RU2647834C2 - Fluorescent method for chemotherapy efficiency prediction in children with acute lymphoblastic leukemia - Google Patents
Fluorescent method for chemotherapy efficiency prediction in children with acute lymphoblastic leukemia Download PDFInfo
- Publication number
- RU2647834C2 RU2647834C2 RU2016124210A RU2016124210A RU2647834C2 RU 2647834 C2 RU2647834 C2 RU 2647834C2 RU 2016124210 A RU2016124210 A RU 2016124210A RU 2016124210 A RU2016124210 A RU 2016124210A RU 2647834 C2 RU2647834 C2 RU 2647834C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- chemotherapy
- atp
- concentration
- children
- biomarker
- Prior art date
Links
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 title claims abstract description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 22
- 208000024893 Acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 title claims abstract description 10
- 208000014697 Acute lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 title claims abstract description 8
- 208000006664 Precursor Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 title claims abstract description 8
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 30
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J ATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J 0.000 claims abstract description 29
- 206010019851 Hepatotoxicity Diseases 0.000 claims abstract description 8
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 claims abstract description 8
- 231100000334 hepatotoxic Toxicity 0.000 claims abstract description 4
- 230000003082 hepatotoxic effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 claims abstract description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 4
- 230000030833 cell death Effects 0.000 claims 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 abstract description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 4
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 abstract description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 2
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 abstract description 2
- 238000000053 physical method Methods 0.000 abstract description 2
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 20
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 5
- 102100036475 Alanine aminotransferase 1 Human genes 0.000 description 4
- 108010082126 Alanine transaminase Proteins 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 4
- 231100000304 hepatotoxicity Toxicity 0.000 description 4
- 230000007686 hepatotoxicity Effects 0.000 description 4
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000599862 Homo sapiens Intercellular adhesion molecule 3 Proteins 0.000 description 3
- 102100037871 Intercellular adhesion molecule 3 Human genes 0.000 description 3
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 3
- 238000004624 confocal microscopy Methods 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 3
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 3
- 108010003415 Aspartate Aminotransferases Proteins 0.000 description 2
- 102000004625 Aspartate Aminotransferases Human genes 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000009534 blood test Methods 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000035572 chemosensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 239000000824 cytostatic agent Substances 0.000 description 1
- 230000001085 cytostatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 235000013861 fat-free Nutrition 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000013394 immunophenotyping Methods 0.000 description 1
- 230000016507 interphase Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- AYEKOFBPNLCAJY-UHFFFAOYSA-O thiamine pyrophosphate Chemical compound CC1=C(CCOP(O)(=O)OP(O)(O)=O)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N AYEKOFBPNLCAJY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Hematology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области биофизики, а именно к медицинской физики, и описывает способ прогнозирования эффективности химиотерапии у детей, больных острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ), в частности прогнозирования рисков возникновения лекарственной резистентности при проведении химиотерапии у пациентов с ОЛЛ с помощью исследования свойств биологических жидкостей физическими методами. Способ включает в себя определение и оценку количественных уровней концентрации аденозинтрифосфата (АТФ), в клетках крови, методом лазерной конфокальной микроскопии, после получения курса химиотерапии пациентом. Изобретение может быть использовано в онкологии, в клинической лабораторной практике для индивидуального прогнозирования эффективности химиотерапии при лечении острых лимфобластных лейкозов у детей.The invention relates to the field of biophysics, namely to medical physics, and describes a method for predicting the effectiveness of chemotherapy in children with acute lymphoblastic leukemia (ALL), in particular predicting the risks of drug resistance during chemotherapy in patients with ALL by studying the properties of biological fluids by physical methods. The method includes determining and evaluating quantitative levels of adenosine triphosphate (ATP) concentration in blood cells by laser confocal microscopy after receiving a course of chemotherapy by a patient. The invention can be used in oncology, in clinical laboratory practice for individual prediction of the effectiveness of chemotherapy in the treatment of acute lymphoblastic leukemia in children.
