RU2657433C1 - Method of assessing the risk of non-pregnancy in women with usual miscarriage - Google Patents
Method of assessing the risk of non-pregnancy in women with usual miscarriage Download PDFInfo
- Publication number
- RU2657433C1 RU2657433C1 RU2017112833A RU2017112833A RU2657433C1 RU 2657433 C1 RU2657433 C1 RU 2657433C1 RU 2017112833 A RU2017112833 A RU 2017112833A RU 2017112833 A RU2017112833 A RU 2017112833A RU 2657433 C1 RU2657433 C1 RU 2657433C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- trophoblast
- total
- miscarriage
- trophoblast cells
- Prior art date
Links
- 206010000234 Abortion spontaneous Diseases 0.000 title claims abstract description 40
- 208000000995 spontaneous abortion Diseases 0.000 title claims abstract description 40
- 208000015994 miscarriage Diseases 0.000 title claims abstract description 38
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 16
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 title description 11
- 210000002993 trophoblast Anatomy 0.000 claims abstract description 104
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 claims abstract description 39
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 claims abstract description 39
- 230000034994 death Effects 0.000 claims abstract description 25
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 25
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 claims abstract description 24
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 claims abstract description 21
- 230000002650 habitual effect Effects 0.000 claims abstract description 16
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 claims abstract description 14
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 claims abstract description 12
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 claims abstract description 12
- 230000027758 ovulation cycle Effects 0.000 claims abstract description 11
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 claims abstract description 10
- 230000030833 cell death Effects 0.000 abstract description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 5
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 abstract description 5
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 abstract description 3
- 210000000270 basal cell Anatomy 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 44
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 31
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 15
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 15
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 10
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 5
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 4
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 4
- 101100257624 Arabidopsis thaliana SPS4 gene Proteins 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010055690 Foetal death Diseases 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 3
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 208000006332 Choriocarcinoma Diseases 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 2
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 2
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 2
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 2
- 238000000295 emission spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 2
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 2
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 2
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoserine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@H](N)C(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 0.000 description 1
- FADQCEBBTITJBI-UHFFFAOYSA-N 2-[(2-methoxyphenyl)methoxymethyl]oxirane Chemical compound COC1=CC=CC=C1COCC1OC1 FADQCEBBTITJBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylserin Natural products OC(=O)C(N)COP(O)(=O)OCC(O)CO ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 208000008899 Habitual abortion Diseases 0.000 description 1
- 101000917858 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 description 1
- 101000917839 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Proteins 0.000 description 1
- 101000581981 Homo sapiens Neural cell adhesion molecule 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100029185 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Human genes 0.000 description 1
- 238000000585 Mann–Whitney U test Methods 0.000 description 1
- 102100027347 Neural cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- ZGSPNIOCEDOHGS-UHFFFAOYSA-L disodium [3-[2,3-di(octadeca-9,12-dienoyloxy)propoxy-oxidophosphoryl]oxy-2-hydroxypropyl] 2,3-di(octadeca-9,12-dienoyloxy)propyl phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].CCCCCC=CCC=CCCCCCCCC(=O)OCC(OC(=O)CCCCCCCC=CCC=CCCCCC)COP([O-])(=O)OCC(O)COP([O-])(=O)OCC(OC(=O)CCCCCCCC=CCC=CCCCCC)COC(=O)CCCCCCCC=CCC=CCCCCC ZGSPNIOCEDOHGS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000011493 immune profiling Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000008611 intercellular interaction Effects 0.000 description 1
- 238000012332 laboratory investigation Methods 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 206010025135 lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 238000011017 operating method Methods 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 239000013630 prepared media Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000035752 proliferative phase Effects 0.000 description 1
- 208000034213 recurrent susceptibility to 1 pregnancy loss Diseases 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области медицины, а именно к репродуктивной медицине, и может быть использовано для оценки риска невынашивания беременности у женщин с привычным невынашиванием.The invention relates to medicine, namely to reproductive medicine, and can be used to assess the risk of miscarriage in women with habitual miscarriage.
Известен способ оценки риска невынашивания беременности у женщин с привычным невынашиванием, при котором определяют содержание в сыворотке крови волчаночного антикоагулянта, антител к кардиолипину и к фосфатидилсерину (Jaslow C.R. et al. Diagnostic factors identified in 1020 women with two versus three or more recurrent pregnancy losses // Fertility and sterility. - 2010. - Vol. 93. - 1234-1243).A known method for assessing the risk of miscarriage in women with habitual miscarriage, in which the blood serum content of the lupus anticoagulant, antibodies to cardiolipin and phosphatidylserine is determined (Jaslow CR et al. Diagnostic factors identified in 1020 women with two versus three or more recurrent pregnancy losses / / Fertility and sterility. - 2010 .-- Vol. 93. - 1234-1243).
Недостаток способа состоит в том, что только у 40% женщин с привычным невынашиванием беременности выявляются изменения, выходящие за рамки нормальных значений (Jaslow C.R. et al. Diagnostic factors identified in 1020 women with two versus three or more recurrent pregnancy losses // Fertility and sterility. - 2010. - Vol. 93. - 1234-1243). У 60% женщин с привычным невынашиванием беременности уточнить причины развития заболевания не удается (Jaslow C.R. et al. Diagnostic factors identified in 1020 women with two versus three or more recurrent pregnancy losses // Fertility and sterility. - 2010. - Vol. 93. - 1234-1243). Другой недостаток способа состоит в том, что указанные параметры не позволяют оценить функциональные взаимодействия между клетками матери и клетками трофобласта, которые могут вносить вклад в повышение риска развития невынашивания беременности (Kuon R.J. et al. Immune profiling in patients with recurrent miscarriage // Journal of reproductive immunology. - 2015. - Vol. 108. - 136-141).The disadvantage of this method is that only 40% of women with habitual miscarriage show changes that go beyond normal values (Jaslow CR et al. Diagnostic factors identified in 1020 women with two versus three or more recurrent pregnancy losses // Fertility and sterility . - 2010. - Vol. 93. - 1234-1243). In 60% of women with habitual miscarriage, it is not possible to clarify the causes of the development of the disease (Jaslow CR et al. Diagnostic factors identified in 1020 women with two versus three or more recurrent pregnancy losses // Fertility and sterility. - 2010. - Vol. 93. - 1234-1243). Another disadvantage of the method is that these parameters do not allow to evaluate the functional interactions between mother cells and trophoblast cells, which can contribute to an increased risk of miscarriage (Kuon RJ et al. Immune profiling in patients with recurrent miscarriage // Journal of reproductive immunology. - 2015. - Vol. 108. - 136-141).
Техническим результатом изобретения является расширение арсенала средств по оценке риска невынашивания беременности у женщин с привычным невынашиванием и возможность дать иммунологическую оценку этого риска.The technical result of the invention is to expand the arsenal of tools for assessing the risk of miscarriage in women with habitual miscarriage and the ability to give an immunological assessment of this risk.
Указанный технический результат достигается тем, что согласно изобретению у пациенток с привычным невынашиванием беременности определяют цитотоксическую активность NK-клеток периферической крови в секреторной фазе менструального цикла в отношении клеток трофобласта линии Jeg-3, и, если значение цитотоксической активности NK-клеток превышает предварительно определенное значение цитотоксической активности NK-клеток у здоровых фертильных женщин в секреторной фазе менструального цикла, прогнозируют высокий риск невынашивания беременности.The specified technical result is achieved by the fact that according to the invention, in patients with habitual miscarriage, the cytotoxic activity of peripheral blood NK cells in the secretory phase of the menstrual cycle is determined for trophoblast cells of the Jeg-3 line, and if the value of the cytotoxic activity of NK cells exceeds a predetermined value cytotoxic activity of NK cells in healthy fertile women in the secretory phase of the menstrual cycle, a high risk of miscarriage is predicted and.
