to which:

- используют препарат в виде раствора, содержащего 0,035-10 мас. % фотосенсибилизатора, осуществляют дополнительную активацию хлорофиллсодержащего фотосенсибилизатора в организме пациента путем воздействия источником волновой энергии,- use the drug in the form of a solution containing 0,035-10 wt. % photosensitizer, carry out additional activation of a chlorophyll-containing photosensitizer in the patient's body by exposure to a wave energy source,

- препарат вводят внутривенно и/или перорально и/или ректально и/или методом аппликации, для фотодинамической терапии используют хлорофиллсодержащий препарат, например «Радахлорофилл-С» или «Фотостим»,- the drug is administered intravenously and / or orally and / or rectally and / or by the method of application, for photodynamic therapy using a chlorophyll-containing preparation, for example, Radachlorophyll-C or Photostim,

- осуществляют предварительное определение патологического объекта организма, а также его контроль в процессе и после проведения фотодинамической терапии методом флуоресцентной или раман, или раман-флуоресцентной диагностики,- carry out a preliminary determination of the pathological object of the body, as well as its control during and after the photodynamic therapy using fluorescence or Raman, or Raman-fluorescence diagnostics,

- осуществляют предварительный контроль нормированных показателей аутофлуоресценции различных биологических жидкостей пациента.- carry out preliminary control of normalized autofluorescence indicators of various biological fluids of the patient.

Осуществление изобретенияThe implementation of the invention

Заявленное изобретение характеризует комплексный метод лечения опухолевых и/или воспалительных заболеваний с применением хлорофиллсодержащего сенсибилизатора, который обеспечивает эффективное накопление в месте локализации патологического объекта:икробной и/или опухолевой природы. Данный препарат по составу аналогичен хлорофиллу растений, что определяет и обеспечивает безвредность и доступность. Для повышения эффективности ФДТ в заявленном изобретении активация фотосенсибилизатора осуществляется вне организма, что позволяет повысить точность и эффективность объемной активации. При этом активация проводится путем воздействия волнового источника излучения (света), при котором происходит возбуждение молекул фотосенсибилизатора и повышается его реакционная активность, а также путем дополнительного обогащения препарата кислородом. Определены минимальные значения плотности мощности излучения - 10 мВт/см² и дозы облучения - 0,02 Дж, при которых воздействие света способствует активизации хлорофилла и его производных с переносом энергии на кислород тканей.The claimed invention characterizes a comprehensive method for the treatment of tumor and / or inflammatory diseases using a chlorophyll-containing sensitizer, which provides effective accumulation in the localization of a pathological object: of an microbial and / or tumor nature. This preparation is similar in composition to plant chlorophyll, which determines and ensures safety and affordability. To increase the effectiveness of PDT in the claimed invention, the activation of the photosensitizer is carried out outside the body, which improves the accuracy and efficiency of volumetric activation. In this case, activation is carried out by exposure to a wave source of radiation (light), at which the photosensitizer molecules are excited and its reaction activity increases, as well as by additional enrichment of the drug with oxygen. The minimum values of the radiation power density were determined - 10 mW / cm ² and the radiation dose - 0.02 J, at which exposure to light promotes activation of chlorophyll and its derivatives with energy transfer to tissue oxygen.

Представленная комплексная медицинская технология способствует профилактике заболеваний, особенно, при диагностике и лечении скрытых патологических объектов, повышению эффективности и скорости диагностики, индивидуально обоснованной терапии заболеваний и процессов микробной и неопластической природы. В связи с возможностью профилактики, ранней экспресс-диагностики заболеваний и дальнейшего комплексного лечения увеличивается социальная значимость предлагаемого способа, так как уровень здоровья населения можно будет поддерживать на постоянном адекватном метаболическом и структурно - функциональном индивидуально обоснованном гомеостатическом уровне, а при возникновении патологических состояний(выявлении и/или объективном подозрении на их наличие) эффективно помогать, воздействуя на разные уровни выявления патологических состояний организма человека (на принципе обратной связи).The presented comprehensive medical technology contributes to the prevention of diseases, especially in the diagnosis and treatment of hidden pathological objects, to increase the efficiency and speed of diagnosis, individually based treatment of diseases and processes of a microbial and neoplastic nature. In connection with the possibility of prevention, early rapid diagnosis of diseases and further comprehensive treatment, the social significance of the proposed method increases, since the population’s health level can be maintained at a constant adequate metabolic and structurally functional individually substantiated homeostatic level, and in the event of pathological conditions (identification and / or objective suspicion of their presence) to help effectively by acting on different levels of detection of pathological conditions Nij human body (on the feedback principle).

Заявленный способ диагностики и лечения включает следующие этапы Предварительная диагностика.The claimed method of diagnosis and treatment includes the following stages Preliminary diagnosis.

Предварительная диагностика может включать выявление патологических объектов (органов и тканей) организма методами лазерно-конверсионной диагностики (ЛКД), основанными на воздействии лазерного излучения на пробу вещества, сбор рассеянного излучения и его последующем спектральном анализе. В частности, могут применяться флуоресцентные, раман или раман-флюоресентные методы (см., например, патент на полезную модель RU 144665, 27.08.2014).Preliminary diagnostics may include the identification of pathological objects (organs and tissues) of the body using laser conversion diagnostics (LCD) based on the effect of laser radiation on a sample of the substance, the collection of scattered radiation and its subsequent spectral analysis. In particular, fluorescent, raman or raman-fluorescence methods can be used (see, for example, utility model patent RU 144665, 08/27/2014).

Для диагностики скрытых (с неизвестной топографией), для мониторинга или скрининга очагов инфекции и\или неопластических процессов может осуществлять периодический контроль нормированных показателей аутофлуоресценции различных биологических жидкостей пациента (плазмы крови, слюны, мочи, мокроты, экссудатов, транссудатов и др.), регистрируемых в соответствии его геронтологическими градиентами жизни. В частности, вычисляют нормированный индекс флуоресценции, определяемый как отношение интенсивности флуоресценции биологического объекта в геронтологической норме к значению интенсивности в момент введения фотосенсибилизатора. Изменение данного показателя более чем на 5-20% свидетельствует о развитии скрытого патологического объекта и необходимости профилактического и/или лечебного применения ФДТ. При этом для реализации указанных методов ЛКД необходимо применение аппаратов с высокой степенью аналитической и диагностической чувствительности порядка 5⋅10¹-5⋅10³ КОЕ/МЛ.For the diagnosis of latent (with unknown topography), for monitoring or screening foci of infection and / or neoplastic processes, periodic normalized autofluorescence parameters of various biological fluids of the patient (blood plasma, saliva, urine, sputum, exudates, transudates, etc.) can be monitored according to his gerontological gradients of life. In particular, the normalized fluorescence index is calculated, which is defined as the ratio of the fluorescence intensity of a biological object in the gerontological norm to the intensity value at the time the photosensitizer is introduced. A change in this indicator by more than 5-20% indicates the development of a hidden pathological object and the need for preventive and / or therapeutic use of PDT. Moreover, to implement the indicated LCD methods, it is necessary to use devices with a high degree of analytical and diagnostic sensitivity of the order of 5⋅10 ¹ -5⋅10 ³ CFU / ML.

