RU2690380C1 - Method of producing oxidised dextran, suitable for its visualization in blood serum - Google Patents
Method of producing oxidised dextran, suitable for its visualization in blood serum Download PDFInfo
- Publication number
- RU2690380C1 RU2690380C1 RU2019103912A RU2019103912A RU2690380C1 RU 2690380 C1 RU2690380 C1 RU 2690380C1 RU 2019103912 A RU2019103912 A RU 2019103912A RU 2019103912 A RU2019103912 A RU 2019103912A RU 2690380 C1 RU2690380 C1 RU 2690380C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- oxidized dextran
- derivative
- oxidized
- dextran
- liposomal
- Prior art date
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
- A61K31/716—Glucans
- A61K31/721—Dextrans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/0006—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid
- C08B37/0009—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid alpha-D-Glucans, e.g. polydextrose, alternan, glycogen; (alpha-1,4)(alpha-1,6)-D-Glucans; (alpha-1,3)(alpha-1,4)-D-Glucans, e.g. isolichenan or nigeran; (alpha-1,4)-D-Glucans; (alpha-1,3)-D-Glucans, e.g. pseudonigeran; Derivatives thereof
- C08B37/0021—Dextran, i.e. (alpha-1,4)-D-glucan; Derivatives thereof, e.g. Sephadex, i.e. crosslinked dextran
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
Abstract
Description
Изобретение относится к медицине, экспериментальной и клинической фармакологии, в частности, оно может быть использовано при исследовании фармакокинетики окисленных декстранов, а именно исследовании фармакокинетики их липосомальных форм.The invention relates to medicine, experimental and clinical pharmacology, in particular, it can be used in the study of the pharmacokinetics of oxidized dextrans, namely the study of the pharmacokinetics of their liposomal forms.
В экспериментальной медицине широко используются флуоресцентно меченные модифицированные производные полисахаридов, в частности декстрана, для изучения транспорта биологически активных веществ через клеточные мембраны (1).In experimental medicine, fluorescently labeled modified derivatives of polysaccharides, in particular dextran, are widely used to study the transport of biologically active substances through cell membranes (1).
Особый интерес для фармакологии представляют окисленные декстраны, так как они обладают высокой биосовместимостью, иммуномодулирующей активностью и могут использоваться в качестве перспективной матрицы для иммобилизации биологически активных веществ с целью их адресной доставки в различные клетки-мишени (2). Окисленные декстраны представляют собой производные декстрана, полученные путем его химического или радиационного окисления и содержащие карбонильные группы. С помощью окисленных декстранов получены перспективные лекарственные композиции (конъюгаты) для лечения туберкулеза (3), системных микозов (4) и вирусных заболеваний (5). Однако механизм действия окисленных декстранов до настоящего времени изучен недостаточно, так как отсутствуют способы получения их меченных производных с сохраненными карбонильными группами, образующимися при окислении декстранов и обусловливающих их специфические биологические свойства. Особенно малоизучены липосомальные формы окисленного декстрана и его коньюгатов с лекарственными субстанциями, так как спецификой липосомальных форм является экранирование окисленного декстрана внутри липосом, затрудняющее его визуализацию, например, методом иммуноферментного анализа, так как липосомальная мембрана мешает взаимодействию окисленного декстрана и его коньюгатов, например биотинилированных коньюгатов, с антителами и стрептавидин-пероксидазным комплексом.Of particular interest for pharmacology are oxidized dextrans, since they have high biocompatibility, immunomodulating activity and can be used as a promising matrix for immobilizing biologically active substances with the aim of their targeted delivery to various target cells (2). Oxidized dextrans are dextran derivatives obtained by its chemical or radiation oxidation and containing carbonyl groups. With the help of oxidized dextrans, promising drug compositions (conjugates) for the treatment of tuberculosis (3), systemic mycoses (4) and viral diseases (5) have been obtained. However, the mechanism of action of oxidized dextrans has not yet been studied sufficiently, since there are no methods for obtaining their labeled derivatives with preserved carbonyl groups, which are formed during the oxidation of dextrans and determine their specific biological properties. Especially little studied liposomal forms of oxidized dextran and its conjugates with medicinal substances, as the specificity of liposomal forms is the screening of oxidized dextran inside the liposomes, making it difficult to visualize it, for example, by enzyme immunoassay, since the liposomal membrane prevents the interaction of the oxidized dextran and its conjugates of the template will have to have the same template. , with antibodies and streptavidin-peroxidase complex.
Известно, что для визуализации окисленных декстранов используют различные метки, например флуоресцентные красители.It is known that various labels, for example fluorescent dyes, are used to visualize oxidized dextrans.
Известен способ получения флуоресцентного производного декстрана, включающий активацию декстрана путем реакции с бромпропиламином, осаждение полученного аминопроизводного декстрана этанолом; очистку аминопроизводного декстрана диализом; проведение реакции аминопроизводного декстрана с 5-([4,6-дихлоротриазин-2-ил]амино)-флуоресцеином путем конденсации в буферном растворе; отделение полученного флуоресцентного производного декстрана от свободного 5-([4,6-дихлоротриазин-2-ил]амино)-флуоресцеина ультрафильтрацией, в частности, диализом; очистку флуоресцентного аминопроизводного декстрана путем хроматографического разделения (6). Недостатком известного способа является его непригодность для получения флуоресцентных производных окисленных декстранов, т.к. это может привести к полной потере карбонильных групп, обусловливающих специфические биологические свойства окисленных декстранов.A method of obtaining a fluorescent derivative of dextran, including the activation of dextran by reaction with bromopropylamine, the precipitation of the obtained amine derivative of dextran with ethanol; purification of the amino dextran by dialysis; carrying out the reaction of the amino dextran with 5 - ([4,6-dichlorotriazin-2-yl] amino) -fluorescein by condensation in a buffer solution; separating the obtained fluorescent dextran derivative from free 5 - ([4,6-dichlorotriazin-2-yl] amino) -fluorescein by ultrafiltration, in particular, dialysis; purification of fluorescent amino derivative dextran by chromatographic separation (6). The disadvantage of this method is its unsuitability for the production of fluorescent derivatives of oxidized dextrans, because this can lead to a complete loss of carbonyl groups, which determine the specific biological properties of oxidized dextrans.