Среди множества иммунологических параметров в патогенезе привычного невынашивания беременности выделяют определение количества NK-клеток и реализуемую ими цитотоксическую функцию (Pandey М.К. et al. An update in recurrent spontaneous abortion // Archives of gynecology and obstetrics. - 2005. - Vol. 272. - 95-108).Among the many immunological parameters in the pathogenesis of habitual miscarriage, the determination of the number of NK cells and the cytotoxic function realized by them are distinguished (Pandey M.K. et al. An update in recurrent spontaneous abortion // Archives of gynecology and obstetrics. - 2005. - Vol. 272 . - 95-108).
При этом имеются данные, свидетельствующие о том, что содержание NK-клеток в периферической крови не отличается между небеременными женщинами с невынашиванием беременности и здоровыми фертильными женщинами (Emmer P.M. et al. Peripheral natural killer cytotoxicity and CD56(pos)CD16(pos) cells increase during early pregnancy in women with a history of recurrent spontaneous abortion // Human reproduction. - 2000. - Vol. 15. - 1163-1169).Moreover, there is evidence that the content of NK cells in peripheral blood does not differ between non-pregnant women with miscarriage and healthy fertile women (Emmer PM et al. Peripheral natural killer cytotoxicity and CD56 (pos) CD16 (pos) cells increase during early pregnancy in women with a history of recurrent spontaneous abortion // Human reproduction. - 2000. - Vol. 15. - 1163-1169).
В заявляемом способе достоверные различия цитотоксической активности NK-клеток периферической крови у здоровых женщин и у женщин с высоким риском невынашивания беременности были получены в секреторной фазе менструального цикла.In the claimed method, significant differences in the cytotoxic activity of peripheral blood NK cells in healthy women and in women with a high risk of miscarriage were obtained in the secretory phase of the menstrual cycle.
Для определения цитотоксической активности NK-клеток в качестве клеток-мишеней использовали клетки трофобласта линии Jeg-3, воспроизводящие основные морфологические, фенотипические и функциональные характеристики инвазивного трофобласта первого триместра беременности (Kohler P.O. and Bridson W.E. Isolation of hormone-producing clonal lines of human choriocarcinoma // The Journal of clinical endocrinology and metabolism. - 1971. - Vol. 32. - 683-687).To determine the cytotoxic activity of NK cells, Jeg-3 trophoblast cells reproducing the main morphological, phenotypic, and functional characteristics of the invasive trophoblast of the first trimester of pregnancy (Kohler PO and Bridson WE Isolation of hormone-producing clonal lines of human choriocarcinoma / / The Journal of clinical endocrinology and metabolism. - 1971. - Vol. 32. - 683-687).
Преимущество использования клеток трофобласта линии Jeg-3 по сравнению со стандартными клетками-мишенями К562 состоит в моделировании межклеточных взаимодействий, которые могут протекать при наступлении беременности в маточно-плацентарном комплексе.The advantage of using Jeg-3 trophoblast cells compared to standard K562 target cells is to simulate the intercellular interactions that can occur during pregnancy in the uteroplacental complex.
Таким образом, способ позволяет дать иммунологическую оценку риска невынашивания беременности.Thus, the method allows you to give an immunological assessment of the risk of miscarriage.
В исследование, на котором основано изобретение, входили следующие группы пациентов: здоровые небеременные фертильные женщины в пролиферативной фазе менструального цикла (ПФМЦ) (n=20) и в секреторной фазе менструального цикла (СФМЦ) (n=20), женщины с физиологической беременностью (ФБ) на сроке 6-7 недель (n=25), небеременные женщины с привычным невынашиванием беременности (ПНБ) в ПФМЦ (n=19) и в СФМЦ (n=23).The study on which the invention is based included the following patient groups: healthy, non-pregnant, fertile women in the proliferative phase of the menstrual cycle (PFMC) (n = 20) and in the secretory phase of the menstrual cycle (PFMC) (n = 20), women with physiological pregnancy ( FB) for a period of 6-7 weeks (n = 25), non-pregnant women with habitual miscarriage (PFB) in PFMC (n = 19) and in PFMC (n = 23).
Для каждого пациента измерение цитотоксической активности NK-клеток проводили не менее чем в 4 повторах. При каждой постановке опыта цитотоксической активности NK-клеток также измеряли базовую гибель клеток трофобласта в отсутствие мононуклеаров. Статистическая обработка данных включала вычисление среднего арифметического уровня базовой гибели клеток трофобласта.For each patient, the measurement of the cytotoxic activity of NK cells was carried out in at least 4 replicates. At each experiment setting, the cytotoxic activity of NK cells also measured the basic death of trophoblast cells in the absence of mononuclear cells. Statistical data processing included the calculation of the arithmetic mean level of basal trophoblast cell death.
Для проведения исследования используют мононуклеары, выделенные из периферической крови пациентки при помощи стандартного метода центрифугирования в градиенте плотности фиколл-верографин (Boyum А. Separation of leukocytes from blood and bone marrow. Introduction // Scandinavian journal of clinical and laboratory investigation. Supplementum. - 1968. - Vol. 97. - 7). После выделения мононуклеары периферической крови, содержащие NK-клетки, инкубируют в полной культуральной среде, содержащей модифицированную среду DMEM, 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, 2 мМ L-глютамина, 10 мМ пирувата натрия. В эксперименте применяют клетки трофобласта линии Jeg-3, воспроизводящие основные морфологические, фенотипические и функциональные характеристики инвазивного трофобласта первого триместра беременности (Kohler P.O. andBridson W.E. Isolation of hormone-producing clonal lines of human choriocarcinoma // The Journal of clinical endocrinology and metabolism. - 1971. - Vol. 32. - 683-687). За сутки до эксперимента производят подготовку клеток трофобласта, осуществляют дезинтеграцию монослоя с помощью экспозиции в растворе трипсин-версен (1:1), затем половину полученной суспензии клеток помещают в новый матрас для адгезионных культур, добавляют 12 мл полной культуральной среды, 1% буферного раствора HEPES и 10% ЭТС. На следующий день осуществляют дезинтеграцию клеток трофобласта, проводят обработку клеток раствором 5-,6-карбоксифлуоресцеинадиацетатсукцинилмидилового эфира (КФДЭ) и инкубируют в течение 4 часов с мононуклеарами периферической крови в соотношении эффектор: мишень 10:1. Часть клеток трофобласта инкубируют в аналогичной культуральной среде без добавления мононуклеров для определения базовой гибели клеток трофобласта. После этого оценивают количество жизнеспособных и нежизнеспособных клеток трофобласта с помощью окраски клеток раствором пропидия иодида. Часть клеток трофобласта не обрабатывают растворами КФДЭ и пропидия иодида и используют в качестве отрицательного контроля при оценке флюоресценции клеток.For the study, mononuclear cells isolated from the patient’s peripheral blood are used using the standard method of centrifugation in density gradient ficoll-verographin (Boyum A. Separation of leukocytes from blood and bone marrow. Introduction // Scandinavian journal of clinical and laboratory investigation. Supplementum. - 1968 . - Vol. 97. - 7). After isolation, peripheral blood mononuclear cells containing NK cells are incubated in a complete culture medium containing modified DMEM medium, 10% fetal calf serum (ETS), 100 U / ml penicillin and 100 μg / ml streptomycin, 2 mM L-glutamine, 10 mm sodium pyruvate. The experiment uses Jeg-3 trophoblast cells that reproduce the main morphological, phenotypic, and functional characteristics of the invasive trophoblast of the first trimester of pregnancy (Kohler PO and Bridson WE Isolation of hormone-producing clonal lines of human choriocarcinoma // The Journal of clinical endocrinology and metabolism. - 1971 . - Vol. 32. - 683-687). The day before the experiment, trophoblast cells are prepared, the monolayer is disintegrated by exposure to trypsin-versene solution (1: 1), then half of the resulting cell suspension is placed in a new adhesive culture mattress, 12 ml of the complete culture medium, 1% buffer solution are added HEPES and 10% ETS. The next day, the trophoblast cells are disintegrated, the cells are treated with a solution of 5-, 6-carboxyfluorescein diacetate succinylmidyl ether (CPDE) and incubated for 4 hours with peripheral blood mononuclear cells in the ratio of 10: 1 effector: target. Part of the trophoblast cells are incubated in a similar culture medium without the addition of mononucleators to determine the basic death of trophoblast cells. After that, the number of viable and non-viable trophoblast cells is estimated by staining the cells with a solution of propidium iodide. Some of the trophoblast cells are not treated with solutions of CPDE and propidium iodide and are used as a negative control in assessing cell fluorescence.
