RU2642989C1 - Method for oncological diseases diagnostics - Google Patents

Method for oncological diseases diagnostics Download PDF

Info

Publication number
RU2642989C1
RU2642989C1 RU2016149978A RU2016149978A RU2642989C1 RU 2642989 C1 RU2642989 C1 RU 2642989C1 RU 2016149978 A RU2016149978 A RU 2016149978A RU 2016149978 A RU2016149978 A RU 2016149978A RU 2642989 C1 RU2642989 C1 RU 2642989C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
cancer
gene
cdna
linc00309
rna
Prior art date
Application number
RU2016149978A
Other languages
Russian (ru)
Inventor
Лариса Леонидовна Круковская
Дмитрий Евгеньевич Полев
Тамара Викторовна Курбатова
Юлия Константиновна Карнаухова
Андрей Петрович Козлов
Original Assignee
федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Санкт-Петербургский политехнический университет Петра Великого" (ФГАОУ ВО "СПбПУ")
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Санкт-Петербургский политехнический университет Петра Великого" (ФГАОУ ВО "СПбПУ") filed Critical федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Санкт-Петербургский политехнический университет Петра Великого" (ФГАОУ ВО "СПбПУ")
Priority to RU2016149978A priority Critical patent/RU2642989C1/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2642989C1 publication Critical patent/RU2642989C1/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6804—Nucleic acid analysis using immunogens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6881—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for tissue or cell typing, e.g. human leukocyte antigen [HLA] probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2531/00—Reactions of nucleic acids characterised by
    • C12Q2531/10—Reactions of nucleic acids characterised by the purpose being amplify/increase the copy number of target nucleic acid
    • C12Q2531/113—PCR
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2565/00—Nucleic acid analysis characterised by mode or means of detection
    • C12Q2565/10—Detection mode being characterised by the assay principle
    • C12Q2565/125—Electrophoretic separation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/50—Determining the risk of developing a disease
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57415—Specifically defined cancers of breast
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57423—Specifically defined cancers of lung
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57446—Specifically defined cancers of stomach or intestine
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites

Abstract

FIELD: medicine.
SUBSTANCE: during study of a sample, taken from the patient, the total RNA is allocated, cDNA is obtained and amplified by polymerase chain reaction with primers specific to the nucleotide sequence of the LINC00309 gene (Long intergenic non-protein coding RNA 309). A high probability of cancer is diagnosed with a PCR product corresponding to the gene.
EFFECT: detection of cancer of various organs of the human body.
2 cl, 6 dwg, 2 ex

Description

Изобретение относится к области медицины, а именно к способам диагностики онкологических заболеваний.The invention relates to medicine, namely to methods for diagnosing cancer.

Рак является одной из основных причин заболеваемости и смертности во всем мире; примерно 14 миллионов новых случаев заболевания и 8,2 миллиона случаев смерти, связанных с раком, зафиксировано в 2012 году (World Cancer Report, 2014). Ожидается, что число новых случаев онкологических заболеваний увеличится на 70% в течение следующих 2-х десятилетий (http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs297/en).Cancer is one of the leading causes of morbidity and mortality worldwide; approximately 14 million new cases and 8.2 million cancer-related deaths were reported in 2012 (World Cancer Report, 2014). The number of new cases of cancer is expected to increase by 70% over the next 2 decades (http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs297/en).

Эту ситуацию связывают с рядом причин: повышением общего радиационного фона Земли, ухудшением экологической обстановки и эндоэкологической среды, а также со многими поведенческими рисками, такими как табакокурение и употребление алкоголя. Все это вызывает снижение иммунитета организма и повышение способности трансформированных клеток к прогрессирующему росту.This situation is associated with a number of reasons: an increase in the general radiation background of the Earth, a deterioration of the ecological situation and the endoecological environment, as well as with many behavioral risks, such as smoking and drinking alcohol. All this causes a decrease in the body's immunity and an increase in the ability of transformed cells to progressive growth.

Успех лечения онкологических больных во многом зависит от стадии, на которой выявлено заболевание. Диагностика рака на ранней бессимптомной стадии развития заболевания дает возможность эффективного лечения, менее травматичного и безопасного для всего организма, и позволяет предотвратить стадию метастазирования рака и добиться длительной ремиссии.The success of treatment of cancer patients largely depends on the stage at which the disease is detected. Diagnosis of cancer at an early asymptomatic stage of the development of the disease enables effective treatment, less traumatic and safe for the whole organism, and helps prevent the stage of cancer metastasis and achieve long-term remission.

