RU2670071C1 - Рекомбинатная плазмида pET21a-ProChym, обеспечивающая синтез химерного белка прохимозина В Bos taurus, и штамм Escherichia coli BL21(DE3)pLysE pET21a-ProChym - продуцент химерного белка прохимозина В Bos Taurus - Google Patents
Рекомбинатная плазмида pET21a-ProChym, обеспечивающая синтез химерного белка прохимозина В Bos taurus, и штамм Escherichia coli BL21(DE3)pLysE pET21a-ProChym - продуцент химерного белка прохимозина В Bos Taurus Download PDFInfo
- Publication number
- RU2670071C1 RU2670071C1 RU2017123395A RU2017123395A RU2670071C1 RU 2670071 C1 RU2670071 C1 RU 2670071C1 RU 2017123395 A RU2017123395 A RU 2017123395A RU 2017123395 A RU2017123395 A RU 2017123395A RU 2670071 C1 RU2670071 C1 RU 2670071C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- prochymosin
- bos taurus
- protein
- pet21a
- recombinant
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 41
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 title claims abstract description 40
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims abstract description 34
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 21
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 title claims abstract description 16
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title claims abstract description 10
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 title claims abstract description 8
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 title 1
- 102000057593 human F8 Human genes 0.000 title 1
- 229940047431 recombinate Drugs 0.000 title 1
- 108010064037 prorennin Proteins 0.000 claims abstract description 63
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 21
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims abstract description 17
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 15
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 15
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims abstract description 10
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims abstract description 10
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims abstract description 10
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 9
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 8
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims abstract description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 4
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims abstract description 4
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 claims abstract description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims abstract description 3
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 claims abstract description 3
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 claims abstract description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 2
- 241000701867 Enterobacteria phage T7 Species 0.000 claims description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 3
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 8
- 241000701832 Enterobacteria phage T3 Species 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 230000036642 wellbeing Effects 0.000 abstract 1
- 108090000746 Chymosin Proteins 0.000 description 36
- GNOLWGAJQVLBSM-UHFFFAOYSA-N n,n,5,7-tetramethyl-1,2,3,4-tetrahydronaphthalen-1-amine Chemical compound C1=C(C)C=C2C(N(C)C)CCCC2=C1C GNOLWGAJQVLBSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 29
- 229940080701 chymosin Drugs 0.000 description 28
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 16
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 16
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 16
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 16
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 14
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 13
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 12
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 12
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 12
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000000047 product Substances 0.000 description 12
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 11
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 11
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 11
- 238000001994 activation Methods 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 description 8
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 8
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 7
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 6
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 description 5
- 102000011632 Caseins Human genes 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 5
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 5
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 5
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 5
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 5
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 5
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 5
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 5
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 5
- 229940108461 rennet Drugs 0.000 description 5
- 108010058314 rennet Proteins 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 4
- 244000309466 calf Species 0.000 description 4
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical group NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 4
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 4
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 3
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 3
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 3
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 3
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 3
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 3
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 3
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 108010005090 rennin-like enzyme (Aspergillus ochraceus) Proteins 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 241000222344 Irpex lacteus Species 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 240000002129 Malva sylvestris Species 0.000 description 2
- 235000006770 Malva sylvestris Nutrition 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 239000000701 coagulant Substances 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000021246 κ-casein Nutrition 0.000 description 2
- OJHZNMVJJKMFGX-RNWHKREASA-N (4r,4ar,7ar,12bs)-9-methoxy-3-methyl-1,2,4,4a,5,6,7a,13-octahydro-4,12-methanobenzofuro[3,2-e]isoquinoline-7-one;2,3-dihydroxybutanedioic acid Chemical compound OC(=O)C(O)C(O)C(O)=O.O=C([C@@H]1O2)CC[C@H]3[C@]4([H])N(C)CC[C@]13C1=C2C(OC)=CC=C1C4 OJHZNMVJJKMFGX-RNWHKREASA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 108091005502 Aspartic proteases Proteins 0.000 description 1
- 102000035101 Aspartic proteases Human genes 0.000 description 1
- 101150076489 B gene Proteins 0.000 description 1
- 241000030939 Bubalus bubalis Species 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical group NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Chemical group 0.000 description 1
- 241001138401 Kluyveromyces lactis Species 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 101100412856 Mus musculus Rhod gene Proteins 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 208000024777 Prion disease Diseases 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 210000003165 abomasum Anatomy 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 1
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 1
- -1 beef pepsin Chemical compound 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 235000014121 butter Nutrition 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 108010067454 caseinomacropeptide Proteins 0.000 description 1
- 229940021722 caseins Drugs 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 1
- 229940079919 digestives enzyme preparation Drugs 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 238000001879 gelation Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical class [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 208000008864 scrapie Diseases 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000001338 self-assembly Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000003307 slaughter Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6478—Aspartic endopeptidases (3.4.23)
- C12N9/6483—Chymosin (3.4.23.4), i.e. rennin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/64—General methods for preparing the vector, for introducing it into the cell or for selecting the vector-containing host
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/23—Aspartic endopeptidases (3.4.23)
- C12Y304/23004—Chymosin (3.4.23.4), i.e. rennin
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Группа изобретений относится к рекомбинантной плазмиде, обеспечивающей синтез химерного белка прохимозина В Bos Taurus, и рекомбинантному штамму Е. coli - продуценту химерного белка прохимозина В Bos taurus в клетках E. coli. Рекомбинантная плазмида рЕТ21а-ProChym размером 6504 пар оснований (п.о.) содержит следующие существенные для ее функционирования и экспрессии целевого белка структурные элементы: промотер бактериофага Т7, обеспечивающий эффективную транскрипцию контролируемой мРНК; рекомбинантный ген прохимозина В Bos taurus, кодирующий целевой химерный белок; Т7 терминатор, являющийся нетранслируемой областью терминации транскрипции бактериального оперона, обеспечивающей эффективное окончание транскрипции; последовательность экспрессионного тага Т7, добавленную в состав нуклеотидной последовательности гена прохимозина В Bos taurus на N-конец, для увеличения выхода целевого белка; последовательность blа, кодирующий белок бета-лактамазу, являющуюся селективным маркером для трансформации штаммов Е. coli; последовательность ColE1, обеспечивающий репликацию плазмиды в штаммах Е. coli. Рекомбинантный ген белка прохимозина В Bos taurus имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1 от нуклеотида в положении 5205 п.о. до нуклеотида в положении 6347 п.о., кодирующий целевой химерный белок прохимозин В Bos taurus с полной аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2, встроенный по сайтам рестрикции FauND I и Sfr274 I в область полилинкера вектора рЕТ21а, содержащего промотор и терминатор РНК-полимеразы фага Т7. Предложенный рекомбинантный штамм Escherichia coli BL21(DE3)pLysE рЕТ21а-ProChym получен трансформацией рекомбинантной плазмидой рЕT21a-ProChym и депонирован в Коллекции бактерий, бактериофагов и грибов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора под регистрационным номером В-1362. Группа изобретений обеспечивает высокую продукцию прохимозина. 2 н.п. ф-лы, 5 ил., 2 табл., 6 пр.