Среднюю базовую гибель клеток трофобласта при инкубации в отсутствие мононуклеаров в каждом эксперименте вычисляют по формулеThe average basic death of trophoblast cells during incubation in the absence of mononuclear cells in each experiment is calculated by the formula
СБГэксп={(Хн/Хобщ)1+(Хн/Хобщ)2+…+{(Хн/Хобщ)n}*100%/n, гдеSBGEXP = {(X n / X total ) 1 + (X n / X total ) 2 + ... + {(X n / X total ) n } * 100% / n, where
СБГэксп - средняя базовая гибель клеток трофобласта в каждом эксперименте (%);SBHexp — average basal trophoblast cell death in each experiment (%);
Хн - количество нежизнеспособных клеток трофобласта, инкубированных в культуральной среде без добавления мононуклеаров;X n - the number of non-viable trophoblast cells incubated in the culture medium without the addition of mononuclear cells;
Хобщ - общее количество клеток трофобласта, инкубированных в культуральной среде без добавления мононуклеаров;X total - the total number of trophoblast cells incubated in the culture medium without the addition of mononuclear cells;
n - количество повторов (лунок).n is the number of repetitions (holes).
Предварительно проводится оценка показателя общей базовой гибели клеток трофобласта при инкубации в отсутствие мононуклеаров по формуле:A preliminary assessment of the indicator of the total basic death of trophoblast cells during incubation in the absence of mononuclear cells is carried out according to the formula:
оБГ=(СБГэксп1+СБГэксп2+…+СБГэкспm)/m, гдеOBG = (SBGExp 1 + SBGExp 2 + ... + SBGExp m ) / m, where
оБГ - общая базовая гибель клеток трофобласта при инкубации в отсутствие мононуклеаров (%);OBG - the total basic death of trophoblast cells during incubation in the absence of mononuclear cells (%);
СБГэксп - средняя базовая гибель клеток трофобласта при инкубации в отсутствие мононуклеаров;SBHexp - the average basic death of trophoblast cells during incubation in the absence of mononuclear cells;
m - количество экспериментов (не менее 30 повторов).m is the number of experiments (at least 30 repetitions).
Показатель общей базовой гибели клеток трофобласта (оБГ) является общей характеристикой клеток трофобласта линии Jeg-3 в конкретных условиях культивирования. До постановки эксперимента по способу оценки риска невынашивания беременности у конкретной пациентки рекомендуется предварительно оценить показатель оБГ, с этой целью рекомендуется оценить СБГэксп не менее, чем в 30 повторах. В дальнейшем полученная величина принимается в качестве константной, в каждом эксперименте данный показатель вычислять не требуется.The indicator of the total basic death of trophoblast cells (OBH) is a general characteristic of trophoblast cells of the Jeg-3 line under specific cultivation conditions. Before setting up an experiment on a method for assessing the risk of miscarriage in a particular patient, it is recommended to preliminarily evaluate the OBH indicator, for this purpose it is recommended to evaluate SBHexp in at least 30 repetitions. Subsequently, the obtained value is taken as constant; in each experiment, this indicator is not required to be calculated.
Затем вычисляют средний цитотоксический эффект NK-клеток в отношении клеток трофобласта в каждом эксперименте по формуле:Then calculate the average cytotoxic effect of NK cells in relation to trophoblast cells in each experiment according to the formula:
СЦЭпац={(Yн/Yобщ)1+(Yн/Yобщ)2+…+(Yн/Yобщ)n}*100%/n, гдеSCECap = {(Yn / Ytotal) 1 + (Yn / Ytotal) 2 + ... + (Yn / Ytotal) n } * 100% / n, where
СЦЭпац - средний цитотоксический эффект NK-клеток в отношении клеток трофобласта (%);SCeapac - the average cytotoxic effect of NK cells in relation to trophoblast cells (%);
Yн - количество нежизнеспособных клеток трофобласта, инкубированных с мононуклеарами периферической крови в каждой лунке;Yн is the number of non-viable trophoblast cells incubated with peripheral blood mononuclear cells in each well;
Yобщ - общее количество клеток трофобласта, инкубированных с мононуклеарами периферической крови;Ytotal is the total number of trophoblast cells incubated with peripheral blood mononuclear cells;
n - количество повторов (лунок) (не менее 4 повторов).n is the number of repetitions (holes) (at least 4 repetitions).
Затем оценивают цитотоксический эффект NK-клеток пациента с учетом усредненных значений по формулеThen, the cytotoxic effect of the patient's NK cells is evaluated taking into account the averaged values according to the formula
ЦЭпац=СЦЭпац-СБГэксп+оБГ, гдеЦЭпats = СЦЭпат-СБГекссп + оБГ, where
ЦЭпац - цитотоксический эффект NK-клеток пациента, %;CEPac - cytotoxic effect of patient NK cells,%;
СЦЭпац - средний цитотоксический эффект NK-клеток в отношении клеток трофобласта;SCeapac - the average cytotoxic effect of NK cells in relation to trophoblast cells;
СБГэксп - средняя базовая гибель клеток трофобласта в каждом эксперименте;SBHexp - the average basic death of trophoblast cells in each experiment;
оБГ - общая базовая гибель клеток трофобластаOBG - total underlying trophoblast cell death
Полученные данные были статистически обработаны с помощью программы Statistica 10. Для сравнения полученных данных использовался U-критерий Манна-Уитни, являющийся непараметрическим аналогом t-критерия Стьюдента. Статистически значимыми признавались различия при р<0,05, р<0,01, р<0,001.The obtained data were statistically processed using the
В табл. 1 для каждой группы пациентов представлены значения медианы, в фигурных скобках приведены значения верхнего и нижнего квартиля.In the table. 1, the median values are presented for each group of patients; the values of the upper and lower quartiles are shown in braces.
Установлено, что цитотоксическая активность NK-клеток периферической крови здоровых фертильных женщин в ПФМЦ была повышена по сравнению с показателем группы женщин с физиологической беременностью. Различий между группой фертильных женщин в СФМЦ и группой женщин с физиологической беременностью не выявлено. У фертильных женщин в СФМЦ была снижена по сравнению с соответствующим показателем для ПФМЦ (Табл. 1).It was found that the cytotoxic activity of NK cells of the peripheral blood of healthy fertile women in PFMC was increased compared to the group of women with physiological pregnancy. There were no differences between the group of fertile women in the SPMC and the group of women with physiological pregnancy. In fertile women, the PFMC was reduced compared with the corresponding indicator for PFMC (Table 1).
Достоверность различий: различия между группами представлены в виде значения р с индексом, соответствующим номерам сравниваемых групп.Significance of differences: differences between groups are presented as p values with an index corresponding to the numbers of the compared groups.
У небеременных женщин с привычным невынашиванием беременности цитотоксическая активность NK-клеток в отношении клеток трофобласта была повышена в СФМЦ по сравнению с ПФМЦ. Группа небеременных женщин с привычным невынашиванием беременности в СФМЦ отличается повышенной цитотоксической активностью NK-клеток в отношении трофобласта по сравнению с соответствующим показателем для группы небеременных фертильных женщин в СФМЦ (36%) (Табл. 1).In non-pregnant women with habitual miscarriage, the cytotoxic activity of NK cells in relation to trophoblast cells was increased in SPSC compared to PFMS. The group of non-pregnant women with habitual miscarriage in the SPMC is characterized by increased cytotoxic activity of NK cells against trophoblast compared with the corresponding indicator for the group of non-pregnant fertile women in the SPMC (36%) (Table 1).
