RU2670450C1 - Способ прогнозирования успеха имплантации в стандартном длинном протоколе стимуляции суперовуляции - Google Patents
Способ прогнозирования успеха имплантации в стандартном длинном протоколе стимуляции суперовуляции Download PDFInfo
- Publication number
- RU2670450C1 RU2670450C1 RU2017145663A RU2017145663A RU2670450C1 RU 2670450 C1 RU2670450 C1 RU 2670450C1 RU 2017145663 A RU2017145663 A RU 2017145663A RU 2017145663 A RU2017145663 A RU 2017145663A RU 2670450 C1 RU2670450 C1 RU 2670450C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- superovulation
- stimulation
- pibf
- patients
- protocol
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 title claims abstract description 11
- 206010042573 Superovulation Diseases 0.000 title claims abstract description 10
- 238000002513 implantation Methods 0.000 title abstract description 12
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims abstract description 11
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 11
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 claims abstract description 7
- 230000027758 ovulation cycle Effects 0.000 claims abstract description 6
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 claims abstract description 6
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 claims abstract description 6
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims abstract description 4
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 claims abstract description 3
- 101000583459 Homo sapiens Progesterone-induced-blocking factor 1 Proteins 0.000 claims abstract 4
- 102100031015 Progesterone-induced-blocking factor 1 Human genes 0.000 claims abstract 4
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 claims abstract 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 12
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 9
- RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N Progesterone Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H](C(=O)C)[C@@]1(C)CC2 RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N 0.000 description 8
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 8
- 230000002357 endometrial effect Effects 0.000 description 6
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 5
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 5
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 description 5
- 231100000535 infertility Toxicity 0.000 description 5
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 4
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 4
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 239000000186 progesterone Substances 0.000 description 4
- 229960003387 progesterone Drugs 0.000 description 4
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 3
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 3
- 102000016267 Leptin Human genes 0.000 description 3
- 108010092277 Leptin Proteins 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 229940039781 leptin Drugs 0.000 description 3
- NRYBAZVQPHGZNS-ZSOCWYAHSA-N leptin Chemical compound O=C([C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)CCSC)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O NRYBAZVQPHGZNS-ZSOCWYAHSA-N 0.000 description 3
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 3
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 3
- 102000003998 progesterone receptors Human genes 0.000 description 3
- 108090000468 progesterone receptors Proteins 0.000 description 3
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 3
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 3
- 102000014654 Aromatase Human genes 0.000 description 2
- 108010078554 Aromatase Proteins 0.000 description 2
- 102000002274 Matrix Metalloproteinases Human genes 0.000 description 2
- 108010000684 Matrix Metalloproteinases Proteins 0.000 description 2
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 230000003325 follicular Effects 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 2
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 2
- 230000029849 luteinization Effects 0.000 description 2
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 2
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 230000000391 smoking effect Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 2
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 2
- VXKHXGOKWPXYNA-PGBVPBMZSA-N triptorelin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)NCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)C1=CC=C(O)C=C1 VXKHXGOKWPXYNA-PGBVPBMZSA-N 0.000 description 2
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 101150112014 Gapdh gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000579 Gonadotropin-Releasing Hormone Substances 0.000 description 1
- 102000006771 Gonadotropins Human genes 0.000 description 1
- 108010086677 Gonadotropins Proteins 0.000 description 1