Известен способ получения флуоресцентного производного окисленного декстрана, включающий проведение реакции флуоресцентного красителя с активированным окисленным декстраном с последующей очисткой конечного продукта от примесей путем ультрафильтрации. В качестве флуоресцентного красителя используют флуоресцеин, в качестве активирующего реагента - 1,1'-карбонилдиимидазол и активацию окисленного декстрана производят путем добавления 1,1'-карбонилдиимидазола в реакционную смесь окисленного декстрана с флуоресцеином (7). Недостатком известного способа является низкая емкость (низкая визуализирующая способность) получаемого флуоресцентного производного окисленного декстрана, поскольку в него можно ввести ограниченное количество молекул флуоресцеина, при этом на сравнительно большой молекуле декстрана (около 250 глюкопиранозных звеньев для м.М. 40 кДа) будет находиться до 10 остатков флуоресцеина. Кроме этого, большинство биологических объектов (клетки, тканевые гомогенаты, компоненты крови и др.) обладают весьма интенсивной собственной флуоресценцией, которая совпадает со спектральными характеристиками флуоресцеина, что не позволяет определить содержание в сыворотке крови как липосомальные, так и нелипосомальные формы окисленного декстрана.A method of obtaining a fluorescent derivative of oxidized dextran, including the reaction of a fluorescent dye with activated oxidized dextran, followed by purification of the final product from impurities by ultrafiltration. Fluorescein is used as a fluorescent dye, 1,1'-carbonyldiimidazole is used as an activating agent, and oxidized dextran is activated by adding 1,1'-carbonyldiimidazole to the reaction mixture of oxidized dextran with fluorescein (7). The disadvantage of this method is the low capacity (low visualization ability) of the obtained fluorescent oxidized dextran derivative, since a limited number of fluorescein molecules can be introduced into it, while the relatively large dextran molecule (about 250 glucopyranose units for mM 40 kDa) will be up to 10 residues of fluorescein. In addition, most biological objects (cells, tissue homogenates, blood components, etc.) have a very intense intrinsic fluorescence, which coincides with the spectral characteristics of fluorescein, which does not allow determining the content in the serum of both liposomal and non-liposomal forms of oxidized dextran.
Наиболее близким к заявляемому является способ получения биотинилированного производного окисленного декстрана, включающий проведение реакции окисленного декстрана с гидразидом биотина, используемого в качестве метки для визуализации в сыворотке крови; биотинилирование окисленного декстрана проводят путем добавления в реакционную смесь гидразида биотина в соотношении гидразид биотина - окисленный декстран, равном 1:(20-25), а реакцию проводят при 80-90°С в течение 30-60 минут (8). Способ позволяет визуализировать в сыворотке крови нелипосомальную форму биотинилированного производного окисленного декстрана. Недостатком способа-прототипа является непригодность биотинилированного производного окисленного декстрана для определения содержания его липосомальных форм в сыворотке крови ввиду экранирующих свойств липосомальной мембраны.Closest to the claimed method is to obtain biotinylated derivative of oxidized dextran, including the reaction of oxidized dextran with biotin hydrazide, used as a label for visualization in serum; Biotinylation of oxidized dextran is carried out by adding biotin hydrazide in the ratio of biotin hydrazide to oxidized dextran equal to 1: (20-25) in the reaction mixture, and the reaction is carried out at 80-90 ° C for 30-60 minutes (8). The method allows visualization in the serum of the non-liposomal form of a biotinylated derivative of oxidized dextran. The disadvantage of the prototype method is the unsuitability of the biotinylated derivative of oxidized dextran for determining the content of its liposomal forms in the blood serum due to the shielding properties of the liposomal membrane.
Задачей, на решение которой направлено изобретение, является получение производного окисленного декстрана, обеспечивающего определение содержания его липосомальных форм в сыворотке крови.The problem to which the invention is directed, is to obtain a derivative of oxidized dextran, which provides for the determination of the content of its liposomal forms in the blood serum.
Решение поставленной задачи достигается тем, что в качестве метки для визуализации в сыворотки крови используют гидразид акридонуксусной кислоты; реакцию проводят при соотношении компонентов гидразид акридонуксусной кислоты - окисленный декстран 1:10 в пересчете на массу сухого вещества в течение 90 минут, фильтруют полученную суспензию, охлаждают ее до комнатной температуры, добавляют липосомообразующий агент, выдерживают полученную липосомальную форму окисленного декстрана при температуре 4-6°С в течение не менее 24 часов, затем фильтруют ее с помощью микрофильтра; окисленный декстран предварительно растворяют в дистиллированной воде до концентрации 1-2%; липосомальную форму окисленного декстрана фильтруют не менее 5 раз с помощью микрофильтра с диаметром пор 0,45 мкм.The solution of this problem is achieved by the use of acridone acetic acid hydrazide as a label for visualization in blood serum; the reaction is carried out at the ratio of the components of acridone acetic acid hydrazide - oxidized dextran 1:10 based on dry weight for 90 minutes, filter the resulting suspension, cool it to room temperature, add a liposome-forming agent, maintain the resulting liposomal form of oxidized dextran at a temperature of 4-6 ° C for at least 24 hours, then filter it with a microfilter; oxidized dextran is pre-dissolved in distilled water to a concentration of 1-2%; The liposomal form of oxidized dextran is filtered at least 5 times using a microfilter with a pore diameter of 0.45 microns.
