RU2696586C1

RU2696586C1 - Hemoprotective agent

Info

Publication number: RU2696586C1
Application number: RU2018124146A
Authority: RU
Inventors: Глеб Николаевич Зюзьков; Елена Владимировна Удут; Лариса Аркадьевна Мирошниченко; Татьяна Юрьевна Полякова; Лариса Александровна Ставрова; Елена Владиславовна Симанина; Вадим Вадимович Жданов
Priority date: 2018-07-02
Filing date: 2018-07-02
Publication date: 2019-08-05

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: invention refers to medicine, more specifically to pharmacology, haematology and oncology. Disclosed is use of a protein kinase A (PKA) activator as a haemoprotective agent, effective when administered in vivo with respect to erythro- and granulomonocytopoiesis.

EFFECT: technical result consists in the implementation of the PKA activators by cAMP analogues 8-Cl-cAMP and 8-Br-cAMP, which corrected the changes in the number of erythroid cells and monocytes in the cytostatic myosuppressive cyclophosphan mice.

1 cl, 3 tbl, 1 ex

Description

Изобретение относится к медицине, конкретно к фармакологии, гематологии и онкологии.The invention relates to medicine, specifically to pharmacology, hematology and oncology.

Высокая частота встречаемости миелосупрессивных состояний, развивающихся в результате химиотерапии опухолевых заболеваний [1], является основанием необходимости применения гемостимулирующих (используются после химиотерапии) и гемопротекторных (используются перед химиотерапией) средств в медицинской практике.The high frequency of occurrence of myelosuppressive conditions developing as a result of chemotherapy of tumor diseases [1] is the basis for the need for hemostimulating (used after chemotherapy) and hemoprotective (used before chemotherapy) drugs in medical practice.

Известны гемопротекторные средства [2-5].Known hemoprotective agents [2-5].

Недостатком данных средств является зачастую их низкая эффективность [5, 6].The disadvantage of these funds is often their low efficiency [5, 6].

Задачей, решаемой настоящим изобретением, является расширение арсенала высокоэффективных гемопротекторных средств.The problem solved by the present invention is to expand the arsenal of highly effective hemoprotective agents.

Поставленная задача достигается применением активатора протеинкиназы А (РКА) в качестве гемопротекторного средства.The task is achieved by the use of protein kinase A activator (PKA) as a hemoprotective agent.

Новым в предлагаемом изобретении является использование в качестве гемопротекторного средства активатора РКА.New in the invention is the use of a RCA activator as a hemoprotective agent.

Химиотерапия представляет собой одним из основных методов лечения в онкологии. Однако применение противоопухолевых средств зачастую приводит к развитию тяжелых побочных эффектов [1]. Мишенью цитостатических агентов, в первую очередь, являются митотически активные клеточные элементы. К данной категории, помимо опухолевых, относятся клетки здоровых тканей с высокой способностью к физиологическому клеточному обновлению, в том числе костный мозг [6].Chemotherapy is one of the main treatment methods in oncology. However, the use of anticancer agents often leads to the development of severe side effects [1]. The target of cytostatic agents, in the first place, are mitotically active cellular elements. In addition to tumor, this category includes cells of healthy tissues with a high ability for physiological cell renewal, including bone marrow [6].

Одним из путей повышения безопасности химиотерапии является профилактика повреждающего действия цитостатических препаратов на ткани и органы, не вовлеченные в опухолевый патологический процесс [3]. Для предупреждения развития миелосупрессивных состояний используют гемопротекторы, вводимые в организм (в отличие от гемостимуляторов) перед проведением химиотерапии либо в промежутках между ее курсами (например, дикарбамин [1]).One way to increase the safety of chemotherapy is to prevent the damaging effects of cytotoxic drugs on tissues and organs that are not involved in the tumor pathological process [3]. To prevent the development of myelosuppressive conditions, hemoprotectors are introduced into the body (as opposed to haemostimulants) before chemotherapy or in the intervals between its courses (for example, dicarbamine [1]).

