RU2688156C2 - Способ оценки эффективности лечения лепры с помощью полимеразной цепной реакции - Google Patents

Способ оценки эффективности лечения лепры с помощью полимеразной цепной реакции Download PDF

Info

Publication number
RU2688156C2
RU2688156C2 RU2017129673A RU2017129673A RU2688156C2 RU 2688156 C2 RU2688156 C2 RU 2688156C2 RU 2017129673 A RU2017129673 A RU 2017129673A RU 2017129673 A RU2017129673 A RU 2017129673A RU 2688156 C2 RU2688156 C2 RU 2688156C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
leprosy
treatment
pcr
effectiveness
leprae
Prior art date
Application number
RU2017129673A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2017129673A3 (ru
RU2017129673A (ru
Inventor
Людмила Валентиновна Сароянц
Кристина Шотаевна Арнаудова
Original Assignee
Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт по изучению лепры" Министерства здравоохранения Российской Федерации
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт по изучению лепры" Министерства здравоохранения Российской Федерации filed Critical Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт по изучению лепры" Министерства здравоохранения Российской Федерации
Priority to RU2017129673A priority Critical patent/RU2688156C2/ru
Publication of RU2017129673A3 publication Critical patent/RU2017129673A3/ru
Publication of RU2017129673A publication Critical patent/RU2017129673A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2688156C2 publication Critical patent/RU2688156C2/ru

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6804—Nucleic acid analysis using immunogens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области медицины и предназначено для оценки эффективности лечения лепры на основе идентификации жизнеспособных Mycobacterium leprae. Из биоптатов и скарификатов кожи выделяют ДНК/РНК. Реакцию ОТ-ПЦР проводят в режиме реального времени. При снижении бактериоскопического индекса (БИН) и процента положительных образцов, полученных через 6 и 9 месяцев после начала лечения, определяют эффективность проводимой антимикобактериальной терапии. Изобретение обеспечивает повышение точности способа. 4 табл., 2 пр.