Description
Изобретение относится к генетической конструкции (плазмиде), обеспечивающей синтез химерного белка прохимозина В Bos Taurus, предназначенного для гидролиза пептидной связи Phe105-Met106 в молекуле каппа-казеина при изготовлении сыров твердых и полутвердых сортов и рекомбинантному штамму Е. coli - продуценту химерного белка прохимозина В Bos Taurus и может быть использовано в области биотехнологии и пищевой промышленности.
Производство сыра - наиболее рентабельная сфера в молочной промышленности. Ключевой стадией производства сыра является свертывание молока, с использованием молокосвертывающих ферментных препаратов (МФП). Свертывание молока в данном процессе условно разделяется на две, частично перекрывающиеся фазы - первичную или ферментативную и вторичную - агрегационную. Во время первичной фазы, под действием молокосвертывающего фермента, в молекуле каппа-казеина (к-казеина) происходит разрыв связи Phe105-Met106. В результате образуются два фрагмента - пара-κ-CN (остатки 1-105), N-терминальный гидрофобный участок, и гидрофильный С-терминальный казеинмакропептид (остатки 106-169). Гидрофобный пара-κ-казеин остается в мицелле, а гидрофильный анионный казеинмакропептид "отходит" в сыворотку. Таким образом, в ходе первой фазы свертывания, под действием химозина (или других молокосвертывающих ферментов) стабильность мицелл нарушается, за счет удаления с их поверхности гликомакропептидного участка к-казеина [1, 2, 3, 4].
В результате устранения стабилизирующего "волоскового" слоя, мицеллы получают возможность сблизиться настолько, что начинается их агрегация - наступает вторичная фаза свертывания. В конечном итоге, агрегация дестабилизированных мицелл приводит к формированию молочного сгустка. Таким образом, специфический гидролиз связи Phe105-Met106 обеспечивает образование молочного сгустка со свойствами необходимыми при изготовлении сыров [3, 4].
В природе существует множество ферментов, обладающих протеолитической активностью. Однако, классическим МФП, обеспечивающим максимальный выход и высокое качество сыра, считается сычужный фермент (СФ). Основным действующим агентом СФ является химозин - фермент, относящийся к классу аспарагиновых протеаз (ЕС 3.4.23.4). Объемы производства сыров ежегодно увеличиваются, вследствие повышения спроса на этот продукт. Увеличение объемов производства сыров неразрывно связано с увеличением потребности в молокосвертывающих препаратах. В связи с этим, начиная со второй половины XX века, наблюдается мировой дефицит сычужного фермента.
Проблема дефицита СФ связана с острой нехваткой сырья для его производства - сычугов телят-молокопоек. Это обусловлено тем, что в условиях снижения поголовья скота, из-за резкого возрастания его продуктивности, экономически нецелесообразно забивать молодняк, питающийся молоком. Эпидемия "скрэпи" - прионового заболевания сельскохозяйственных животных - привела к дополнительному сокращению сырьевой базы натуральных МСФ. Мировой дефицит СФ инициировал поиски его заменителей среди природных молокосвертывающих протеиназ животного, растительного и микробного происхождения, которые продолжаются и в настоящее время.
Наиболее близкие химозину коагулянты, такие как говяжий пепсин, некоторые микробные, растительные и микрофунгиальные протеазы, применяются в настоящее время в качестве его заменителей при производстве определенных видов сыров. Однако, в отличие от натурального химозина, почти все его известные аналоги имеют повышенный уровень неспецифической протеолитической активности, а некоторые часто превосходят химозин и по термостабильности, что приводит к более глубокому гидролизу казеинов, снижению выхода сыра и ухудшению его органолептических характеристик [6, 7, 8, 9].
Современное решение проблемы дефицита СФ - это не только поиск новых сырьевых источников, но и создание технологий производства рекомбинантного химозина. Широкое использование рекомбинантного химозина в качестве МСФ связано с рядом преимуществ этого фермента по сравнению с другими протеазами. К ним относятся: возможность крупномасштабного производства фермента; низкая неспецифическая протеолитическая активность; предсказуемость реакции коагуляции; отсутствие компонентов тканей сельскохозяйственных животных; наличие сертификатов кошерности.
Рекомбинантный химозин является одним из первых рекомбинантных ферментов, получившим широкое распространение в промышленности. В настоящее время описано несколько подходов по получения рекомбинантного химозина.
Известна международная заявка на изобретение (WO 2009/027572, А1, МПК C12N 9/64; C12N 15/69; C12N 15/81, опубл. 05.03.2009 г.) [14] в котором описан способ получения активного химозина буйвола, без процесса аутокаталитической промежуточной активации, опосредованной низким значением рН, для коагуляции молока. Для этого ген химозина буйвола был встроен в ДНК дрожжей Pichia pastoris. При культивировании химозин секретируется во внеклеточную среду в активной форме. Таким образом, авторы заявляют, что использование этого рекомбинантного химозина буйвола, который не подвергается процессу активации с помощью рН, является дополнительным преимуществом по сравнению с предшествующим уровнем техники, избегая промежуточного процесса активации для получения сырных масс.
Недостатком генетической конструкции данного изобретения может быть то, что авторы используют природный ген Bubalus arnee bubalus. При переносе гена в другой организм реципиент из-за отличий в механизмах транскрипции, трансляции и посттрансляционных модификаций (высших и низших эукариот) может значительно снизиться выход продукта и его стабильность [10, 11]. Оценить это в данном изобретении не предоставляется возможным, т.к. не описан выход целевого продукта. Так же в генетической конструкции отсутствуют какие-либо аминокислотные метки (например, 6×His), которые дают возможность получать высокоочищенный продукт. В данном изобретении, авторы, для определения молокосвертывающей активности, используют культуральный супернатант, не учитывая, что при ферментации в культуральную среду наряду с целевым белком, могут секретироваться и дрожжевые протеазы и другие белки. Данное обстоятельство не позволяет точно оценить специфичность получаемого химозина. В изобретении не раскрыто использование данного продукта в стандартизированных условиях производства сыра. В нашем изобретении получен химозин со степенью чистоты 98% (Фигура 5, Б), который используют для определения ферментативных свойств указанного конечного продукта.