Согласно современным представлениям, функционирование клеток осуществляется, в том числе посредством системы внутриклеточной сигнальной трансдукции. В связи с этим перспективной выглядит возможность разработки гемопротекторов в рамкахAccording to modern concepts, the functioning of cells is carried out, including through the system of intracellular signal transduction. In this regard, the possibility of developing hemoprotectors in the framework of

«Стратегии фармакологической регуляции внутриклеточной сигнальной трансдукции в регенераторно-компетентных клетках» [7, 8], предполагающей использование в качестве мишеней воздействия отдельные звенья внутриклеточной сигнальной трансдукции, ответственные за функционирование прогениторных клеток и элементов микроокружения. В настоящее время известны лишь общие представления о том, что процессы пролиферации и дифференцировки кроветворных клеток регулируются сАМР-, NF-кВ-, PI3K- и МАР-опосредованными сигнальными путями [7, 8]. При этом считается, что повышение концентрации цАМФ в клетке, активирующего протеинкиназу А (РКА), способно приводить к торможению их митотической активности. Более того, существуют данные о выраженных антипролиферативных эффектах РКА в отношении опухолевых клеток [9]. В то же время известно, что поддержание необходимого уровня интенсивности кроветворения и развитие адекватных компенсаторно-приспособительных реакций со стороны системы крови, в том числе при введении цитостатических агентов, обеспечиваться, в первую очередь, напротив, за счет повышения пролиферативной активности гемопоэтических клеток-предшественников, отражением которого является увеличение их количества в костном мозге [10, 11].“Strategies for the pharmacological regulation of intracellular signal transduction in regenerative competent cells” [7, 8], which involves the use of individual units of intracellular signal transduction responsible for the functioning of progenitor cells and microenvironment elements as targets. At present, only general ideas are known that the proliferation and differentiation of hematopoietic cells are regulated by cAMP, NF-kB, PI3K, and MAP-mediated signaling pathways [7, 8]. It is believed that an increase in the concentration of cAMP in the cell activating protein kinase A (PKA) can lead to inhibition of their mitotic activity. Moreover, there is evidence of pronounced antiproliferative effects of RCA in relation to tumor cells [9]. At the same time, it is known that maintaining the necessary level of hematopoiesis intensity and developing adequate compensatory and adaptive reactions from the blood system, including with the introduction of cytostatic agents, is ensured, first of all, on the contrary, by increasing the proliferative activity of hematopoietic progenitor cells, a reflection of which is an increase in their number in the bone marrow [10, 11].

Возможность влияния активаторов РКА на процессы кроветворения, в том числе ускорять восстановление гемопоэза в постцитостатическом периоде, не известна. Эксперимент показал непредсказуемые результаты.The possibility of the effect of RCA activators on blood formation processes, including accelerating the restoration of hematopoiesis in the post-cytostatic period, is not known. The experiment showed unpredictable results.

Факт применения активатора РКА с достижением нового технического результата, заключающегося в гемопротекции, для специалиста является не очевидным.The fact of using the RCA activator with the achievement of a new technical result, which is hemoprotection, is not obvious for a specialist.

Новые свойства не вытекают явным образом из уровня техники в данной области и не обнаружены в патентной и научно-технической литературе.New properties do not follow explicitly from the prior art in this field and are not found in the patent and scientific literature.

Предлагаемое изобретение может быть использовано в медицине.The present invention can be used in medicine.

Исходя из вышеизложенного, следует считать заявляемое техническое решение соответствующим критериям: «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».Based on the foregoing, the claimed technical solution should be considered relevant criteria: "Novelty", "Inventive step", "Industrial applicability".

Эксперименты были проведены на 60 мышах линии С57В 1/6. Животные получены из отдела экспериментальных биологических моделей НИИФиРМ им. Е.Д. Гольдберга Томского НИМЦ.The experiments were conducted on 60 mice line C57B 1/6. Animals are obtained from the Department of Experimental Biological Models NIIIFiRM them. E.D. Goldberg Tomsk Scientific and Technical Center.