Description

Изобретение относится к области медицины, а именно к лабораторной диагностике лепры и может быть использовано, в частности, для контроля эффективности антимикобактериального лечения у больных лепрой. Сущность изобретения состоит в том, что с кожи больных лепрой берут скарификаты и биоптаты и далее посредством проведения полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) с использованием внешних и внутренних праймеров: 5'-GCATGTCTTGTGGTGGAAAGC-3' и 5'-CACCCCACCAACAAGCTGAT-3' и флуоресцентного зонда 5'- (FAM) CATCCTGCACCGCA (RTQ1)-3' проводят идентификацию возбудителя лепры. Способ позволяет оценить эффективность проводимого лечения лепры на основе определения жизнеспособности Mycobacterium leprae в диагностических лабораториях и противолепрозных учреждениях.
Лепра является хроническим инфекционным заболеванием с преимущественным поражением кожи и периферической нервной системы, что часто приводит к серьезным инвалидизирующим осложнениям. Несмотря на значительное снижение распространенности лепры в мире после внедрения комбинированной химиотерапии, частота выявления новых случаев заболевания остается высокой. Кроме того, серьезной проблемой, осложняющей борьбу с лепрой, являются рецидивы заболевания. Возникновение рецидива обычно приводит к повторной госпитализации, увеличивает степень инвалидизации больных и осложняет эпидемическую ситуацию. Одним из факторов риска возникновения рецидивов, несмотря на проводимую противолепрозную терапию, может стать персистирование в организме больного жизнеспособных микобактерий лепры [1, 2].
На сегодняшний день ВОЗ рекомендует при лечении лепры использовать комбинированную антимикобактериальную терапию. Для оценки противолепрозного лечения, кроме клинической картины и гистологического исследования биоптатов кожи руководствуются бактериоскопическим индексом (БИН), с помощью которого при микроскопировании определяют соотношение «гомогенных» /«фрагментированных» / «зернистых» форм кислотоустойчивых микобактерий. Существенными недостатками этого метода, помимо субъективизма оценки и низкой чувствительности, является отсутствие общепринятого стандарта классификации неравномерно окрашенных микобактерий, а, следовательно, отсутствие достоверной оценки эффективности противолепрозной терапии.
Признанным способом определения жизнеспособности М. leprae является экспериментальная модель, предложенная С.С. Shepard в 1960 году [3]. Моделирование заключается в заражении мышей дозированным количеством M.leprae в подушечки лапок мышей и их дальнейшем размножением в месте инокуляции. После завершения эксперимента (период 8-12 месяцев) подсчитывается число микобактерий в лапке по методу Shepard С.С, McRae D.H [4]. По разнице между введенным количеством микобактерий и количеством, оказавшемся в лапке после заражения судят о степени размножения M.leprae.
Из практики медицины известен способ контроля за эффективностью химиотерапии у больных лепрой с помощью серологического исследования, заключающегося в определении уровня антител к различным антигенным детерминантам M.leprae с использованием комплекса серологических реакций в сыворотке крови больных лепрой (Дячина М.Н., Ющенко А.А., Дегтярев О.В., Лукин Ю.В., Ибраимов М.И. Серологический контроль за эффективностью химиотерапии при лепре. Методические рекомендации.Астрахань, 1994, 16 с.)
Недостатками этого способа являются:
- необходимость в параллельном выполнении 5 серологических тестов;
- большого объема сыворотки крови больного, пула сывороток от доноров и больных активной стадией лепры;
- использование в качестве тест-антигенов ультразвуковых дезинтегратов M.leprae и M.avium.
Эти недостатки не дают возможности получения конкретного технического результата - повышение эффективности (точности) способа.
Известен также «Способ прогнозирования эффективности терапии у больных лепрой» (патент №2247374 от 25.02.2005). Сущность способа заключается в том, что в периферической крови определяют цитохимический коэффициент степени накопления липидов в лейкоцитах в условных единицах до начала лечения и через 2-3 или 5-6, 10-12, 20-24 месяца терапии.
Существенными недостатками данного способа являются:
- невозможность длительного хранения биологического материала, что диктует необходимость осуществления способа сразу после забора крови больного;
- возможное влияние на оцениваемый показатель сопутствующей патологии как инфекционной, так неинфекционной природы, что делает необходимым проведение более сложных лабораторных методов исследования.
Все перечисленное в итоге не позволяет получить конкретный технический результат - повышение эффективности (точности) способа.
После открытия полимеразно-цепной реакции (ПЦР) стала очевидной возможность применения данного метода для идентификации возбудителя лепры и его преимущества по сравнению со стандартными методами диагностики. При невозможности культивирования M.leprae на искусственных питательных средах ПЦР позволяет решать вопрос быстрой идентификации M.leprae в тканях. Однако, с помощью ПЦР возможна детекция не только жизнеспособных некультивируемых форм бактерий, но и мертвых клеток, содержащих генетический материал. Методом, исключающим этот недостаток, является сочетание ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ГШР). Отличие жизнеспособных от нежизнеспособных M.leprae имеет большое значение для оценки эффективности проводимой терапии и прогноза развития рецидива заболевания.
С целью определения жизнеспособности микобактерий в качестве мишени используются рибосомальные гены. Одним из таких генов является 16S рРНК, который содержит не только общие для всех бактерий последовательности, но и специфические для каждого вида. Использование 16S рРНК мишени для ПЦР весьма выгодно, т.к. 16S рРНК - компонент микобактериальных рибосом и экспрессируется в большом количестве копий (от 103 до 104 на клетку). De Wit и Klaster [5] установили, что микобактерий лепры из различных источников имеют идентичные по 16S рРНК межгенные спейсерные области. Поскольку мРНК быстро деградирует после гибели клетки, ее обнаружение позволяет оценить жизнеспособность клетки [7]. Поэтому наиболее перспективными ПЦР-тестами для определения жизнеспособных микобактерий лепры являются те, в которых в качестве праймеров будет использоваться участок, кодирующий 16S рРНК.