Активный рекомбинантный химозин, используемый для сыроделия, получают путем активации прохимозина. Поэтому для встройки в вектор экспрессии используют последовательность прохимозина [12, 13].
Наиболее близким аналогом (прототипом) является препарат рекомбинантного химозина и способ его получения (заявка США №20070166785, А1, МПК С12Р 21/06, С07Н 21/04, опубл. 19.07.2007 г.) [15]. В данном изобретении описывается получение рекомбинантного прохимозина Bos taurus в системе Escherichia coli, которое включает стадию амплификации природного гена прохимозина Bos taurus, его встройку в экспрессионный вектор рЕТ21b, трансформацию полученной рекомбинантной плазмидой клеток Е. coli, ферментирование указанной Е. coli для получения прохимозина, методы очистки, ренатурации и активации прохимозина для определения его молокосвертывающей активности.
Недостатком генетической конструкции в прототипе и, как следствие, продуцента - рекомбинантного химозина, так же как и в описанном выше аналоге (WO, 2009/027572), является неоптимизированный под выбранную систему экспрессии ген прохимозина, что особенно отражается при переносе гена из эукариотической клетки в прокариотическую вследствие чего снижается выход продукта и его стабильность [10, 11]. В заявляемом техническом решении ген прохимозина был оптимизирован (Codon Optimization OnLine) для экспрессии в прокариотических клетках. Помимо этого в прототипе не приведены данные о конечной чистоте продукта в результате чего в конечном продукте могут оставаться бактериальные белки, что может повлиять на характеристики продукта.
Техническим результатом заявленного изобретения является создание генетической конструкции и на ее основе рекомбинантного штамма Escherichia coli - продуцента прохимозина В Bos taurus, который обеспечивает более высокую продукцию прохимозина (до 40% от общего белка клетки) с чистотой до 98% (пример 4, фигура 5, А, Б).
Указанный технический результат достигается созданием рекомбинантной плазмиды рЕТ21а- ProChym размером 6504 пар оснований (п.о.), характеризующейся физической и генетической картой, представленной на фиг. 4, обеспечивающей синтез химерного белка прохимозина В Bos taurus размером 41 кДа в клетках Escherichia coli BL21(DE3)pLysE, содержащей рекомбинантный ген белка прохимозина В Bos taurus, имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1 (см. фиг. 1 и приложение) от нуклеотида в положении 5205 п.о. до нуклеотида в положении 6347 п.о., кодирующий целевой химерный белок прохимозин В Bos taurus с полной аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2 (см. фиг. 3 и приложение), встроенный по сайтам рестрикции FauND I и Sfr274 I в область полилинкера вектора рЕТ21а, содержащего промотор и терминатор РНК-полимеразы фага Т7.
Указанный технический результат достигается также созданием рекомбинантного штамма Escherichia coli BL21(DE3)pLysE рЕТ21а- ProChym - продуцента химерного белка прохимозина В Bos taurus E.coli, полученного трансформацией рекомбинантной плазмидой рЕТ21а- ProChym по п. 1 и депонированного в Коллекции бактерий, бактериофагов и грибов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора под регистрационным номером В-1362.
Заявляемый штамм Escherichia coli BL21(DE3)pLysE/ рЕТ21а- ProChym - продуцент рекомбинантного прохимозина В Bos taurus, обеспечивающего специфический гидролиз пептидной связи Phe105-Met106 в молекуле к-казеина и предназначенного для использования при изготовлении сыров твердых и полутвердых сортов, получают следующим образом.
При разработке штамма продуцента рекомбинантного прохимозина, была выбрана последовательность Bos taurus В (Swiss-ProtID:P00794). Выбор последовательности прохимозина В, а не препрохимозина или химозина объяснятся следующим. Химозин синтезируется в организме животных в форме препрохимозина. Препрохимозин - это белок, состоящий из 365 аминокислотных остатков, 16 из которых являются гидрофобной лидерной последовательностью, которая играет важную роль в секреции химозина через клеточную мембрану, для экспрессии в прокариотической системе она не требуется [16]. В проведенных ранее исследованиях было установлено, что экспрессия зрелого химозина ведет к наработке продукта, не обладающего молокосвертывающей активностью (МА) [17]. Существуют две альтернативные формы химозина - химозин А и В. Эти формы отличаются друг от друга одним аминокислотным остатком, аспартатом или глицином в положении 244 соответственно, при этом химозин В встречается чаще и имеет более стабильную структуру (Фиг 1) [18].
Для обеспечения высокого и стабильного выхода целевого продукта была проведена оптимизация кодонного состава выбранной последовательности прохимозина В Bos taurus для экспрессии в E.coli. В ходе теоретического дизайна проведена замена кодонов, используемых в клетках эукариот на кодоны, используемые прокариотами. В состав нуклеотидной последовательности гена на N-конец добавлена последовательность экспрессионного тага Т7. Оптимизированная последовательность была синтезирована.
В качестве вектора экспрессии выбрана плазмида рЕТ21а. После клонирования синтезированной последовательности в составе вектора, полученной рекомбинантной плазмидой была проведена трансформация бактериальных клеток ТОР10 для наработки плазмидной ДНК.
В качестве продуцента выбран штамм E.coli BL21(DE3)pLysE. Выбор штамма-реципиента обусловлен тем, что он несет ген РНК-полимеразы фага Т7, которая необходима для обеспечения эффективной транскрипции целевых генов, находящихся в векторной конструкции под контролем промотора фага Т7, а также тем, что данный штамм дефектен по синтезу протеаз, что существенно повышает выход синтезируемых гетерологичных белков.
При культивировании штамм E.coli BL21(DE3)pLysE/pET21a-ProChym, обеспечивает синтез рекомбинантного, ферментативно-активного прохимозина В Bos taurus на уровне 40% от общего бактериального белка (см. Фигура 5, А).
Благодаря оптимизации кодоного состава и добавлению последовательности тага Т7 увеличивается выход целевого белка, так как в исследованиях было показано что прохимозин нарабатывается в небольших количествах без добавления данного региона [17]. На С-конце гена заложен фрагмент, кодирующий шесть гистидинов (6×His), для возможности вести очистку и концентрирование целевого белка с помощью металл-хелатной хроматографии.