Современная онкологическая наука располагает рядом методов скрининговой диагностики злокачественных новообразований, позволяющих судить о наличии или отсутствии опухоли в момент обследования. В частности широкое распространение получило ежегодное флюорографическое обследование всех групп населения, а также профилактическая маммография, проводимая с целью ранней диагностики злокачественных новообразований молочной железы у женского населения (A.G. Holleb. Review of Breast Cancer Screening Guidelines. Cancer Supplement, 1992; 69, c. 1911-1912). Известен также метод цитологического скрининга злокачественных опухолей шейки матки (Guzick DS. Efficacy of screening for cervical cancer. A review. Am. J. Public Heath, 1978; 68, c. 125-134).Modern oncological science has a number of methods for screening diagnosis of malignant neoplasms, which make it possible to judge the presence or absence of a tumor at the time of examination. In particular, an annual fluorographic examination of all population groups, as well as preventive mammography performed for the early diagnosis of breast cancer in the female population, has become widespread (AG Holleb. Review of Breast Cancer Screening Guidelines. Cancer Supplement, 1992; 69, p. 1911 -1912). Also known is the method of cytological screening of malignant tumors of the cervix (Guzick DS. Efficacy of screening for cervical cancer. A review. Am. J. Public Heath, 1978; 68, p. 125-134).

Однако большинство методов скрининговой диагностики направлено на выявление конкретного вида опухоли конкретного органа и не может быть использовано при общей диагностике онкологии.However, most methods of screening diagnostics are aimed at identifying a specific type of tumor of a specific organ and cannot be used in the general diagnosis of oncology.

Известен многопараметрический способ диагностики злокачественных новообразований (RU заявка №98112260, 2000), включающий определение времени продольной ядерной магнитной резонансной релаксации в сыворотке крови, а также проведение количественной оценки нарушения гомеостаза по данным биофизических, гематологических и биохимических анализов, по результатам которой судят о наличии злокачественного новообразования.A multi-parameter method for diagnosing malignant neoplasms is known (RU application No. 98112260, 2000), including determining the time of longitudinal nuclear magnetic resonance relaxation in the blood serum, as well as quantifying homeostasis disorders according to biophysical, hematological and biochemical analyzes, according to which the presence of malignant is judged neoplasms.

Недостатком этого способа является его техническая сложность, длительность, невозможность использования в клинических лабораториях больниц, трудность выявления ранней стадии злокачественного роста.The disadvantage of this method is its technical complexity, duration, the inability to use in the clinical laboratories of hospitals, the difficulty of identifying an early stage of malignant growth.

В настоящее время предполагают, что наиболее перспективными для общей диагностики онкологических заболеваний являются методы, основанные на определении опухолевых маркеров в биологических жидкостях организма, в частности в крови. Так, известен способ диагностики злокачественных опухолей человека, основанный на выявлении в крови обследуемого белков, специфичных для злокачественного роста (Короткоручко В.П. Осадочная реакция на рак при диагностике опухолевой болезни. Киев, "Наукова думка". 1967). Для этого сыворотку крови выдерживают в растворе соляной кислоты, после чего осаждают белок азотной кислотой и добавляют к нему дистиллированную воду. Образующийся осадок белков сыворотки крови онкологических больных в отличие от здоровых людей не растворяется. Результат реакции, получившей название осадочной реакции на рак (ОРР), фиксируют по визуальному показателю. Этот способ является достаточно универсальным, однако он не обладает достаточной специфичностью, т.к. ОРР часто бывает положительной при воспалительных и других неопухолевых заболеваниях.Currently, it is assumed that the most promising for the general diagnosis of cancer are methods based on the determination of tumor markers in biological fluids of the body, in particular in the blood. So, there is a known method for the diagnosis of human malignant tumors, based on the detection of proteins specific for malignant growth in the blood of the patient (V. Korotorkuchko. Precipitation of cancer in the diagnosis of tumor disease. Kiev, Naukova Dumka. 1967). To do this, the blood serum is kept in a solution of hydrochloric acid, after which the protein is precipitated with nitric acid and distilled water is added to it. The resulting precipitate of serum proteins in cancer patients, in contrast to healthy people, does not dissolve. The result of the reaction, called the sedimentary response to cancer (ORP), is fixed by visual indicator. This method is quite universal, however, it does not have sufficient specificity, because ORP is often positive for inflammatory and other non-tumor diseases.