Изложенное определяет актуальность предполагаемого изобретения и проведение работы, направленной на разработку метода, позволяющего оценивать жизнеспособность микобактерий лепры и, следовательно, эффективность противолепрозного лечения с использованием полимеразной цепной реакции.
После того, как для детекции жизнеспособности микобактерий туберкулеза была показана перспективность использования ОТ-ПЦР, это наблюдение нашло свое применение и в лепрологии. Haile Y. и Ryon J.J. [8] на основе ОТ-ПЦР разработан метод с колориметрической детекцией M.leprae на микротитровальных платах. В качестве праймеров использовался участок, кодирующий 16S рРНК. Общая чувствительность составляла 91,3%. Метод основан на выделение РНК, амплификации с использованием праймера к 16S рРНК и электрофорезе в агарозном геле с дальнейшей колориметрической гибридизацией.
Недостатками этого способа являются:
-использование в качестве детекции продуктов амплификации помимо электрофореза ДНК-гибридизации, что делает процесс идентификации возбудителя лепры более трудоемким и долгим;
- исследование проводится только у нелеченых больных.
Эти недостатки не дают возможность получить конкретный технический результат - повышение эффективности (точности) способа.
Известен способ, предложенный Сох et al. [11] и примененный в различных модификациях в работах других авторов [9, 10], при котором для детекции M.leprae использовался метод ОТ-ПЦР с несколькими праймерами, фланкирующими участки гена 16S рРНК в позициях 9-18, 69-91 и 218-239 последовательности ДНК.
Недостатками данного метода являются:
- длительность этапа выделения, включающая, обработку биопсий реагентом TRIzol и экстракцию с использованием протеиназы К;
- применение нескольких пар праймеров;
- использование в качестве детекции продуктов амплификации электрофореза, что увеличивает возможность контаминации образцов. Эти недостатки не дают возможность получить конкретный технический результат - повышение эффективности (точности) способа.
Также известен способ, предложенный Sharma R., Lavania М., Katoch K. et al. (Development and evalution of real-time RT-PCR asaay for quantitative estimation of viable mycobacterium leprae in clinical samples // Indian J. Lepr. - 2008. - Vol. 80. - P. 315-321), при котором применяется метод ОТ-ПЦР, в качестве праймера используется последовательность к 16S рРНК и амплификация проходит в режиме реального времени «Real time» в течение 45 циклов. Чувствительность теста составляет в пределах 88,9% в кожных скарификатах.
Недостатками известного способа являются:
- использование дорогостоящих готовых зарубежных наборов реагентов;
- увеличение времени осаждения ДНК до 2 часов при -20°;
- клинические образцы исследовались только от больных в активной стадии, что не дает возможности проведения оценку эффективности лечения, то есть обеспечения точности способа.
За прототип предполагаемого изобретения взят способ, предложенный Martinez N.A., Lahiri R., Pittman L.T. et al. (Molecular determination of Mycobacterium leprae viability by use of real-time PCR // J. Clin. Microbiol. 2009, 47: 2124-2130), при котором для обнаружения M.leprae применяется метод ПЦР с обратной транскрипцией с использованием в качестве праймеров sodA mRNA, 16S rRNA и RLEP M.leprae.
Общим существенным признаком является то, что в обоих способах для определения эффективности проводимого лечения в качестве праймеров используются последовательности гена 16S рРНК M.leprae.
Сущность способа по прототипу состоит в обнаружении в биоптатах больных лепрой с помощью ОТ-ПЦР жизнеспособной ДНК M.leprae во время и после курса противолепрозного лечения при использовании двух пар праймеров, а именно SodA/RLEP, 16 SrRNA/RLEP.
Недостатками известного способа по прототипу являются:
- длительность экстракции ДНК, состоящая из многих этапов, один из которых (инкубация биопсии с протеиназой К) продолжается до 12 часов;
- использование дорогостоящих готовых зарубежных наборов реагентов;
- применение нескольких пар праймеров;
- исследование только кожных биоптатов от больных лепрой в процессе лечения, тогда как при контроле за эффективностью проводимого специфического лечения необходимо еще подсчитывать и БИН в скарификатах кожи.
Эти недостатки не дают возможности получения конкретного технического результата - повышение эффективности (точности) способа.
Таким образом, перечисленные недостатки не обеспечивают повышение скорости и точности, т.е. эффективности способа.
Целью предполагаемого изобретения является создание способа оценки эффективности, проводимой антимикобактериальной терапии на основе определения жизнеспособности микобактерий лепры с помощью ОТ-ПЦР в режиме Real tame.
Цель достигается путем обнаружения Mycobacterium leprae в скарификатах и биоптатах кожи от больных лепрой с применением отечественных реактивов, сокращением времени проведения реакции, проведение реакции в режиме Real tame. с использованием флуоресцентного зонда, что предотвращает контаминацию.
Сущность способа состоит в следующем:
Для выделения РНК/ДНК из биоптатов и скарификатов кожи применяют модифицированный метод экстракции ДНК, основанный на лизисе нуклеиновых кислот лизирующим раствором, преципитации, с дальнейшей многократной отмывкой полученного препарата ДНК с помощью набора «Проба-НК» (ООО «НПО ДНК-технология», Москва). Комплект реагентов предназначен для получения препарата ДНК/РНК из биологического материала (периферическая кровь, слюна, мокрота, молоко, моча, сперма, секрет предстательной железы, ликвор, соскобы эпителиальных клеток с задней стенки глотки, из уретры, цервикального канала, заднего свода влагалища; мазки и смывы из полости носа и ротоглотки; материал от павших и больных животных).
С учетом того, что в инструкции к набору в качестве биологического материала не указаны кожные биоптаты и скарификаты, проводят подготовку клинического материала следующим образом: биоптат получают путем иссечения скальпелем ткани на границе здоровой и пораженной кожи с предварительной местной анестезией. Затем ножницами или скальпелем мелко нарезают образец и помещают полученный биоптат размером 10-25 мм3 в пробирку, содержащую 0,5 мл стерильного физиологического раствора. Далее кожный биоптат измельчают с помощью стерильного скальпеля, а затем инъекционных игл, встряхивают на вортексе 1 мин, затем отбирают 100 мкл надосадочной жидкости и переносят в чистую пробирку.