Исследования проводили в соответствии с правилами лабораторной практики (GLP), Приказом 199н от 15.08.2016 «Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики», ГОСТ 33044-2014 «Принципы надлежащей лабораторной практики» (2015), Федеральным Законом от 12 апреля 2010 г. №61-ФЗ «Об обращении лекарственных средств», «Методическими рекомендациями по изучению гемостимулирующей активности фармакологических веществ» Руководства по проведению доклинических исследований новых лекарственных средств (2013) [11].The studies were carried out in accordance with the rules of laboratory practice (GLP), Order 199n dated 08/15/2016 "On approval of the Rules of Good Laboratory Practice", GOST 33044-2014 "Principles of Good Laboratory Practice" (2015), Federal Law of April 12, 2010 No. 61-ФЗ “On the circulation of medicines”, “Methodological recommendations for the study of hemostimulating activity of pharmacological substances” of the Guidelines for preclinical studies of new drugs (2013) [11].

Пример 1Example 1

Эффективность гемопротекции определялась на модели цитостатической миелосупрессии.The effectiveness of hemoprotection was determined on a model of cytostatic myelosuppression.

Цитостатическую миелосупрессию моделировали путем однократного внутрибрюшинно введения раствора циклофосфана (ЦФ) в максимально переносимой дозе (МПД) (250 мг/кг).Cytostatic myelosuppression was modeled by a single intraperitoneal injection of a solution of cyclophosphamide (CF) in the maximum tolerated dose (MPD) (250 mg / kg).

Мыши опытных групп однократно за 6 часов до введения цитостатика получали активатор РКА (8-Cl-сАМР, 8-Chloradenosine 3',5'-cyclic-monophosphat, «Sigma»), либо активатор РКА (8-Br-cAMP, 8-Bromoadenosine-3',5'-cyclic monophosphate sodium salt, «Abcam plc.») подкожно в дозе 20 мкг/кг. Животным группы сравнения в аналогичном режиме внутрижелудочно в дозе 0,5 мг/кг вводили Дикарбамин (ОАО «Валента Фарм»), Контрольные животные получали растворитель в эквивалентном объеме (0,2 мл). Указанные дозы дикарбамина и активаторов были определены на основании данных предварительных экспериментов.The mice of the experimental groups once 6 hours before administration of the cytostatic agent received a PKA activator (8-Cl-cAMP, 8-Chloradenosine 3 ', 5'-cyclic-monophosphat, "Sigma"), or a PKA activator (8-Br-cAMP, 8- Bromoadenosine-3 ', 5'-cyclic monophosphate sodium salt, "Abcam plc.") Subcutaneously at a dose of 20 μg / kg. In a similar regimen, animals of the comparison group were injected intragastrically at a dose of 0.5 mg / kg with Dicarbamine (Valenta Pharm OJSC). Control animals received solvent in an equivalent volume (0.2 ml). The indicated doses of dicarbamine and activators were determined based on data from preliminary experiments.

На 5, 8 и 12 сутки после введения цитостатика животных умерщвляли путем ингаляции СО². У опытных и контрольных мышей стандартными методами определяли показатели периферической крови и костномозгового кроветворения. С помощью культуральных методов оценивали содержание коммитированных клеток-предшественников эритро- (КОЕ-Э) и гранулоцитопоэза (КОЕ-ГМ) в костном мозге [11].On days 5, 8, and 12 after the administration of cytostatic, the animals were killed by inhalation of CO ² . In experimental and control mice, the parameters of peripheral blood and bone marrow hematopoiesis were determined by standard methods. Using culture methods, the content of committed erythro- (CFU-E) and granulocytopoiesis (CFU-GM) precursor cells in the bone marrow was evaluated [11].

Статистическую обработку полученных данных проводили методом вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента. В случаях отклонения распределения вариант в выборках от нормального для оценки достоверности различий применяли непараметрический критерий Уилкоксона-Манна-Уитни.Statistical processing of the obtained data was carried out by the method of variation statistics using t-student criterion. In cases of deviation of the distribution, the variant in the samples from normal to assess the significance of the differences, the non-parametric Wilcoxon-Mann-Whitney test was used.

Введение ЦФ проводило к закономерному [11] развитию миелосупрессии. Отмечалось падение содержания незрелых нейтрофильных гранулоцитов (5 сутки), лимфоидных и эритроидных клеток (5 и 8 сутки) в гемопоэтической ткани (табл. 1).The introduction of CF led to a natural [11] development of myelosuppression. A drop in the content of immature neutrophilic granulocytes (5 days), lymphoid and erythroid cells (5 and 8 days) in the hematopoietic tissue was noted (Table 1).