Определение индивидуальных параметров фотодинамической терапииDetermination of individual parameters of photodynamic therapy

Препараты для проведения ФДТ выпускают в различных концентрациях для разных способов введения, например, для внутривенного введения используют 0,035%-ный раствор, для перорального введения и аппликаций - 5-7%-ный раствор. Однако возможно менять концентрацию препарата путем разбавления или выпаривания стандартизированных растворов.Preparations for PDT are produced in various concentrations for different methods of administration, for example, a 0.035% solution is used for intravenous administration, a 5-7% solution for oral administration and applications. However, it is possible to change the concentration of the drug by diluting or evaporating standardized solutions.

При определении индивидуальных параметров терапии осуществляется подбор оптимальной концентрации фотосенсибилизатора в препарате и параметров его активации.When determining individual therapy parameters, the optimal concentration of the photosensitizer in the drug and its activation parameters are selected.

Это может быть осуществлено двумя методами:This can be done in two ways:

1. Нефелометрический метод.1. Nephelometric method.

Согласно данному методу у пациента берутся пробы асептично микробосодержащего субстрата (гнойное отделяемое, слюна, моча, плазма крови, транссудаты, экссудаты, ликвор или их комбинация) в объеме не менее 0,001-0,1 мл и помещается в стерильную емкость. Производят замер исходной интенсивность флюоресценции в нормированных единицах.According to this method, a patient is sampled from an aseptic microbial-containing substrate (purulent discharge, saliva, urine, blood plasma, transudates, exudates, cerebrospinal fluid, or a combination thereof) in a volume of at least 0.001-0.1 ml and placed in a sterile container. Measure the initial fluorescence intensity in normalized units.

Далее пробы субстрата обрабатывают препаратами с различными концентрациями фотосенсибилизатора и параметрами активации (плотность и доза лазерного излучения, дополнительная активация введением кислорода). Например, используют 5-%ный раствор препарата в активированной и неактивированной форме, и, аналогично, разведеннный в 10 и 100 раз препарат. Для подбора методов активации осуществляют воздействие лазерным излучением разными дозами (не менее 0,02 Дж и не более 20 Дж) и плотностями мощности (не менее 10-20 мВт/см²) без дополнительной активации и с дополнительной активацией путем барботирования в течение не менее 30 секунд и/или добавлением Н₂О₂ различных концентрациях.Next, the substrate samples are treated with preparations with different concentrations of the photosensitizer and activation parameters (density and dose of laser radiation, additional activation by the introduction of oxygen). For example, use a 5% solution of the drug in activated and non-activated form, and, similarly, the drug is diluted 10 and 100 times. To select activation methods, they are exposed to laser radiation in different doses (not less than 0.02 J and not more than 20 J) and power densities (not less than 10-20 mW / cm ² ) without additional activation and with additional activation by bubbling for at least 30 seconds and / or the addition of H ₂ O ₂ various concentrations.

Затем, не менее чем через 30 мин после действия препарата (в активированной и неактивированной форме) определяют нефелометрический индекс (мутность) полученных взвесей. После этого в каждую пробу вводят раствор нефлюоресцирующего детергента, например, мирамистина в конечной концентрации в смеси не менее 0,1-0,2%, повторно выдерживают взвесь с детергентом не менее 1-20 минут и снова аналогичным образом определяют нефелометрический индекс. Путем сравнения измеренных до и после нефелометрических показателей определяют нормированный нефелометрический индекс, выражающий отношение значения нефелометрического индекса после введения детергента к индексу до введения. При этом для дальнейшего лечения используют препарат, имеющий наибольший нормированный индекс. Для исключения влияния концентрационного тушения флюоресценции на итоговые результаты допускается разведение исследуемого субстрата в 10 и более раз.Then, at least 30 minutes after the action of the drug (in activated and inactivated form), the nephelometric index (turbidity) of the obtained suspensions is determined. After that, a solution of a non-fluorescent detergent, for example, miramistin in a final concentration in the mixture of at least 0.1-0.2%, is introduced into each sample, the suspension with the detergent is kept for at least 1-20 minutes and the nephelometric index is again determined in a similar way. By comparing the measured before and after nephelometric indicators, a normalized nephelometric index is determined that expresses the ratio of the value of the nephelometric index after the introduction of the detergent to the index before administration. Moreover, for further treatment using the drug with the highest normalized index. To exclude the influence of concentration quenching of fluorescence on the final results, dilution of the investigated substrate by 10 times or more is allowed.

2. Микробиологический метод.2. Microbiological method.

В данном методе используют анализ конкретных микробов, являющихся причиной заболевания конкретного пациента. Чашки Петри с питательной средой засеивают монокультурой микроба и накладывают на них микропористые диски, смоченные препаратом с различными концентрациями и методами активации. Не менее чем через 1-3 часа определяют размеры зон задержки роста микроба препаратом вокруг диска (она должна быть не менее 10-20 мм). При этом для дальнейшей терапии применяют препарат, соответствующий пробе с наибольшей зоной.This method uses the analysis of specific microbes that cause the disease of a particular patient. Petri dishes with nutrient medium are seeded with a monoculture of the microbe and microporous discs moistened with a preparation with various concentrations and activation methods are applied to them. Not less than 1-3 hours later, determine the size of the zones of growth inhibition of the microbe by the drug around the disk (it should be at least 10-20 mm). In this case, for further therapy, a drug corresponding to the sample with the largest zone is used.

Следует также упомянуть возможность осуществления подбора параметров ФДТ путем анализа показателей флуоресценции проб до и после обработки препаратом.It should also be mentioned the possibility of selecting PDT parameters by analyzing the fluorescence indices of samples before and after treatment with the drug.

Проведение фотодинамической терапии.Carrying out photodynamic therapy.

Для проведения ФДТ используют препарат в виде раствора, включающего от 0,035 до 10 мас. % хлорофиллсодержащего фотосенсибилизатора. В качестве примера может быть использован препарат «радахлорофилл-С», содержащий соли щелочных металлов (натрия и калия) (см. патент РФ №21839566 27.06.2002). Конкретную концентрацию препарата подбирают в зависимости от способа введения и типа заболевания описанными выше способами.For PDT use the drug in the form of a solution comprising from 0.035 to 10 wt. % chlorophyll-containing photosensitizer. As an example, the drug "radachlorophyll-C" containing alkali metal salts (sodium and potassium) can be used (see RF patent No. 21839566 06/27/2002). The specific concentration of the drug is selected depending on the route of administration and the type of disease as described above.