Для взятия скарификатов на пораженных участках кожи, а также с кожи надбровных дуг, мочек ушных раковин, подбородка, дистальных отделов конечностей скальпелем делают небольшой разрез (глубиной 1-2 мм). Стерильным одноразовым зондом проводят по коже на месте разреза. Зонд помещают в пробирку, содержащую 0,5 мл стерильного физиологического раствора, и аккуратно перемешивают, после чего зонд отжимают о стенки пробирки и извлекают. Пробирку закрывают и встряхивают на вортексе 1 мин. Далее пробирки центрифугируют при 13000 об/мин в течение 10 мин и удаляют надосадочную жидкость, оставляя в пробирке примерно 100 мкл (осадок + жидкая фракция).
На данном этапе используют только наконечники с маркировкой «RNAase free» и «DNAase free». В пробирку, маркированную «K-», вносят 100 мкл стерильного физиологического раствора.
Далее экстракцию ДНК проводят согласно инструкции, прилагаемой к комплекту реагентов «ПРОБА-НК» (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия).
Проведение реакции обратной транскрипции: маркируют необходимое количество пробирок объемом 0,5 мл с учетом пробирок «K-». Размораживают содержимое пробирок «ОТ-буфера» и «праймеры ОТ-RANDOM + дНТФ» из комплекта реагентов для обратной транскрипции (ООО «НПФ ДНК-технология», Москва) при комнатной температуре, затем встряхивают пробирки на вортексе в течение 3-5 сек и осаждают капли центрифугированием при 1000 об/мин в течение 3-5 сек. В отдельной пробирке готовят ОТ-смесь путем смешивания 2,0×(N+1) мкл «ОТ-буфера», l,0×(N+l) мкл «Праймеров OT-RANDOM + дНТФ» и 0,5×(N+1) мкл обратной транскриптазы, где (N+1) - количество анализируемых на наличие РНК образцов с учетом «K-» (N) с запасом на 1 образец. Далее по 3,5 мкл ОТ-смеси вносят в промаркированные пробирки. Переносят пробирки в рабочую зону, предназначенную для выделения РНК; вносят в пробирки по 16,5 мкл соответствующего образца РНК (или образца «K-»); встряхивают на вортексе 3-5 сек и центрифугируют при 1000 об/мин 3-5 сек; термостатируют при 40°С в течение 30 мин, затем при 95°С - 5 мин; осаждают конденсат при 13000 об/мин 30 сек. Препарат кДНК готов для постановки ПЦР.
Выделенные 5 мкл ДНК добавляют в амплификационную смесь, содержащую 50 мМ KCl, 10 мМ Трис HCl (рН8,8), 6,25 мМ MgCl2, Taq ДНК-полимеразу (5 ед/мкл), смесь dNTP, концентрация каждого нуклеотида 25 мМ, глицерол, Tween 20, 0,5 мкл (10 пкмоль/мкл) каждого праймера, 0,1 мкл (10 пкмоль/мкл) зонда и 13,9 мкл деионизированной воды (общий объем 25 мкл). Количество амплификационной смеси рассчитывают с учетом «K-» (N) и одного образца. Затем вносят в пробирку 20 мкл минерального масла.
Последовательность праймеров и зонда к 16S рРНК M.leprae:
ML16S rRNATaq-F: 5'-GCATGTCTTGTGGTGGAAAGC-3'
ML16S rRNATaq-R: 5'-CACCCCACCAACAAGCTGAT-3'
ML16S rRNATaq probe: (FAM) 5'-CATCCTGCACCGCA-3' (RTQ1)
Использование в предлагаемом способе флуоресцентного зонда позволяет проводить ПЦР в реальном времени и избежать контаминации. Отработанный нами режим амплификации представляет из себя следующее:
Figure 00000001
Амплификацию и учет результатов проводят на термоциклере «ДТ-96 Real time» (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия).
Таким образом, способ оценки эффективности лечения лепры с помощью полимеразной цепной реакции включает выделение ДНК/РНК из биопсий и скарификатов кожи с предварительной гомогенизацией с применением ОТ-ПЦР «Real time» с использованием внешних и внутренних праймеров 5'-GCATGTCTTGTGGTGGAAAGC-3' и 5'-CACCCCACCAACAAGCTGAT-3', флуоресцентного зонда (FAM) 5'-CATCCTGCACCGCA-3' (RTQ1) и режима амплификации: 95°С - 5 мин, 60°С - 50 сек - 1 цикл; 95°С - 15 сек, 62°С - 40 сек - 40 циклов; в Трис HCl буфере с KCl и MgCl2, твином и глицеролом для определения жизнеспособности M.leprae.
Проверку специфичности проводят на кожных биоптатах, полученных от больных лепрой. Кроме того, специфичность оценивается на музейных штаммах микобактерий: M.avium, M.kansasii, M.scrofulaceum, M.marinum, M.vaccae, M.intracellulare, M.clegg, M.duvalii, M.phlei, M.gastri, M.gordonae, M.lufu, M.smegmatis, M.bovis, M.paratuberculosis, M. Кедровский. Все изоляты исследовались в пределах 100 клеток в образце. Ни один из изолятов не показал реактивности в ПЦР. Для характеристики чувствительности предлагаемой тест-системы проведено сравнительное изучение выявления микобактерий лепры с помощью предлагаемого способа и стандартным бактериоскопическим методом. Результаты представлены в таблице1.
Figure 00000002
Курс комбинированной специфической терапии больных лепрой длится 6 месяцев (Приказ МЗ РФ от 29.12.2012 г №1681). После окончания курса терапии у больных проводят повторные лабораторные исследования Для изучения возможности использования данной тест-системы в оценке эффективности противолепрозного лечения исследованы кожные скарификаты и биоптаты от 6 больных лепрой в процессе курса специфической терапии (табл. 2).
Figure 00000003
Как видно из данной таблицы у некоторых больных микобактерий лепры обнаруживаются и после окончания курса лечения, что наиболее наглядно выявляется в ПЦР. Это дает основание для продолжения специфической терапии. В работах индийских ученых ранее [2] было показано, что в 3,3% случаев у больных с высоким БИН жизнеспособные M.leprae сохраняются и после 12 месяцев лечения.
В качестве примеров оценки эффективности лечения лепры с помощью ОТ-ПЦР приводятся выписки из историй болезни больных лепрой.
Пример 1. Больная Р. 1967 г. р. ИБ №28, жительница г. Астрахани, проходила обследование в «НИИЛ» Предварительный диагноз: Лепра, погранично-лепроматозная форма, активная стадия.
Поступила в клинику «НИИЛ» 23.09.2015 г. При поступлении на коже груди и живота имелись поверхностные инфильтраты без четких границ, местами сливающиеся между собой красноватого цвета. В поясничном отделе инфильтрация красновато-синюшного цвета с переходом на ягодицы. На правой ягодице отмечались лепромы диаметром до 0,3-0,5 см, эластичной консистенции. На кистях и стопах поверхностная инфильтрация красновато-синюшного цвета, сухость и шелушение ладоней и подошв, а также разреженность бровей. Для обследования и подтверждения диагноза 23.09.2015 г. у пациентки взяты биопсия и скарификаты кожи для проведения бактериоскопического, гистологического исследований и постановки ПЦР. Биоптат взят с кожи правой ягодицы путем иссечения скальпелем ткани на границе здоровой и пораженной кожи с предварительной местной анестезией. Затем скальпелем мелко нарезан образец и помещен полученный биоптат размером 10-25 мм в пробирку, содержащую 0,5 мл транспортной среды. Скарификаты взяты скарификатором с помощью небольших разрезов (глубиной 1-2 мм) с кожи левой надбровной дуги, левой мочки уха, правого предплечья, поясничного отдела спины слева и справа, наружной поверхности правой ягодицы для бактериоскопического исследования, а стерильными одноразовыми зондами для ПЦР. Зонды с исследуемым материалом с пораженных участков кожи помещены в пластиковые пробирки объемом 1,5 мл и аккуратно перемешаны со стерильным физиологическим раствором (0,5 мл), после чего зонды отжаты о стенки пробирки и извлечены. После встряхивания пробирки на вортексе в течение 1 мин и центрифугирования при 13000 об/мин в течение 10 мин удалена надосадочную жидкость, оставив в пробирке примерно 100 мкл (осадок + жидкая фракция). Далее экстракция ДНК проведена согласно инструкции, прилагаемой к комплекту реагентов «ПРОБА-НК» (ООО «НПО ДНК-Технология», Москва).