Таким образом, выявление показателей ЦЭпац у женщин с привычным невынашиванием в СФМЦ выше, чем значение цитотоксической активности NK-клеток у здоровых фертильных женщин в секреторной фазе менструального цикла, является негативным прогностическим признаком для наступления беременности.Thus, the detection of CEAC indices in women with habitual miscarriage in the SPSC is higher than the value of the NK cell cytotoxic activity in healthy fertile women in the secretory phase of the menstrual cycle, is a negative prognostic sign for pregnancy.
Способ иллюстрируется фиг. 1-4, где:The method is illustrated in FIG. 1-4, where:
на фиг. 1 представлена двумерная гистограмма распределения относительного количества клеток трофобласта, необработанных КФДЭ и раствором пропидий иодида (а) в координатах FSC-SSC; б) в координатах FSC-FITC;in FIG. 1 shows a two-dimensional histogram of the distribution of the relative number of trophoblast cells, untreated CPDE and a solution of propidium iodide (a) in the coordinates of FSC-SSC; b) in FSC-FITC coordinates;
на фиг. 2 представлена двумерная гистограмма распределения относительного количества клеток трофобласта, обработанных раствором КФДЭ (а) в координатах FSC-SSC; б) в координатах FSC-FITC; в) в координатах FSC-PE;in FIG. 2 shows a two-dimensional histogram of the distribution of the relative number of trophoblast cells treated with a solution of CPDE (a) in the coordinates of FSC-SSC; b) in FSC-FITC coordinates; c) in FSC-PE coordinates;
на фиг. 3 представлена двумерная гистограмма распределения относительного количества клеток трофобласта, обработанных раствором КФДЭ и раствором пропидий иодида в координатах FSC-PE. Регион Dead cells содержит нежизнеспособные клетки трофобласта. а)-г) Лунка 1-4;in FIG. Figure 3 shows a two-dimensional histogram of the distribution of the relative number of trophoblast cells treated with a solution of CPDE and a solution of propidium iodide in FSC-PE coordinates. The Dead cells region contains non-viable trophoblast cells. a) -d) Well 1-4;
на фиг. 4 представлена двумерная гистограмма распределения относительного количества клеток трофобласта, обработанных раствором КФДЭ и раствором пропидий иодида, в опытных пробах, инкубированных с мононуклеарами периферической крови, (а) в координатах FSC-SSC, б) в координатах FSC-FITC. Регион Jeg-3 содержит клетки трофобласта; в)-е) в координатах FSC-PE - лунки 1-4. Регион Dead cells содержит нежизнеспособные клетки трофобласта.in FIG. Figure 4 shows a two-dimensional histogram of the distribution of the relative number of trophoblast cells treated with CPED solution and propidium iodide solution in experimental samples incubated with peripheral blood mononuclear cells, (a) in FSC-SSC coordinates, b) in FSC-FITC coordinates. The Jeg-3 region contains trophoblast cells; c) -f) in the coordinates of FSC-PE - holes 1-4. The Dead cells region contains non-viable trophoblast cells.
Способ осуществляют, например, следующим образом.The method is carried out, for example, as follows.
Для оценки цитотоксической активности NK-клеток периферической крови в отношении клеток трофобласта используют клетки трофобласта линии Jeg-3.To assess the cytotoxic activity of peripheral blood NK cells in relation to trophoblast cells, trophoblast cells of the Jeg-3 line are used.
I. Порядок исследования.I. The order of the study.
1. Подготовка рабочих растворов.1. Preparation of working solutions.
1.1. Культуральная среда DMEM с добавлением 10% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, 2 мМ L-глютамина, 10 мМ пирувата натрия (полная культуральная среда).1.1. DMEM culture medium supplemented with 10% inactivated fetal calf serum (ETS), 100 U / ml penicillin and 100 μg / ml streptomycin, 2 mM L-glutamine, 10 mM sodium pyruvate (complete culture medium).
1.2. Раствор версена стерильный.1.2. The versene solution is sterile.
1.3. Раствор трипсина стерильный.1.3. Trypsin solution is sterile.
1.4. Раствор градиента плотности фиколл-верографин.1.4. Ficoll-Verographin Density Gradient Solution.
1.5. Раствор Хенкса стерильный.1.5. Hanks solution is sterile.
2. Подготовка необходимых материалов.2. Preparation of the necessary materials.
2.1. Планшет 96-луночный, стерильный, с крышкой, прозрачный, круглодонный.2.1. The tablet is 96-well, sterile, with a lid, transparent, round-bottom.
2.2. Флакон для культивирования прилипающих культур с вентилируемой синей крышкой 75 см2.2.2. Adhesive culture bottle with a ventilated blue cap 75 cm 2 .
2.3. Камера Горяева.2.3. Goryaev’s camera.
2.4. Стерильные наконечники на 5 мл.2.4. 5 ml sterile tips.
2.5. Одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема до 10 мкл, до 300 мкл, до 1000 мкл.2.5. Disposable tips for dispensers of variable volume up to 10 μl, up to 300 μl, up to 1000 μl.
2.6. Конические стерильные пробирки объемом 13 мл, 15 мл, 50 мл.2.6. Conical sterile tubes with a volume of 13 ml, 15 ml, 50 ml.
2.9. Раствор пропидия иодида 1 мкг/мл, приготовленный на PBS.2.9. A solution of
3. Подготовка необходимого оборудования:3. Preparation of necessary equipment:
3.1 Вертикальный ламинарно-потоковый шкаф.3.1 Vertical laminar flow cabinet.
3.2 Набор механических дозаторов переменного объема.3.2 A set of mechanical dispensers of variable volume.
3.3 Центрифуга.3.3 Centrifuge.
3.4 Термостат.3.4 Thermostat
3.5 Вортекс.3.5 Vortex.
3.6 Холодильник 6+2°C.3.6
3.7 CO2 инкубатор.3.7 CO2 incubator.
3.8 Проточный цитофлюориметр, оборудованный 488 нм лазером, датчиками прямого и бокового светорассеяния, датчиками учета флюоресценции FITC (519 нм), РЕ (578 нм).3.8 Flow cytometer, equipped with a 488 nm laser, direct and side light scattering sensors, FITC fluorescence sensors (519 nm), PE (578 nm).
II. Культивирование клеток трофобласта линии Jeg-3.II. Cultivation of trophoblast cells of the Jeg-3 line.
Порядок работы.Operating procedure.
1. До начала процедуры прогреть стерильные контейнеры со средой для культивирования клеток трофобласта, стерильным раствором трипсина и стерильным раствором версена при температуре 37°C.1. Before starting the procedure, warm sterile containers with medium for culturing trophoblast cells, a sterile trypsin solution and a sterile versen solution at a temperature of 37 ° C.
2. Все необходимые материалы, перечисленные в разделе I (п. 1-2), внести стерильно в вертикальный ламинарно-потоковый шкаф для работы с клеточными культурами.2. All the necessary materials listed in Section I (paragraph 1-2) should be sterilized in a vertical laminar-flow cabinet for working with cell cultures.
3. Смешать стерильно раствор трипсина с раствором версена (ТВ), содержащий равные части раствора трипсина и раствора версена.3. Mix sterile trypsin solution with versene solution (TB) containing equal parts of trypsin solution and versene solution.