Д ля проведения терапии препарат активирует вне организма воздействием источника волновой энергии с плотностью мощности не менее 10 мВт/см² и дозе облучения не менее 0,02 Дж. в присутствии кислородсодержащего препарата. Для этого, осуществляют дополнительную активацию фотосенсибилизатора путем обогащения раствора кислородом. Введение кислорода может осуществляться посредством барботирования раствора или его разбавления кислородсодержащими соединениями в жидкой форме (например, раствором перекиси водорода). Конкретные параметры активации подбирают индивидуально для каждого пациента описанным выше способом.For therapy, the drug activates outside the body by the action of a wave energy source with a power density of at least 10 mW / cm ² and a radiation dose of at least 0.02 J. in the presence of an oxygen-containing drug. For this, additional activation of the photosensitizer is carried out by enriching the solution with oxygen. The introduction of oxygen can be carried out by bubbling the solution or diluting it with oxygen-containing compounds in liquid form (for example, a solution of hydrogen peroxide). Specific activation parameters are selected individually for each patient as described above.

Активированный препарат может вводиться в организм пациента различными способами в зависимости от типа заболевания, например, внутривенно, перорально, ректально, методом аппликации и т.д. Например, при пероральном введении препарат применяют каплями при достижении дозы не менее 1-3 чайных ложек. Допускается предварительное введение в организм не активированного препарата в течении не менее 10-30 дней для лучшего его накопления в тканях и органах,особенно при хронической патологии и/или скрытой, когда поступление препарата в объект (очаг) патологии возможно затруднено из за нарушенного и/или замедленного кровотока.The activated drug can be introduced into the patient’s body in various ways, depending on the type of disease, for example, intravenously, orally, rectally, by application, etc. For example, when administered orally, the drug is used in drops when a dose of at least 1-3 teaspoons is reached. It is allowed to pre-administer an unactivated drug into the body for at least 10-30 days for its better accumulation in tissues and organs, especially in case of chronic pathology and / or hidden, when the drug can be delivered to an object (focus) of the pathology due to impaired and / or slow blood flow.

После введения препарата в организм может осуществляться его дополнительная активация путем воздействия волнового излучения непосредственно на очаг поражения (ткань или орган,биологические жидкости).After the introduction of the drug into the body, it can be additionally activated by the action of wave radiation directly on the lesion (tissue or organ, biological fluids).

При этом перед применением активированного препарата желательно принимать неактивированный препарат не менее 1- 2 месяцев для его накопления в тканях. Активированный препарат принимают в течении не менее 1-3 недель и/или используют дополнительную активацию препарата экстра- или интракорпоративным облучением лазерным излучением при клиническом и ЛКД контроле качества и эффективности процесса реабилитации пациента, его корректировки (при необходимости).Moreover, before using the activated drug, it is advisable to take an inactive drug for at least 1–2 months for its accumulation in tissues. The activated drug is taken for at least 1-3 weeks and / or use additional activation of the drug by extra- or intracorporate laser irradiation in clinical and LCD control of the quality and effectiveness of the patient's rehabilitation process, its adjustment (if necessary).

Контроль процесса фотодинамической терапииControl of the process of photodynamic therapy

Для определения эффективности проводимой терапии и внесения необходимых корректировок осуществляют контроль накопления фотосенсибилизатора в патологических тканях организма пациента путем определения интенсивности флюоресценции патологического объекта или предполагаемой его топографии или различных биологических субстратов, связанных с патологическим объектом до, в процессе и после проведения курса терапии. Для этого могут применяться различные методы нефелометрии и/или ЛКД (раман и/или флуоресцентной ее составляющей) диагностики.To determine the effectiveness of the therapy and make the necessary adjustments, the accumulation of the photosensitizer in the pathological tissues of the patient’s body is monitored by determining the fluorescence intensity of the pathological object or its proposed topography or various biological substrates associated with the pathological object before, during and after the course of therapy. For this, various methods of nephelometry and / or LCD (Raman and / or its fluorescent component) diagnostics can be used.

При наличие прямого доступа к биологическому объекту осуществляют анализ кожи и видимых слизистых оболочек. Также возможно применение эндоскопических исследований органов и тканей, например, в случае поражения пазух челюстно-лицевой области, внутреннего уха, желудка, кишечника, суставов, матки и т.д. При отсутствии доступа к биологическому объекту осуществляют определение нормированного индекса флуоресценции плазмы крови, по отношению к индивидуальному нормированному показателю флуоресценции, измеренному в геронтологической норме (проводят каждые 5 лет).With direct access to a biological object, an analysis of the skin and visible mucous membranes is performed. It is also possible to use endoscopic examinations of organs and tissues, for example, in case of damage to the sinuses of the maxillofacial region, inner ear, stomach, intestines, joints, uterus, etc. In the absence of access to a biological object, a normalized plasma fluorescence index is determined in relation to the individual normalized fluorescence index measured in the gerontological norm (performed every 5 years).

Время накопления фотосенсибилизатора тем меньше, чем выше допустимая для применения концентрация препарата (для перорального и ректального введения составляет около 3-7 мас. %, для внутривенного введения не более 0,05 мас. % для избежания клинически выраженного фототоксического действия препарата).The accumulation time of the photosensitizer is shorter, the higher the concentration of the drug allowed for use (for oral and rectal administration is about 3-7 wt.%, For intravenous administration no more than 0.05 wt.% To avoid the clinically pronounced phototoxic effect of the drug).

Препарат вводят в организм пациента до тех пор, пока измеренное (или определенное) значение интенсивности флуоресценции не перестанет подвергаться существенным изменениям (кривая значений не выйдет на «плато») или не менее чем в 1,5 раза (в некоторых случаях в 2-3 раза) превысит значение интенсивности флуоресценции интактных тканей, т.е. аналогичных непораженных тканей и/или биологических жидкостей, подвергаемым исследованиям.The drug is introduced into the patient's body until the measured (or determined) value of the fluorescence intensity ceases to undergo significant changes (the curve of the values does not reach a “plateau”) or at least 1.5 times (in some cases, 2-3 times) will exceed the value of the fluorescence intensity of intact tissues, i.e. similar unaffected tissues and / or body fluids to be examined.

При наличие данных по нормированным индексам флуоресценции ФДТ проводят до их нормализации для данного показателя у конкретного пациента.If there is data on normalized fluorescence indices, PDT is carried out until they are normalized for this indicator in a particular patient.

Пример 1Example 1

Проводили лабораторные исследования эффективности заявленного способа путем:Conducted laboratory studies of the effectiveness of the claimed method by:

1. Обоснования технологии выбора, регистрации и активации хлорофилл содержащего препарата (Фотостим, Радохлорофилл С);1. Justification of the technology for the selection, registration and activation of chlorophyll-containing preparation (Photostim, Radochlorophyll C);

2. Моделирования объемной ФДТ в пробирке.2. Modeling volumetric PDT in vitro.

3. Исследования накопления хлорофилл содержащего препарата в тканях и органах,3. Studies of the accumulation of chlorophyll-containing drug in tissues and organs,

4. Исследования эффекта воздействия объемной активированной ФДТ на микробы и опухолевые клетки (культуральный материал) in vitro.4. Studies of the effect of volumetric activated PDT on microbes and tumor cells (culture material) in vitro.