Использование гидразида акридонуксусной кислоты в качестве метки для визуализации окисленного декстрана позволяет визуализировать липосомальную форму окисленного декстрана в спектре, отличном от спектра собственной флуоресценции биологических объектов (клетки, тканевые гомогенаты, компоненты крови и др.), а именно при длине волны возбуждения 390 нм, длине волны эмиссии 445 нм, в то время как собственная флуоресценция биологических объектов выявляется при длине волны возбуждения 400 нм, длине волны эмиссии 455 нм.The use of acridone acetic acid hydrazide as a label to visualize oxidized dextran allows visualizing the liposomal form of oxidized dextran in a spectrum other than the spectrum of the native fluorescence of biological objects (cells, tissue homogenates, blood components, etc.), namely, at an excitation wavelength of 390 nm, length the emission wave is 445 nm, while the intrinsic fluorescence of biological objects is detected at an excitation wavelength of 400 nm, and an emission wavelength of 455 nm.
Раскрытие сущности изобретенияDisclosure of the invention
Способ получения производного окисленного декстрана, пригодного для его визуализации в сыворотке крови, включает проведение реакции окисленного декстрана с гидразидом акридонуксусной кислоты, используемым в качестве метки для его визуализации в сыворотке крови, при соотношении компонентов гидразид акридонуксусной кислоты - окисленный декстран 1:10 в пересчете на массу сухого вещества в течение 90 минут при температуре 80-90°С. Затем полученную суспензию фильтруют, охлаждают ее до комнатной температуры, добавляют липосомообразующий агент, выдерживают полученную липосомальную форму производного окисленного декстрана при температуре 4-6°С в течение не менее 24 часов, затем фильтруют ее с помощью микрофильтра. Окисленный декстран до проведения реакции с гидразидом акридонуксусной кислоты предварительно растворяют в дистиллированной воде до концентрации 1-2%. Липосомальную форму производного окисленного декстрана фильтруют не менее 5 раз с помощью микрофильтра с диаметром пор 0,45 мкм.The method of obtaining the oxidized dextran derivative suitable for its visualization in blood serum includes carrying out the reaction of oxidized dextran with acridone acetic acid hydrazide used as a label for its visualization in serum, with the ratio of the components of acridone acetic acid hydrazide - oxidized dextran 1:10 in terms of dry weight for 90 minutes at a temperature of 80-90 ° C. Then, the resulting suspension is filtered, cooled to room temperature, the liposome-forming agent is added, the obtained liposomal form of the oxidized dextran derivative is maintained at a temperature of 4-6 ° C for at least 24 hours, then it is filtered using a microfilter. Oxidized dextran is pre-dissolved in distilled water to a concentration of 1-2% prior to reaction with acridone acetic acid hydrazide. The liposomal form of the oxidized dextran derivative is filtered at least 5 times using a microfilter with a pore diameter of 0.45 μm.
Для осуществления способа используют окисленный декстран молекулярной массы 40-60 кДа.For the implementation of the method using oxidized dextran molecular weight of 40-60 kDa.
В качестве липосомоообразующего агента используют, например, фосфатидилхолин.As a liposome-forming agent, for example, phosphatidylcholine is used.
Полученную липосомальную форму производного окисленного декстрана хранят в холодильнике не более 14 дней. Для ее калибровки рассчитывают коэффициент флуоресценции в стандартной концентрации. Для этого полученную липосомальную форму производного окисленного декстрана разводят до стандартной суммарной концентрации сухих веществ 600 мкг/мл. Затем измеряют флуоресценцию ее образца на спектрофлуориметре, длина волны возбуждения 390 нм, длина волны эмиссии 445 нм. Коэффициент флуоресценции липосомальной формы производного окисленного декстрана в стандартном разведении 600 мкг/мл должен быть не менее 0,9 о.е.The resulting liposomal derivative of oxidized dextran is stored in the refrigerator for no more than 14 days. To calibrate it, calculate the fluorescence coefficient at the standard concentration. For this, the obtained liposomal form of the oxidized dextran derivative is diluted to a standard total concentration of solids of 600 μg / ml. Then measure the fluorescence of its sample on a spectrofluorometer, an excitation wavelength of 390 nm, an emission wavelength of 445 nm. The fluorescence coefficient of the liposomal form of the oxidized dextran derivative at a standard dilution of 600 µg / ml must be at least 0.9 o.
Определяющим отличием предлагаемого способа от прототипа является то, что в качестве метки для визуализации в сыворотке крови используют гидразид акридонуксусной кислоты, что позволяет определять в крови содержание липосомальных форм окисленного декстрана и в перспективе открывает возможности исследования фармакокинетики коньюгатов липосомальных форм окисленного декстрана с лекарственными субстанциями.The decisive difference of the proposed method from the prototype is that acridone acetic acid hydrazide is used as a label for visualization in blood serum, which allows determining the content of liposomal forms of oxidized dextran in blood and in the long term opens up the possibility of studying the pharmacokinetics of conjugates of liposomal forms of oxidized dextran with medicinal substances.