4. Аккуратно слить старую среду из флакона 75 см2 для культивирования с клетками трофобласта, добавить 5 мл стерильного раствора ТВ, чтобы дезинтегрировать монослой клеток. Подождать 30 секунд, аккуратно потрясти флакон и слить раствор ТВ. Повторить операцию 2 раза, затем добавить две капли раствора ТВ. Закрыть крышку флакона. Покачивать флакон в течение 5 минут так, чтобы клетки все время омывались раствором. Похлопать флакон по бокам, чтобы снять клетки со стенок флакона.4. Carefully drain the old medium from a 75 cm 2 vial for cultivation with trophoblast cells, add 5 ml of sterile TB solution to disintegrate the cell monolayer. Wait 30 seconds, gently shake the bottle and drain the TV solution. Repeat the
5. Добавить 5 мл ранее приготовленной среды для клеток трофобласта в флакон 75 см2.5. Add 5 ml of previously prepared medium for trophoblast cells to a 75 cm 2 vial.
6. Тщательно ресуспендировать. Перенести 700 мкл среды с клетками в новый флакон 75 см2 и долить в него 10 мл среды для культивирования.6. Carefully resuspend. Transfer 700 μl of cell medium to a new 75 cm 2 vial and add 10 ml of culture medium to it.
7. Культивировать клеточную культуру во влажной атмосфере с 7% CO2 при 37°C в течение 72 часов или до образования клетками 2/3 монослоя.7. Cultivate the cell culture in a humid atmosphere with 7% CO2 at 37 ° C for 72 hours or until the cells form 2/3 of the monolayer.
III. Выделение мононуклеаров из периферической крови.III. Isolation of mononuclear cells from peripheral blood.
1. Все необходимые материалы, перечисленные в разделе I (п. 1-2), внести стерильно в вертикальный ламинарно-потоковый шкаф для работы с клеточными культурами.1. All the necessary materials listed in section I (paragraph 1-2) should be sterilized in a vertical laminar-flow cabinet for working with cell cultures.
2. Подогреть раствор Хенкса и раствор градиента плотности фиколл-верографин в термостате 37°C.2. Heat a Hanks solution and a density gradient solution of ficoll-verographin in a 37 ° C thermostat.
3. Подписать и внести в ламинар (из расчета на анализ 1 пациента): 1 пробирку на 50 мл, 3 пробирки на 13 мл, 1 пробирку на 15 мл.3. Sign and add to the laminar (based on the analysis of 1 patient): 1 test tube per 50 ml, 3 test tubes per 13 ml, 1 test tube per 15 ml.
4. Внести в пробирки на 13 мл по 4 мл раствора градиента. В пробирки на 50 мл внести по 12 мл Хенкса, в пробирки для отмывки мононуклеаров внести по 10 мл Хенкса.4. Add 4 ml of gradient solution to 13 ml tubes. Add 50 ml of Hanks to 50 ml tubes; add 10 ml of Hanks to tubes for washing mononuclear cells.
5. Смешать 6 мл периферической крови с теплым раствором Хенкса в соотношении 1:2.5.
6. Пипеткой на 1 мл аккуратно наслоить разведенную раствором Хенкса периферическую кровь на раствор градиента из расчета на 4 мл градиента по 6 мл разведенной крови.6. Using a 1 ml pipette, carefully lay the peripheral blood diluted with Hanks solution onto a gradient solution based on a 4 ml gradient of 6 ml diluted blood.
7. Центрифугировать 400 g в течение 30 мин при 22°C.7. Centrifuge 400 g for 30 min at 22 ° C.
8. Стерильно внести пробирки в ламинарно-потоковый шкаф. Отобрать 4-5 мл плазмы пипеткой на 1 мл и слить ее. Собрать кольцо мононуклеаров.8. Sterilize the tubes in the laminar-flow cabinet. Take 4-5 ml of plasma with a 1 ml pipette and drain it. Assemble the mononuclear ring.
9. Перенести мононуклеары в пробирку с 10 мл раствора Хенкса.9. Transfer the mononuclear cells into a test tube with 10 ml of Hanks solution.
10. Центрифугировать 200 g в течение 10 мин при 22°C.10. Centrifuge 200 g for 10 min at 22 ° C.
11. Аккуратно слить надосадочную жидкость, добавить к мононуклеарам 3 мл раствора Хенкса, ресуспендировать.11. Carefully drain the supernatant, add 3 ml of Hanks solution to the mononuclear cells, resuspend.
12. Посчитать концентрацию мононуклеаров в камере Горяева. Добавить 10 мл раствора Хенкса.12. Calculate the concentration of mononuclear cells in the Goryaev chamber. Add 10 ml of Hanks solution.
13. Центрифугировать 200 g в течение 10 мин при 22°C.13. Centrifuge 200 g for 10 min at 22 ° C.
14. Аккуратно слить надосадочную жидкость. Развести клетки в культуральной среде на основе DMEM до концентрации 3 млн/мл.14. Carefully drain the supernatant. Dilute cells in a DMEM-based culture medium to a concentration of 3 ppm.
15. Перенести по 100 мкл клеток в лунки круглодонных планшетов.15.
IV. Проведение эксперимента.IV. Conducting an experiment.
1. Подогреть культуральную среду DMEM, полную культуральную среду для клеток трофобласта линии JEG-3, раствор ТВ в термостате 37°C.1. Heat the culture medium DMEM, the complete culture medium for trophoblast cells of the JEG-3 line, a solution of TB in a 37 ° C thermostat.
2. Все необходимые материалы, перечисленные в разделе I (п. 1-2), внести стерильно в вертикальный ламинарно-потоковый шкаф для работы с клеточными культурами.2. All the necessary materials listed in Section I (paragraph 1-2) should be sterilized in a vertical laminar-flow cabinet for working with cell cultures.
3. Развести в 5 мл теплой культуральной среды DMEM 4 мкл КФДЭ (стоковый раствор: 4,48 ммоль/л) и ресуспендировать.3. Dilute 4 μl of CPDE (stock solution: 4.48 mmol / L) in 5 ml of warm DMEM culture medium and resuspend.
4. Аккуратно слить старую среду из флакона для культивирования с клетками трофобласта, добавить 5 мл стерильного раствора культуральной среды DMEM, слить среду. Повторно добавить 5 мл стерильного раствора культуральной среды DMEM, слить среду. Внести раствор красителя КФДЭ.4. Carefully drain the old medium from the culture vial with the trophoblast cells, add 5 ml of a sterile solution of DMEM culture medium, and drain the medium. Re-add 5 ml of a sterile solution of DMEM culture medium, drain the medium. Add a solution of dye KFDE.
5. Инкубировать в течение 10 мин при 37°C, 7% CO2.5. Incubate for 10 min at 37 ° C, 7% CO 2 .
6. Слить раствор красителя, внести 10 мл холодной культуральной среды DMEM.6. Drain the dye solution, add 10 ml of cold DMEM culture medium.
7. Повторить отмывку: слить раствор холодной культуральной среды и повторно внести 10 мл холодной культуральной среды DMEM.7. Repeat washing: drain the solution of the cold culture medium and re-add 10 ml of cold DMEM culture medium.
8. Слить раствор культуральной среды.8. Drain the culture medium solution.
9. Добавить во флакон для культивирования клеток трофобласта 5 мл стерильного раствора ТВ, чтобы дезинтегрировать монослой клеток. Подождать 30 секунд, аккуратно потрясти флакон и слить раствор ТВ. Повторить операцию 2 раза, затем добавить две капли раствора ТВ. Закрыть крышку флакона. Покачивать флакон в течение 5 минут так, чтобы клетки все время омывались раствором.9. Add 5 ml of sterile TB solution to the trophoblast cell culture vial to disintegrate the cell monolayer. Wait 30 seconds, gently shake the bottle and drain the TV solution. Repeat the
10. Внести 2 мл теплой среды для клеток трофобласта.10. Dispense 2 ml of warm trophoblast cell medium.
11. Аккуратно смыть клетки со стенок флакона струей среды.11. Gently flush cells from the walls of the vial with a stream of medium.