Известно изобретение «Способ прогнозирования эффективности химиотерапии у больных со злокачественными новообразованиями эпителиальных тканей» (патент РФ №2542505, 2013 г., G01N 33/49), содержащее сходный с используемым в заявленном способе принцип выбора молекулярных маркеров химиочувствительности новообразований.The invention is known "A method for predicting the effectiveness of chemotherapy in patients with malignant neoplasms of epithelial tissues" (RF patent No. 2542505, 2013, G01N 33/49), containing a principle similar to that used in the claimed method of choosing molecular markers of chemosensitivity of tumors.
Недостатком этого способа является то, что с его помощью не представляется возможным производить работу с флуоресцентными маркерами, а именно обеспечивать их использование для определения концентраций АТФ в клетках крови, и, как следствие, производить оценку степени гепатотоксических эффектов и степени лекарственной резистентности, необходимых для индивидуализации химиотерапии (и ее эффективности) у пациентов.The disadvantage of this method is that with its help it is not possible to work with fluorescent markers, namely, to ensure their use for determining the concentration of ATP in blood cells, and, as a result, to assess the degree of hepatotoxic effects and the degree of drug resistance required for individualization chemotherapy (and its effectiveness) in patients.
За прототип изобретения выбран способ прогнозирования эффективности химиотерапии у больных со злокачественными опухолями эпителиальных тканей, включающий в себя исследование крови до и после лечения с количественным определением содержания CD50+ антигена (Алясова А.В. Клинико-неврологические и клинико-иммунологические характеристики рака молочной железы: Автореферат диссертации д.м.н., Иваново, 2004, 43 с.).For the prototype of the invention, a method for predicting the effectiveness of chemotherapy in patients with malignant tumors of epithelial tissues was selected, which includes a blood test before and after treatment with a quantitative determination of the content of CD50 + antigen (Alyasova A.V. Clinical and neurological and clinical and immunological characteristics of breast cancer: Abstract of the dissertation MD, Ivanovo, 2004, 43 pp.).
Иммунофенотипирование мононуклеарных клеток периферической крови проводят с помощью метода непрямой иммунофлуоресценции. Для выделения мононуклеарных клеток периферической крови гепаринизированную кровь, разведенную на 1/3 средой 199, наслаивают на градиент фиколл-верографина (9 объемов крови на 3 объема градиента) и центрифугируют при 1700 об/мин в течение 40 минут при 20°C. Мононуклеарные клетки собирают из интерфазы, а затем трижды отмывают средой 199. При этом центрифугируют в течение 20 минут при 1200 об/мин.Immunophenotyping of peripheral blood mononuclear cells is carried out using the indirect immunofluorescence method. To isolate peripheral blood mononuclear cells, heparinized blood diluted 1/3 with medium 199 is layered on a ficoll-verographin gradient (9 blood volumes per 3 gradient volumes) and centrifuged at 1700 rpm for 40 minutes at 20 ° C. Mononuclear cells are harvested from interphase and then washed three times with 199 medium. At the same time, they are centrifuged for 20 minutes at 1200 rpm.
На обезжиренное предметное стекло, предварительно покрытое парафилмом фирмы American Can Company, имеющим круглые перфорации диаметром 7 мм, наносят по 20-50 мкл поли-L-лизина Serva в концентрации 50 мкг/мл. Предметное стекло помещают на 30 минут в термостат при температуре 37°C. Затем его отмывают физиологическим раствором, забуференным 0,01 молярным фосфатным буфером pH 7,4. Суспензию клеток в концентрации 2-106 кл/мл наносят по 40 мкл в лунки на предметное стекло. Предметное стекло выдерживают 30 минут при 37°C во влажной камере. Затем не прикрепившиеся к стеклу клетки отсасывают пипеткой и наносят в лунки раствор моноклональных антител (МКА) объемом 40 мкл. В контрольных образцах клетки обрабатывают физиологическим раствором взамен МКА.A 20-50 μl Serva poly-L-lysine at a concentration of 50 μg / ml is applied to a fat-free glass slide, previously coated with paraffilim of the American Can Company, having round perforations with a diameter of 7 mm. A slide is placed for 30 minutes in a thermostat at 37 ° C. Then it is washed with physiological saline, buffered with 0.01 molar phosphate buffer pH 7.4. A suspension of cells at a concentration of 2-10 6 cells / ml is applied to 40 μl per well on a glass slide. A slide is held for 30 minutes at 37 ° C in a humid chamber. Then the cells that are not attached to the glass are aspirated with a pipette and a solution of monoclonal antibodies (MCA) of 40 μl is applied to the wells. In control samples, cells are treated with saline instead of MCA.