В качестве опухолевых маркеров с целью диагностики солидных нелимфоидных опухолей и их метастазов использовали также рецептор

Figure 00000001
2 (патент RU №2144675, 2000), полинуклеотиды (RU патент №2174409, 2001) и некоторые другие вещества. В частности, перспективными являются методы диагностики онкологических заболеваний по присутствию в биологических жидкостях организма внеклеточных нуклеиновых кислот, специфических для клеток злокачественных новообразований (Y.M. Dennis Lo and Rossa W.K. Chiu The biology and diagnostic application of plasma RNA // Ann. N.Y. Acad. Sci., 2004, 1022: 135-139), или базирующиеся на обнаружении раковых клеток, экспрессирующих специфический ген (A.M. Gilbey, D. Burnett, R.E. Coleman, I. Holen. The detection of circulating breast cancer cells in blood // J. Clin. Pathol. 2004; 57: 903-911). В качестве одного из вариантов предлагается (патент RU №2251696, 2005) определять концентрацию нуклеиновых кислот (НК), связанных с клеточной поверхностью форменных элементов крови, и на основе данного показателя диагностировать наличие или отсутствие онкологического заболевания. Однако, как правило, большинство разработок ограничиваются диагностикой опухоли определенной локализации. В качестве примера можно привести группу маркеров на основе генов микроPHKmiR-129-2, miR-125b1, miR-137 и miR-375, для диагностики немелкоклеточного рака легкого, где диагностическим признаком является выявление метилирования хотя бы одной микроPHK (RU патент №2507268, 2012). Другим примером является количественное определение мРНК гена KIFC1 c помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени для диагностики рака мочевого пузыря (RU заявка №2011109883, 2011). Достоинство таких разработок состоит в их высокой чувствительности и специфичности к определенному виду опухоли, однако их использование для опухолей других локализаций, как правило, неэффективно из-за строгих требований к выбору тканеспецифического гена сравнения (референсного гена).The receptor was also used as tumor markers for the diagnosis of solid non-lymphoid tumors and their metastases
Figure 00000001
2 (RU patent No. 2144675, 2000), polynucleotides (RU patent No. 2174409, 2001) and some other substances. In particular, methods for diagnosing cancer by the presence in the body fluids of extracellular nucleic acids specific for malignant neoplasm cells are promising (YM Dennis Lo and Rossa WK Chiu The biology and diagnostic application of plasma RNA // Ann. NY Acad. Sci., 2004, 1022: 135-139), or based on the detection of cancer cells expressing a specific gene (AM Gilbey, D. Burnett, RE Coleman, I. Holen. The detection of circulating breast cancer cells in blood // J. Clin. Pathol . 2004; 57: 903-911). As one of the options proposed (patent RU No. 2251696, 2005) to determine the concentration of nucleic acids (NK) associated with the cell surface of blood cells, and based on this indicator to diagnose the presence or absence of cancer. However, as a rule, most developments are limited to the diagnosis of a tumor of a certain location. As an example, we can cite a group of markers based on the microPHKmiR-129-2, miR-125b1, miR-137 and miR-375 genes for the diagnosis of non-small cell lung cancer, where the diagnostic sign is the detection of methylation of at least one microPHK (RU Patent No. 2507268, 2012). Another example is the quantitative determination of KIFC1 mRNA using real-time polymerase chain reaction (PCR) for the diagnosis of bladder cancer (RU application No. 2011109883, 2011). The advantage of such developments is their high sensitivity and specificity for a particular type of tumor, however, their use for tumors of other locations is usually ineffective due to strict requirements for the choice of tissue-specific reference gene (reference gene).