12. Посчитать концентрацию клеток в камере Горяева. Развести клетки в полной культуральной среде для клеток трофобласта линии JEG-3 до концентрации 0,6 млн/мл.12. Calculate the concentration of cells in the Goryaev chamber. Dilute cells in a complete culture medium for trophoblast cells of the JEG-3 line to a concentration of 0.6 ppm.
13. Перенести по 50 мкл клеток в планшет с предварительно засеянными мононуклеарами периферической крови, ресуспендировать. Внести в 4 лунки без мононуклеаров по 150 мкл клеток JEG-3.13.
14. Центрифугировать планшет при 100 g в течение 3 мин при 22°C.14. Centrifuge the plate at 100 g for 3 min at 22 ° C.
15. Инкубировать пробы в течение 4 часов при 37°C, 5% СО2.15. Incubate samples for 4 hours at 37 ° C, 5% CO 2 .
16. Обработать пробы раствором пропидий иодида. Конечная концентрация пропидия иодида должна составлять 2 мкг/мл. Оставить неокрашенной 1 пробу с клетками JEG-3.16. Treat samples with a solution of propidium iodide. The final concentration of propidium iodide should be 2 μg / ml. Leave unpainted 1 sample with JEG-3 cells.
17. Инкубировать пробы 20 минут при 4°C.17. Incubate samples for 20 minutes at 4 ° C.
18. Добавить в пробы по 300 мкл стандартного фосфатно-солевого буфера.18. Add 300 μl of standard phosphate buffered saline to the samples.
V. Проведение анализа и учет результатов.V. Analysis and recording of results.
Анализ клеток проводят на проточном цитофлюориметре, оборудованном 488 нм лазером, по четырем параметрам: интенсивности прямого и бокового светорассеяния, флуоресценции по каналу FITC (спектр поглощения 488 нм, спектр эмиссии 519 нм), флуоресценции по каналу РЕ (спектр поглощения 488 нм, спектр эмиссии 578 нм). В пробе с необработанными КФДЭ и красителем пропидий иодида анализируют 10000 событий. На двумерной гистограмме с координатами FSC-SSC выделяют регион Cells, содержащий клетки трофобласта (фиг. 1а). Клетки из региона Cells проецируют на двумерную гистограмму с координатами FSC-FITC (фиг. 1б). Границу квадрантов на графике устанавливают на основании измерения контрольной пробы, необработанной раствором КФДЭ (фиг. 1б). При измерении опытной пробы, обработанной раствором КФДЭ, клетки из региона Cells (фиг. 2а) проецируют на двумерную гистограмму с координатами FSC-FITC. Анализируют 3000 событий в квадранте Jeg-3 (фиг. 2б), данное количество соответствует количеству клеток трофобласта. Затем события из квадранта Jeg-3 проецируют на двумерную гистограмму с координатами FSC-PE. Границу квадрантов на графике устанавливают на основании измерения контрольной пробы, необработанной раствором пропидия иодида (фиг. 2в). При измерении пробы, обработанной растворами КФДЭ и пропидия иодида, на двумерной гистограмме с координатами FSC-PE анализируют относительное количество погибших клеток трофобласта линии Jeg-3 (клетки из квадранта Jeg-3, обработанные красителем пропидия иодида) (базовая гибель клеток трофобласта) (фиг. 3а-г). Минимальное число повторов (лунок) для определения базовой гибели клеток трофобласта составляет 4. Регион Dead cells содержит клетки трофобласта, обработанные раствором пропидия иодида. Количество событий в квадранте Dead cells соответствует нежизнеспособным клеткам трофобласта. На фиг. 3 представлено 4 результата измерения базовой гибели клеток трофобласта (фиг. 3а-г). Процент нежизнеспособных клеток трофобласта, представленный на рисунке соответствует отношению количества клеток трофобласта, обработанных раствором пропидий иодида к общему количеству клеток трофобласта, измеренных в конкретной пробе, и соответствует соотношению Хн/Хобщ в формуле. Гибель клеток в контрольных лунках (после инкубации клеток трофобласта без мононуклеаров периферической крови) не должна превышать 30%.Cell analysis is carried out on a flow cytometer equipped with a 488 nm laser, according to four parameters: direct and side light scattering intensities, FITC fluorescence (absorption spectrum 488 nm, 519 nm emission spectrum), fluorescence through PE channel (absorption spectrum 488 nm, emission spectrum 578 nm). In a sample with untreated CPDE and a propidium iodide dye, 10,000 events are analyzed. In the two-dimensional histogram with FSC-SSC coordinates, the Cells region containing trophoblast cells is isolated (Fig. 1a). Cells from the Cells region project onto a two-dimensional histogram with FSC-FITC coordinates (Fig. 1b). The border of the quadrants on the graph is set based on the measurement of the control sample, the untreated solution of KFDE (Fig. 1B). When measuring a test sample treated with CPED solution, cells from the Cells region (Fig. 2a) project onto a two-dimensional histogram with FSC-FITC coordinates. 3000 events are analyzed in the Jeg-3 quadrant (Fig. 2b), this number corresponds to the number of trophoblast cells. Then, events from the Jeg-3 quadrant are projected onto a two-dimensional histogram with FSC-PE coordinates. The border of the quadrants on the graph is set based on the measurement of the control sample, the untreated solution of propidium iodide (Fig. 2B). When measuring a sample treated with solutions of CPDE and propidium iodide, the relative number of dead trophoblast cells of the Jeg-3 line (cells from the Jeg-3 quadrant treated with the propidium iodide dye) (basic trophoblast cell death) is analyzed on a two-dimensional histogram with FSC-PE coordinates (Fig. . 3a-d). The minimum number of repeats (holes) for determining the basic death of trophoblast cells is 4. The Dead cells region contains trophoblast cells treated with a solution of propidium iodide. The number of events in the Dead cells quadrant corresponds to non-viable trophoblast cells. In FIG. 3
Затем проводят учет количества событий в квадранте Dead cells после инкубации клеток трофобласта с мононуклеарами периферической крови при (фиг. 4, а-е). По количеству событий в квадрантах Dead cells определяют процент нежизнеспособных клеток трофобласта. Процент нежизнеспособных клеток трофобласта, представленный на фиг. 4 соответствует отношению количества клеток трофобласта, окрашенных раствором пропидия иодида к общему количеству клеток трофобласта, измеренных в конкретной пробе, и соответствует соотношению Yн/Yобщ в формуле. Повторов (лунок) должно быть не менее 4 для оценки цитотоксической активности NK-клеток.Then, the number of events is recorded in the Dead cells quadrant after incubation of trophoblast cells with peripheral blood mononuclear cells at (Fig. 4, a-e). The percentage of non-viable trophoblast cells is determined by the number of events in the quadrants of Dead cells. The percentage of non-viable trophoblast cells shown in FIG. 4 corresponds to the ratio of the number of trophoblast cells stained with a solution of propidium iodide to the total number of trophoblast cells measured in a particular sample, and corresponds to the ratio Y n / Y total in the formula. Repeats (holes) should be at least 4 to assess the cytotoxic activity of NK cells.
Затем вычисляют среднюю базовую гибель клеток трофобласта при инкубации в отсутствие мононуклеаров в эксперименте по формулеThen calculate the average base death of trophoblast cells during incubation in the absence of mononuclear cells in an experiment according to the formula
СБГэксп={(Хн/Хобщ)1+(Хн/Хобщ)2+…+{(Хн/Хобщ)n}*100%/n, гдеSBGEXP = {(X n / X total ) 1 + (X n / X total ) 2 + ... + {(X n / X total ) n } * 100% / n, where
СБГэксп - средняя базовая гибель клеток трофобласта в каждом эксперименте (%);SBHexp — average basal trophoblast cell death in each experiment (%);
Хн - количество нежизнеспособных клеток трофобласта, инкубированных в культуральной среде без добавления мононуклеаров;X n - the number of non-viable trophoblast cells incubated in the culture medium without the addition of mononuclear cells;
Хобщ - общее количество клеток трофобласта, инкубированных в культуральной среде без добавления мононуклеаров;X total - the total number of trophoblast cells incubated in the culture medium without the addition of mononuclear cells;
n - количество повторов (лунок).n is the number of repetitions (holes).