Вновь инкубируют стекла при 37°C во влажной камере в течение 30 минут, после чего отмывают их в пяти порциях физиологического раствора с фосфатным буфером pH 7,4. На отмытые клетки наслаивают по 40 мкл ФИТЦ-меченных фрагментов козьих антител против мышиных иммуноглобулинов производства НПК Препарат и стекла инкубируют на льду во влажной камере в течение 30 минут. Затем стекла промывают в пяти порциях физиологического раствора с фосфатным буфером pH 7,4, заливают 50%-ным глицерином в физиологическом растворе и препарат закрывают предметными стеклами. Просмотр препаратов проводят с помощью люминесцентного микроскопа ЛЮМАМ-И2. Учитывают свечение при увеличении объектива × 40-100, окуляра × 2,5-10. Люминесценцию клеточной поверхности регистрируют визуально. В препарате просчитывали 200-300 клеток. Учитывают общее количество клеток и антиген-положительных клеток. Затем подсчитывают относительное содержание антиген-положительных клеток.The glasses were again incubated at 37 ° C in a humid chamber for 30 minutes, after which they were washed in five portions of physiological saline with phosphate buffer pH 7.4. 40 μl of FITC-labeled goat antibody fragments against mouse immunoglobulins produced by NPK are layered onto washed cells. The preparation and glasses are incubated on ice in a humid chamber for 30 minutes. Then the glasses are washed in five portions of physiological saline with phosphate buffer pH 7.4, pour 50% glycerol in saline and the drug is closed with glass slides. Viewing drugs is carried out using a luminescent microscope LUMAM-I2. Take into account the glow with an increase in the lens × 40-100, eyepiece × 2.5-10. Cell surface luminescence is recorded visually. 200-300 cells were counted in the preparation. Take into account the total number of cells and antigen-positive cells. Then calculate the relative content of antigen-positive cells.
В результате проведенных исследований было показано, что изменение содержания CD50+ клеток является устойчивым признаком, позволяющим прогнозировать исход заболевания. Снижение уровня этой популяции по окончании лечения не менее чем в 1,2-1,6 раза, по сравнению с ее содержанием перед 1 курсом ПХТ, особенно на фоне угнетения иммунологической реактивности, свидетельствует о неэффективности проводимой терапии, возможности развития рецидива заболевания в ближайшие 4-5 месяцев или прогрессирования процесса на фоне введения цитостатиков. Напротив, в случаях повышения в процессе лечения исходно сниженного количества CD50+ клеток отмечалось развитие стойкой ремиссии болезни.As a result of the studies, it was shown that a change in the content of CD50 + cells is a stable sign that allows to predict the outcome of the disease. A decrease in the level of this population at the end of treatment by at least 1.2-1.6 times, compared with its content before the first course of PCT, especially against the background of suppression of immunological reactivity, indicates the ineffectiveness of the therapy, the possibility of a relapse in the next 4 -5 months or the progression of the process against the background of the introduction of cytostatics. On the contrary, in cases of an increase in the treatment process of the initially reduced number of CD50 + cells, the development of persistent remission of the disease was noted.
Несовершенство этого способа заключается в недостаточной его автоматизации, а именно ручной подсчет клеток и антиген-положительных клеток, что может приводить к ошибкам. Другим недостатком способа является невозможность непосредственного мониторинга рисков возникновения гепатотоксичности и лекарственной резистентности у пациентов.The imperfection of this method lies in its insufficient automation, namely, manual counting of cells and antigen-positive cells, which can lead to errors. Another disadvantage of this method is the inability to directly monitor the risks of hepatotoxicity and drug resistance in patients.
Задачей предлагаемого изобретения является создание флуоресцентного способа для прогнозирования эффективности химиотерапии у больных с острыми лимфобластными лейкозами, обладающего высокой степенью автоматизации ключевых этапов эксперимента, а также обеспечение возможности непосредственного мониторинга рисков возникновения гепатотоксичности и лекарственной резистентности у пациентов.The objective of the invention is to create a fluorescent method for predicting the effectiveness of chemotherapy in patients with acute lymphoblastic leukemia, with a high degree of automation of key stages of the experiment, as well as providing the ability to directly monitor the risks of hepatotoxicity and drug resistance in patients.