Отражением указанных изменений костномозгового кроветворения явилось падение числа сегментоядерных нейтрофилов, лимфоцитов, моноцитов и ретикулоцитов в периферической крови на 5 сутки и увеличение данных параметров на 8 (сегментоядерные нейтрофилы, лимфоциты, моноциты) и 12 сутки опыта (ретикулоциты) (табл. 2).A reflection of these changes in bone marrow hematopoiesis was a decrease in the number of segmented neutrophils, lymphocytes, monocytes and reticulocytes in peripheral blood by 5 days and an increase in these parameters by 8 (segmented neutrophils, lymphocytes, monocytes) and 12 days of experiment (reticulocytes) (Table 2).

В основе развития миелосупрессии лежало повреждающее действие цитостатического агента на кроветворные предшественники костного мозга [6, 11]. При этом в дальнейшем отмечалась активация компенсаторной реакции [6] со стороны пула прекурсоров гемопоэза. Отмечалось увеличение числа КОЕ-ГМ на 5 сутки и восстановление числа КОЕ-Э к 12 суткам опыта (табл. 3).The development of myelosuppression was based on the damaging effect of the cytostatic agent on hematopoietic bone marrow precursors [6, 11]. Moreover, later on, activation of the compensatory reaction [6] from the pool of hematopoietic precursors was noted. There was an increase in the number of CFU-GM on the 5th day and a restoration in the number of CFU-E by 12 days of the experiment (Table 3).

Профилактическое введение активаторов РКА существенно корригировало изменения гемопоэза, вызываемые цитостатиком. Наблюдалось увеличение клеточности костного мозга. При этом число эритроидных клеток в костном мозге экспериментальных животных на 5 сутки составило 152,2% для активатора РКА 8-Cl-сАМР и 134,5% для активатора РКА 8-Br-сАМР от цитостатического контроля соответственно. В дальнейшем наблюдалось увеличение содержания в костном мозге зрелых нейтрофильных гранулоцитов до 145,4% и 141,1%, моноцитов до 406,8% и 393.1%, лимфоидных клеток до 145,4% и 141,1% на 8 сутки опыта, а также зрелых нейтрофильных гранулоцитов до 136,8% и 136,4% на 12 сутки от цитостатического контроля при применении активатора РКА 8-Cl-сАМР и активатора РКА 8-Br-сАМР соответственно (табл. 1). Дикарбамин вызывал аналогичные по динамике, но менее выраженные изменения (табл. 1).The prophylactic administration of RCA activators substantially corrected the changes in hematopoiesis caused by the cytostatic. An increase in bone marrow cellularity was observed. The number of erythroid cells in the bone marrow of experimental animals on the 5th day was 152.2% for the 8-Cl-cAMP PKA activator and 134.5% for the 8-Br-cAMP PKA activator from the cytostatic control, respectively. Subsequently, there was an increase in the content in the bone marrow of mature neutrophilic granulocytes to 145.4% and 141.1%, monocytes to 406.8% and 393.1%, lymphoid cells to 145.4% and 141.1% on the 8th day of the experiment, and also mature neutrophilic granulocytes up to 136.8% and 136.4% on day 12 of the cytostatic control with the use of the 8-Cl-cAMP PKA activator and the 8-Br-cAMP pKA activator, respectively (Table 1). Dicarbamine caused similar dynamics, but less pronounced changes (table. 1).

В периферической крови содержание ретикулоцитов при профилактическом введении активаторов РКА 8-Cl-сАМР и 8-Br-сАМР уже на 5 сутки опыта составило 260,3% и 262,2% от группы с циклофосфаном соответственно. Имело место повышение числа сегментоядерных нейтрофилов (до 133,7% и 133,5% на 8 сутки, до 143.2% и 134,1% на 12 сутки) и моноцитов (до 159,7% и 153,2% на 8 сутки, до 187,5% и 179,2% на 12 сутки) от цитостатического контроля соответственно. Введение дикарбамина приводило к восстановлению числа ретикулоцитов на лишь на 8 сутки опыта (табл. 2).In peripheral blood, the content of reticulocytes after the prophylactic administration of PKA activators 8-Cl-cAMP and 8-Br-cAMP on the 5th day of the experiment amounted to 260.3% and 262.2% of the group with cyclophosphamide, respectively. There was an increase in the number of segmented neutrophils (up to 133.7% and 133.5% on day 8, up to 143.2% and 134.1% on day 12) and monocytes (up to 159.7% and 153.2% on day 8, up to 187.5% and 179.2% on day 12) from cytostatic control, respectively. The introduction of dicarbamine led to the restoration of the number of reticulocytes on only 8 days of the experiment (table. 2).