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000581981 Homo sapiens Neural cell adhesion molecule 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102100027347 Neural cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 1
- CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N SYBR Green I Chemical compound CN(C)CCCN(CCC)C1=CC(C=C2N(C3=CC=CC=C3S2)C)=C2C=CC=CC2=[N+]1C1=CC=CC=C1 CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000857870 Squalus acanthias Gonadoliberin Proteins 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 210000003793 centrosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 1
- 210000004696 endometrium Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000012847 fine chemical Substances 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 238000013277 forecasting method Methods 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- XLXSAKCOAKORKW-AQJXLSMYSA-N gonadorelin Chemical compound C([C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)NCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)C1=CC=C(O)C=C1 XLXSAKCOAKORKW-AQJXLSMYSA-N 0.000 description 1
- 229940121381 gonadotrophin releasing hormone (gnrh) antagonists Drugs 0.000 description 1
- 239000002622 gonadotropin Substances 0.000 description 1
- 229940035638 gonadotropin-releasing hormone Drugs 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 230000016507 interphase Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 235000020938 metabolic status Nutrition 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 210000004976 peripheral blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- ABDKAPXRBAPSQN-UHFFFAOYSA-N veratrole Chemical compound COC1=CC=CC=C1OC ABDKAPXRBAPSQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение касается способа прогнозирования результатов экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов в стандартном длинном протоколе стимуляции суперовуляции. Способ заключается в отборе периферической крови у пациенток на 21-23 день менструального цикла перед проведением стимуляции суперовуляции и выделении мононуклеарной фракции клеток крови. В клетках мононуклеарной фракции крови определяют содержание матричного РНК PIBF методом ПЦР в реальном времени и при уровне матричного РНК PIBF более 0,4 у.е. прогнозируют успех экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов в стандартном длинном протоколе стимуляции суперовуляции. Использование изобретения обеспечивает расширение доступности и повышение достоверности определения вероятности успеха имплантации у пациенток в длинном протоколе ЭКО. 1 табл., 2 пр.
Description
Изобретение относится к медицине, в частности, к гинекологии.
Увеличение количества рецепторов прогестерона в клетках мононуклеарной фракции крови в середине лютеиновой фазы является необходимым условием успешной имплантации эмбриона. Прогестерон через собственные рецепторы стимулирует секрецию лимфоцитами прогестерон-индуцированный блокирующий фактор (PIBF). Это иммуномодулирующая молекула 34 кДа, секретируемая лимфоцитами играет решающую роль в предотвращении отторжения эмбриона материнским иммунным ответом (Int J Cancer. 2004; 112(1):51-60. PIBF (Progesterone induced blocking factor) is overexpressed in highly proliferating cells and associated with the centrosome. Lachmann M., Gelbmann D, 
E, 
B, Buschle M, Von Gabain A, 
J, Nagy E.). Однако уровень самого цитокина в крови значительно варьирует и не используется в качестве прогностического критерия эффективности ЭКО.
Несмотря на разрабатываемые более 40 лет методы вспомогательных репродуктивных технологий, эффективность даже наиболее действенного метода ЭКО и ПЭ оставляет желать лучшего: частота имплантации достаточно низка - 35-55% по данным European IVF-Monitoring Program, 2015.
Общепринятые прогностические факторы успеха ЭКО и ПЭ хорошо известны и включают в себя:
- Возраст пациентки. Большое количество работ демонстрируют резкий спад эффективности программы с каждым годом после 35 лет.
- Фолликулярный резерв яичников, оцениваемый по числу антральных фолликулов в яичниках при УЗИ или по уровню антимюллерова гормона. Во многих исследованиях показано снижение результативности программы в 2-3 раза у пациенток с бедным ответом яичников на стимуляцию гонадотропинами.
- Курение. Для курильщиц требуется примерно в 2 раза больше попыток ЭКО и ПЭ для достижения желаемого результата.
- Ожирение. Пациенткам с ожирением также как и курильщицам для достижения беременности в среднем требуется проведение большего количества циклов ЭКО.
Однако, даже для некурящих пациенток моложе 35 лет, не страдающих ожирением и имеющих нормальный фолликулярный резерв, прогнозировать результаты ЭКО и ПЭ весьма затруднительно. В связи с этим разрабатываются более сложные методы прогнозирования, которые нуждаются в дальнейших исследованиях и доработке.