Полученный препарат РНК сразу использован для постановки реакции обратной транскрипции, для которой проведена маркировка необходимого количества пробирок объемом 0,5 мл с учетом пробирок «K-». Содержимое пробирок «ОТ-буфера» и «праймеров OT-RANDOM + дНТФ» из комплекта реагентов для обратной транскрипции (ООО «НПО ДНК-технология», Москва) разморожено при комнатной температуре и после встряхивания на вортексе в течение 3-5 сек капли осаждены при 1000 об/мин в течение В отдельной пробирке приготовлена ОТ-смесь путем смешивания 2,0 мкл × (N+1) «ОТ-буфера», 1,0 мкл × (N+1) «Праймеров OT-RANDOM + дНТФ» и 0,5 мкл × (N+1) обратной транскриптазы, где (N+1) - количество анализируемых на наличие РНК образцов с учетом «К-» (N) с запасом на 1 образец. Далее по 3,5 мкл ОТ-смеси внесено в промаркированные пробирки, которые затем перенесены в рабочую зону, предназначенную для выделения РНК. Далее в пробирки внесено по 16,5 мкл соответствующего образца РНК (или образца «К-»), которые после встряхивания на вортексе 3-5 сек и центрифугирования при 1000 об/мин 3-5 сек термостатированы при 40°С в течение 30 мин, затем при 95°С в течение 5 мин, конденсат осажден при 13000 об/мин 30 сек.
Полученный препарат ДНК в количестве 5 мкл использован для постановки ПЦР, добавляя в амплификационную смесь, содержащую 50 мМ KCl, 10 мМ Трис HCl (рН 8,8), 6,25 мМ MgCl2, Taq ДНК-полимеразу (5ед/мкл), смесь dNTP, концентрация каждого нуклеотида 25 мМ, глицерол, Tween 20; 0,5 мкл (10 пкмоль/мкл) каждого праймера, 0,1 мкл (10 пкмоль/мкл) зонда. Общий объем доведен до 25 мкл деионизированной водой. Количество амплификационной смеси рассчитано с учетом «К-». Затем в пробирки внесены по 20 мкл минерального масла.
Далее образцы поставлены в термоциклер «ДТ-96» с программой амплификации: 95°С - 5 мин, 60°С - 50 сек - 1 цикл; 95°С - 15 сек, 62°С - 40 сек - 40 циклов, 10°С - хранение.
Во всех пробах у больной Р. с помощью ОТ-ПЦР обнаружены M.leprae. При бактериоскопическом исследовании у больной во всех скарификатах выявлены микобактерий лепры, БИН=3,67. В гистологическом исследовании биоптата кожи отмечалось истончение эпидермиса, в сетчатом слое дермы множественные гранулемы, состоящие из гистиоцитов и лепрозных клеток, содержащих большое количество преимущественно гомогенных микобактерий; гранулемы находились вокруг нервных пучков и придатков кожи, частично разрушенных. Таким образом, результаты как стандартных методов исследования по выявлению микобактерий лепры (бактериоскопического и гистологического), так и ПЦР анализа у больной Р. полностью совпали. Это позволило с учетом клинических данных поставить диагноз: Лепра, лепроматозный тип, активная стадия.
После постановки диагноза больной назначено антимикобактериальное лечение по схеме ВОЗ. В процессе лечения для оценки его эффективности через 6 и 9 месяцев у больной повторно взяты скарификаты (6 мест) и биоптаты кожи с тех же мест, что и до начала лечения и проведены исследования (табл. 3).
Figure 00000004
До лечения во всех 6 скарификатах, как методом бактериоскопии, так и ОТ-ПЦР обнаруживались микобактерий лепры. Через 6 месяцев после начала лечения в скарификатах с левой мочки уха, правого предплечья и наружной поверхности правой ягодицы результаты бактериоскопии и ОТ-ПЦР оставались положительными, кроме того M.leprae идентифицировалась с помощью ОТ- ПЦР и в скарификате с поясничного отдела позвоночника справа. Через 9 месяцев результаты бактериоскопии и ОТ-ПЦР совпали в двух скарификатах (левой мочки уха и правого предплечья), в то время как при ПЦР анализе M.leprae идентифицировалась еще и в скарификате с наружной поверхности правой ягодицы. Больной продолжена комбинированная антимикобактериальная терапия.
Как видно из табл. 3 в процессе лечения отмечалось снижение БИН и процента положительных образцов как в бактериоскопическом исследовании, так и в ПЦР-анализе, что свидетельствует об эффективности проводимой антимикобактериальной терапии. В тоже время обнаружение более высокого процента микобактерий лепры с помощью ОТ-ПЦР во время лечения демонстрирует его более высокую чувствительность. Кроме того, по результатам бактериоскопического исследования невозможно определить жизнеспособность возбудителя, в то время как ОТ-ПЦР анализ на 16S рРНК позволяет детектировать жизнеспособные микобактерий лепры. Нами была использована модель Shepard С.С. [3] для подтверждения жизнеспособности микобактерий лепры. Материалом от больной Р. были заражены 20 мышей линии СВА дозированным количеством M.leprae (104 на мышь). Через 12 месяцев после заражения макроскопических изменений в лапах не отмечалось. При ПЦР анализе на 16S рРНК M.leprae обнаружены, а при микроскопическом исследовании у всех животных отмечалось размножение M.leprae, что подтверждалось увеличением их числа в месте инокуляции больше, чем на порядок по сравнению с введенным количеством. Таким образом, обнаружение жизнеспособных M.leprae с помощью общепринятого в лепрологии метода Shepard С.С. с использованием заражения экспериментальных животных предусматривает длительные сроки исследования - до 12 и более месяцев, в то время как с помощью ПЦР анализа возможно детектирование жизнеспособных микобактерий лепры в кратчайшие сроки.
Полученные результаты подтверждают, что предлагаемый способ идентификации микобактерий лепры можно использовать для контроля эффективности лечения лепры на основе оценки жизнеспособности M.leprae.
Пример 2. Больной Л. 1967 г.р., житель Астраханской области, ИБ №3364, проходил обследование в «НИИЛ». Предварительный диагноз: Лепра, лепроматозный тип, рецидив заболевания.