Исследование механизмов гемопротекторного действия активаторов РКА выявило зависимость формирования картины крови и костного мозга от состояния пула костномозговых родоначальных клеток. Профилактическое введение растворов исследуемых фармакологических веществ увеличивала содержание КОЕ-Э и КОЕ-ГМ в гемопоэтической ткани, подвергшейся цитостатическому воздействию. Имело место значительное повышение количества КОЕ-Э и КОЕ-ГМ на 5, 8-е и 5, 8, 12-е сутки опыта соответственно как при использовании 8-Cl-сАМР, так и 8-Br-сАМР (табл. 3). Курсовое введение дикарбамина также способствовало более раннему восстановлению содержания кроветворных предшественников в кроветворной ткани, которое, однако, было менее выраженным по сравнению с таковым у животных, получавших активаторы РКА (табл. 3).The study of the mechanisms of hemoprotective action of RCA activators revealed the dependence of the formation of a blood picture and bone marrow on the state of the pool of bone marrow progenitor cells. Prophylactic administration of solutions of the studied pharmacological substances increased the content of CFU-E and CFU-GM in hematopoietic tissue subjected to cytostatic effects. There was a significant increase in the number of CFU-E and CFU-GM on the 5th, 8th and 5th, 8th, 12th day of the experiment, respectively, when using 8-Cl-cAMP and 8-Br-cAMP (table 3) . The course administration of dicarbamine also contributed to an earlier restoration of the content of hematopoietic precursors in the hematopoietic tissue, which, however, was less pronounced compared to that in animals treated with RCA activators (Table 3).

Полученные результаты свидетельствуют о выраженных гемопротекторных свойствах активаторов РКА [11]. При этом механизмом действия данных модификаторов внутриклеточной сигнальной трансдукции являлось их влияние на функционирование родоначальных гемопоэтических клеток.The results obtained indicate the pronounced hemoprotective properties of RCA activators [11]. The mechanism of action of these modifiers of intracellular signal transduction was their effect on the functioning of the original hematopoietic cells.

Таким образом, проведенные исследования свидетельствуют о высокой эффективности применения активаторов РКА в качестве гемопротекторных средств при гипопластических состояниях кроветворения.Thus, the studies indicate a high efficiency of the use of RCA activators as hemoprotective agents for hypoplastic hematopoiesis.

Цитируемая литература:References cited:

1) Assessment of erythroid and granulocytic hematopoietic lineages in patients with non-small-cell lung carcinoma / T.Y. Polyakova [et al.] // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 2017. T. 163. №4. C. 469-474.1) Assessment of erythroid and granulocytic hematopoietic lineages in patients with non-small-cell lung carcinoma / T.Y. Polyakova [et al.] // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 2017. T. 163. No. 4. C. 469-474.

2) Моисеенко, B.M. Волков O.H. Симптоматическая терапия больных распространенным раком ободочной кишки / В.М. Моисеенко, О.Н. Волков // Практическая онкология. 2000. №1. С.38-42.2) Moiseenko, B.M. Volkov O.H. Symptomatic therapy of patients with advanced colon cancer / V.M. Moiseenko, O.N. Volkov // Practical Oncology. 2000. No1. S.38-42.

3) Птушкин, В.В. Профилактика осложнений химиотерапии / В.В. Птушкин // Русский медицинский журнал. 2004. Том 12. №11.3) Ptushkin, V.V. Prevention of complications of chemotherapy / V.V. Ptushkin // Russian Medical Journal. 2004. Volume 12. No. 11.