Близкими к предлагаемому нами способу прогнозирования результатов ЭКО и ПЭ является определение уровня интерлейкинов 12, 15 и 18 и клеток-натуральных киллеров CD56+ в биоптате эндометрия или смывах из полости матки (Ledee-Bataille N, Bonnet-Chea K, Hosny G, Dubanchet S, Frydman R, Chaouat G. Role of the endometrial tripod interleukin-18-15, and - 12 in inadequate uterine receptivity in patients with a history of repeated in vitro fertilization-embryo transfer failure, Fertil Steril, 2005, vol. 83, p. 598-605), определение уровня интегрина aVb3 в биоптате эндометрия (Tei С, Maruyama Т, Kuji N, Miyazaki T, Mikami M, Yoshimura Y. Reduced expression of alphavbeta3 integrin in the endometrium of unexplained infertility patients with recurrent IVF-ET failures: improvement by danazol treatment, J Assist Reprod Genet, 2003, vol. 20 p. 13-20) или определение уровня матриксных металлопротеиназ 2 и 9, ИЛ-1 и ИЛ-10, а также гамма-ИФ в смывах из полости матки (Inagaki N, Stern С, McBain J, Lopata A, Kornman L, Wilkinson D. Analysis of intra-uterine cytokine concentration and matrix-metalloproteinase activity in women with recurrent failed embryo transfer, Hum Reprod, 2003, vol. 18 p. 608-615). Также было предложено определение уровня мРНК эндометриальной ароматазы Р450 в биоптате эндометрия (Brosens J, Verhoeven Н, Campo R, Gianaroli L, Gordts S, Hazekamp J, Hagglund L, Mardesic T, Varila E, Zech J, et al. High endometrial aromatase P450 mRNA expression is associated with poor IVF outcome, Hum Reprod, 2004, vol. 19 p. 352-356). Недостатками методов является их инвазивность, а именно забор биоптата или смыва из полости матки, а также сложность интерпретации результатов при проведении анализа смыва из полости матки.
Известен метод определения экспрессии цитокинов Т-хелперного звена лимфоцитами периферической крови пациенток (Kwak-Kim JY, Chung-Bang HS, Ng SC, Ntrivalas EI, Mangubat CP, Beaman KD, Beer AE, Gilman-Sachs A. The prevalence of dominant Th1 immune responses in peripheral blood lymphocytes may reflect the systemic contribution of Th1 cytokines to RSA or multiple implantation failures in IVF cycles, Hum Reprod, 2003, vol. 18 p. 767-773). Недостатком метода является его многокомпонентность: необходимость отдельного выделения фракций лимфоцитов, а затем тестирования их функциональной активности по уровню экспрессии ими различных цитокинов, а также его высокая стоимость.
Известен способ прогнозирования вероятности наступления клинической беременности у женщин с индексом массы тела от 18,5 до 28,49 в программе ЭКО на основании оценки уровня лептина в плазме крови и трансмембранного потенциала митохондрий в мононуклеарах периферической крови (RU 2614725 С1 "Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова", 28.03.2017). Включает оценку трансмембранного потенциала митохондрий в мононуклеарах периферической крови, измерение концентрации лептина в плазме крови и прогнозирование вероятности наступления клинической беременности по формуле. Недостаток способа состоит в том, что наряду со стандартным методом определения лептина в плазме крови пациенток (характеризующих метаболический статус) необходимо наличие специфического оборудования для анализа трансмембранного потенциала митохондрий, которое не входит в штатный набор клинических лабораторий.
Наиболее близким к патентуемому является способ прогнозирования успеха имплантации в стандартном длинном протоколе стимуляции суперовуляции (RU2430379 С1, ГОУ ВПО РГМУ Росздрава, 27.09.2011 - ПРОТОТИП). Исследуют гормональный статус пациентки, для чего в середине лютеиновой фазы менструального цикла пациентки, перед назначением агониста гонадотропин-релизинг гормона, при проведении лечения по стандартному длинному протоколу стимуляции суперовуляции, определяют содержание рецепторов прогестерона в мононуклеарной фракции клеток периферической крови и при величине более 700 рецепторов прогестерона на клетку прогнозируют наступление беременности в результате проведения программы ЭКО и переноса эмбрионов в стандартном длинном протоколе стимуляции суперовуляции.