Предварительно проводится оценка показателя общей базовой гибели клеток трофобласта при инкубации в отсутствие мононуклеаров по формулеA preliminary assessment of the indicator of the total basic death of trophoblast cells during incubation in the absence of mononuclear cells is carried out according to the formula
оБГ=(СБГэксп1+СБГэксп2+…+СБГэкспm)/m, гдеOBG = (SBGExp 1 + SBGExp 2 + ... + SBGExp m ) / m, where
оБГ - общая базовая гибель клеток трофобласта при инкубации в отсутствие мононуклеаров (%);OBG - the total basic death of trophoblast cells during incubation in the absence of mononuclear cells (%);
СБГэксп - средняя базовая гибель клеток трофобласта при инкубации в отсутствие мононуклеаров;SBHexp - the average basic death of trophoblast cells during incubation in the absence of mononuclear cells;
m - количество экспериментов (не менее 30 повторов).m is the number of experiments (at least 30 repetitions).
Показатель общей базовой гибели клеток трофобласта (оБГ) является общей характеристикой клеток трофобласта линии Jeg-3 в конкретных условиях культивирования. До постановки эксперимента по способу оценки риска невынашивания беременности у конкретной пациентки рекомендуется предварительно оценить показатель оБГ, с этой целью рекомендуется оценить СБГэксп не менее, чем в 30 повторах. В дальнейшем полученная величина принимается в качестве константной, в каждом эксперименте данный показатель вычислять не требуется. В данном исследовании оБГ составляет 26,4%.The indicator of the total basic death of trophoblast cells (OBH) is a general characteristic of trophoblast cells of the Jeg-3 line under specific cultivation conditions. Before setting up an experiment on a method for assessing the risk of miscarriage in a particular patient, it is recommended to preliminarily evaluate the OBH indicator, for this purpose it is recommended to evaluate SBHexp in at least 30 repetitions. Subsequently, the obtained value is taken as constant; in each experiment, this indicator is not required to be calculated. In this study, the OBH is 26.4%.
Затем вычисляют средний цитотоксический эффект NK-клеток фракции мононуклеаров периферической крови в отношении клеток трофобласта по формуле:Then calculate the average cytotoxic effect of NK cells of the peripheral blood mononuclear fraction in relation to trophoblast cells according to the formula:
СЦЭпац={(Yн/Yобщ)1+(Yн/Yобщ)2+…+(Yн/Yобщ)n}*100%/n, гдеSCECap = {(Yn / Ytotal) 1 + (Yn / Ytotal) 2 + ... + (Yn / Ytotal) n } * 100% / n, where
СЦЭпац - средний цитотоксический эффект NK-клеток в отношении клеток трофобласта (%);SCeapac - the average cytotoxic effect of NK cells in relation to trophoblast cells (%);
Yн - количество нежизнеспособных клеток трофобласта, инкубированных с мононуклеарами периферической крови в каждой лунке;Yн is the number of non-viable trophoblast cells incubated with peripheral blood mononuclear cells in each well;
Yобщ - общее количество клеток трофобласта, инкубированных с мононуклеарами периферической крови;Ytotal is the total number of trophoblast cells incubated with peripheral blood mononuclear cells;
n - количество повторов (лунок) (не менее 4 повторов).n is the number of repetitions (holes) (at least 4 repetitions).
Затем оценивают цитотоксический эффект NK-клеток пациента с учетом усредненных значений по формуле:Then assess the cytotoxic effect of NK cells of the patient, taking into account the average values according to the formula:
ЦЭпац=СЦЭпац-СБГэксп+оБГ, где:ЦЭпats = СЦЭпат-СБГекссп + оБГ, where:
ЦЭпац - цитотоксический эффект NK-клеток пациента, %;CEPac - cytotoxic effect of patient NK cells,%;
СЦЭпац - средний цитотоксический эффект NK-клеток в отношении клеток трофобласта;SCeapac - the average cytotoxic effect of NK cells in relation to trophoblast cells;
СБГэксп - средняя базовая гибель клеток трофобласта в каждом эксперименте;SBHexp - the average basic death of trophoblast cells in each experiment;
оБГ - общая базовая гибель клеток трофобластаOBG - total underlying trophoblast cell death
Делают вывод о риске невынашивания беременности для пациентки путем сравнения ЦЭпац с показателем ЦЭ для здоровых фертильных женщин в СФМЦ. Если значение ЦЭпац превышает предварительно определенное значение цитотоксической активности NK-клеток у здоровых фертильных женщин в секреторной фазе менструального цикла, оценивают высокий риск невынашивания беременности.A conclusion is drawn about the risk of miscarriage for the patient by comparing the CEPac with the CE indicator for healthy fertile women in the SPSC. If the CEEC value exceeds a predetermined value of the cytotoxic activity of NK cells in healthy fertile women in the secretory phase of the menstrual cycle, a high risk of miscarriage is assessed.
Способ иллюстрируется следующими клиническими примерами.The method is illustrated by the following clinical examples.
Пример 1. Пациентка 1, здоровая фертильная женщина в СФМЦ. Базовая гибель клеток трофобласта составила в четырех повторах 17,4%, 18,3%, 21,6%, 17,4%. Средняя базовая гибель составляет СБГэксп={(Хн/Хобщ)1+(Хн/Хобщ)2+(Хн/Хобщ)3+{(Хн/Хобщ)4}*100%/4=(17,4+18,3+21,6+17,4)/4=18,7%Example 1.
Затем вычисляют цитотоксический эффект NK-клеток: СЦЭпац1={(Yн/Yобщ)1+(Yн/Yобщ)2+(Yн/Yобщ)3+(Yн/Yобщ)4}*100%/4=(28,7+28,4+26,0+26,5)/4=27,4%Then, the cytotoxic effect of NK cells is calculated: SCEpac1 = {(Y n / Y total ) 1 + (Y n / Y total ) 2 + (Y n / Y total ) 3 + (Y n / Y total ) 4 } * 100% / 4 = (28.7 + 28.4 + 26.0 + 26.5) / 4 = 27.4%
Затем вычисляют общую базовую гибель клеток трофобласта в эксперименте. В данном исследовании оБГ составила 26,4%.Then calculate the total base death of trophoblast cells in the experiment. In this study, the OBG was 26.4%.
Затем усредняют показатели цитотоксического эффекта для пациента по формуле: ЦЭпац1=СЦЭпац1-СБГэксп+оБГ=27,4-18,7+26,4=35,1%.Then the indicators of the cytotoxic effect for the patient are averaged according to the formula: CEcac1 = SCECac1-SBHexp + oBG = 27.4-18.7 + 26.4 = 35.1%.
Полученный результат сравнивают с показателем ЦЭ для здоровых фертильных женщин с СФМЦ равным 36%. Делают вывод о благоприятном прогнозе наступления беременности.The result obtained is compared with the CE value for healthy fertile women with an SPMC of 36%. Make a conclusion about a favorable prognosis of pregnancy.
Пример 2. Пациентка 2, женщина с привычным невынашиванием беременности в СФМЦ. Базовая гибель клеток трофобласта составила в четырех повторах 19,3%, 20,4%, 19,0%, 20,1%. Средняя базовая гибель составляет: СБГэксп={(Хн/Хобщ)1+(Хн/Хобщ)2+(Хн/Хобщ)3+{(Хн/Хобщ)4}*100%/4=(19,3+20,4+19,0+20,1)/4=19,7%Example 2.