Наиболее близким по технической сути к заявляемому способу является способ диагностики рака желудка (патент RU №2204835, 2005), заключающийся в исследовании образца ткани пациента, содержащего клетки проблемной зоны, с целью определения в образце мРНК циклооксигеназы-2 или белка ЦОКС-2. Для этого общую РНК выделяли с помощью реагента RNAzol 1 (Tel-Test). Образец РНК денатурировали и переносили на нейлоновые мембраны, которые затем облучали УФ. Фрагменты очищенной к ДНК - циклооксигеназы-1 (ЦОКС-1), ЦОКС-2 и глицеральальдегид-3-фосфат дегидрогеназы (ГАФДГ) метили, после чего очищали на ник-колонках. Тотальную РНК превращали в кДНК, с помощью обратной транскриптазы SuperscriptII и олиго-dT или гексонуклеотидных праймеров (LifeTechnology), кДНК амплифицировали с помощью полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) с использованием специфических праймеров Цокс-2 в присутствии ДНК-полимеразы. Амплифицированную кДНК окрашивали бромистым этидием и количественно определяли по результатам электрофореза на 2% геле агарозы с помощью камеры CCD высокого разрешения. Полученные результаты сопоставляли с данными, полученными при аналогичном исследовании здоровых тканей и заведомо раковых клеток, и на базе такого сопоставления диагностировали наличие или отсутствие онкологического заболевания.The closest in technical essence to the claimed method is a method for the diagnosis of gastric cancer (patent RU No. 2204835, 2005), which consists in examining a patient’s tissue sample containing cells of the problem area in order to determine cyclooxygenase-2 or protein COX-2 in the mRNA sample. For this, total RNA was isolated using RNAzol 1 reagent (Tel-Test). The RNA sample was denatured and transferred to nylon membranes, which were then irradiated with UV. Fragments of DNA purified - cyclooxygenase-1 (COX-1), COX-2 and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) were labeled, and then purified on nick-columns. Total RNA was converted to cDNA using SuperscriptII reverse transcriptase and oligo-dT or hexonucleotide primers (LifeTechnology), cDNA was amplified by polymerase chain reaction (RT-PCR) using specific Cox-2 primers in the presence of DNA polymerase. Amplified cDNA was stained with ethidium bromide and quantified by electrophoresis on a 2% agarose gel using a high-resolution CCD camera. The results were compared with data obtained in a similar study of healthy tissues and obviously cancer cells, and on the basis of such a comparison, the presence or absence of cancer was diagnosed.

Недостатком данного способа является ограниченная область применения в связи с отсутствием достоверных данных о наличии ЦОКС в других тканях организма, а также длительность и сложность анализа.The disadvantage of this method is the limited scope due to the lack of reliable data on the presence of COX in other tissues of the body, as well as the duration and complexity of the analysis.

Технической проблемой является создание метода диагностики онкологических заболеваний, пригодного для выявления рака различных органов организма человека.A technical problem is the creation of a method for the diagnosis of cancer, suitable for detecting cancer of various organs of the human body.

Данная техническая проблема решается путем обнаружения в опухолевых тканях мРНК гена LINC00309 (Long intergenic non-protein coding RNA 309), отсутствующую в здоровых тканях организма человека. Это позволило создать способ диагностики онкологических заболеваний, сущность которого состоит в анализе тканей организма человека и диагностики онкологических заболеваний при обнаружении в тканях мРНК гена LINC00309.This technical problem is solved by detecting the LINC00309 gene (Long intergenic non-protein coding RNA 309), which is absent in healthy tissues of the human body, in tumor tissues. This allowed us to create a method for the diagnosis of cancer, the essence of which is to analyze the tissues of the human body and diagnose cancer when a LINC00309 gene is detected in mRNA tissues.

Нуклеотидная последовательность мРНК гена LINC00309 (Long intergenic non-protein coding RNA 309) представлена на рис. 1.The nucleotide sequence of the mRNA of the LINC00309 gene (Long intergenic non-protein coding RNA 309) is shown in Fig. one.

На фиг. 1, на фиг. 2, на фиг. 3, на фиг. 4, на фиг. 5 приведены результаты ПЦР с праймерами специфическими к гену LINC00309 на панелях кДНК из нормальных, фетальных и опухолевых тканей человека.In FIG. 1, in FIG. 2, in FIG. 3, in FIG. 4, in FIG. Figure 5 shows the results of PCR with primers specific for the LINC00309 gene on cDNA panels from normal, fetal, and human tumor tissues.