5. Моделирования эффекта объемной активированной ФДТ на животных (карцинома Эрлиха).5. Modeling the effect of volumetric activated PDT on animals (Ehrlich carcinoma).

Во всех исследованиях и клинических наблюдениях использовали сертифицированный аппаратно-программный комплекс раман-флюоресцентной диагностики «Ин Спектр М» с чувствительностью не менее 50×1-10×3 КОЕ\мл.In all studies and clinical observations, the certified In-Spectrum M Raman-fluorescence diagnostic hardware and software complex with a sensitivity of at least 50 × 1-10 × 3 CFU / ml was used.

Для исследований по этапам 1 и 2 использовали неактивированный и активированный хлорофилл содержащий препарат (Фотостим или Радохлорофилл С) и аналоги различных производителей.For studies in stages 1 and 2, unactivated and activated chlorophyll containing the preparation (Photostim or Radochlorophyll C) and analogues of various manufacturers were used.

Для выявления накопления хлорофилл содержащего препарата (третий этап) в органах и тканях (мыши в возрасте 2 мес.и весом 70-80 г) лабораторных животных разделили на 4 группы по 15 мышей в каждой: 1 группа получала стандартный корм и чистую воду; 2 группа аналогичный корм и в качестве питья препарат фотостим в концентрации 0.07%; 3 группа - в концентрации 0.007%; в 4 - в концентрации 0.0007%. Через 1 месяц животных усыпляли и исследовали метотом лазерной флюоресцентной диагностики на аппарате «ИнСпектр М» для регистрации нормированных показателей(по отношению к контролю) накопления флюоресцирующего препарата Фотостим в различных органах и тканях животных.To detect the accumulation of chlorophyll-containing preparation (third stage) in organs and tissues (mice aged 2 months and weighing 70-80 g) laboratory animals were divided into 4 groups of 15 mice each: 1 group received standard food and clean water; Group 2 similar food and as a drink, photostim preparation at a concentration of 0.07%; Group 3 - at a concentration of 0.007%; in 4 - at a concentration of 0.0007%. After 1 month, the animals were euthanized and examined by laser fluorescence diagnostics using the InSpektr M apparatus for recording normalized indicators (relative to the control) of the accumulation of the fluorescent Photostim preparation in various organs and tissues of animals.

Исходя из представленной концепции в качестве модельного объекта (4 этап) использовали культуру микробов - 20 тест образцов (из них 5 - контрольная группа). Для проведения эксперимента были взяты два микроорганизма Ps.aeruginosa и S.aureus.Based on the presented concept, a microbial culture was used as a model object (stage 4) - 20 test samples (5 of them were a control group). Two microorganisms Ps.aeruginosa and S.aureus were taken for the experiment.

В качестве основы для эксперимента был взят диско-диффузионный метод, основанный на диффузии антибиотиков из носителя в плотную питательную среду и ингибиции роста исследуемой культуры в той зоне, где концентрация антибиотика превосходит минимальная подавляющая концентрация (МПК). Из чистой суточной культуры Ps.aeruginosa и S.aureus, выращенной на неселективной плотной питательной среде с помощью дистиллированной воды, готовили инокулят 0.5 по МакФарланду, что соответствует концентрации 1×10⁸ КОЕ/мл. Полученный инокулят наносили на MX агар.The disco-diffusion method was used as the basis for the experiment, based on the diffusion of antibiotics from the carrier into a dense nutrient medium and growth inhibition of the test culture in the zone where the antibiotic concentration exceeds the minimum inhibitory concentration (MIC). From a pure diurnal culture of Ps.aeruginosa and S.aureus grown on a non-selective solid nutrient medium using distilled water, 0.5 MacFarland inoculum was prepared, which corresponds to a concentration of 1 × 10 ⁸ CFU / ml. The resulting inoculum was applied to MX agar.

Затем помещали диски пропитанные, предварительно активированным кислородсодержащим препаратом и лазерным излучением с длиной волны 0.63 нм, 0.514 нм, 0.405 нм в дозе 0.2-20 дж/мл), в концентрации 0.7%, 0.07% и 0.007%. В качестве контроля использовали стерильные диски, диски с неактивированным препаратом (в тех же концентрациях), диски с препаратом после воздействия на него кислородсодержащего водного раствора, диски с кислородсодержащим водным раствором (перекись водорода 3%).Then the disks were impregnated with pre-activated oxygen-containing preparation and laser radiation with a wavelength of 0.63 nm, 0.514 nm, 0.405 nm at a dose of 0.2-20 j / ml) at a concentration of 0.7%, 0.07% and 0.007%. As a control, we used sterile disks, disks with an inactive preparation (at the same concentrations), disks with a preparation after exposure to an oxygen-containing aqueous solution, disks with an oxygen-containing aqueous solution (3% hydrogen peroxide).

В другом варианте эксперимента готовили инокулят из чистой суточной культуры Ps.aeruginosa, выращенной на не селективной плотной питательной среде, с помощью дистиллированной воды, 0.5 по МакФарланду, что соответствует концентрации 1×10⁸ КОЕ/мл. Добавляли в него Фотостим, исходной концентрацией 0.7%, с добавлением 3% раствором перекиси водорода, активировали лазерным излучением. Далее проводили измерение спектров на приборе «ИнСпектр М» и делали высев на плотную питательную среду. Исследование проводилось в следующих временных интервалах: сразу, через 30 минут, 1 час, 1 час 30 минут, 2 часа, 2 часа 30 минут.In another version of the experiment, an inoculum was prepared from a pure daily culture of Ps.aeruginosa grown on a non-selective solid nutrient medium using distilled water, 0.5 MacFarland, which corresponds to a concentration of 1 × 10 ⁸ CFU / ml. Photostim was added to it, with an initial concentration of 0.7%, with the addition of a 3% hydrogen peroxide solution, and activated by laser radiation. Next, the spectra were measured on an InSpektr M instrument and plated on solid nutrient medium. The study was carried out in the following time intervals: immediately, after 30 minutes, 1 hour, 1 hour 30 minutes, 2 hours, 2 hours 30 minutes.