Экспериментальным путем обнаружено, что именно совокупность предложенных существенных признаков способа позволяет получать целевой продукт высокого качества, обеспечивающий высокую точность определения содержания липосомальной формы производного окисленного декстрана в сыворотке крови при проведении флуоресцентного анализа. При понижении количества гидразида акридонуксусной кислоты в реакционной смеси и при уменьшении температуры и времени реакции понижается выход получения производного окисленного декстрана. При повышении количества гидразида акридонуксусной кислоты в реакционной смеси и при увеличении температуры и времени реакции выход заявленного производного окисленного декстрана не увеличивается.It was found experimentally that it is the totality of the proposed essential features of the method that allows to obtain a high-quality target product that provides high accuracy in determining the content of the liposomal form of the oxidized dextran derivative in serum when conducting fluorescent analysis. With a decrease in the amount of acridone acetic acid hydrazide in the reaction mixture and with a decrease in temperature and reaction time, the yield of obtaining the oxidized dextran derivative decreases. With an increase in the amount of hydride acridone acetic acid in the reaction mixture and with increasing temperature and reaction time, the yield of the claimed oxidized dextran derivative does not increase.
Осуществление изобретенияThe implementation of the invention
Заявляемое изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.The invention is illustrated by the following examples of specific performance.
Пример 1. Точную навеску окисленного декстрана со средней м.М. 40 к Да массой 1,0 г помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3, добавляют 100 мл дистиллированной воды, выдерживают раствор до полного растворения навески, затем добавляют 0,1 г гидразида акридонуксусной кислоты, перемешивают, закрывают неплотно стеклянной пробкой и ставят на водяную баню при температуре 80-90°С на 90 минут, периодически перемешивая суспензию. После чего суспензию фильтруют через обеззоленные бумажные фильтры синяя лента. Полученный прозрачный раствор производного окисленного декстрана охлаждают до комнатной температуры и добавляют в него 1,0 г липосомообразующего компонента - фосфатидилхолина. Смесь выдерживают в холодильнике в течение 24 часов для набухания фосфатидилхолина, после чего полученную липосомальную форму производного окисленного декстрана не менее 5 раз пропускают через микрофильтр с диаметром пор 0,45 мкм. Коэффициент флуоресценции полученной липосомальной формы производного окисленного декстрана в стандартном разведении 600 мкг/мл составляет 0,9 о.е.Example 1. Exact weighed oxidized dextran with an average m. M. 40 to Yes weighing 1.0 g is placed in a volumetric flask with a capacity of 100 cm 3 , add 100 ml of distilled water, withstand the solution until the sample is completely dissolved, then add 0.1 g of acridone acetic acid hydrazide, mix, cover tightly with a glass stopper and put on a water bath at a temperature of 80-90 ° C for 90 minutes, periodically mixing the suspension. After that, the suspension is filtered through a blue ribbon with ashless paper filters. The resulting clear solution of the oxidized dextran derivative is cooled to room temperature and 1.0 g of phosphatidylcholine liposome-forming component is added to it. The mixture is kept in the refrigerator for 24 hours to swell phosphatidylcholine, after which the resulting liposomal derivative of oxidized dextran is passed at least 5 times through a microfilter with a pore diameter of 0.45 microns. The fluorescence coefficient of the obtained liposomal form of the oxidized dextran derivative at a standard dilution of 600 μg / ml is 0.9 o.e.
Пример 2. Точную навеску окисленного декстрана со средней м.М. 40 кДа массой 2,0 г помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3, добавляют 100 мл дистиллированной воды, выдерживают раствор до полного растворения навески, затем добавляют 0,2 г гидразида акридонуксусной кислоты, перемешивают, закрывают неплотно стеклянной пробкой и ставят на водяную баню при температуре 80-90°С на 90 минут, периодически перемешивая суспензию. Затем суспензию фильтруют через обеззоленные бумажные фильтры синяя лента. Полученный прозрачный раствор охлаждают до комнатной температуры и добавляют в него 1,0 г липосомообразующего компонента - фосфатидилхолина. Смесь выдерживают в холодильнике при температуре 5°С в течение 24 часов для набухания фосфатидилхолина, после чего липосомальную форму производного окисленного декстрана не менее 5 раз пропускают через микрофильтр с диаметром пор 0,45 мкм. Коэффициент флуоресценции полученной липосомальной формы флуоресцентного производного окисленного декстрана в стандартном разведении 600 мкг/мл составляет 0,95 о.е.Example 2. Exact weighed oxidized dextran with an average m. M. 40 kDa with a weight of 2.0 g are placed in a 100 cm 3 volumetric flask, 100 ml of distilled water is added, the solution is kept until the sample is completely dissolved, then 0.2 g of acridone acetic acid hydrazide is added, stirred, sealed tightly with a glass stopper and put in a water bath at a temperature of 80-90 ° C for 90 minutes, periodically stirring the suspension. Then the suspension is filtered through a blue ribbon with ashless paper filters. The resulting clear solution is cooled to room temperature and 1.0 g of phosphatidylcholine liposome-forming component is added to it. The mixture is kept in a refrigerator at 5 ° C for 24 hours to swell phosphatidylcholine, after which the liposomal form of the oxidized dextran derivative is passed at least 5 times through a microfilter with a pore diameter of 0.45 microns. The fluorescence coefficient of the obtained liposomal form of the fluorescent oxidized dextran derivative at a standard dilution of 600 μg / ml is 0.95 pu