Обнаружение мРНК гена LINC00309 осуществляется с помощью традиционных методов анализа мРНК, таких как дот-гибридизация, методы обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) и т.д. Лучшие результаты достигались при проведении детекции методами ОТ-ПЦР. В рамках ее осуществления полученную известными способами кДНК пациента амплифицировали в присутствии праймеров, специфических к фрагменту мРНК гена LINC00309, нуклеотидная последовательность которого представлена в SEQ ID NO 1. При этом в качестве прямого праймера использовали олигонуклеотид с последовательностью: 5'-CATGTCAGTCCCACCTTGAA-3', а в качестве обратного - 5'-GAGGCAGTATCCAGGGCTTA-3'.Detection of mRNA of the LINC00309 gene is carried out using traditional mRNA analysis methods such as dot hybridization, reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR), etc. The best results were achieved during detection by RT-PCR. In the framework of its implementation, the patient’s cDNA obtained by known methods was amplified in the presence of primers specific for the LINC00309 mRNA fragment, the nucleotide sequence of which is presented in SEQ ID NO 1. The oligonucleotide with the sequence: 5'-CATGTCAGTCCCACCTTGAA-3 'was used as a direct primer, and, on the contrary, 5'-GAGGCAGTATCCAGGGCTTA-3 '.

Диагностику проводили следующим образом. Суммарную РНК выделяли из замороженных образцов с помощью TRI Reagent (Sigma). Для этого 100-500 мг замороженной в жидком азоте ткани разрушали с использованием микродесмембратора («Sartorius», Германия) и затем разрушенный образец лизировали в растворе TRI Reagent (Sigma), содержащем гуанидинизотиоцианат и фенол. Смесь оставляли при комнатной температуре на 5 минут, после чего в нее добавляли хлороформ для разделения фаз и затем центрифугировали 10 минут при 12000×g при температуре 4°С. После центрифугированиия отбирали водную (верхнюю) фазу, содержащую суммарную РНК. Из водной фазы РНК осаждали путем добавления изопропилового спирта и затем повторно центрифугировали в течение 10 минутпри 12000×g при температуре 4°C. Надосадочную жидкость сливали, осадок промывали 70% этанолом и подсушивали при -20°C, после чего осадок растворяли в воде, обработанной диметилпирокарбонатом (ДПК). Концентрацию и чистоту выделенной РНК определяли на спектрофотометре Ultrospec® 3100 pro. Чистоту РНК считали пригодной для работы при соотношении A260/А280≥1,7 (водный раствор). Далее проводили анализ качества РНК гель-электрофорезом, по соотношению 28s и 18s рРНК в 1% агарозном геле. Перед проведением электрофореза к препаратам РНК, содержащим 1-2 мкг тотальной РНК (в объеме 5-10 мкл), добавляли додецил-сульфат натрия (SDS) до концентрации 0,3%. После чего пробы РНК денатурировали при 65°C в течение 10 минут, быстро охлаждали на льду, добавляли 0,1 объема от объема пробы 10-кратного буферного раствора, содержащего 50%-ный глицерин и 0,4%-ный бромфеноловый синий, и наносили на гель.Diagnosis was as follows. Total RNA was isolated from frozen samples using TRI Reagent (Sigma). To do this, 100-500 mg of tissue frozen in liquid nitrogen was destroyed using a microdesembler (Sartorius, Germany), and then the destroyed sample was lysed in a TRI Reagent solution (Sigma) containing guanidine isothiocyanate and phenol. The mixture was left at room temperature for 5 minutes, after which chloroform was added to it to separate the phases, and then centrifuged for 10 minutes at 12000 × g at 4 ° C. After centrifugation, the aqueous (upper) phase containing total RNA was selected. From the aqueous phase, RNA was precipitated by the addition of isopropyl alcohol and then centrifuged again for 10 minutes at 12,000 × g at 4 ° C. The supernatant was decanted, the precipitate was washed with 70% ethanol and dried at -20 ° C, after which the precipitate was dissolved in water treated with dimethyl pyrocarbonate (WPC). The concentration and purity of the isolated RNA was determined using an Ultrospec® 3100 pro spectrophotometer. RNA purity was considered suitable for operation at a ratio of A 260 / A 280 ≥1.7 (aqueous solution). Next, RNA quality analysis was performed by gel electrophoresis, according to the ratio of 28s and 18s rRNA in 1% agarose gel. Before electrophoresis, sodium dodecyl sulfate (SDS) was added to RNA preparations containing 1-2 μg of total RNA (in a volume of 5-10 μl) to a concentration of 0.3%. After which the RNA samples were denatured at 65 ° C for 10 minutes, quickly cooled on ice, 0.1 volume of the sample volume of 10-fold buffer solution containing 50% glycerol and 0.4% bromophenol blue was added, and applied to the gel.