Изобретение иллюстрируется следующими графическими фигурами. На фиг. 1 приведена нуклеотидная последовательность гена химерного белка прохимозина ProChym. На фиг. 2 представлена структура аминокислотной последовательности препрохимозина В Bos taurus (Swiss-ProtID:P00794). На фиг. 3 приведена аминокислотная последовательность химерного белка прохимозина В Bos taurus, кодируемого геном ProChym. На фиг. 4 изображена физическая и генетическая карта рекомбинантной плазмиды рЕТ21a-ProChym, содержащая последовательность химерного бкелка прохимозина Bos taurus. На фиг. 5А, Б представлены фотографии электрофоретического разделения: (фиг. 5, А) - лизата клеток E.coli BL21(DE3)pLysE/pET21a-ProChym в 12% ПААГ (1 - отрицательный контроль (культура Е. coli BL21(DE3)pLysE без плазмиды); 2 - лизат клеток Е. coli BL21(DE3)pLysE рЕТ21а- ProChym; 3 - лизат дебриса Е. coli BL21(DE3)pLysE рЕТ21а- ProChym после гомогенизирования и отделения от растворимой фракции; 4 - маркер молекулярной массы); (фиг. 5, Б) - электрофорез в ПААГ препарата химерного белка прохимозина В Bos taurus (1 - образец рекомбинантного химозина В Bos taurus транслируемого в BL21(DE3)pLysE без пропептида, 2 - образец рекомбинантного химерного белка прохимозина В Bos taurus (получен с использованием заявляемой плазмиды и штамма-продуцента), 3 - маркер молекулярной массы).
Для лучшего понимания сущности предлагаемого изобретения ниже приведены примеры его осуществления. Все стандартные генно-инженерные и микробиологические манипуляции, а также амплификацию и секвенирование ДНК проводили по известным методикам (Маниатис Т., Фрич Э, Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование, М.: Мир, 1984 [19]; Клонирование ДНК. Методы. Под ред. Д. Гловера, Пер. с англ., Москва, Мир, 1988 [20]; Saiki R.K., Gelfand D.H., Stoffel S., Sharf S.J., Higuehi R., Horn G.T., Mullis K.B., Eriich H.A. Science, 1988. V. 239, №4839, p. 487-491; Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1977, V. 74, p. 5463-5467) [21].
Пример 1. Синтез, встройка и анализ фрагмента ДНК, включающего полную кодирующую последовательность гена прохимозина В Bos taurus.
Заявляемая плазмида содержит следующие существенные для ее функционирования и экспрессии целевого белка структурные элементы:
- промотер бактериофага Т7, обеспечивающий эффективную транскрипцию контролируемой мРНК; рекомбинантный ген, кодирующий целевой химерный белок (ген прохимозина В Bos taurus); нетранслируемую область терминации транскрипции бактериального оперона, обеспечивающую эффективное окончание транскрипции;
- бактериальный оперон blа, кодирующий белок бета-лактамазу, являющуюся селективным маркером для трансформации штаммов Е. coli;
- бактериальный участок инициации репликации типа ColEl, обеспечивающий репликацию плазмиды в штаммах Е. coli.
Выбранная нуклеотидная последовательность гена прохимозина В Bos taurus (Swiss-ProtID:P00794) была синтезирована на автоматическом синтезаторе ABI 3400 DNA/RNA Synthesizer. Синтезированный ген был клонирован в составе клонирующего вектора pGH («ДНК синтез», г. Москва). Для получения гена прохимозина Bos taurus проводили ПНР с использованием олигонуклеотидных праймеров, соответствующих начальной части pET21a+proChym-(S) (содержит пропептид и таг Т7 обеспечивающий повышенный уровень экспрессии целевого белка) и концевой рЕТ21а+Chym (В) с помощью высокоточной ДНК-полимеразы AmpliTaq Gold фирмы Thermo Fisher Scientific (США) (таблица 1).
ПЦР проводили с использованием ПЦР-амплификатора «БИС» фирмы ООО БИС-Н (Россия). Реакционная смесь объемом 50 мкл, содержащая 2 мкг ДНК (плазмиды pGH с геном химозина), 10 пкМ каждого праймера (pET21a+proChym-(S) и рЕТ21а+Chym(B), 67 мМ трис-HCl (рН 8,8), 15 мМ сульфата аммония, 2,5 мМ хлористого магния, 0,01% Твин-20, смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дАТФ, дЦТФ, дТТФ, дГТФ по 2,5 мМ) и 1 ед. ДНК-полимеразы AmpliTaq Gold фирмы Thermo Fisher Scientific (США); реакцию осуществляли при следующих параметрах: 50 с - 96°С, 30 с - 60°С, 1 мин - 72°С (30 циклов).
По окончанию реакционную смесь разделяли электрофорезом в 1% агарозном геле и выявляли продукт реакции - единичный фрагмент размером 1.1 т.п.н. Фрагмент выделяли из геля с помощью набора «Gel Extraction Kit» фирмы Qiagen (Германия). Затем выделенный ПЦР-продукт и предварительно наработанную и очищенную плазмиду рЕТ21а обрабатывали эндонуклеазами рестрикции FauND I и Sfr274I («СибЭнзим», г. Новосибирск).
Реакцию гидролиза проводили в условиях рекомендованных производителем. С целью очистки рестрицированного вектора плазмидную ДНК наносили на 1%-й агарозный гель и выделяли из геля с использованием набора «Gel Extraction Kit» фирмы Qiagen (Германия). Реакцию лигирования проводили с использованием ДНК-лигазы бактериофага Т4 («СибЭнзим», г. Новосибирск). Реакция проводилась при +4°С в течение ночи. Полученной лигазной смесью трансформировали (как описано в примере 2) химически компетентные клетки Е. coli штамм ТОР10.
После трансформации клоны отбирали на агаризованнной среде LB, содержащей антибиотик ампициллин (50 мг/мл). Плазмидную ДНК из колоний выделяли методом щелочного лизиса. Для анализа наличия вставки гена прохимозина в рекомбинантной плазмиде использовали ПЦР со специфичными праймерами (таблица 1, праймеры 1 и 2). Разделение продуктов амплификации проводили в 1%-м агарозном геле с последующим окрашиванием бромистым этидием (0,5 мкг/мл). Положительные колонии, вносили в 5 мл среды LB с ампициллином (50 мкг/мл) и растили в течение ночи при 37°С при 170 об/мин. Затем плазмидную ДНК выделяли из бактериальных клеток с помощью коммерческих наборов DNA mini kit фирмы «Qiagen» согласно рекомендациям производителя. Первичную структуру полученных плазмид подтверждали секвенированием. Секвенирование проводили по методу Сэнгера в ЦКП «Геномика» СО РАН (г. Новосибирск).