Поставленная задача решается тем, что во флуоресцентном способе для прогнозирования эффективности химиотерапии у детей, больных острым лимфобластным лейкозом, при котором производится забор крови до и после химиотерапии, выделяется флуоресцентный макро-биомаркер эффективности химиотерапии, согласно изобретению, макро-биомаркером является концентрация аденозинтрифосфата, определяемая автоматизировано, с помощью лазерного конфокального микроскопа, путем подсчета интенсивности флуоресценции макро-биомаркера для непосредственного мониторинга рисков возникновения гепатотоксичности и лекарственной резистентности у пациентов.The problem is solved in that in the fluorescent method for predicting the effectiveness of chemotherapy in children with acute lymphoblastic leukemia, in which blood is taken before and after chemotherapy, a fluorescent macro-biomarker of the effectiveness of chemotherapy is released, according to the invention, the concentration of adenosine triphosphate is determined as a macro-biomarker automated, using a laser confocal microscope, by counting the fluorescence intensity of a macro-biomarker for direct monitoring the risks of hepatotoxicity and drug resistance in patients.
Заявленный способ основан на использовании определения концентрации АТФ методом лазерной конфокальной микроскопии, который начинается с обработки образца после формирования кровяного сгустка (не ранее чем через 30 минут и не более 3 часов после забора). Далее осуществляется центрифугирование на скоростях 1500 об/мин в течение 10 минут, 2000 об/мин в течение 10 минут и 3000 об/мин в течение 7,5 минут. Максимальное разделение сыворотки и клеточного осадка наблюдают при режиме центрифугирования 2000 об/мин в течение 10 минут при комнатной температуре.The claimed method is based on the use of determining the concentration of ATP by laser confocal microscopy, which begins with the processing of the sample after the formation of a blood clot (not earlier than 30 minutes and no more than 3 hours after collection). Next, centrifugation is carried out at speeds of 1500 rpm for 10 minutes, 2000 rpm for 10 minutes and 3000 rpm for 7.5 minutes. The maximum separation of serum and cell pellet was observed with a centrifugation mode of 2000 rpm for 10 minutes at room temperature.
Далее сыворотка отбирается по 1 мл в криовиалы объемом (1,8-2,0) мл. Пробы хранят в штативах с крышками, при -20°C, -40°C, -60°C, -80°C до выполнения анализа. При температуре -80°C количество жизнеспособных мононуклеарных клеток превышало должно быть не меньше 25 млн. Для длительного хранения и коллекционирования образцов выбирается температурный режим -80°C. Для реализации способа проводят выделение мононуклеарных клеток и их подготовку для конфокальной микроскопии.Then, 1 ml of serum is taken into cryovials with a volume of (1.8-2.0) ml. Samples are stored in tripods with covers at -20 ° C, -40 ° C, -60 ° C, -80 ° C until analysis. At a temperature of -80 ° C, the number of viable mononuclear cells exceeded should be at least 25 million. For long-term storage and collection of samples, the temperature regime of -80 ° C is chosen. To implement the method, mononuclear cells are isolated and prepared for confocal microscopy.
Обработку предварительно подготовленных образцов начинают после их размораживания в течение 30 минут при комнатной температуре. В ламинарном шкафу, при помощи 0,5 мл и 1 мл механических пипеток переносят образцы периферической крови в маркированные пробирки типа Фалькон объемом 10 мл. Пробу разводят стерильным 0,2 молярным фосфатно-солевым буфером (ФСБ) из расчета 5:1. Значение pH буфера составляло 7,8 ед. Далее центрифугируют образцы на скорости 4000 оборотов в минуту в течение 10 минут при температуре 4°C. Аккуратно удаляют жидкую фазу механической пипеткой и добавляли 5 мл ФСБ к осадку. Также используют механическую пипетку объемом 1 мл, разводят осадок в ФСБ и доливают ФСБ до 5 мл, далее перемешивают. Затем повторяют процедуру отмывки (центрифугирования образца, удаления жидкой фазы, добавления буфера) при указанных выше параметрах еще 2 раза.The processing of pre-prepared samples begins after thawing them for 30 minutes at room temperature. In a laminar cabinet, peripheral blood samples are transferred using 0.5 ml and 1 ml mechanical pipettes to labeled 10 ml Falcon tubes. The sample is diluted with sterile 0.2 molar phosphate-buffered saline (FSB) at a rate of 5: 1. The pH of the buffer was 7.8 units. Next, the samples are centrifuged at a speed of 4000 rpm for 10 minutes at a temperature of 4 ° C. The liquid phase was carefully removed with a mechanical pipette and 5 ml of PBS was added to the precipitate. A 1 ml mechanical pipette was also used, the precipitate was diluted in PBS and the PBS was added to 5 ml, then mixed. Then repeat the washing procedure (centrifuging the sample, removing the liquid phase, adding buffer) with the above parameters 2 more times.