Пример 3. Точную навеску окисленного декстрана со средней м.М. 60 кДа массой 1,0 г помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3, добавляют 100 мл дистиллированной воды, выдерживают до полного растворения навески, затем добавляют 0,1 г гидразида акридонуксусной кислоты, перемешивают, закрывают неплотно стеклянной пробкой и ставить на водяную баню при температуре 80-90°С на 90 минут, периодически перемешивая суспензию. После чего суспензию фильтруют через обеззоленные бумажные фильтры синяя лента. Полученный прозрачный раствор производного окисленного декстрана охлаждают до комнатной температуры и добавляют в него 1,0 г липосомообразующего компонента - фосфатидилхолина. Смесь выдерживают в холодильнике при температуре 5°С в течение 24 часов для набухания фосфатидилхолина, после чего липосомальную форму производного окисленного декстрана не менее 5 раз пропускают через микрофильтр с диаметром пор 0,45 мкм. Коэффициент флуоресценции полученной липосомальной формы флуоресцентного производного окисленного декстрана в стандартном разведении 600 мкг/мл составляет 0,9 о.е.Example 3. Exact weighed oxidized dextran with an average m. M. 60 kDa with a mass of 1.0 g are placed in a volumetric flask with a capacity of 100 cm 3 , 100 ml of distilled water are added, the mixture is allowed to dissolve until complete dissolution, then 0.1 g of acridone acetic acid hydrazide is added, mixed, sealed with a glass stopper and put temperature 80-90 ° C for 90 minutes, periodically stirring the suspension. After that, the suspension is filtered through a blue ribbon with ashless paper filters. The resulting clear solution of the oxidized dextran derivative is cooled to room temperature and 1.0 g of phosphatidylcholine liposome-forming component is added to it. The mixture is kept in a refrigerator at 5 ° C for 24 hours to swell phosphatidylcholine, after which the liposomal form of the oxidized dextran derivative is passed at least 5 times through a microfilter with a pore diameter of 0.45 microns. The fluorescence coefficient of the obtained liposomal form of the fluorescent derivative of oxidized dextran at a standard dilution of 600 μg / ml is 0.9 o.e.
Пример 4. Точную навеску окисленного декстрана со средней м.М. 60 кДа массой 2,0 г помещают в мерную колбу вместимостью 100 см, добавляют 100 мл дистиллированной воды, выдерживают до полного растворения навески, затем добавляют 0,2 г гидразида акридонуксусной кислоты перемешивают, закрывают неплотно стеклянной пробкой и ставят на водяную баню при температуре 80-90°С на 90 минут, периодически перемешивая суспензию. После чего суспензию фильтруют через обеззоленные бумажные фильтры синяя лента. Полученный прозрачный раствор производного окисленного декстрана охлаждают до комнатной температуры и добавляют в него 1,0 г липосомообразующего компонента - фосфатидилхолина. Смесь выдерживают в холодильнике в течение 24 часов для набухания фосфатидилхолина, после чего липосомальную форму производного окисленного декстрана не менее 5 раз пропускают через микрофильтр с диаметром пор 0,45 мкм. Коэффициент флуоресценции полученной липосомальной формы флуоресцентного производного окисленного декстрана в стандартном разведении 600 мкг/мл составляет 0,95 о.е.Example 4. Exact weighed oxidized dextran with an average m. M. 60 kDa weighing 2.0 g are placed in a volumetric flask with a capacity of 100 cm, 100 ml of distilled water are added, the mixture is allowed to dissolve until complete dissolution, then 0.2 g of acridone acetic acid hydrazide is mixed, sealed tightly with a glass stopper and put in a water bath at 80 -90 ° C for 90 minutes, periodically stirring the suspension. After that, the suspension is filtered through a blue ribbon with ashless paper filters. The resulting clear solution of the oxidized dextran derivative is cooled to room temperature and 1.0 g of phosphatidylcholine liposome-forming component is added to it. The mixture is kept in the refrigerator for 24 hours to swell phosphatidylcholine, after which the liposomal form of the oxidized dextran derivative is passed at least 5 times through a microfilter with a pore diameter of 0.45 μm. The fluorescence coefficient of the obtained liposomal form of the fluorescent oxidized dextran derivative at a standard dilution of 600 μg / ml is 0.95 pu
Пример 5. Точную навеску окисленного декстрана со средней м.М. 60 кДа массой 1,0 г помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3, добавляют 100 мл дистиллированной воды, выдерживают до полного растворения навески, затем добавляют 0,2 г гидразида акридонуксусной кислоты, перемешивают, закрывают неплотно стеклянной пробкой и ставят на водяную баню при температуре 80-90°С на 90 минут, периодически перемешивая суспензию. После чего суспензию фильтруют через обеззоленные бумажные фильтры синяя лента. Полученный прозрачный раствор производного окисленного декстрана охлаждают до комнатной температуры и добавляют в него 1,0 г липосомообразующего компонента - фосфатидилхолина. Смесь выдерживают в холодильнике в течение 24 часов для набухания фосфатидилхолина, после чего липосомальную форму производного окисленного декстрана не менее 5 раз пропускают через микрофильтр с диаметром пор 0,45 мкм. Коэффициент флуоресценции полученной липосомальной формы производного окисленного декстрана в стандартном разведении 600 мкг/мл составляет 0,9 о.е.Example 5. Exact weighed oxidized dextran with an average m. M. 60 kDa weighing 1.0 g is placed in a volumetric flask with a capacity of 100 cm 3 , add 100 ml of distilled water, incubate until complete dissolution of the sample, then add 0.2 g of acridone acetic acid hydrazide, mix, close tightly with a glass stopper and put in a water bath at temperature 80-90 ° C for 90 minutes, periodically stirring the suspension. After that, the suspension is filtered through a blue ribbon with ashless paper filters. The resulting clear solution of the oxidized dextran derivative is cooled to room temperature and 1.0 g of phosphatidylcholine liposome-forming component is added to it. The mixture is kept in the refrigerator for 24 hours to swell phosphatidylcholine, after which the liposomal form of the oxidized dextran derivative is passed at least 5 times through a microfilter with a pore diameter of 0.45 μm. The fluorescence coefficient of the obtained liposomal form of the oxidized dextran derivative at a standard dilution of 600 μg / ml is 0.9 o.e.