Секвенирование плазмидной ДНК положительных клонов в районе встройки гена прохимозина В коровы позволило отобрать клоны с отсутствием дефектов встраиваемых генов (вставки, делеции, замены), после чего из отобранных клонов была наработана и выделена плазмидная ДНК.
Пример 2. Получение рекомбинантного штамма Escherichia coli BL21(DE3) PLysE/pET21a- ProChym
Полученной рекомбинантной плазмидой рЕТ21a-ProChym была проведена трансформация клеток Е. coli BL21(DE3) pLysE с использованием хлористого кальция. Культуру клеток подращивали до ODλ600=0.5. о.е. 1,5 мл суспензии центрифугировали 6000 об/мин 2 мин на центрифуге "Eppendorf 5415 R". Осадок клеток суспензировали в 700 мкл 0,2М СаСl2, инкубировали при 4°С в течение 15 мин, затем клетки осаждали центрифугированием 4000 об/мин 3 мин. Осадок клеток суспензировали в 100 мкл 0,2М СаСl2. К суспензии клеток добавляли 50-70 нг плазмидной ДНК, инкубировали 30 мин при 4°С, затем в течение 5 мин при 37°С. К суспензии клеток добавляли 1 мл среды LB и инкубировали при 37°С в течение 1 часа. 100 мкл культуры рассевали на чашку Петри с агаризованной средой с добавлением ампициллина до концентрации 100 мкг/мл. Остаток культуры осаждали центрифугированием 4000 об/мин 3 мин, отбирали супернатант, суспендировали в 100 мкл LB и высевали на чашку с агаризованной средой LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина. Чашки помещали в термостат 37°С и инкубировали в течении ночи. На следующий день были идентифицированы отдельные колонии BL21 (DE3)pLysE/pET21a- ProChym.
Штамм E. coli BL21 (DE3) pLysE, несущий рекомбинантную плазмиду рЕТ21a-ProChym, - продуцент рекомбинантного прохимозина В Bos taurus характеризуются следующими признаками: высокой физиологической стабильностью (снижение активности продуцируемого фермента после 50 генераций не превышает 20%) и высоким выходом активного продукта.
Клетки хорошо растут на обычно используемых питательных средах.. При выращивании на жидких LB- и YT-средах образуется интенсивная ровная мутность.
Физиолого-биохимические признаки
Оптимальная температура культивирования - от 30 до 37°С, оптимум рН - 7,6. Источником азота служат органические соединения (в виде триптона, дрожжевого экстракта).
Существенным при использовании данных штаммов является их чувствительность к канамицину (до 25 мкг/мл). Проявляют устойчивость к ампициллину (до 100 мкг/мл), обусловленную наличием плазмид рЕТ21а-Chym.
Один из отобранных клонов обозначали как Escherichia coli BL21(DE3) pLysE/pET21a- ProChym, выращивали его в 5 мл жидкой среды LB, содержащей 100 мг/л ампиницилина до ODλ600=5,0, добавляли к культуре равный объем стерильного 30% глицерина, разливали по 500 мкл в стерильные 1.5 мл пробирки, заморозили и храним при - 70°С.
Пример 3. Наработка биомассы BL21 (DE3) pLysE/ рЕТ21а- ProChym и выделение рекомбинантного прохимозина В Bos taurus
Полученные клоны Е. coli штамма BL21 (DE3) pLysE после трансформации рекомбинантной плазмидой рЕТ21a- ProChym наращивали в 5 мл среды YT×2 в течение ночи. Полученную ночную культуру добавляли по 1,5 мл в колбы объемом 750 мл содержащих 150 мл среды YT×2 и растили до плотности ODλ600=0,8. После этого в культуры вносили ИПТГ до конечной концентрации 1 мкМ для индукции промотора фага Т7 и продолжали культивирование в течение 5 часов при температуре 37°С, 170 об/мин. Биомассу бактериальных клеток осаждали центрифугированием (7000 об/мин), затем биомассу гомогенизировали в лизирующем буфере с использованием ультразвукового гомогенизатора Soniprep 150 Plus. Дебрис отделяли центрифугированием при 16000 rpm в течение 15 мин, 4°С.
Биомассу бактериальных клеток осаждали центрифугированием (7000 об/мин, 9000 g). Осадок суспендировали в лизирующем буфере (20 мМ Трис, 300 мМ NaCl, 0.1% Twin 20, рН=8,0) с использованием ультразвукового гомогенизатора Soniprep 150 Plus. Дебрис (осадок, формируемый в результате центрифугирования суспензии гомогенизированной ткани и содержащий полуразрушенные клетки) отделяли центрифугированием при 16000 rpm (31000 g) в течение 15 мин, при 4°С.
После разделения обе фракции были проанализированы в 12% ПААГ на наличие целевого белка. Результаты показали, что весь целевой белок находится в нерастворимой фракции (Фигура 5, А).
Пример 4. Очистка рекомбинатного прохимозина В Bos taurus
Так как в примере 3 было показано, что целевой белок находится в тельцах включения, для последующей очистки дебрис растворяли в базовом буфере (20 мМ Трис, 300 мМ NaCl, рН=8), содержащем 8М мочевину.
Поскольку в нуклеотидную последовательность С-терминальных участков рекомбинантного белка был заложен фрагмент 6×His, его очистку проводили с помощью металл-хелатной хроматографии на Ni-NTA агарозе.
Колонку, содержащую Ni-NTA агарозу, уравновешивали базовым буфером: 20 мМ Трис, 300 мМ NaCl, 8М мочевина, рН=8,0. Дебрис после дезинтеграции растворяли в базовом буфере с 8 М мочевиной и наносили на колонку. Промывали колонку 10 объемами промывочного буфера (базовый буфер с 8 М мочевиной + 20 мМ имидазола). Десорбцию связанных с сорбентом белков, проводили базовым буфером со ступенчато (шаг 50 мМ) повышающейся (20-300 мМ) концентрацией имидазола. Было установлено, что рекомбинантный прохимозин элюируется при концентрации имидазола 250 мМ. Количественный анализ показал, что на 1 литр культуральной среды нарабатывается 1.5 г прохимозина (Фигура 5). При этом масса очищенного прохимозина составляет от 30 до 40% общей массы клеток BL21 (DE3) pLysE/ рЕТ21а- ProChym. Чистоту белка контролировали с помощью электрофореза в 12%-м полиакриламидном геле (фиг. 5, А).