4) Симптоматическое лечение осложнений современной химиотерапии и текущего опухолевого процесса. Краткий обзор работ, посвященных теме преодоления неспецифических расстройств // Научно-информационный медицинский журнал. Весна. 2004. №1.4) Symptomatic treatment of complications of modern chemotherapy and the current tumor process. A brief review of the works devoted to the topic of overcoming non-specific disorders // Scientific-Information Medical Journal. Spring. 2004. No1.

5) Стенина, М.Б. Поддерживающая терапия при проведении современной химиотерапии (гемоцитокины и антиэметики) / М.Б. Стенина // Русский медицинский журнал. 1999. №10. С.455-457.5) Stenina, M.B. Supportive therapy during modern chemotherapy (hemocytokines and antiemetics) / M.B. Stenina // Russian Medical Journal. 1999. No. 10. S.455-457.

6) Механизмы протективного действия «дикарбамина» в отношении системы крови при цитостатическом воздействии / В.Е. Небольсин [и др.] // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2010. Т. 150. №9. С. 312-316.6) The mechanisms of the protective effect of "dicarbamine" in relation to the blood system with cytostatic effects / V.E. Nebolsin [et al.] // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 2010.V. 150. No. 9. S. 312-316.

7) Participation of Pi3k, Марк Erk1/2 and P38 in the realization of growth potential of mesenchymal precursor cells under in vitro conditions / G.N. Zyuzkov [et al.] // Bulletin Of Experimental Biology And Medicine. 2014. T. 156. №4. C. 556-559.7) Participation of Pi3k, Mark Erk1 / 2 and P38 in the realization of growth potential of mesenchymal precursor cells under in vitro conditions / G.N. Zyuzkov [et al.] // Bulletin Of Experimental Biology And Medicine. 2014. T. 156. No. 4. C. 556-559.

8) PI3K, MAPK EPK1/2 and Р38 are involved in the realization of growth potential of mesenchymal progenitor cells under the infl uence of basic fibroblast growth factor / G.N. Zyuzkov [et al.] // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 2014. T. 157. №4. C. 436-439.8) PI3K, MAPK EPK1 / 2 and P38 are involved in the realization of growth potential of mesenchymal progenitor cells under the influence of basic fibroblast growth factor / G.N. Zyuzkov [et al.] // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 2014. T. 157. No. 4. C. 436-439.

9) Phase i study of the novel cyclic AMP (cAMP) Analogue 8-Chloro-cAMP in patients with cancer: toxicity, hormonal, and immunological effects / D.J. Propper [et al.] // Clin. Cancer Res. 1999. Vol. 5. P. 1682-1689.9) Phase i study of the novel cyclic AMP (cAMP) Analogue 8-Chloro-cAMP in patients with cancer: toxicity, hormonal, and immunological effects / D.J. Propper [et al.] // Clin. Cancer Res. 1999. Vol. 5. P. 1682-1689.

10) Mechanisms of regulation of hemopoiesis during experimental cytostatic myelosuppression induced by carboplatin / A.M. Dygai [et al.] // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 2007. T. 143. №5. C. 581-584.10) Mechanisms of regulation of hemopoiesis during experimental cytostatic myelosuppression induced by carboplatin / A.M. Dygai [et al.] // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 2007. T. 143. No. 5. C. 581-584.

11) Методические рекомендации по изучению гемостимулирующей активности фармакологических веществ Руководство по проведению доклинических исследований новых лекарственных средств. Часть первая Под ред. А.Н. Миронова / A.M. Дыгай [и др.]. М.: Гриф и К, 2013. С. 759-766.11) Guidelines for the study of hemostimulating activity of pharmacological substances. Guidelines for preclinical studies of new drugs. Part One Ed. A.N. Mironova / A.M. Digay [et al.]. M .: Grif and K, 2013.S. 759-766.

Примечание: в таблицах 1-3* - статистически значимые отличия от интактной группы; # - статистически значимые различия с группой 1 (Р<0,05)Note: in tables 1-3 * - statistically significant differences from the intact group; # - statistically significant differences with group 1 (P <0.05)

Claims

The use of protein kinase A activator (PKA) as a hemoprotective agent effective when administered in vivo against erythro- and granulomonocytopoiesis.