Поступил в клинику «НИИЛ» 18.01.2016 г. для обследования и дальнейшего лечения. При поступлении на коже задне-наружной поверхности бедра и в области правой ягодицы имелось гипопигментное пятно со сниженной болевой, тактильной и температурной чувствительностью без четких границ, размерами 25,0×12,0 см. В области кожи лба, латеральной орбитальной области с обеих сторон, а также подбородка и спины имелась невыраженная инфильтрация. Отмечалась разреженность бровей. Для подтверждения рецидива заболевания 20.01.2016 г. у пациента взяты скарификаты (5 мест) кожи: с правой надбровной дуги, левой мочки уха, подбородка, верхней трети бедра справа, правой области ягодицы и биопсия с кожи правого бедра. Взятие материала и постановка ОТ-ПЦР проводились так, как описано выше.
В скарификатах с левой мочки уха и области ягодицы справа, а также в биоптате больного при проведении ОТ-ПЦР идентифицированы M.leprae. При бактериоскопическом исследовании у больного только в скарификате с области ягодицы справа обнаружены микобактерий лепры, БИН=0,25. В гистологическом исследовании биоптата кожи у обследуемого отмечалось истончение эпидермиса, с умеренным акантозом, папилломатозом и гиперкератозом; умеренный фиброз дермы с очажками периваскулярной полиморфной лимфогистиоцитарной инфильтрацией, в сетчатом слое гранулемы из гистиоцитов и лепрозных клеток.
Таким образом, с учетом клинических данных, бактериоскопического, гистологического и ОТ-ПЦР исследований больному был поставлен диагноз: Лепра, лепроматозный тип, рецидив заболевания.
После постановки диагноза больному назначено противорецидивное лечение. Для оценки эффективности лечения через 6 и 9 месяцев у больного повторно взяты скарификаты (5 мест) с тех же мест, что и до начала лечения и проведены исследования (табл.4).
Через 6 месяцев после начала лечения только в ОТ-ПЦР анализе в одном скарификате обнаруживались микобактерий, бактериоскопия была отрицательной. Больному было продолжено лечение и через 9 месяцев как в ОТ-ПЦР исследовании, так и при бактериоскопии микобактерий лепры не выявлялись. Больной выписан под амбулаторное наблюдение.
Figure 00000005
Полученные результаты подтверждают, что предлагаемый способ определения жизнеспособности M.leprae можно использовать для контроля эффективности антимикобактериального лечения у больных лепрой. Предлагаемый способ идентификации M.leprae прост в исполнении, значительно дешевле импортных тест-систем, выполняется на отечественном оборудовании и отличается повышенной чувствительностью.
Предполагаемое изобретение удовлетворяет критериям новизны, так как при определении уровня исследований по данному вопросу не обнаружено способа, которому присущи признаки, идентичные всем признакам, перечисленным в формуле изобретения, включая характеристику назначения.
Способ оценки эффективности лечения лепры с помощью ОТ-ПЦР имеет изобретательский уровень, поскольку не выявлены технические решения, имеющие признаки, совпадающие со всеми отличительными признаками предполагаемого изобретения.
Таким образом, предполагаемое изобретение решает основную задачу - повышение эффективности способа, а именно оценку эффективности лечения лепры с помощью полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией для определения жизнеспособности Mycobacterium leprae. Предполагаемое изобретение позволяет получить результат в течение 4-5 часов, что значительно сокращает время интерпретации эффективности проводимого лечения и позволяет своевременно его скорректировать. Предлагаемый способ подразумевает использование не только биопсийного материала, но и скарификатов кожи, что значительно расширяет его возможности для оценки эффективности специфического лечения. Предлагаемый способ позволяет решать поставленную задачу с использованием только одной пары праймеров и при использовании реактивов только отечественного производства.
Авторами предложен новый, никем ранее незаявленный способ оценки эффективности лечения лепры с помощью полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией для определения жизнеспособности Mycobacterium leprae.
Предлагаемый способ может быть рекомендован к клиническому использованию в противолепрозных учреждениях, в диагностических лабораториях, в лечебных учреждениях для контроля за эффективностью противолепрозного лечения.
Использованные источники
1. Santos A.R., Balassiano V., Oliveira M.L. et al. Detection of Mycobacterium leprae DNA by polymerase chain reaction in the blood of individuals, eight years after completion of anti-leprosy therapy // Mem.Inst.Oswaldo Cruz. - 2001. - Vol. 96. - P. 1129-1133.
2. Ebenezer G.J., Daniel S., Norman G. et al. Are viable Mycobacterium leprae present in lepromatous patients after completion of 12 months and 24 months multi-drug therapy // Indian J. Lepr. - 2004. - Vol. 76 (3). - P. 199-206.
3. Shepard С.С. The experimental disease that follows the infection of human leprosy bacilli into footpads of mice // J. Exp. Med. - 1960. - Vol. 112. - P. 445-454.
4. Shepard С.C, McRae D.H. A method for counting acid-fast bacteria // Int. J. Lepr - 1968. - Vol. 36. - P. 78-82.
5. De Wit M.Y., Klatser P.R. Purification and characterization of a 36 kDa antigen of Mycobacterium leprae // J. Gen. Microbiol. - 1988. - Vol. 134. - P. 1541-1548.
6. Martinez N.A., Lahiri R., Pittman L.T. et al. Molecular determination of Mycobacterium leprae viabi lity by use of real-time PCR // J. Clin. Microbiol. - 2009. - Vol. 47. - P. 2124-2130.
7. Kurabachew M., Wondimu A., Ryon J.J. Reverse transcription-PCR detection of Mycobacterium leprae in clinical specimens // J. Clin. Microbiol. - 1998. - Vol. 36. - P. 1352-1356.
8. Haile Y and Ryon J.J. Colorimetric microtitre plate hybridization assay for the detection of Mycobacterium leprae 16S rRNA in clinical specimens. Lepr. Rev. 2004, 75: 40-49.
9. Hirawati, Katoch K., Chauhan D.S. et al. Detection of M.leprae by reverse transcription-PCR in biopsy specimens from leprosy cases: a preliminary study // J. Commun. Dis. - 2006. - Vol. 38 (3). - P. 1129-1133.
10. Phetsuksiri В., Rudeeaneksin J., Supapkul P. et al. (A simplified reverse transcriptase PCR for rapid detection of Mycobacterium leprae in skin specimens // FEMS Immunol. Med. Microbiol. - 2006. - P. 319-328.
11. Cox R.A., Kempsell K., Fairclough L. at al. The 16s ribosomal RNA of Mycobacterium leprae contains a unique sequence which can be used for identification by the polymerase chain reaction // J. Med. Microbiol. - 1991. - Vol. 35. - P. 284-290.