Пример 6. Точную навеску окисленного декстрана со средней м.М. 40 кДа массой 2,0 г помещают в мерную колбу вместимостью 100 см, добавляют 100 мл дистиллированной воды, выдерживают до полного растворения навески, затем добавляют 0,1 г гидразида акридонуксусной кислоты, перемешивают, закрывают неплотно стеклянной пробкой и ставят на водяную баню при температуре 80-90°С на 90 минут, периодически перемешивая суспензию. Затем суспензию фильтруют через обеззоленные бумажные фильтры синяя лента. Полученный прозрачный раствор производного окисленного декстрана охлаждают до комнатной температуры и добавляют в него 1,0 г липосомообразующего компонента - фосфатидилхолина. Смесь выдерживают в холодильнике в течение 24 часов для набухания фосфатидилхолина, после чего липосомальную форму производного окисленного декстрана не менее 5 раз пропускают через микрофильтр с диаметром пор 0,45 мкм. Коэффициент флуоресценции полученной липосомальной формы производного окисленного декстрана в стандартном разведении 600 мкг/мл составляет 0,9 о.е.Example 6. Exact weighed oxidized dextran with an average m. M. 40 kDa weighing 2.0 g are placed in a volumetric flask with a capacity of 100 cm, 100 ml of distilled water are added, the sample is allowed to dissolve until complete dissolution, then 0.1 g of acridone acetic acid hydrazide is added, stirred, sealed with a glass stopper and put in a water bath at 80-90 ° C for 90 minutes, periodically stirring the suspension. Then the suspension is filtered through a blue ribbon with ashless paper filters. The resulting clear solution of the oxidized dextran derivative is cooled to room temperature and 1.0 g of phosphatidylcholine liposome-forming component is added to it. The mixture is kept in the refrigerator for 24 hours to swell phosphatidylcholine, after which the liposomal form of the oxidized dextran derivative is passed at least 5 times through a microfilter with a pore diameter of 0.45 μm. The fluorescence coefficient of the obtained liposomal form of the oxidized dextran derivative at a standard dilution of 600 μg / ml is 0.9 o.e.
Полученная по заявленному способу липосомальная форма производного окисленного декстрана позволяет исследовать ее фармакокинетику. В таблицах 1 и 2 представлены данные по сравнительному исследованию фар-макокинетики смеси нелипосомальных и липосомальных форм производного окисленного декстрана с м.М. 40 кДа по заявленному способу и биотинилированного производного окисленного декстрана по прототипу. Мышам внутрибрюшинно однократно вводили 0,5 мл тестируемого вещества в виде комбинированной эмульсии, содержащей 50% липосомальной и 50% нелипосомальной форм производного окисленного декстрана. Дозы эквивалентны по количеству производного окисленного декстрана и размеру липосом.Obtained by the claimed method, the liposomal form of the derivative of oxidized dextran allows you to explore its pharmacokinetics. Tables 1 and 2 present data on a comparative study of the pharmacokinetics of a mixture of non-liposomal and liposomal forms of the oxidized dextran derivative with M.M. 40 kDa according to the claimed method and biotinylated derivative of oxidized dextran prototype. Mice were injected intraperitoneally once with 0.5 ml of the test substance in the form of a combined emulsion containing 50% liposomal and 50% non-liposomal forms of the oxidized dextran derivative. Doses are equivalent in terms of the amount of oxidized dextran derivative and the size of liposomes.
Как видно из данных, представленных в таблицах 1 и 2, концентрации смеси нелипосомальной и липосомальной форм биотинилированного производного окисленного декстрана имеют заниженные значения, так как биотинилированное производное окисленного декстрана, находящееся внутри липосом, за счет экранирующего эффекта липосомальной мембраны, не выявляется в условиях иммуноферментного анализа. При использовании смеси нелипосомальной и липосомальной форм производного окисленного декстрана по заявленному способу более высокие значения концентрации отражают суммарное содержание в крови обеих форм производного окисленного декстрана, включая липосомальную.As can be seen from the data presented in Tables 1 and 2, the concentrations of the mixture of non-liposomal and liposomal forms of biotinylated oxidized dextran derivative have underestimated values, since the biotinylated derivative of oxidized dextran inside the liposomes, due to the screening effect of the liposomal membrane, is not detected in the conditions of immunoenzyme analysis . When using a mixture of non-liposomal and liposomal forms of the oxidized dextran derivative according to the claimed method, higher concentration values reflect the total blood levels of both forms of the oxidized dextran derivative, including liposomal.