Пример 5 Реанатурация и активация рекомбинантного прохимозина В Bos tauru
Рефолдинг целевого белка, элюированного с металл-хелатного сорбента, и его очистку от мочевины и имидазола проводили диализом. Диализ проводили в две стадии: однократно против буфера содержащего 50 мМ Трис, 300 мМ NaCl, рН=10.25, не более 5 часов. Затем четырехкратно против раствора, содержащего 50 мм Трис, рН=7,5.
После диализа была определена концентрация образцов используемых для определения молокосвертывающей активности. Так же для сравнения был взят ранее полученный рекомбинантный химозин В Bos taurus транслируемый в BL21 (DE3) pLysE без про пептида, то есть не требующий активации.
№1. Рекомбинантный прохимозин с=0.2 мг/мл
№2. Рекомбинантный химозин с=0.8 мг/мл
Для подтверждения наличия специфической ферментативной активности был проведен анализ молокосвертывающей активности. Для этого фермент необходимо было перевести в активную форму.
Активацию прохимозина проводили путем ступенчатого понижения и повышения рН. Все операции выполняли в пластиковой посуде, при комнатной температуре. Для контроля исходной молокосвертывающей активности (МА) рекомбинантного прохимозина, отбирали аликвоту неактивированного фермента.
Для активации в образец рекомбинантного прохимозина, при постоянном перемешивании, вносили 2,0М НСl до рН 3,0. Останавливали перемешивание и инкубировали смесь при рН 3,0 в течение 2 часов. По истечении времени инкубации, доводили рН образца до 6,2, используя 0,5М NaOH. В активированном таким способом образце определяли МА.
Пример 6 Определение молокосвертывающей активности рекомбинантного активированного химозина (после активации прохимозин переходит в химозин)
Для определения МА использовали стандартизированный сухой молочный субстрат ("Субстрат СТ.3"), выпускаемый ВНИИМС (г. Углич). Для подготовки к работе 25,0 гр. субстрата растворяли в 230 мл 0,01N СаСl2 в течение 1 ч при комнатной температуре и постоянном перемешивании. Доводили рН полученной смеси до 6,5, используя 1,0М NaOH. Конечный объем раствора доводили до 250 мл 0,01 N СаСl2.
Активность исследуемых образцов определяли относительно отраслевого контрольного образца сычужного фермента (ОКО СФ), аттестованного по МА, выпускаемого ОАО "Московский завод сычужного фермента". Для подготовки к работе, к 1,0 г ОКО СФ добавляли 80 мл дистиллированной воды, перемешивали 30 минут при 20-25°С, доводили объем смеси до 100 мл и выдерживали на водяной бане при 35°С в течение 15 мин. Перед определением МА исследуемые образцы выдерживали 15 минут при 35°С.
Определение МА проводили при 35°С. В сухую стеклянную пробирку вносили 2,5 мл раствора стандартизированного субстрата и прогревали при 35°С в течение 5 минут. В пробирку с субстратом добавляли 0,25 мл исследуемого образца, включали секундомер, содержимое пробирки сразу же тщательно перемешивали. Продолжительность свертывания субстрата отмечали по секундомеру с момента внесения образца до появления первых хлопьев коагуляции субстрата. Появление хлопьев проверяли путем периодического нанесения стеклянной палочкой капли реакционной смеси на стенку пробирки.
Молокосвертывающую активность исследуемых образцов выражали в условных единицах на 1 мл препарата (усл. ед./мл) и рассчитывали по формуле:
МА=0,01*А*Т1/Т2, где:
А - аттестованная молокосвертывающая активность ОКО СФ в условных единицах;
Т1 - продолжительность свертывания субстрата с ОКО СФ;
Т2 - продолжительность свертывания субстрата с исследуемым образцом.
Для перевода условных единиц МА в международные молокосвертывающие единицы (IMCU) использовали понижающий коэффициент 129,1. Результаты исследования представлены в таблице 2.
Сравнительная ферментативная активность показала, что рекомбинатный прохимозин после активации проявляет высокую молокосвертывающую активность (примеры 3 и 4).
Источники научно-технической и патентной информации
1. Horne, D.S. Casein structure, self-assembly and gelation / D.S. Horne // Current Opinion in Colloid and Interface Sci. - 2002. - V 7. - P. 456-461.
2. Green, M.L. Studies on the mechanism of clotting of milk / M.L. Green // Neth. Milk Dairy J. - 1973. - V 27. - P. 278-285.
3. Cheese Chemistry, Physics and Microbiology, Third edition, Volume I: General Aspects. Rennet-induced Coagulation of Milk / D.S. Horne, J.M. Banks.; P.F. Fox, P.L.H. McSweeney, T.M. Cogan, T.P. Guinee, eds. - London, UK: Elsevier Academic Press, 2004. - P. 47-70.
4. Осинцев, A.M Теоретическое и экспериментальное исследование процессов, лежащих в основе свертывания молока / A.M. Осинцев. - Кемеровский технологический институт пищевой промышленности. - Кемерово, 2003. - 120 С.
5. Harboe M., Broe M.L., Qvist K.B. In: Technology of Cheesemaking. Law BA, Tamime AY, Eds., John Wiley & Sons., 2010, Ch. 3. The Production, Action and Application of Rennet and Coagulants, pp. 98-129. DOI: 10.1002/9781444323740. ch3.
6. Jacob M., Jaros D., Rhom H. Recent advances in milk clotting enzymes. International Journal of Dairy Technology, 2011, vol. 64, no. 1, pp. 14-33. DOI: 10.1111/j.1471-0307.2010.00633.x.
7. Shah M.A., Mir S.A., Paray M.A. Plant proteases as milk-clotting enzymes in cheesemaking: a review. Dairy Science and Technology, 2014, vol. 94, no. 1, pp. 5-16. DOI: 10.1007/s13594-013-0144-3.
8. Ельчанинов B.B., Уманский M.C., Белов A.H., Коваль А.Д., Шелепов В.Г. Молокосвертывающий фермент из сычугов северного оленя. 1. Выделение и краткая характеристика Сыроделие и маслоделие, 2005, №4, стр. 13-16.
9. Lebedev L.R., Kosogova Т.А., Teplyakova T.V., Kriger A.V., Elchaninov V.V., Belov A.N., Koval' A.D. Study of technological properties of milk-clotting enzyme from Irpex lacteus (Irpex lacteus (Fr.) Fr.). Foods and Raw Materials, 2016, vol. 4, no. 2, pp. 58-65. DOI: 10.21179/2308-4057-2016-2-58-65.