Электрофорез проводили в горизонтальных аппаратах в буфере TAE (40 мМ Трис-ацетат; 2 мМ ЭДТА, pH 8,0; 0,5 мкг/мл бромистого этидия) при напряжении 5-14 В/см длины геля. Результат разделения РНК регистрировали в проходящем ультрафиолетовом свете трансиллюминатора (Macrovue, LKB, Швеция).Electrophoresis was performed in horizontal apparatuses in TAE buffer (40 mM Tris-acetate; 2 mM EDTA, pH 8.0; 0.5 μg / ml ethidium bromide) at a voltage of 5-14 V / cm of gel length. The result of RNA separation was recorded in transmitted ultraviolet light of the transilluminator (Macrovue, LKB, Sweden).

Синтез кДНК проводили с помощью набора Revert Aid® First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas). Для этого на льду смешивали 5 мкг тотальной РНК, 0,2 мкг гексануклеотидных праймеров и доводили объем смеси до 12 мкл водой. Для денатурации РНК смесь инкубировали 5 минут при 70°C и переносили на лед. Затем добавляли 4 мкл 5-кратного буфера, 1 мкл (20 ед.) ингибитора рибонуклеаз RiboLock, 2 мкл смеси10 мМ dNTP. После этого смесь инкубировали при 25°C в течение 5 минут и добавляли 1 мкл (200 ед.) Revert Aid® M-MuLV обратной транскриптазы. Объем полученной смеси составлял 20 мкл. Реакционную смесь инкубировали 10 минут при 25°C, а затем 60 минут при 42°C. Далее реакцию останавливали прогреванием до 70°C в течение 10 минут и ставили на лед. Полученную кДНК хранили при -20°С до использования.CDNA synthesis was performed using the Revert Aid® First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas). For this, 5 μg of total RNA and 0.2 μg of hexanucleotide primers were mixed on ice and the mixture volume was adjusted to 12 μl with water. To denature RNA, the mixture was incubated for 5 minutes at 70 ° C and transferred to ice. Then 4 μl of 5-fold buffer, 1 μl (20 units) of RiboLock ribonuclease inhibitor, 2 μl of a mixture of 10 mM dNTP were added. After this, the mixture was incubated at 25 ° C for 5 minutes and 1 μl (200 units) of Revert Aid® M-MuLV reverse transcriptase was added. The volume of the resulting mixture was 20 μl. The reaction mixture was incubated for 10 minutes at 25 ° C, and then 60 minutes at 42 ° C. Next, the reaction was stopped by heating to 70 ° C for 10 minutes and put on ice. The resulting cDNA was stored at −20 ° C. until use.

Для выявления самостоятельных транскриптов гена LINC00309 в тканях человека была проведена серия ПЦР-экспериментов на панелях кДНК из различных нормальных и опухолевых тканей.To identify independent transcripts of the LINC00309 gene in human tissues, a series of PCR experiments was performed on cDNA panels from various normal and tumor tissues.