Исследование эффекта воздействия объемной активированной ФДТ на опухолевые клетки проводилось на клетках линии хронической миелогенной лейкемией К562. Изучалось воздействие ФДТ на миграцию опухолевых клеток с использованием камеры Бойдена 96 - Well Filtration Plate Multiscreen TM - MIC с размером пор 8 мкм (фирма Millipore). В верхний отсек камеры помещалась взвесь клеток линии в объеме 60 мкл и количестве 60±1×10³. В нижний отсек камеры вносили хемоаттрактант/лиганд в объеме 175 мкл в концентрации 5 мкг/мл (DNA_lig) и в концентрации 200нг/мл (CXCL12). Исследование хемотаксиса проводился в динамике через 10, 60 мин и через сутки с использованием вышеперечисленных лигандов. Перед проведением эксперимента пробирки с концентрациями препарата 0.7%, 0.07%, 0.007%, с использованием перекиси водорода облучались лазерным излучением с длиной волны 0.63 нм,0.514 нм,0.405 нм в дозе 0.2-20 дж/мл), после чего в пробирки помещались клетки и в дальнейшем исследовалась их мигрирующая способность.The effect of volumetric activated PDT on tumor cells was studied on cells of the K562 line of chronic myelogenous leukemia. The effect of PDT on tumor cell migration was studied using a Boyden 96 - Well Filtration Plate Multiscreen TM - MIC camera with a pore size of 8 μm (Millipore). A suspension of line cells in a volume of 60 μl and an amount of 60 ± 1 × 10 ³ was placed in the upper compartment of the chamber. A chemoattractant / ligand was introduced into the lower compartment of the chamber in a volume of 175 μl at a concentration of 5 μg / ml (DNA_lig) and at a concentration of 200 ng / ml (CXCL12). The study of chemotaxis was carried out in dynamics after 10, 60 minutes and every other day using the above ligands. Before the experiment, tubes with drug concentrations of 0.7%, 0.07%, 0.007%, using hydrogen peroxide, were irradiated with laser radiation with a wavelength of 0.63 nm, 0.514 nm, 0.405 nm at a dose of 0.2-20 j / ml), after which cells were placed in the tubes and subsequently investigated their migratory ability.

Культуру клеток карциномы Эрлиха (5 этап) использовали в качестве объекта исследования для заражения ею лабораторных мышей (вводили внутрибрюшинно по 0.1 мл) в возрасте 2 мес.и весом 70-80 г (45 тест образцов и 15-контрольная группа). Результаты учитывали по срокам гибели мышей на фоне асцита, вызванного карциномой Эрлиха. 15 мышей контрольной группы не заражали.The Ehrlich carcinoma cell culture (stage 5) was used as an object of study for infection in laboratory mice (it was injected intraperitoneally in 0.1 ml) at the age of 2 months and weighing 70-80 g (45 test samples and 15 control group). The results were taken into account in terms of the death of mice on the background of ascites caused by Ehrlich carcinoma. 15 mice of the control group were not infected.

Для объективной оценки результататов исследований были выбраны оптимальные параметры времени и мощности излучения лазера, при которых не наблюдается эффект выгорания(не возмущающая и воспроизводимая диагностика): мощность 2,5 мВт и время экспозиции 50 мс для лазера с длиной волны 405 нм и, при которых эффект выгорания составляет не более 5%; мощность 170 мкВт и время экспозиции 100 мс для лазера с длиной волны 532 нм, при которых эффект выгорания составляет не более 5%; аналогичные параметры - для лазера с длиной волны 637 нм, при которых эффект выгорания составил не более 6%.For an objective assessment of the research results, the optimal parameters of the laser radiation time and power were selected for which there is no burn-out effect (non-disturbing and reproducible diagnostics): 2.5 mW power and 50 ms exposure time for a laser with a wavelength of 405 nm and, at which the burnout effect is not more than 5%; power of 170 μW and exposure time of 100 ms for a laser with a wavelength of 532 nm, at which the burn-out effect is not more than 5%; similar parameters - for a laser with a wavelength of 637 nm, at which the burn-out effect was not more than 6%.

Наиболее эффективными длинами волн возбуждения являются - 405 нм и 637 нм.The most effective excitation wavelengths are 405 nm and 637 nm.

Исследование действия объемной активированной ФДТ на культуру микробов и опухолевых клеток показали, что при использовании активированного фотостима наблюдалось незначительное подавление зоны роста. микроорганизма через 24 часа, при этом не активированный препарат с Ps.aeruginosa не давал задержки зоны роста, а у S.aureus наблюдалась минимальное подавление зоны роста.The study of the effect of volumetric activated PDT on the culture of microbes and tumor cells showed that when using activated photostim, a slight suppression of the growth zone was observed. microorganism after 24 hours, while the non-activated drug with Ps.aeruginosa did not give a growth zone delay, and S.aureus showed minimal suppression of the growth zone.

Показана значительно более высокая бактерицидная эффективность активированного вне бактериального субстрата препарата фотостим. Наибольшая зона задержки роста (20- 30 мм) выявлена при концентрации препарата-0.7%+3%H₂O г и дозе лазерного облучения 20Дж. Полученный эффект сравним с бактерицидным действием антибиотика цефепима, как объекта сравнения (цефепим 30 мг, диск на 12 часа, на всех чашках Петри).A significantly higher bactericidal efficacy of photostim activated outside the bacterial substrate was shown. The largest growth retardation zone (20-30 mm) was detected at a drug concentration of 0.7% + 3% H ₂ O g and a laser dose of 20 J. The effect obtained is comparable to the bactericidal effect of the cefepime antibiotic as an object of comparison (cefepime 30 mg, disk for 12 hours, on all Petri dishes).

Таким образом, было подтверждено, что способность фотосенсибилизатора накапливаться в измененных тканях, микробных клетках с реализацией эффекта летальной фотосенсибилизации бактерий может быть использована при лечении заболеваний и процессов микробной природы, в том числе при выявлении антибиотикорезистентных штаммов патогенных микроорганизмов. При этом эффекта привыкания к препарату не выявлено.Thus, it was confirmed that the ability of the photosensitizer to accumulate in altered tissues and microbial cells with the realization of the effect of lethal photosensitization of bacteria can be used in the treatment of diseases and processes of a microbial nature, including the detection of antibiotic-resistant strains of pathogenic microorganisms. In this case, the effect of addiction to the drug was not detected.

Исследование миграции опухолевых клеток под воздействием хемокина CXCL12 и без него при инкубации клеток с разными концентрациями препарата (0.7%, 0.07%, 0.007%) и при разной длительности воздействия лазера (0, 10 и 100 секунд) с использованием перекиси водорода выявлено, что чем выше концентрация препарата тем ниже эффект миграции опухолевых клеток(в 4-8 раз). Полученные результаты имеют высокую воспроизводимость и степень достоверности.. Таким образом, можно сказать, что ФДТ может снижать миграционную активность опухолевых клеток, что потенциально может быть использовано для блокировки процесса метастазирования у онкологических больных.A study of the migration of tumor cells under the influence of the chemokine CXCL12 and without it during the incubation of cells with different concentrations of the drug (0.7%, 0.07%, 0.007%) and at different laser exposure times (0, 10 and 100 seconds) using hydrogen peroxide revealed that the higher the concentration of the drug, the lower the effect of the migration of tumor cells (4-8 times). The results obtained have high reproducibility and reliability. Thus, we can say that PDT can reduce the migration activity of tumor cells, which could potentially be used to block the process of metastasis in cancer patients.