10. Feng Z. et al. Codon optimization of the calf prochymosin gene and its expression in Kluyveromyces lactis // World Journal of Microbiology and Biotechnology. - 2010. - T. 26. - №.5. - P. 895-901.
11. Menzella H.G. Comparison of two codon optimization strategies to enhance recombinant protein production in Escherichia coli // Microbial cell factories. - 2011. - Т. 10. - №.1. - P. 15.
12. Marston F.A.O. et al. Purification of calf prochymosin (prorennin) synthesized in Escherichia coli // Nature Biotechnology. - 1984. - T. 2. - №.9. - P. 800-804.
13. Yonezawa M. et al. Role of the amino-terminal amino acid sequences determining the in vitro refolding process of prochymosin polypeptide // Journal of biotechnology. - 1993. - T. 28. - №.1. - P. 85-97.
14. WO 2009/027572, A1, МПК C12N 9/64; C12N 15/69; C12N 15/81, опубл. 05.03.2009 г.
15. Заявка США №20070166785, A1, МПК С12Р 21/06, С07Н 21/04, опубл. 19.07.2007 г. (прототип).
16. Rao S. Extraction and purification of chymosin from buffalo calves. PhD thesis, Natl. Dairy Res. Inst., Karnal, India, 1984.
17. Рудометов А.П. Сравнение экспрессии нуклеотидной последовательности химозина и прохимозина теленка в Е. coli BL21 и оценка молокосвертывающей активности полученных рекомбинантных белков / А.П. Рудометов, С.В. Беленькая, Е.А. Колосова и др. // Международный научно-исследовательский журнал. - 2016. - №10 (52) Часть 4. - С. 37-40.
18. Pitts J.Е., Dhanraj V., Dealwis C.G., Mountafounis D., Nugent P., Orphrayoon P. Multidisciplinary cycles for protein engineering: Site directed mutagenesis and X-ray structural studies of aspartic proteinases // Scand JClin Lab Invest. 1992. 52(suppl. 210). P. 39-50.
19. Маниатис Т., Фрич Э, Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование, М.: Мир, 1984; Клонирование ДНК. Методы. Под ред. Д. Гловера, Пер. с англ., Москва, Мир, 1988.
20. Saiki R.K., Gelfand D.H., Stoffel S., Sharf S.J., Higuehi R., Horn G.T., Mullis K.B., Eriich H.A. Science, 1988. V. 239, №4839, p. 487-491.
21. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1977, V. 74, p. 5463-5467.
Claims (2)
1. Рекомбинантная плазмида pET21a-ProChym размером 6504 пар оснований (п.о.), обеспечивающая синтез химерного белка прохимозина В Bos taurus размером 41 кДа в клетках Escherichia coli BL2\(DE3)pLysE и содержащая следующие существенные для ее функционирования и экспрессии целевого белка структурные элементы: промотер бактериофага Т7, обеспечивающий эффективную транскрипцию контролируемой мРНК; рекомбинантный ген прохимозина В Bos taurus, кодирующий целевой химерный белок; Т7 терминатор, являющийся нетранслируемой областью терминации транскрипции бактериального оперона, обеспечивающей эффективное окончание транскрипции; последовательность экспрессионного тага Т7, добавленную в состав нуклеотидной последовательности гена прохимозина В Bos taurus на N-конец, для увеличения выхода целевого белка; последовательность blа, кодирующий белок бета-лактамазу, являющуюся селективным маркером для трансформации штаммов Е. coli; последовательность ColE1, обеспечивающий репликацию плазмиды в штаммах Е. coli, причем рекомбинантный ген белка прохимозина В Bos taurus имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1 от нуклеотида в положении 5205 п.о. до нуклеотида в положении 6347 п.о., кодирующий целевой химерный белок прохимозин В Bos taurus с полной аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2, встроенный по сайтам рестрикции FauND I и Sfr274 I в область полилинкера вектора рЕТ21а, содержащего промотор и терминатор РНК-полимеразы фага Т7.
2. Рекомбинантный штамм Escherichia coli BL21(DE3)pLysE рЕТ21а-ProChym - продуцент химерного белка прохимозина В Bos taurus E.coli, полученный трансформацией рекомбинантной плазмидой рЕТ21а-ProChym по п. 1 и депонированный в Коллекции бактерий, бактериофагов и грибов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора под регистрационным номером В-1362.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017123395A RU2670071C1 (ru) | 2017-07-03 | 2017-07-03 | Рекомбинатная плазмида pET21a-ProChym, обеспечивающая синтез химерного белка прохимозина В Bos taurus, и штамм Escherichia coli BL21(DE3)pLysE pET21a-ProChym - продуцент химерного белка прохимозина В Bos Taurus |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017123395A RU2670071C1 (ru) | 2017-07-03 | 2017-07-03 | Рекомбинатная плазмида pET21a-ProChym, обеспечивающая синтез химерного белка прохимозина В Bos taurus, и штамм Escherichia coli BL21(DE3)pLysE pET21a-ProChym - продуцент химерного белка прохимозина В Bos Taurus |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2670071C1 true RU2670071C1 (ru) | 2018-10-17 |
Family
ID=63862580
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017123395A RU2670071C1 (ru) | 2017-07-03 | 2017-07-03 | Рекомбинатная плазмида pET21a-ProChym, обеспечивающая синтез химерного белка прохимозина В Bos taurus, и штамм Escherichia coli BL21(DE3)pLysE pET21a-ProChym - продуцент химерного белка прохимозина В Bos Taurus |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2670071C1 (ru) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2729403C1 (ru) * | 2019-05-31 | 2020-08-06 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Алтайский государственный университет" | Рекомбинантная плазмида pET32-Trex Vic, обеспечивающая синтез химерного белка прохимозина Vicugna pacos, и штамм Escherichia coli BL21(DE3)pLysE pET32-Trx Vic-продуцент химерного белка прохимозина Vicugna pacos |
| RU2769175C1 (ru) * | 2020-10-29 | 2022-03-29 | Федеральное государственное учреждение «Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» Российской академии наук» (ФИЦ Биотехнологии РАН) | Способ микробиологической продукции химозина быка с использованием рекомбинантного штамма Pichia pastoris, содержащего синтетический ген варианта химозина с коэкспрессией фактора HAC1 |