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили в растворе, содержащем 2,5 мкл кДНК, 1-кратный ПЦР-буфер, MgCl2(4 mM), dNTP (200 μМ каждого), 0,4 μМ каждого праймера и 1 единицу Taq ДНК-полимеразы в общем объеме 25 мкл, при следующих условиях: 1 мин при 95°С, 35 циклов, включавших 20 сек при 95°С, 20 сек при 60°С и 40 сек при 72°С. В конце проводили достройку фрагментов в течение 5 мин при 72°С. Продукты ПЦР разделяли электрофорезом в 2% агарозе и прокрашивали бромистым этидием. Присутствие искомой мРНК в образце определяли по наличию продукта амплификации с размером 221 п.н.The polymerase chain reaction (PCR) was carried out in a solution containing 2.5 μl of cDNA, 1-time PCR buffer, MgCl 2 (4 mM), dNTP (200 μM each), 0.4 μM of each primer and 1 Taq DNA unit polymerase in a total volume of 25 μl, under the following conditions: 1 min at 95 ° C, 35 cycles, including 20 sec at 95 ° C, 20 sec at 60 ° C and 40 sec at 72 ° C. At the end, the completion of the fragments was carried out for 5 min at 72 ° C. PCR products were separated by electrophoresis in 2% agarose and stained with ethidium bromide. The presence of the desired mRNA in the sample was determined by the presence of an amplification product with a size of 221 bp

Для проверки качества панелей кДНК ставили ПЦР с использованием праймеров к гену G3PDH (прямой 5'-TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGT-3', обратный 5'-CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC-3', Tm 68°С, 30 циклов, размер амплифицируемого фрагмента 983 п.о.).To check the quality of cDNA panels, PCR was performed using primers for the G3PDH gene (direct 5'-TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGT-3 ', reverse 5'-CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC-3', Tm 68 ° C, 30 cycles, amplified fragment size. 9). 9.

На фиг. 1 показаны результаты ПЦР с праймерами, специфическими к гену LINC00309, на панели кДНК нормальных тканей (Human МТС Panel I и Human МТС Panel II, Clontech).In FIG. Figure 1 shows the results of PCR with primers specific for the LINC00309 gene on the cDNA panel of normal tissues (Human MTS Panel I and Human MTS Panel II, Clontech).

1 - мозг, 2 - сердце, 3 - почка, 4 - печень, 5 - легкое, 6 - поджелудочная железа, 7 - плацента, 8 - скелетная мышца, 9 - толстая кишка, 10 - яичник, 11 - лейкоциты периферической крови, 12 - предстательная железа, 13 - тонкий кишечник, 14 - селезенка, 15 - яичко, 16 - тимус, -К - отрицательный контроль, +К - положительный контроль.1 - brain, 2 - heart, 3 - kidney, 4 - liver, 5 - lung, 6 - pancreas, 7 - placenta, 8 - skeletal muscle, 9 - large intestine, 10 - ovary, 11 - peripheral blood leukocytes, 12 - prostate gland, 13 - small intestine, 14 - spleen, 15 - testicle, 16 - thymus, -K - negative control, + K - positive control.

На фиг. 2 показаны результаты ПЦР с праймерами, специфическими к гену LINC00309, на панелях кДНК из тканей пищеварительной системы и тканей иммунной системы (Human Digestive System МТС Panel и Human Immune System МТС Panel, Clontech).In FIG. 2 shows the results of PCR with primers specific for the LINC00309 gene on cDNA panels from digestive system tissues and immune system tissues (Human Digestive System MTS Panel and Human Immune System MTS Panel, Clontech).

1 - слепая кишка, 2 - восходящая ободочная кишка, 3 - нисходящая ободочная кишка, 4 - поперечная ободочная кишка, 5 - двенадцатиперстная кишка, 6 - пищевод, 7 - подвздошно-слепая кишка, 8 - подвздошная кишка, 9 - тощая кишка, 10 - печень, 11 - прямая кишка, 12 - желудок, 13 - костный мозг, 14 - фетальная печень, 15 - лимфатический узел, 16 - лейкоциты периферической крови, 17 - селезенка, 18 - тимус, 19 - миндалевидная железа, -К - отрицательный контроль, +К - положительный контроль.1 - cecum, 2 - ascending colon, 3 - descending colon, 4 - transverse colon, 5 - duodenum, 6 - esophagus, 7 - ileum-cecum, 8 - ileum, 9 - jejunum, 10 - liver, 11 - rectum, 12 - stomach, 13 - bone marrow, 14 - fetal liver, 15 - lymph node, 16 - peripheral blood leukocytes, 17 - spleen, 18 - thymus, 19 - amygdala, -K - negative control, + K - positive control.

На фиг. 3 показаны результаты ПЦР с праймерами, специфическими к гену LINC00309, на панели кДНК из фетальных тканей (Human Fetal МТС Panel, Clontech).In FIG. Figure 3 shows the results of PCR with primers specific for the LINC00309 gene on a cDNA panel from fetal tissues (Human Fetal MTS Panel, Clontech).