При апробации методики объемной активированной ФДТ при лечении опухолей (карцинома Эрлиха у мышей) установлено, что мыши в группе с чистым контролем были активны и живы в течении всего исследования (1 год). Мыши со вторым чистым контролем быстро увеличивались в размерах (асцит) и погибали на 4-6 день. Мыши, принимавшие не активированный хлорофилл содержащий препарат или раствор 1:10 H₂O₂ 3% погибали на 6-12 день. Мыши, принимавшие не активированный препарат 1 месяц и затем активированный препарат в разведении 1:10 до последнего дня жизни, жили 21-24 дня, а при его разведении 1:1000 - погибали в пределах 10 дней.When testing the method of volumetric activated PDT in the treatment of tumors (Ehrlich carcinoma in mice), it was found that the mice in the group with pure control were active and alive throughout the study (1 year). Mice with a second pure control rapidly increased in size (ascites) and died on days 4–6. Mice that received unactivated chlorophyll containing the drug or a 1:10 H ₂ O ₂ 3% solution died on days 6-12. Mice that took the non-activated drug for 1 month and then the activated drug at a 1:10 dilution until the last day of life lived 21-24 days, and when it was diluted 1: 1000, they died within 10 days.

Таким образом убедительно показан противоопухолевый эффект хлорофилл содержащего препарата, активированного вне организма, особенно при предварительном накоплении препарата в организме животного до введения онкосодержащего субстрата.Thus, the antitumor effect of the chlorophyll-containing preparation activated outside the body is convincingly shown, especially with the preliminary accumulation of the drug in the animal’s body before the introduction of the cancer-containing substrate.

Пример 2.Example 2

С помощью заявленного способа проводили лечение женщин с хроническим эндометритом, гиперплазией эндометрия и бесплодием. Было обследовано 1460 женщин в возрасте 38-42 года, которым предстояла программа ЭКО. При обследовании (гистероскопия и биопсия эндометрия) были выявлены: простая гиперплазия эндометрия без атипии - у 7, сложная гиперплазия эндометрия без атипии - у 5 и сложная гиперплазия - у 4 пациенток. При этом характер рецидивирующей сложной гиперплазии эндометрия после неоднократных повторных курсов гормональной терапии был у 3 женщин. Всем женщинам была проведена объемная фотодинамическая терапия под контролем лазерной люминисцентной спектроскопии в течение 4-6 недель с предварительным введением не активированного препарата в течении 20-30 дней и активированного в течении не менее 6-10 дней. Дополнительно проводили активацию препарата внутриматочный лазерным облучением в указанных дозах.Контрольная верификация проведена клийнически и морфологически. Ни у одной женщины не выявлены признаки гиперплазии эндометрия. «Доклинические» онкологические заболевания (рак эндометрия) у 2 из всех (1460) обследованных пациенток.Using the inventive method, women with chronic endometritis, endometrial hyperplasia and infertility were treated. A total of 1,460 women aged 38-42 years were examined, who were facing an IVF program. The examination (hysteroscopy and endometrial biopsy) revealed: simple endometrial hyperplasia without atypia in 7 patients, complex endometrial hyperplasia without atypia in 5 and complex hyperplasia in 4 patients. Moreover, the character of recurrent complex endometrial hyperplasia after repeated repeated courses of hormone therapy was in 3 women. All women underwent volume photodynamic therapy under the control of laser luminescent spectroscopy for 4-6 weeks with the preliminary administration of an unactivated drug for 20-30 days and activated for at least 6-10 days. Additionally, the preparation was activated by intrauterine laser irradiation in the indicated doses. Control verification was performed clinically and morphologically. None of the women showed signs of endometrial hyperplasia. “Preclinical” oncological diseases (endometrial cancer) in 2 of all (1460) examined patients.

Для каждого пациента определяли индивидуальные параметры ФДТ: концентрацию фотосенсибилизатора, плотность мощности и дозу излучения и т.д., согласно вышеописанным способам. При этом использовались растворы препарата «Фотостим» В некоторых особо тяжелых клинических случаях использовали дополнительную активацию препарата барботированием раствора или его разбавления перекисью водорода. Терапию осуществляли под контролем ЛКД.For each patient, individual PDT parameters were determined: photosensitizer concentration, power density and radiation dose, etc., according to the methods described above. In this case, solutions of the Photostim preparation were used. In some particularly severe clinical cases, additional activation of the preparation was used by bubbling the solution or diluting it with hydrogen peroxide. Therapy was carried out under the control of LCD.

В результате применения комплексной терапии у 238 (91%) наблюдалось повышение регенеративной активности эндометрия и его функциональных резервов. В течение 3 месяцев после лечения в программах ЭКО беременность наступила у 95 (36,5%) пациенток.As a result of the use of complex therapy, 238 (91%) showed an increase in the regenerative activity of the endometrium and its functional reserves. Within 3 months after treatment in IVF programs, pregnancy occurred in 95 (36.5%) patients.

По данным УЗИ имело место достоверное улучшение М-ЭХО, прирост был большим, по сравнению с озонотерапией и составил до 5,9 и после 8,1 мм (Р<0,001), т.е. прирост составил 2,2 мм. У 52,5% женщин отмечалось улучшение морфофункционального состояния эндометрия, характеризующееся однородностью эхоструктуры эндометрия в периовуляторное окно.According to the ultrasound, there was a significant improvement in M-ECHO, the increase was large compared to ozone therapy and amounted to 5.9 and after 8.1 mm (P <0.001), i.e. the increase was 2.2 mm. 52.5% of women showed an improvement in the morphofunctional state of the endometrium, characterized by the uniformity of the endometrial echostructure into the periovulatory window.

Для сравнения озонотерапия оптимизировала этот параметр лишь у 35% пациенток.For comparison, ozone therapy optimized this parameter in only 35% of patients.

По данным ультразвукового исследования применение предлагаемой ФДТ технологии активировало кровоток в сосудах маточных артерий и нормализовалопролиферативную активность эндометрия.According to ultrasound data, the application of the proposed PDT technology activated blood flow in the vessels of the uterine arteries and normalized the proliferative activity of the endometrium.

Исходя из данных флюоресцентной спектроскопии ФДТ способствовала нормализации пролиферативной активности эндометрия, улучшению метаболических процессов и структурированности эндометрия. При этом по данным анализа результатов исследования системы гемостаза под влиянием ФДТ как фотобиостимулирующей терапии с использованием природного фотосенсибилизатора «Фотостим» не выявлено изменений большинства исследованных показателей (эти показатели до и после лечения находились в пределах биологической нормы).Based on the data of fluorescence spectroscopy, PDT contributed to the normalization of the proliferative activity of the endometrium, the improvement of metabolic processes and the structure of the endometrium. Moreover, according to the analysis of the results of the study of the hemostasis system under the influence of PDT as a photobiostimulating therapy using the natural photosensitizer “Photostim”, no changes in the majority of the studied parameters were detected (these indicators before and after treatment were within the biological norm).