Claims (1)

  1. Способ оценки эффективности лечения лепры с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), основанный на определении жизнеспособности Mycobacterium leprae, включающий применение ОТ-ПЦР с внешними и внутренними праймерами: 5'-GCATGTCTTGTGGTGGAAAGC-3' и 5'-CACCCCACCAACAAGCTGAT-3' и с использованием флуоресцентного зонда (FAM)-5'-CATCCTGCACCGCA-3'-(RTQ1), отличающийся тем, что ДНК/РНК выделяют из биоптатов и скарификатов кожи с предварительной их гомогенизацией, реакцию проводят в «Real time» при режиме амплификации: 95°С - 5 мин, 60°С - 50 сек - 1 цикл; 95°С - 15 сек, 62°С - 40 сек - 40 циклов, в Трис HCl буфере с KCl, MgCl2 твином и глицеролом и при снижении бактериоскопического индекса (БИН) и процента положительных образцов, полученных через 6 и 9 месяцев после начала лечения, определяют эффективность проводимой антимикобактериальной терапии.
RU2017129673A 2017-08-21 2017-08-21 Способ оценки эффективности лечения лепры с помощью полимеразной цепной реакции RU2688156C2 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2017129673A RU2688156C2 (ru) 2017-08-21 2017-08-21 Способ оценки эффективности лечения лепры с помощью полимеразной цепной реакции