| RU2779307C2 (ru) * | 2020-10-28 | 2022-09-06 | Федеральное государственное учреждение «Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» Российской академии наук» (ФИЦ Биотехнологии РАН) | Способ микробиологического синтеза прохимозина быка с использованием рекомбинантного штамма Pichia pastoris, содержащего синтетический ген варианта препрохимозина с модифицированной сигнальной последовательностью секреции |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20070166785A1 (en) * | 2004-03-30 | 2007-07-19 | Mule Veakata Madhusudhan R | Recombinant calf-chymosin and a process for producing the same |
| WO2009027572A1 (es) * | 2007-07-27 | 2009-03-05 | Universidade De Santiago De Compostela | Uso de la quimosina recombinante activa |
-
2017
- 2017-07-03 RU RU2017123395A patent/RU2670071C1/ru active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20070166785A1 (en) * | 2004-03-30 | 2007-07-19 | Mule Veakata Madhusudhan R | Recombinant calf-chymosin and a process for producing the same |
| WO2009027572A1 (es) * | 2007-07-27 | 2009-03-05 | Universidade De Santiago De Compostela | Uso de la quimosina recombinante activa |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| РУДОМЕТОВ А.П. И ДР. Дизайн экспрессионной кассеты для получения химозина теленка в культуре Вacillus subtilis // Биотехнология и общество в ХХI веке, Барнаул, 15-18 сентября 2015г., c. 265-268. * |
| РУДОМЕТОВ А.П. И ДР. Сравнение экспрессии нуклеотидной последовательности химозина и прохимозина теленка в E.coli BL21 и оценка молокосвертывающей активности полученных рекомбинантных белков // Международный научно-исследовательский журнал, 2016, Часть 4, Октябрь, c. 37-40. * |
| РУДОМЕТОВ А.П. И ДР. Сравнение экспрессии нуклеотидной последовательности химозина и прохимозина теленка в E.coli BL21 и оценка молокосвертывающей активности полученных рекомбинантных белков // Международный научно-исследовательский журнал, 2016, Часть 4, Октябрь, c. 37-40. РУДОМЕТОВ А.П. И ДР. Дизайн экспрессионной кассеты для получения химозина теленка в культуре Вacillus subtilis // Биотехнология и общество в ХХI веке, Барнаул, 15-18 сентября 2015г., c. 265-268. * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2729403C1 (ru) * | 2019-05-31 | 2020-08-06 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Алтайский государственный университет" | Рекомбинантная плазмида pET32-Trex Vic, обеспечивающая синтез химерного белка прохимозина Vicugna pacos, и штамм Escherichia coli BL21(DE3)pLysE pET32-Trx Vic-продуцент химерного белка прохимозина Vicugna pacos |
| RU2779307C2 (ru) * | 2020-10-28 | 2022-09-06 | Федеральное государственное учреждение «Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» Российской академии наук» (ФИЦ Биотехнологии РАН) | Способ микробиологического синтеза прохимозина быка с использованием рекомбинантного штамма Pichia pastoris, содержащего синтетический ген варианта препрохимозина с модифицированной сигнальной последовательностью секреции |
| RU2769175C1 (ru) * | 2020-10-29 | 2022-03-29 | Федеральное государственное учреждение «Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» Российской академии наук» (ФИЦ Биотехнологии РАН) | Способ микробиологической продукции химозина быка с использованием рекомбинантного штамма Pichia pastoris, содержащего синтетический ген варианта химозина с коэкспрессией фактора HAC1 |
| RU2808458C2 (ru) * | 2021-09-03 | 2023-11-28 | Федеральное государственное учреждение «Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» Российской академии наук» | Способ автокаталитической активации прохимозина быка при культивировании Pichia pastoris в ферментере |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2017272206B2 (en) | Materials and methods for the synthesis of error-minimized nucleic acid molecules | |
| Yegin et al. | Progress in the field of aspartic proteinases in cheese manufacturing: structures, functions, catalytic mechanism, inhibition, and engineering | |
| DK2844750T3 (en) | IMPROVED ENZYM VARIENTS | |
| AU734220B2 (en) | Cloning and characterization of napsin, an aspartic protease | |
| Vallejo et al. | Cloning and expression of buffalo active chymosin in Pichia pastoris | |
| IE53517B1 (en) | Process for the production of a polypeptide | |
| CN109797155B (zh) | 三疣梭子蟹甘露糖结合凝集素PtMBL基因及其编码蛋白和应用 | |
| RU2670071C1 (ru) | Рекомбинатная плазмида pET21a-ProChym, обеспечивающая синтез химерного белка прохимозина В Bos taurus, и штамм Escherichia coli BL21(DE3)pLysE pET21a-ProChym - продуцент химерного белка прохимозина В Bos Taurus | |
| EP0123928A2 (en) | Recombinant DNA coding for a polypeptide displaying milk clotting activity | |
| US7404977B2 (en) | Rennets | |
| KR100961528B1 (ko) | 대장균에서 활성형 인간 상피세포 성장인자의 대량제조방법 | |
| SU1732814A3 (ru) | Способ получени гибридного активатора плазминогена, содержащего область, ответственную за средство с фибрином активатора плазминогена ткани, и область, ответственную за ферментную активность проурокиназного полипептида | |
| US11447780B2 (en) | Preparation of wheat cysteine protease triticain-alpha produced in soluble form and method of producing same | |
| RU2729403C1 (ru) | Рекомбинантная плазмида pET32-Trex Vic, обеспечивающая синтез химерного белка прохимозина Vicugna pacos, и штамм Escherichia coli BL21(DE3)pLysE pET32-Trx Vic-продуцент химерного белка прохимозина Vicugna pacos | |
| JP6991423B2 (ja) | グルコースオキシダーゼＣｎＧＯＤＡ及びその遺伝子ならびに使用 | |
| CA2942785C (en) | Aspartic proteases | |
| US5082775A (en) | Efficient process for isolating insoluble heterologous protein using non-ionic detergents | |
| JPS589687A (ja) | ポリペプチドの生産方法 | |
| JP5757555B2 (ja) | 新規酸性プロテアーゼ及びその用途 | |
| CN101481414A (zh) | 卵巢功能相关蛋白及其制备方法和用途 | |
| NZ275817A (en) | Endothelin converting enzymes, preparation and use | |
| Xin et al. | An X-prolyl dipeptidyl aminopeptidase from Lactococcus lactis: cloning, expression in Escherichia coli, and application for removal of N-terminal Pro-Pro from recombinant proteins | |
| CN121609773A (zh) | 一种截短的鱼类肽聚糖识别蛋白及其应用 | |
| AHMADIAN et al. | Bacterial expression and functional characterization of a naturally occurring exon6-less preprochymosin cDNA | |
| WO2000011146A1 (fr) | Epimorphine destinee a des artiodactyles |