Таким образом, заявленный способ позволяет получить производное окисленного декстрана, которое может быть успешно использовано в липосомальной форме для определения его содержания в сыворотке крови при изучении его фармакокинетики.Thus, the claimed method allows to obtain a derivative of oxidized dextran, which can be successfully used in liposomal form to determine its content in blood serum when studying its pharmacokinetics.
Источники информацииInformation sources
1. Shimizu N, Kawazoe Y. - A new method for permeabilization of the plasma membrane of cultured mammalian cells. III. Internalization of fluorescent dextrans into cultured mammalian cells by vortex-stirring in the presence of high molecular weight polyacrylic acid. - Biol Pharm Bull. 1996 Aug; 19(8); 1023-5.1. Shimizu N, Kawazoe Y. - A new method for mammalian cells. Iii. Internalization of fluorescent dextrans into cultured mammalian cells by vortex-stirring in polyacrylic acid. - Biol Pharm Bull. 1996 Aug; 19 (8); 1023-5.
2. Shkurupii V.A., Arkhipov S.A., Troitskii A.V., Luzgina N.G., Zaikovskaja M.V., Gulyaeva E.P., Bystrova T.N., Ufimtseva E.G., Il'in D.A., Akhramenko E.S. In vitro effect of oxidizeg dextrans of peritoneal cells // Bulletin of Experimental Biology and Medicine, Supplement 1. - 2008. - P. 120-122.2. Shkurupii V.A., Arkhipov S.A., Troitskii A.V., Luzgina N.G., Zaikovskaja M.V., Gulyaeva E.P., Bystrova T.N., Ufimtseva E.G., Il'in D.A., Akhramenko E.S. In vitro effect of oxidizing cells of peritoneal cells // Bulletin of Experimental Biology and Medicine, Supplement 1. - 2008. - P. 120-122.
3. Shkurupii V.A., Archipov S.A., Tkachev V.O., Troitskii A.V, Luzgina N.G., Zaikovskaya M.V.,. Gulyaeva E.P, Bystrova T.N., Ufimtseva E.G. In Vitro Effects of Molecular Nanosomal Hybrid Compositions with Oxidized Dextrans, Conjugated with Isonicotinic Acid Hydrazine on Peritoneal Macrophages // Bulletin of Experimental Biology and Medicine - 2008 - Vol. 146. - No. 5 - P. 627-629.3. Shkurupii V.A., Archipov S.A., Tkachev V.O., Troitskii A.V., Luzgina N.G., Zaikovskaya M.V.,. Gulyaeva E.P., Bystrova T.N., Ufimtseva E.G. In Vitro Effects of Molecular Nanosomal Hybrid Compounds with Oxidized Dextrans, Conjugated with Isonicotinic Acid Hydrazine on Peritoneal Macrophages // Bulletin of Experimental Biology and Medicine - 2008 - Vol. 146. - No. 5 - p. 627-629.
4. Шкурупий B.A., Селятицкая В.Г., Цырендоржиев Д.Д., Пальчикова Н.А., Курилин В.В., Травин М.А., Надев А.П., Троицкий А.В. Эффекты модифицированного амфотерицина В при системном кандидозе в эксперименте. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2007 - Т. 143. - №4 - С. 367-370.4. Shkurupy B.A., Selyatitskaya V.G., Tsyrendorzhiev D.D., Palchikova N.A., Kurilin V.V., Travin M.A., Nadev A.P., Troitsky A.V. Effects of modified amphotericin B in systemic candidiasis in the experiment. // Bulletin of experimental biology and medicine. - 2007 - T. 143. - №4 - P. 367-370.
5. Шкурупий В.А., Шаркова Т.В., Потапова О.В., Шестопалов A.M. Регенераторно-пластические процессы в печени млекопитающих при гриппе птиц A/H5N1 и его профилактике модифицированным декстраном. // IV Всероссийская научно-практическая конференция «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов». - Новосибирск, 2009. - С. 289.5. Shkurupy, VA, Sharkova, TV, Potapova, OV, Shestopalov, A.M. Regenerative and plastic processes in the liver of mammals with avian influenza A / H5N1 and its prevention with modified dextran. // IV All-Russian Scientific and Practical Conference "Fundamental aspects of compensatory-adaptive processes." - Novosibirsk, 2009. - p. 289.
6. Prigent-Richard S., Cansell М., Vassy J., Viron A., Puvion E., Jozefonvicz J., Letourneur D. - Fluorescent and radiolabeling of polysaccharides: Binding and internalization experiments on vascular cells. - J Biomed Mater Res, 1998, 40, 275-281.6. Prigent-Richard S., Cansell, M., Vassy, J., Viron, A., Puvion, E., Jozefonvicz, J., Letourneur, D. - Fluorescent and radiolabeling of polysaccharides: Binding and internalization experiments on vascular cells. - J Biomed Mater Res, 1998, 40, 275-281.
7. Патент RU 2426545 «Способ получения флуоресцентных производных декстранов», опубл. 20.08.2011, МПК A61K 31/721, C08L 5/02, С07С 245/12, A61J 3/00.7. Patent RU 2426545 "Method for producing fluorescent dextran derivatives", publ. 08/20/2011, IPC A61K 31/721, C08L 5/02, C07C 245/12, A61J 3/00.
8. Патент РФ №2537246 «Способ получения биотинилированного производного окисленного декстрана», опубл. 31.10.2014, МПК G01N 33/533, A61K 31/721.8. RF patent №2537246 "Method for producing biotinylated oxidized dextran derivative", publ. 10/31/2014, IPC G01N 33/533, A61K 31/721.