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2017129673A RU2688156C2 (ru) 2017-08-21 2017-08-21 Способ оценки эффективности лечения лепры с помощью полимеразной цепной реакции

Publications (3)

Publication Number Publication Date
RU2017129673A3 RU2017129673A3 (ru) 2019-02-22
RU2017129673A RU2017129673A (ru) 2019-02-22
RU2688156C2 true RU2688156C2 (ru) 2019-05-20

Family

ID=65479177

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2017129673A RU2688156C2 (ru) 2017-08-21 2017-08-21 Способ оценки эффективности лечения лепры с помощью полимеразной цепной реакции

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2688156C2 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2759232C1 (ru) * 2021-01-20 2021-11-11 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научный центр дерматовенерологии и косметологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации Способ оценки эффективности терапии лепры с использованием полимеразной цепной реакции для амплификации видоспецифичных участков геномов лепры, человека или мыши

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2247374C1 (ru) * 2003-06-09 2005-02-27 Научно-исследовательский институт по изучению лепры Министерства здравоохранения Российской Федерации Способ прогнозирования эффективности терапии у больных лепрой

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2247374C1 (ru) * 2003-06-09 2005-02-27 Научно-исследовательский институт по изучению лепры Министерства здравоохранения Российской Федерации Способ прогнозирования эффективности терапии у больных лепрой

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AITKEN A. TE buffer (Tris-EDTA buffer), 11/10/2012 [Найдено 02.08.2018] [он-лайн]. Найдено из Интернет: https://dokumen.tips/documents/te-buffer-aug12-natural-history-aitken-page-1-11102012-te-buffer-tris-edta.html . Молекулярная клиническая диагностика. Методы: Пер. с англ./ Под ред. С. Херрингтона, Дж. Макгли. - М.: Мир, 1999, стр.407. *
MARTINEZ A.N. et al. Molecular determination of Mycobacterium leprae viability by use of real-time PCR. J Clin Microbiol. 2009 Jul; 47(7): 2124-30. *
MARTINEZ A.N. et al. Molecular determination of Mycobacterium leprae viability by use of real-time PCR. J Clin Microbiol. 2009 Jul; 47(7): 2124-30. AITKEN A. TE buffer (Tris-EDTA buffer), 11/10/2012 [Найдено 02.08.2018] [он-лайн]. Найдено из Интернет: https://dokumen.tips/documents/te-buffer-aug12-natural-history-aitken-page-1-11102012-te-buffer-tris-edta.html . Молекулярная клиническая диагностика. Методы: Пер. с англ./ Под ред. С. Херрингтона, Дж. Макгли. - М.: Мир, 1999, стр.407. *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2759232C1 (ru) * 2021-01-20 2021-11-11 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научный центр дерматовенерологии и косметологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации Способ оценки эффективности терапии лепры с использованием полимеразной цепной реакции для амплификации видоспецифичных участков геномов лепры, человека или мыши

Also Published As

Publication number Publication date
RU2017129673A3 (ru) 2019-02-22
RU2017129673A (ru) 2019-02-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Lebech et al. Diagnostic value of PCR for detection of Borrelia burgdorferi DNA in clinical specimens from patients with erythema migrans and Lyme neuroborreliosis
Durant et al. Duplex quantitative real-time PCR assay for the detection and discrimination of the eggs of Toxocara canis and Toxocara cati (Nematoda, Ascaridoidea) in soil and fecal samples
Suárez et al. Quantification of Leishmania (Viannia) kinetoplast DNA in ulcers of cutaneous leishmaniasis reveals inter-site and inter-sampling variability in parasite load
Benson et al. An analysis of select pathogenic messages in lesional and non-lesional psoriatic skin using non-invasive tape harvesting
Khosravi et al. Identification of Mycobacterium tuberculosis in clinical specimens of patients suspected of having extrapulmonary tuberculosis by application of nested PCR on five different genes
Beissner et al. A genotypic approach for detection, identification, and characterization of drug resistance in Mycobacterium ulcerans in clinical samples and isolates from Ghana
Wang et al. Current study of the detection and treatment targets of spinal tuberculosis
Karakuş et al. Evaluation of conjunctival swab sampling in the diagnosis of canine leishmaniasis: A two-year follow-up study in Çukurova Plain, Turkey
Lyly et al. Childhood nontuberculous mycobacterial lymphadenitis-observation alone is a good alternative to surgery
Ogg et al. quantification of leishmaniavirus RNA in clinical samples and its possible role in pathogenesis
Voss et al. A study comparing the healthy and diseased equine glandular gastric microbiota sampled with sheathed transendoscopic cytology brushes
Yang et al. Clinical features of tuberculosis and Bacillus Calmette-Guérin (BCG)-associated adverse effects in children: a 12-year study
Ovalle‐Bracho et al. Polymerase chain reaction–miniexon: A promising diagnostic method for mucocutaneous leishmaniasis
Yıldırım et al. Tuberculosis or tularemia? A molecular study in cervical lymphadenitis
RU2688156C2 (ru) Способ оценки эффективности лечения лепры с помощью полимеразной цепной реакции
Sood et al. A pilot study for diagnosis of genital Chlamydia trachomatis infections by polymerase chain reaction among symptomatic Indian women
Lee et al. Does polymerase chain reaction of tissue specimens aid in the diagnosis of tuberculosis?
JP2012531908A (ja) 結核菌を検出するための方法および／またはプライマー
WO2017092483A1 (zh) 通过检测游离核酸诊断结核病的试剂盒及其应用
Soto et al. Leprosy diagnosis: an update on the use of molecular tools lucrecia
RU2641060C1 (ru) Способ идентификации днк микобактерий лепры с помощью полимеразной цепной реакции
Santos et al. Performance of the IS6110-TaqMan® assay in the diagnosis of extrapulmonary tuberculosis from different biological samples
Hammarström et al. Leishmania infantum infection after visiting southern Spain in patients on biological treatment; an observational, longitudinal, cohort study
RU2542396C1 (ru) Способ и набор для ускоренной лабораторной диагностики коклюшной инфекции
CA3122939A1 (en) Method of detecting infection with pathogens causing tuberculosis