Недостаток способа состоит в том, что в большинстве клинических лабораторий отсутствуют радиоизотопные счетчики, к тому же необходимо приобретение изотопов (меченых гормонов).
Проблема, на решение которой направлено настоящее изобретение, состоит в расширении доступности и повышении достоверности определения вероятности успеха имплантации у пациенток в длинном протоколе ЭКО.
Способ состоит в определении уровня экспрессии прогестерон-индуцированного блокирующего фактора (PIBF) в клетках мононуклеарной фракции периферической крови пациенток с бесплодием перед лечением. Уровень мРНК PIBF более 0,4 у.е. (0,5^ΔCt⋅103/GAPDH) в мононуклеарах крови свидетельствует о высокой вероятности наступления имплантации у данных пациенток, поэтому им целесообразно начинать протокол ЭКО и ПЭ.
Технический результат изобретения - расширение доступности и повышение достоверности определения вероятности успеха имплантации у пациенток в длинном протоколе ЭКО.
Заявляемое изобретение не очевидно для специалистов, работающих в области эндокринологической гинекологии и репродукции человека.
Методика. Мононуклеарные клетки периферической крови выделяют стандартным методом [Boyum A. Separation of leukocytes from blood and bone marrow // Scand. J. Clin. Lab. Investig. - 1968. - Vol. 21 - Suppl. 97. p. 1-9] из гепаринизированной крови (7-10 ME гепарина/мл) с модификациями. Кровь в объеме 5 мл получают из кубитальной вены у пациенток на 22-24 день менструального цикла. Кровь разводят физиологическим раствором (рН 7,2) в соотношении 1:2 (v:v). Разведенную физиологическим раствором кровь (5 мл) наслаивают на подогретый до комнатной температуры фиколл (Pharmacia Fine Chemicals, Швеция, плотность 1, 077 г/мл, 3 мл в центрифужной пробирке) и центрифугируют при 400 g в течение 30 мин 4°С [Хейфиц Л.Б., Абалкин В.А. Разделение форменных элементов крови человека // Ж. Лаб. дело, 1973. - 10. - с. 579-581]. Интерфазу отбирают стерильной стеклянной пипеткой и полученную мононуклеарную фракцию трижды отмывают бесцветным раствором Хенкса (клетки ресуспендируют в десятикратном объеме раствора Хенкса и центрифугируют 5 минут при 250 g). Жизнеспособность клеток, определяемая по методу окрашивания с трипановым синим (Ланг Н.Р. Стимуляция лимфоцитов // М.: Медицина, 1976. - 288 с.), составила 96%. Оставшийся осадок (МНФК) используют для анализа экспрессии генов ПИБФ и гена домашнего хозяйства.
Выделение мРНК из клеток МНФК периферической крови проводят с помощью набора "Рибо-преп" («AmpliSens», Россия) согласно инструкции производителя. Получение кДНК на матрице мРНК проводят с использованием комплекта готовых реагентов "Реверта-L'' "AmpliSens", Россия) согласно инструкции производителя. Для полимеразной цепной реакция в реальном времени с целью определения уровня экспрессии генов использовали набор готовых реактивов для ПЦР "Реакционная смесь 2,5х для проведения ПЦР-РТ в присутствии SYBR Green I" ("Синтол", Россия) на приборе iCycler iQ5 real-time PCR (BioRad, Германия). В качестве контрольного гена использовали ген GAPDH (Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, локализован на хромосоме 12р13). Последовательности праймеров для GAPDH: upgaa-ggt-gaa-ggt-cgg-agt, lowgaa-gat-ggt-gat-ggg-att-tcc. PIBF: uptgc-cct-gct-gtg-tga-tct-talowgat-agc-tga-ggc-tcc-tgg-at; Программа амплификации: 1 цикл: 10:00 мин - 950С, 2-40 циклы: 00:15 мин - 950С, 01:00 мин - 600С.
Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием программного пакета GraphPadPrism 5. Результаты представлены в виде М±SE, где М - среднее значение, SE - стандартная ошибка. Данные анализировали с применением критериев Колмогорова-Смирнова, Манна-Уитни.