После проводят лизирование образцов в течение двух часов при температуре -80°C. Далее пробу размораживают при комнатной температуре, добавляют до 5 мл ФСБ и центрифугируют на скорости 4000 об/мин в течение 4 минут при комнатной температуре 4°C. Жидкую фазу удаляют пипеткой. Для наблюдения внутриклеточного АТФ используют ATP Bioluminescent Assay Kit (BAK), используемый для количественного определения АТФ в клетках.After conducting lysis of the samples for two hours at a temperature of -80 ° C. Next, the sample is thawed at room temperature, add up to 5 ml of FSB and centrifuged at a speed of 4000 rpm for 4 minutes at room temperature 4 ° C. The liquid phase is removed with a pipette. To observe intracellular ATP, the ATP Bioluminescent Assay Kit (BAK) is used, which is used to quantify ATP in cells.
После подготовительных процедур используется 96-луночный плоскодонный культуральный планшет ТРР. Механической пипеткой подготовленные образцы помещаются в лунки планшета в объеме 0,1 мл, и делается отметка соответствия об их размещении в лабораторном журнале. Согласно инструкции BAK готовится люминесцентный реагент, который в объеме 0,1 мл смешивается с образцом в лунке. Для каждой серии эксперимента подготавливается контрольный образец (смесь стандарта АТФ из BAK и ATPAssayMix из BAK в пропорции 1:1 объемом 0,1 мкл), а также образцы для построения калибровочной кривой, согласно инструкции BAK. Далее значение интенсивности люминесценции регистрируется с помощью детектора конфокального микроскопа. Детекция проводится в спектре свечения люцеферина желтого (в видимом диапазоне ~500-700 нм) с ожидаемым максимумом около 536 нм. Для анализа каждой лунки данные снимаются в нескольких точках. Для построения калибровочной кривой используются стандарты в разной степени разведения и без него. После построения калибровочных кривых берутся пробы пациентов с тяжелыми клиническими проявлениями НПР, где проводятся измерения степени интенсивности люминесценции АТФ с помощью лазерного конфокального микроскопа. На основании полученных спектральных данных о пиковой средней величине интенсивности, рассчитывалась концентрация АТФ (мг/мл) по формулеAfter preparatory procedures, a 96-well flat-bottomed TPP culture plate is used. Using a mechanical pipette, the prepared samples are placed in the wells of a tablet in a volume of 0.1 ml, and a mark of compliance is made about their placement in the laboratory journal. According to BAK instructions, a luminescent reagent is prepared, which in a volume of 0.1 ml is mixed with the sample in the well. For each series of experiments, a control sample is prepared (a mixture of ATP standard from BAK and ATPAssayMix from BAK in a 1: 1 ratio with a volume of 0.1 μl), as well as samples for constructing a calibration curve, according to the BAK instructions. Further, the luminescence intensity value is recorded using a confocal microscope detector. Detection is carried out in the spectrum of luminous yellow Luciferin (in the visible range of ~ 500-700 nm) with an expected maximum of about 536 nm. For the analysis of each well, data are taken at several points. To build a calibration curve, standards are used with varying degrees of dilution and without it. After the construction of the calibration curves, samples are taken of patients with severe clinical manifestations of CPD, where the degree of ATP luminescence intensity is measured using a laser confocal microscope. Based on the obtained spectral data on the peak average intensity value, the ATP concentration (mg / ml) was calculated by the formula
Где Inexp - интенсивность свечения образца, Inst - интенсивность свечения стандарта,Where In exp is the luminescence intensity of the sample, In st is the luminescence intensity of the standard,
[АТФ]st - концентрация АТФ в стандарте, бралась равной 0.1 мг/мл.[ATP] st - ATP concentration in the standard, was taken equal to 0.1 mg / ml.