Claims (3)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019103912A RU2690380C1 (en) | 2019-02-12 | 2019-02-12 | Method of producing oxidised dextran, suitable for its visualization in blood serum |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019103912A RU2690380C1 (en) | 2019-02-12 | 2019-02-12 | Method of producing oxidised dextran, suitable for its visualization in blood serum |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2690380C1 true RU2690380C1 (en) | 2019-06-03 |
Family
ID=67037502
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2019103912A RU2690380C1 (en) | 2019-02-12 | 2019-02-12 | Method of producing oxidised dextran, suitable for its visualization in blood serum |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2690380C1 (en) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2426545C1 (en) * | 2010-04-26 | 2011-08-20 | Учреждение Российской академии медицинских наук Научный центр клинической и экспериментальной медицины Сибирского отделения РАМН (НЦКЭМ СО РАМН) | Method of obtaining fluorescent derivatives of dexrans |
| RU2537246C1 (en) * | 2013-10-17 | 2014-12-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научный центр клинической и эскпериментальной медицины" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук ФГБУ "НЦКЭМ" СО РАМН | Method for preparing biotinylated derivative of oxidised dextran |
| RU2557891C1 (en) * | 2014-05-26 | 2015-07-27 | Акционерное общество "Федеральный научно-производственный центр "Алтай", (АО "ФНПЦ "Алтай") | Method of obtaining substance based on oxidated dextran and isonicotinic acid hydrazide |
-
2019
- 2019-02-12 RU RU2019103912A patent/RU2690380C1/en active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2426545C1 (en) * | 2010-04-26 | 2011-08-20 | Учреждение Российской академии медицинских наук Научный центр клинической и экспериментальной медицины Сибирского отделения РАМН (НЦКЭМ СО РАМН) | Method of obtaining fluorescent derivatives of dexrans |
| RU2537246C1 (en) * | 2013-10-17 | 2014-12-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научный центр клинической и эскпериментальной медицины" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук ФГБУ "НЦКЭМ" СО РАМН | Method for preparing biotinylated derivative of oxidised dextran |
| RU2557891C1 (en) * | 2014-05-26 | 2015-07-27 | Акционерное общество "Федеральный научно-производственный центр "Алтай", (АО "ФНПЦ "Алтай") | Method of obtaining substance based on oxidated dextran and isonicotinic acid hydrazide |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Xu-Bo Yuan et al. "Self-aggregated nanoparticles composed of periodate-oxidized dextran and cholic acid: preparation, stabilization and in-vitro drug release" Journal of Chemical Technology and Biotechnology, 81(5), 2006, 746-754. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR101464100B1 (en) | Fusion nano liposome-fluorescence labeled nucleic acid for in vivo application, uses thereof and preparation method thereof | |
| Holowka et al. | Polyarginine segments in block copolypeptides drive both vesicular assembly and intracellular delivery | |
| Tai et al. | Cytosolic delivery of proteins by cholesterol tagging | |
| CN102145173B (en) | Human serum albumin complex hydrophobically modified pullulan nanoparticles and preparation method thereof | |
| CN113292608B (en) | Exosome drug delivery system and preparation method and application thereof | |
| CN108558967B (en) | Cell membrane imaging fluorescent probe and application thereof | |
| Uzuner | Development of a direct trypan blue exclusion method to detect cell viability of adherent cells into ELISA plates | |
| CN111116904A (en) | Phenylboronic acid modified fluorine-containing high polymer material and application thereof in intracellular delivery of protein | |
| US20210214559A1 (en) | Fluorescently labeled polysaccharide, preparation method therefor, and use thereof | |
| Occhipinti et al. | Quantifying diffusion in mucosal systems by pulsed-gradient spin-echo NMR | |
| RU2690380C1 (en) | Method of producing oxidised dextran, suitable for its visualization in blood serum | |
| CN111249235B (en) | Brain targeting nanoliposome loaded with positive polymer/miR-195 compound, and preparation method and application thereof | |
| CN111249234B (en) | Preparation method and application of glycosyl-cell penetrating peptide-modified brain-targeted nanoliposome | |
| CN111150707A (en) | Macromolecule nano vesicle for accurately targeting central nervous system and application thereof | |
| RU2537246C1 (en) | Method for preparing biotinylated derivative of oxidised dextran | |
| RU2426545C1 (en) | Method of obtaining fluorescent derivatives of dexrans | |
| Yin et al. | Isolation of Structurally Heterogeneous TCR‐CD3 Extracellular Vesicle Subpopulations Using Caliper Strategy | |
| CN114225044B (en) | Reagent for modifying extracellular vesicles and preparation method thereof | |
| Xu et al. | Lipid droplet formation and dynamics: tracking by time-resolved fluorescence imaging | |
| JP5721130B2 (en) | Asymmetric nanotube-forming asymmetric double-headed lipid molecule, asymmetric nanotube formed by the lipid molecule, and drug encapsulated product using the asymmetric nanotube | |
| CN111848685B (en) | Preparation method of amphiphilic PN = PS type phosphorus-containing tree crown macromolecule nano micelle and application of drug carrier of amphiphilic PN = PS type phosphorus-containing tree crown macromolecule nano micelle | |
| CN104031636B (en) | Nanometer ball of a kind of autofluorescence and preparation method thereof and application | |
| US9354237B2 (en) | Methods for isolating proteins | |
| CN113429460A (en) | Fluorescent probe for cell membrane imaging and preparation method and application thereof | |
| Jacobs et al. | Cell-free membrane protein expression into hybrid lipid/polymer vesicles |