Нижеследующие примеры иллюстрируют изобретение.
Пример №1. Больная В. 28 лет повторно обратилась в отделение ЭКО ЦПСиР с диагнозом: бесплодие вторичное длительностью 7 лет, мужской фактор, трубно-перитонеальный фактор для проведения второй попытки ЭКО (ИКСИ) и ПЭ. В анамнезе 1 неудачная попытка ЭКО (ИКСИ) и ПЭ по короткому протоколу с антагонистами ГнРГ. На 21-й день менструального цикла, перед назначением пациентке ежедневных подкожных инъекций Диферелина 0,1, был произведен забор периферической крови из кубитальной вены для определения уровня экспрессии гена домашнего хозяйства и PIBF в клетках МНФК.
При определении количества мРНК PIBF относительно GAPDH получили следующее значение: 0,51 у.е. Таким образом, результат исследования транскрипторного профиля клеток МНФК позволил предположить благоприятный для данной пациентки прогноз на наступление беременности в протоколе ЭКО и ПЭ, что подтвердилось в последующем: наступила одноплодная беременность, завершившаяся срочными родами и рождением живой доношенной девочки.
Пример №2. Больная М. 33 года первично обратилась в отделение ЭКО ЦПСиР с диагнозом: бесплодие вторичное длительностью 2 года, абсолютный трубный фактор для проведения первой попытки ЭКО и ПЭ. На 20-й день менструального цикла, перед назначением пациентке ежедневных подкожных инъекций Диферелина 0,1, был произведен забор периферической крови из кубитальной вены для определения уровня мРНК PIBF в мононуклеарных клетках, который составил 0, 35 у.е. Таким образом, результаты исследования транскриптома клеток МНФК, позволили предположить неблагоприятный для данной пациентки прогноз на наступление беременности в протоколе ЭКО и ПЭ, что не подтвердилось в последующем: наступила одноплодная беременность, завершившаяся экстренным кесаревым сечением и рождением живой доношенной девочки.
Нами показано, что уровень экспрессии гена PIBF в клетках мононуклеарной фракции может служить надежным критерием в оценке успеха имплантации у пациенток, включенных в программу ЭКО. Анализ транскриптома клеток мононуклеарной фракции крови пациенток проводился непосредственно перед началом терапии (длинный протокол ЭКО). Полученные результаты были сгруппированы ретроспективно по признаку наличия имплантации у пациентки (табл.). Как видно из представленных данных, уровень мРНК PIBF в МНФК пациенток зависит от успеха имплантации, и может быть использован с прогностической целью. Данная зависимость выявлена впервые.
Сравнительный анализ уровня мРНК PIBF в МНК у пациенток при бесплодии показал, что пороговыми значениями прогнозирования успеха лечения можно считать количество мРНК PIBF в МНФК 0,4 у.е. (1 y.e.=0,5^ΔCt⋅103/GAPDH).
При проведении прогнозирования успеха лечения в цикле ЭКО и ПЭ у 39 пациенток была подтверждена его возможность использования для целей прогноза и его высокая точность.
* - значение статистически достоверно отличается от аналогичного параметра в I и II группах. Приведены средние данные исследованных параметров.