Пример 3.Example 3

Клинический случай: пациентка 38 лет, наблюдалась в клинике репродуктивного здоровья по поводу первичного бесплодия и готовилась вступить в программу ЭКО. Согласно приказу проводилось комплексное обследование, в процессе которого была диагносцирована гиперплазия эндометрия. Была произведена гистероскопия и раздельное диагностическое выскабливание эндометрия и эндоцервикса. Гистологическое заключение: сложная атипическая гиперплазия. Женщина отправилась в Германию на лечение. Немецкие врачи назначили гормональное лечение: гестагены - утрожестан в дозе 600 мг в непрерывном режиме на 3 месяца. Через 3 месяца они же выполнили гистероскопию и биопсию эндометрия из 4 разных точек стенок полости матки. Гистологический диагноз был тот же, атипическая гиперплазия эндометрия без малигнизации. Лечение было продолжено с увеличением дозы утрожестана до 800 мг в сутки. Через 3 месяца проведена повторная гистероскопия и биопсия эндометрия из 6 точек - диагноз атипическая гиперплазия эндометрия без малигнизации. Обсуждался вопрос о радикальном лечении (удаление матки) в связи с неэффективностью консервативной терапии. Женщина отказалась. Тогда было предложено провести курс лечения с использованием фотостима (хлорофилл содержащий препарат) с предварительной эстракорпоральной активацией лазерным излучением с длиной волны 0,63 мкм (объемная фотодинамическая терапия), что и было сделано в течение 6 недель. После этого была произведена гастроскопия с тотальным выскабливанием эндометрия, учитывая прошлый диагноз. Гистологическое заключение показало, что эндометрий с признаками атрофии и атипических клеток не обнаружено.Clinical case: a 38-year-old patient was observed at the Reproductive Health Clinic for primary infertility and was preparing to join the IVF program. According to the order, a comprehensive examination was conducted, during which endometrial hyperplasia was diagnosed. Hysteroscopy and separate diagnostic curettage of the endometrium and endocervix were performed. Histological conclusion: complex atypical hyperplasia. The woman went to Germany for treatment. German doctors prescribed hormonal treatment: gestagens - Utrozhestan at a dose of 600 mg in continuous mode for 3 months. After 3 months, they also performed hysteroscopy and endometrial biopsy from 4 different points on the walls of the uterine cavity. The histological diagnosis was the same, atypical endometrial hyperplasia without malignancy. Treatment was continued with an increase in the dose of utrozhestan to 800 mg per day. After 3 months, repeated hysteroscopy and endometrial biopsy from 6 points were performed - the diagnosis of atypical endometrial hyperplasia without malignancy. The issue of radical treatment (removal of the uterus) in connection with the ineffectiveness of conservative therapy was discussed. The woman refused. Then it was proposed to conduct a course of treatment using photostim (chlorophyll containing the drug) with preliminary extracorporeal activation by laser radiation with a wavelength of 0.63 μm (volumetric photodynamic therapy), which was done for 6 weeks. After this, a gastroscopy was performed with total curettage of the endometrium, taking into account the previous diagnosis. The histological conclusion showed that an endometrium with signs of atrophy and atypical cells was not found.

Пример 4Example 4

На амбулаторном лечении находилось 20 пациентов с остеоартрозом (OA) коленного сустава, верифицированного клинически и рентгенологически и обследованных методом ЛКД.Outpatient treatment included 20 patients with osteoarthrosis (OA) of the knee joint, clinically and radiologically verified and examined using LCD.

Лечение пациентов проводили по описанной методике с использованием сначала не активированного (1 месяц), а затем активированного препарата «Фотостим» в течении 10-20 дней до получения клинически и рентгенологически выраженного саногенетического эффекта. Активированный препарат давали капельно (начальная доза 5 капель) и доводили его до объема, равного 1-3 чайной ложки.Patients were treated according to the described method using the first non-activated (1 month) and then activated Photostim preparation for 10-20 days until a clinically and radiologically pronounced sanogenetic effect was obtained. The activated drug was given dropwise (initial dose of 5 drops) and adjusted to a volume of 1-3 teaspoons.

На первом этапе исследования было установлено, что чувствительность и специфичность метода ЛКД диагностики (флюоресцентный составляющая) суставного хряща у больных с OA близки к 99-100%. Результаты исследования показаны в Таблице 1.At the first stage of the study, it was found that the sensitivity and specificity of the LCD diagnostic method (fluorescent component) of articular cartilage in patients with OA are close to 99-100%. The results of the study are shown in Table 1.

При этом на втором этапе исследования выявлено, что интенсивность флюоресценции в интактной точке (интактный хрящ) значительно отличается от таковой в исследуемых областях и составляет около от 10000 до 20000 относительных единиц интенсивности флюоресценции (ОЕ). Максимальный пик флюоресценции приходится на величину волнового числа - 5450/пм. При этом показано, что интактный (Т-1) и патологически измененный хрящ (Т-2) имеют различия по спектральной интенсивности флюоресценции в 4-6 раз. Набухший и разволокненный хрящ (Т-2) и узурированный и трещиноватый хрящ с просветами субхондральной кости (Т-3) имеют различия по интенсивности флюоресценции в пять раз, а интактная компактная кость (Т-4) имеет интенсивность флуоресценции в 6 раз меньше предыдущего. Выявлен отчетливый сдвиг длины волны максимума флюоресценции сравниваемых структур хряща на шесть нанометров (различия достоверны уже при разнице в 1 нм.).Т.е для всех сравниваемых структур различие исследованных параметров достоверны (р=0.03), что в реальных клинических условиях позволило, в итоге, использовать предложенную методику для диагностики состояния сустава на этапах консервативного лечения, в том числе ФДТ или при решении вопроса о назначении или исключении операций эндопротезирования.At the same time, at the second stage of the study, it was found that the fluorescence intensity at the intact point (intact cartilage) is significantly different from that in the studied areas and ranges from about 10,000 to 20,000 relative units of fluorescence intensity (OE). The maximum fluorescence peak occurs at a wave number of 5450 / pm. It was shown that intact (T-1) and pathologically altered cartilage (T-2) have differences in spectral fluorescence intensity by 4-6 times. Swollen and fibrous cartilage (T-2) and usurized and fissured cartilage with lumens of the subchondral bone (T-3) have differences in fluorescence intensity by five times, and the intact compact bone (T-4) has a fluorescence intensity of 6 times less than the previous one. A distinct shift of the wavelength of the maximum fluorescence of the compared cartilage structures by six nanometers was revealed (the differences are significant even at a difference of 1 nm.) That is, for all the compared structures, the difference in the studied parameters is significant (p = 0.03), which in real clinical conditions allowed As a result, use the proposed technique for diagnosing the condition of the joint at the stages of conservative treatment, including PDT or when deciding on the appointment or exclusion of endoprosthetics.

Вычисления индекса аэробности (ИА) и нормированной интенсивности флуоресценции (ИФ)в интактных (Т-1) и патологически измененных участках суставного хряща (Т-2 и Т3) при OA также выявили значительные различия, представленные в таблице 2.Calculations of the aerobic index (IA) and normalized fluorescence intensity (IF) in intact (T-1) and pathologically altered areas of articular cartilage (T-2 and T3) with OA also revealed significant differences, presented in table 2.