Расчетные данные концентрациям АТФ в клетках крови сводятся в таблицу. В таблицу также добавляются данные по возрасту, полу, площади поверхности тела пациента, количественное значение аланинаминотрансфераза (АЛТ), количественное значение аспартатаминотрансфераза (ACT). Номера каждого спектра нумеруются по номеру пациента.The calculated data for ATP concentrations in blood cells are summarized in a table. The table also includes data on age, sex, patient’s body surface area, quantitative value of alanine aminotransferase (ALT), quantitative value of aspartate aminotransferase (ACT). The numbers of each spectrum are numbered by the patient number.
В таблице 1 показаны данные по пациентам и рассчитанные для каждого концентрации АТФ, где АЛТ - аланинамилотрансфераза, АСТ - аспартатаминотрансфераза, ППТ - рассчитанная площадь поверхность тела.Table 1 shows the patient data and calculated for each ATP concentration, where ALT is alanine aminotransferase, AST is aspartate aminotransferase, and PPT is the calculated body surface area.
По результатам подсчитанной концентрации АТФ делается прогностический вывод об эффективности проводимой химиотерапии посредством взятия нормы концентрации АТФ для здоровой функционирующей клетки (1,04±0.14 мг/мл), при которой осуществляется лекарственный транспорт и не наблюдается риска развития гепатотоксических эффектов в данный момент терапии. Концентрация АТФ в клетке более (0,8±0,112 мг/мл) сигнализируют о наступлении апоптоза клетки. Потери АТФ в клетке более 70% (0,312±0,042) сигнализирует о некрозе клеток.Based on the results of the calculated ATP concentration, a predictive conclusion is made on the effectiveness of chemotherapy by taking the norm of ATP concentration for a healthy functioning cell (1.04 ± 0.14 mg / ml), in which drug transport is carried out and there is no risk of hepatotoxic effects at the moment of therapy. ATP concentration in the cell over (0.8 ± 0.112 mg / ml) indicates the onset of cell apoptosis. ATP loss in the cell of more than 70% (0.312 ± 0.042) indicates cell necrosis.
Таким образом, в заявляемом способе, включающем исследование крови до и после лечения, определяют и используют значение концентрации макро-биологического маркера - АТФ в клетках крови пациентов, что позволяет произвести прогноз риска возникновения гепатотоксичности и лекарственной резистентности пациентов, оценив, эффективность проводимой химиотерапии в нужный момент времени.Thus, in the inventive method, including a blood test before and after treatment, the concentration of a macrobiological marker, ATP, in the blood cells of patients is determined and used, which makes it possible to predict the risk of hepatotoxicity and drug resistance of patients, evaluating the effectiveness of the chemotherapy as needed moment of time.