Claims (3)
- Способ прогнозирования результатов экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов в стандартном длинном протоколе стимуляции суперовуляции, заключающийся в отборе периферической крови у пациенток на 21-23 день менструального цикла перед проведением стимуляции суперовуляции и выделении мононуклеарной фракции клеток крови,
- отличающийся тем, что
- в клетках мононуклеарной фракции крови определяют содержание матричного РНК PIBF методом ПЦР в реальном времени и при уровне матричного РНК PIBF более 0,4 у.е. прогнозируют успех экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов в стандартном длинном протоколе стимуляции суперовуляции.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017145663A RU2670450C1 (ru) | 2017-12-25 | 2017-12-25 | Способ прогнозирования успеха имплантации в стандартном длинном протоколе стимуляции суперовуляции |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017145663A RU2670450C1 (ru) | 2017-12-25 | 2017-12-25 | Способ прогнозирования успеха имплантации в стандартном длинном протоколе стимуляции суперовуляции |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2670450C1 true RU2670450C1 (ru) | 2018-10-23 |
Family
ID=63923519
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017145663A RU2670450C1 (ru) | 2017-12-25 | 2017-12-25 | Способ прогнозирования успеха имплантации в стандартном длинном протоколе стимуляции суперовуляции |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2670450C1 (ru) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2765639C1 (ru) * | 2021-06-15 | 2022-02-01 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Южно-Уральский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО ЮУГМУ Минздрава России) | Способ оценки имплантационной состоятельности эндометрия на основании эндометриальной экспрессии vdr, hoxa 11 в программах врт у женщин старшего репродуктивного возраста с трубно-перитонеальным фактором бесплодия |
| RU2783849C1 (ru) * | 2022-03-22 | 2022-11-21 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии имени Д.О. Отта" | Способ диагностики иммунного статуса эндометрия у пациенток с повторными потерями беременности после вспомогательных репродуктивных технологий |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2430379C1 (ru) * | 2010-01-27 | 2011-09-27 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию" (ГОУ ВПО РГМУ Росздрава) | Способ прогнозирования наступления беременности в программе экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов в стандартном длинном протоколе стимуляции суперовуляции |
| RU2523401C1 (ru) * | 2013-02-20 | 2014-07-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства имени В.Н. Городкова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ прогнозирования наступления беременности у женщин с трубно-перитонеальным бесплодием в программе экстракорпорального оплодотворения |
| RU2550965C1 (ru) * | 2014-06-23 | 2015-05-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ прогнозирования наступления беременности в программе экстракорпорального оплодотворения при селективном переносе эмбрионов путем оценки молекулярно-генетического профиля гамет с помощью пцр-рв |
-
2017
- 2017-12-25 RU RU2017145663A patent/RU2670450C1/ru active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2430379C1 (ru) * | 2010-01-27 | 2011-09-27 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию" (ГОУ ВПО РГМУ Росздрава) | Способ прогнозирования наступления беременности в программе экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов в стандартном длинном протоколе стимуляции суперовуляции |
| RU2523401C1 (ru) * | 2013-02-20 | 2014-07-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства имени В.Н. Городкова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ прогнозирования наступления беременности у женщин с трубно-перитонеальным бесплодием в программе экстракорпорального оплодотворения |
| RU2550965C1 (ru) * | 2014-06-23 | 2015-05-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ прогнозирования наступления беременности в программе экстракорпорального оплодотворения при селективном переносе эмбрионов путем оценки молекулярно-генетического профиля гамет с помощью пцр-рв |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| SERAFINI P. et al. Endometrial leukemia inhibitory factor as a predictor of pregnancy after in vitro fertilization// Int. J. Gynaecol. Obstet- 2008. Vol.102, N1. P.23-27. * |