Причем эти различия наблюдались во всех исследованных случаях.Moreover, these differences were observed in all studied cases.

На фоне лечения через 1-2, а в отдельных случаях 3 месяца (3 пациента) указанные показатели приближались к норме, хотя и отличались от нее не более чем на 10-15%, что свидетельствовало и сопутствовало об эффективности процесса реабилитации пациентов и объективности используемых экспресс методов ЛКД (флюоресцентная составляющая) диагностики.Against the background of treatment, after 1-2, and in some cases 3 months (3 patients), these indicators approached the norm, although they differed from it by no more than 10-15%, which testified and accompanied the effectiveness of the patient rehabilitation process and the objectivity of the express methods of LCD (fluorescent component) diagnostics.

Дополнительно у 5 пациентов OA и 5 добровольцев без патологии наблюдали интенсивность флюоресценции синовиальный жидкости и плазмы крови (в сравнительном аспекте). У здоровых обследуемых флюоресценция плазмы крови и синовиальный жидкости не имели существенных различий (по спектру и интенсивности флюоресценции). И наоборот - при OA различия были в 1.5-3 раза, что связывали с интенсивностью выброса порфиритов в патологическом объекте при OA. После лечения, указанные показатели практически соответствовали индивидуальной норме.Additionally, in 5 patients with OA and 5 volunteers without pathology, the intensity of fluorescence of synovial fluid and blood plasma (in a comparative aspect) was observed. In healthy subjects, plasma fluorescence and synovial fluid did not have significant differences (in spectrum and fluorescence intensity). And vice versa - with OA, the differences were 1.5-3 times, which was associated with the intensity of the release of porphyrites in the pathological object with OA. After treatment, these indicators almost corresponded to the individual norm.

Таким образом, обоснован антимикробный и противоопухолевый эффект хлорофилл содержащего препарата, активированного вне организма. Выявленный эффект зависит от концентрации вводимого активированного препарата, длины волны и дозы лазерной его активации (индивидуальная оптимизация дозы препарата и объективная оценка эффекта лечения).Thus, the antimicrobial and antitumor effect of chlorophyll-containing preparation activated outside the body is justified. The revealed effect depends on the concentration of the injected activated drug, the wavelength and the dose of its laser activation (individual optimization of the drug dose and objective assessment of the treatment effect).

Предложенный способ представляет собой ряд лечебно-диагностических мероприятий, предусматривающих комплексное применение флуоресценции, Раман или Раман-флуоресценции для одномоментной диагностики, пробоподготовки фотосенсибилизатора для ФДТ, предварительно или одномоментно с введением подвергнутого действию волновой энергии в присутствии кислорода, или кислород содержащих препаратов, включая оксид азота, проведение на этой основе объемной активированной ФДТ и последующего определения индивидуальной эффективности лечения и/или его коррекции. При этом активация ингибирующего локального воздействия фотосенсибилизаатора на патологический объект (микроб, воспаление, опухоль) может быть реализована как экстра, так и интракорпорально с использованием лазерного излучения в видимом и ближнем ИК диапазоне на всех этапах пробоподготовки, лечения и реабилитации.The proposed method is a series of therapeutic and diagnostic measures, involving the integrated use of fluorescence, Raman or Raman fluorescence for simultaneous diagnosis, sample preparation of a photosensitizer for PDT, previously or simultaneously with the introduction of exposed wave energy in the presence of oxygen, or oxygen-containing preparations, including nitric oxide conducting, on this basis, a volumetric activated PDT and subsequent determination of individual treatment effectiveness and / or his correction. Moreover, the activation of the inhibitory local effect of the photosensitizer on a pathological object (microbe, inflammation, tumor) can be realized both extra and intracorporeally using laser radiation in the visible and near infrared range at all stages of sample preparation, treatment, and rehabilitation.

Таким образом заявленное изобретение может успешно применяться в таких областях как хирургия, травматология, стоматология, артрология, дерматология челюстно-лицевая хирургия, клиническая микробиология и т.д. при заболеваниях и процессах микробной и неопластической природы.Thus, the claimed invention can be successfully applied in such fields as surgery, traumatology, dentistry, arthrology, dermatology, maxillofacial surgery, clinical microbiology, etc. in diseases and processes of microbial and neoplastic nature.

Claims

1. A method of treating tumor and inflammatory diseases, including the use of photodynamic therapy using a drug based on a chlorophyll-containing photosensitizer, in which the photosensitizer is activated outside the body by exposing the drug to a wave energy source and then introducing the treated drug into the patient’s body,

characterized in that when the photosensitizer is activated outside the body, the drug is additionally enriched with oxygen by sparging and / or adding an oxygen-containing compound, and the wave energy source is applied with a power density of at least 10 mW / cm ² and a radiation dose of at least 0.02 J per 1 ml of the drug

Before the introduction of the drug, the parameters of photodynamic therapy, individual for the patient, are determined, including the concentration of the photosensitizer in the drug and its activation parameters, while the determination of the individual parameters of photodynamic therapy provides:

- taking samples of the patient’s microbial substrate, processing the substrate samples with preparations characterized by different contents of the photosensitizer and its activation parameters, affecting the samples with a non-fluorescent detergent and determining the nephelometric indices of the samples before and after the exposure to a non-fluorescent detergent, while using the drug with the highest sample for photodynamic therapy the ratio of the nephelometric index after exposure to the nephelometric index before exposure, or

- analysis of the growth retardation zone of the corresponding microbes when exposed to samples of the drug, characterized by different contents of the photosensitizer and the parameters of its activation, while for photodynamic therapy use the drug corresponding to the sample with the largest growth retardation zone of these microbes

moreover, in the process of photodynamic therapy, the accumulation of the photosensitizer in the patient’s tissues is periodically monitored by assessing the fluorescence intensity of the pathological object by direct external or endoscopic tissue examination, or by an individual normalized plasma plasma fluorescence index, and the drug is stopped after the fluorescence intensity ceases essentially change or reaches a value not less than 1.5 times the value of fluorescence intensities of intact tissues.

2. The method according to p. 1, characterized in that the preparation is used in the form of a solution containing 0.035-10 wt.% Photosensitizer.

3. The method according to p. 1, characterized in that they carry out additional activation of a chlorophyll-containing photosensitizer in the patient's body by exposure to a wave energy source.

4. The method according to p. 1, characterized in that the drug is administered intravenously, and / or orally, and / or rectally, and / or by the method of application.

5. The method according to p. 1, characterized in that for photodynamic therapy using the drug "Radachlorophyll-C" or "Photostim".

6. The method according to p. 1, characterized in that they carry out a preliminary determination of the pathological object of the body, as well as its control during and after the photodynamic therapy by the method of fluorescence, or Raman, or Raman-fluorescence diagnostics.

7. The method according to p. 1, characterized in that it carries out preliminary and subsequent monitoring of normalized autofluorescence indicators of various biological fluids of the patient at the stages of his rehabilitation.