Затем вычисляют цитотоксический эффект NK-клеток: СЦЭпац2={(Yн/Yобщ)1+(Yн/Yобщ)2+(Yн/Yобщ)3+(Yн/Yобщ)4}*100%/4=(37,6+39,6+38,0+38,2)/4=38,4%Then calculate the cytotoxic effect of NK cells: SCeapac2 = {(Y n / Y total ) 1 + (Y n / Y total ) 2 + (Y n / Y total ) 3 + (Y n / Y total ) 4 } * 100% / 4 = (37.6 + 39.6 + 38.0 + 38.2) / 4 = 38.4%
Затем вычисляют общую базовую гибель клеток трофобласта в эксперименте. В данном исследовании оБГ составила 26,4%.Then calculate the total base death of trophoblast cells in the experiment. In this study, the OBG was 26.4%.
Затем усредняют показатели цитотоксического эффекта для пациента по формуле: ЦЭпац2=СЦЭпац2-СБГэксп+оБГ=38,4-19,7+26,4=45,1%Then the indicators of the cytotoxic effect for the patient are averaged according to the formula: CEcac2 = SCecac2-SBHexp + oBG = 38.4-19.7 + 26.4 = 45.1%
ЦЭ составил 45,1%, в данном случае показатель превышает нормальное значение (36% - показатель ЦЭ для здоровых фертильных женщин в СФМЦ), что свидетельствует о неблагоприятном прогнозе наступления беременности - высокий риск невынашивания беременности.The CE was 45.1%, in this case, the indicator exceeds the normal value (36% is the CE for healthy fertile women in the NFMC), which indicates an unfavorable prognosis of pregnancy - a high risk of miscarriage.
Предлагаемый способ расширяет арсенал средств по оценке риска невынашивания беременности у женщин с привычным невынашиванием и дает иммунологическую оценку этого риска.The proposed method expands the arsenal of tools for assessing the risk of miscarriage in women with habitual miscarriage and provides an immunological assessment of this risk.
Claims (19)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017112833A RU2657433C1 (en) | 2017-04-13 | 2017-04-13 | Method of assessing the risk of non-pregnancy in women with usual miscarriage |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017112833A RU2657433C1 (en) | 2017-04-13 | 2017-04-13 | Method of assessing the risk of non-pregnancy in women with usual miscarriage |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2657433C1 true RU2657433C1 (en) | 2018-06-13 |
Family
ID=62620323
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017112833A RU2657433C1 (en) | 2017-04-13 | 2017-04-13 | Method of assessing the risk of non-pregnancy in women with usual miscarriage |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2657433C1 (en) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2285926C2 (en) * | 2005-01-19 | 2006-10-20 | Уральский НИИ охраны материнства и младенчества | Method for predicting threatening miscarriage during early gestation period |
| RU2341799C1 (en) * | 2007-07-26 | 2008-12-20 | ФГУ Ростовский НИИ акушерства и педиатрии Федерального агентства по здравоохранению и социальному равитию | Method of miscarriage prediction associated with urogenital infection |
-
2017
- 2017-04-13 RU RU2017112833A patent/RU2657433C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2285926C2 (en) * | 2005-01-19 | 2006-10-20 | Уральский НИИ охраны материнства и младенчества | Method for predicting threatening miscarriage during early gestation period |
| RU2341799C1 (en) * | 2007-07-26 | 2008-12-20 | ФГУ Ростовский НИИ акушерства и педиатрии Федерального агентства по здравоохранению и социальному равитию | Method of miscarriage prediction associated with urogenital infection |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| JASLOW C.R. et al. Diagnostic factors identified in 1020 women with two versus three or more recurrent pregnancy losses // Fertility and sterility. 2010. Vol. 93. р. 1234-1243. * |
| JASLOW C.R. et al. Diagnostic factors identified in 1020 women with two versus three or more recurrent pregnancy losses // Fertility and sterility. 2010. Vol. 93. р. 1234-1243. ВИКНЯНЩУК А.Н. и др. "Клетки трофобласта подавляют пролиферативную активность NK-клеток при беременности". Журнал акушерства и женских болезней. ТОМ LXV. Спецвыпуск 2016, с. 78, 79. СТЕПАНОВА О.И. и др. "Влияние цитокинов на миграционную активность клеток трофобласта линии Jeg-3". Медицинский академический журнал. 2012. N 3, с. 92, 93. * |
| ВИКНЯНЩУК А.Н. и др. "Клетки трофобласта подавляют пролиферативную активность NK-клеток при беременности". Журнал акушерства и женских болезней. ТОМ LXV. Спецвыпуск 2016, с. 78, 79. * |
| СТЕПАНОВА О.И. и др. "Влияние цитокинов на миграционную активность клеток трофобласта линии Jeg-3". Медицинский академический журнал. 2012. N 3, с. 92, 93. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JE˛ DRZEJCZAK et al. | Consequences of semen inflammation and lipid peroxidation on fertilization capacity of spermatozoa in in vitro conditions | |
| Masuda et al. | Endometrial stem/progenitor cells in menstrual blood and peritoneal fluid of women with and without endometriosis | |
| Koopmans et al. | Chimerism occurs in thyroid, lung, skin and lymph nodes of women with sons | |
| Shaikly et al. | Analysis of HLA-G in maternal plasma, follicular fluid, and preimplantation embryos reveal an asymmetric pattern of expression | |
| AU2015317864A1 (en) | Identifying status of male fertility by determining sperm capacitation | |
| Xu et al. | Changes of human decidual natural killer cells cocultured with YFP-Toxoplasma gondii: implications for abnormal pregnancy | |
| Hey-Cunningham et al. | Circulating and endometrial regulatory T cell and related populations in endometriosis and infertility: Endometriosis is associated with blunting of endometrial cyclical effects and reduced proportions in moderate-severe disease | |
| Rodriguez-Garcia et al. | Isolation of dendritic cells from the human female reproductive tract for phenotypical and functional studies | |
| Kowal et al. | Identification of a clinical signature predictive of differentiation fate of human bone marrow stromal cells | |
| CN108152189B (en) | Quantitative detection method for sperm surface clouding protein 1 | |
| Fugazzola et al. | Fetal cell microchimerism in human cancers | |
| RU2657433C1 (en) | Method of assessing the risk of non-pregnancy in women with usual miscarriage | |
| Wu et al. | A comprehensive multiparameter flow cytometry panel for immune profiling and functional studies of frozen tissue, bone marrow, and spleen | |
| Lin et al. | Effects of cytomegalovirus infection on extravillous trophoblast cells invasion and immune function of NK cells at the maternal‐fetal interface | |
| Riedlova et al. | Differentiation of functional osteoclasts from human peripheral blood CD14+ monocytes | |
| JP6751104B2 (en) | Use of soluble CD146 as a biomarker for selecting in vitro fertilized embryos for implantation in mammals | |
| Hou et al. | The predictive value of NKG2C+ NK cells and LILRB1+ NK cells in recurrent spontaneous abortion | |
| Wolff et al. | Peripheral blood stem cell transplants do not result in endometrial stromal engraftment | |
| Cuadrado-Torroglosa et al. | Increased cytotoxic natural killer cells in the endometrium alone cannot be considered the immunological cause of recurrent miscarriage | |
| CN110361534B (en) | Chemical markers for evaluating embryo and predicting success rate of in vitro fertilization and application thereof | |
| Shams et al. | The satellite cell colony forming cell assay as a tool to measure self-renewal and differentiation potential | |
| RU2768461C1 (en) | Method for assessing the cytoprotective effect of immunoglobulin preparations for intravenous introduction on trophoblast cells under conditions of their interaction with natural killers | |
| Norozi-Hafshejani et al. | MACS-DGC versus DGC sperm wash procedure: comparing clinical outcomes in couples with male factor infertility undergoing ICSI: a clinical trial study | |
| Maini et al. | Monocyte and neutrophil isolation, migration, and phagocytosis assays | |
| Kitamura | Flow of CD11b+ cytometric Gr-1+ detection cells in nontumor-bearing mice: A propolis-elicited model |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20190414 |