| SERAFINI P. et al. Endometrial leukemia inhibitory factor as a predictor of pregnancy after in vitro fertilization// Int. J. Gynaecol. Obstet- 2008. Vol.102, N1. P.23-27. САВЕЛЬЕВА Г. М. и др. Способ прогнозирования наступления беременности у пациенток, включенных в программу экстракорпорального оплодотворения, в стандартном длинном протокол. Лечащий врач. 2013, N3. СУКНОВАЛОВА М. В. Зависимость реализации программы экстракорпорального оплодотворения от количества и сродства гестагенных рецепторов мононуклеаров крови к прогестерону и дидрогестерону у пациенток с бесплодием. Диссер. к.м.н., Москва, 2014. * |
| САВЕЛЬЕВА Г. М. и др. Способ прогнозирования наступления беременности у пациенток, включенных в программу экстракорпорального оплодотворения, в стандартном длинном протокол. Лечащий врач. 2013, N3. * |
| СУКНОВАЛОВА М. В. Зависимость реализации программы экстракорпорального оплодотворения от количества и сродства гестагенных рецепторов мононуклеаров крови к прогестерону и дидрогестерону у пациенток с бесплодием. Диссер. к.м.н., Москва, 2014. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2765639C1 (ru) * | 2021-06-15 | 2022-02-01 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Южно-Уральский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО ЮУГМУ Минздрава России) | Способ оценки имплантационной состоятельности эндометрия на основании эндометриальной экспрессии vdr, hoxa 11 в программах врт у женщин старшего репродуктивного возраста с трубно-перитонеальным фактором бесплодия |
| RU2783849C1 (ru) * | 2022-03-22 | 2022-11-21 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии имени Д.О. Отта" | Способ диагностики иммунного статуса эндометрия у пациенток с повторными потерями беременности после вспомогательных репродуктивных технологий |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Henkel et al. | DNA fragmentation of spermatozoa and assisted reproduction technology | |
| Zhou et al. | Local injury to the endometrium in controlled ovarian hyperstimulation cycles improves implantation rates | |
| Caramelli et al. | Cell‐free fetal DNA concentration in plasma of patients with abnormal uterine artery Doppler waveform and intrauterine growth restriction—a pilot study | |
| JP6411340B2 (ja) | 生殖補助における着床の成功を増大させる方法 | |
| Turgut et al. | Predicting miscarriage using systemic immune‐inflammation index | |
| Bhatti et al. | The amniotic fluid cell-free transcriptome in spontaneous preterm labor | |
| Allegra et al. | Endometrial expression of selected genes in patients achieving pregnancy spontaneously or after ICSI and patients failing at least two ICSI cycles | |
| RU2670450C1 (ru) | Способ прогнозирования успеха имплантации в стандартном длинном протоколе стимуляции суперовуляции | |
| Nguyen et al. | Placental Exosomes as Biomarkers for Maternal Diseases: Current Advances in Isolation, Characterization, and Detection | |
| Casano et al. | Gene expression of pregnancy-associated glycoproteins-1 (PAG-1), interferon-tau (IFNt) and interferon stimulated genes (ISGs) as diagnostic and prognostic markers of maternal-fetal cellular interaction in buffalo cows | |
| RU2430379C1 (ru) | Способ прогнозирования наступления беременности в программе экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов в стандартном длинном протоколе стимуляции суперовуляции | |
| RU2474823C1 (ru) | Способ прогнозирования качества эмбрионов в программе экстракорпорального оплодотворения | |
| Wang et al. | Frequency of RBC alloantibodies in Chinese surgical patients | |
| Nitsche et al. | Maternal neutrophil toll‐like receptor mRNA expression is down‐regulated in preeclampsia | |
| Wang et al. | Predictive value of maternal serum NF‐κB p65 and sTREM‐1 for subclinical chorioamnionitis in premature rupture of membranes | |
| Wong et al. | Do uterine natural killer cell numbers in peri-implantation endometrium predict hypertensive disorder in pregnancy in women with a history of reproductive failure? | |
| Cho et al. | Placental expression of D6 decoy receptor in preeclampsia | |
| EP3615943B1 (en) | Kit for the assessment of endometrial receptivity | |
| López-Luna et al. | The genetic and biochemical blueprint of endometrial receptivity: past, present, and future factors involved in embryo implantation success | |
| RU2581027C1 (ru) | Способ прогнозирования исходов программы эко и пэ | |
| RU2750159C1 (ru) | Способ диагностики преждевременной недостаточности яичников | |
| RU2524650C2 (ru) | Способ прогнозирования наступления беременности | |
| Piróg et al. | GnRH antagonist protocol enhances coagulation during controlled ovarian stimulation for IVF | |
| RU2648839C1 (ru) | Способ прогнозирования наступления беременности в программе экстракорпорального оплодотворения | |
| RU2816049C1 (ru) | Способ прогнозирования наступления беременности у женщин с «бедным» ответом с использованием сыворотки крови |