Claims (1)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2016124210A RU2647834C2 (en) | 2016-06-17 | 2016-06-17 | Fluorescent method for chemotherapy efficiency prediction in children with acute lymphoblastic leukemia |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2016124210A RU2647834C2 (en) | 2016-06-17 | 2016-06-17 | Fluorescent method for chemotherapy efficiency prediction in children with acute lymphoblastic leukemia |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2016124210A RU2016124210A (en) | 2017-12-21 |
RU2647834C2 true RU2647834C2 (en) | 2018-03-19 |
Family
ID=61627532
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2016124210A RU2647834C2 (en) | 2016-06-17 | 2016-06-17 | Fluorescent method for chemotherapy efficiency prediction in children with acute lymphoblastic leukemia |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2647834C2 (en) |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1994017177A1 (en) * | 1993-01-27 | 1994-08-04 | Batle Luminetrics Enterprises, Inc. | Methods and kits for determining effects of anti-cancer agents on cancer cells |
RU2542505C1 (en) * | 2013-07-30 | 2015-02-20 | Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Нижегородская государственная медицинская академия "Министерства здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ ВПО НижГМА Минздрава России) | Method for prediction of chemotherapeutic effectiveness in patients with malignant new growths of epithelial tissues |
-
2016
- 2016-06-17 RU RU2016124210A patent/RU2647834C2/en active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1994017177A1 (en) * | 1993-01-27 | 1994-08-04 | Batle Luminetrics Enterprises, Inc. | Methods and kits for determining effects of anti-cancer agents on cancer cells |
RU2542505C1 (en) * | 2013-07-30 | 2015-02-20 | Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Нижегородская государственная медицинская академия "Министерства здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ ВПО НижГМА Минздрава России) | Method for prediction of chemotherapeutic effectiveness in patients with malignant new growths of epithelial tissues |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
А.В. Алясова. Клинико-нейрофизиологическая и нейро-иммунологическая характеристика больных раком молочной железы / Авто, Иваново, 2004. * |
А.В. Алясова. Клинико-нейрофизиологическая и нейро-иммунологическая характеристика больных раком молочной железы / Автореферат, Иваново, 2004. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU2016124210A (en) | 2017-12-21 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Catenacci et al. | Acquisition of portal venous circulating tumor cells from patients with pancreaticobiliary cancers by endoscopic ultrasound | |
JP3699399B2 (en) | Methods for determining response to cancer treatment | |
JP2824155B2 (en) | Method for detecting and / or optionally quantifying and / or separating apoptotic cells in or from a sample | |
Alexiou et al. | Expression of heat shock proteins in medulloblastoma | |
US20190128870A1 (en) | Diagnostic Methods For Patient Specific Therapeutic Decision Making In Cancer Care | |
Sheikh et al. | The expression of S100A8 in pancreatic cancer‐associated monocytes is associated with the Smad4 status of pancreatic cancer cells | |
US20230184744A1 (en) | INTERTUMORAL HOMOGENEITY DETERMINED BY MiCK ASSAY | |
Blücher et al. | Single cell study of adipose tissue mediated lipid droplet formation and biochemical alterations in breast cancer cells | |
KR20130061128A (en) | System and method for anti-cancer drug candidate evaluation | |
JP2018155752A (en) | Methods for diagnosing and treating cancer | |
RU2647834C2 (en) | Fluorescent method for chemotherapy efficiency prediction in children with acute lymphoblastic leukemia | |
RU2642589C2 (en) | Fluorescent method for chemotherapy efficiency prediction in children with acute lymphoblastic leukemia by determination of adenosine triphosphate concentrations in mitochondria | |
US20140273016A1 (en) | Device and method for the detection and diagnosis of aggressive and metastatic cancer and cancer stem cells employing podocalyxin and tra biomarkers | |
RU2538219C2 (en) | Method of determining platelet resistance to acetylsalicylic acid | |
RU2612021C1 (en) | Method of predicting risk of gastric adenocarcinoma development in case of chronic processes of ulcer formation in organ | |
CA3086794A1 (en) | Methods based on the detection of rad51 foci in tumor cells | |
RU2707083C1 (en) | Method for detecting or recovering/producing a circulating tumor cell using a cell proliferation technique | |
US20140295483A1 (en) | Apparatus and method for in-vitro drug screening for cancer metastasis | |
JP6002379B2 (en) | Method for determining risk of cancer recurrence and use thereof | |
RU2581925C2 (en) | Method for assessing allogenic immune response in short-term mixed mononuclear culture of unrelated donors | |
EP2972377A1 (en) | Systems and methods employing human stem cell markers for detection, diagnosis and treatment of circulating tumor cells | |
WO2014152443A2 (en) | Single-cell analysis as a sensitive and specific method for early prostate cancer detection | |
RU2712946C1 (en) | Method for assessing the balance of the immune, inflammatory and anti-inflammatory reaction of alveolar macrophages recovered from resected parts of the lung of patients suffering pulmonary tuberculosis, depending on the degree of mycobacterium tuberculosis macrophages infection | |
Neumann et al. | Biospecimen collection, processing, and analysis: new challenges for oncology nurses | |
US20140274773A1 (en) | Systems and methods for employing podocalyxin and tra human stem cell markers as prognostic markers for aggressive and metastatic cancer |