1 - фетальный мозг, 2 - фетальное сердце, 3 - фетальная почка, 4 - фетальная печень, 5 - фетальное легкое, 6 - фетальная скелетная мышца, 7 - фетальная селезенка, 8 - фетальный тимус, -К - отрицательный контроль, +К - положительный контроль.1 - fetal brain, 2 - fetal heart, 3 - fetal kidney, 4 - fetal liver, 5 - fetal lung, 6 - fetal skeletal muscle, 7 - fetal spleen, 8 - fetal thymus, -K - negative control, + K - positive control.

На фиг. 4 показаны результаты ПЦР с праймерами, специфическими к гену LINC00309, на панели кДНК опухолевых тканей (BioChain).In FIG. 4 shows the results of PCR with primers specific for the LINC00309 gene on the cDNA panel of tumor tissues (BioChain).

1 - медуллобластома мозга, 2 - плоскоклеточный рак легкого, 3 - зернистоклеточный рак почки, 4 - светлоклеточный рак почки, 5 - холангиоцеллюлярный рак печени, 6 - гепатоцеллюлярный рак печени, 7 - аденокарцинома желчного пузыря, 8 - плоскоклеточный рак пищевода, 9 - перстневидноклеточный рак желудка, 10 - аденокарцинома тонкого кишечника, 11 - папиллярная аденокарцинома ободочной кишки, 12 - аденокарцинома прямой кишки, 13 - фиброаденома молочной железы, 14 - серозная цистоаденокарцинома яичника, 15 - медуллярный рак фаллопиевых труб, 16 - аденокарцинома матки, 17 - папиллярный переходноклеточный рак мочеточника, 18 - переходноклеточный рак мочевого пузыря, 19 -семиномаяичка, 20 - аденокарцинома предстательной железы, 21 - меланома кожи, 22 - злокачественная фиброзная гистоцитома мышц, 23 - феохромоцитома надпочечника, 24 - неходжкинская лимфома, 25 - папиллярная аденокарцинома щитовидной железы, 26 - смешанная опухоль околоушной железы, 27 - аденокарцинома поджелудочной железы, 28 - семинома тимуса, 29 - аденокарцинома селезенки, 30 - неходжкинская лимфома, 31 - T-клеточная ходжкинская лимфома, 32 - злокачественная лимфома, -K - отрицательный контроль, +K - положительный контроль.1 - medulloblastoma of the brain, 2 - squamous cell carcinoma of the lung, 3 - granular cell carcinoma of the kidney, 4 - clear cell carcinoma of the kidney, 5 - cholangiocellular carcinoma of the liver, 6 - hepatocellular carcinoma of the liver, 7 - adenocarcinoma of the gallbladder, 8 - squamous cell carcinoma of the esophagus, 9 - cricoid cell stomach cancer, 10 - small bowel adenocarcinoma, 11 - colon papillary adenocarcinoma of the colon, 12 - rectal adenocarcinoma, 13 - breast fibroadenoma, 14 - serous cystoadenocarcinoma of the ovary, 15 - medullary cancer of the fallopian tubes, 16 - adenocarcinoma 17 - papillary transitional cell carcinoma of the ureter, 18 - transitional cell carcinoma of the bladder, 19 - seminomial testicle, 20 - prostate adenocarcinoma, 21 - skin melanoma, 22 - malignant fibrous muscle histocytoma, 23 - adrenal pheochromocytoma, 24 - non-Hodgkin papilloma, thyroid adenocarcinoma, 26 - mixed parotid tumor, 27 - pancreas adenocarcinoma, 28 - thymus seminoma, 29 - spleen adenocarcinoma, 30 - non-Hodgkin lymphoma, 31 - T-cell Hodgkin lymphoma, 32 - whether malignant mfoma, -K - negative control, + K - positive control.

На фиг. 5 показаны результаты ПЦР с праймерами, специфическими к гену LINC00309, на панели кДНК из клинических образцов опухолевых тканей (Биомедицинский центр).In FIG. Figure 5 shows the results of PCR with primers specific for the LINC00309 gene on a cDNA panel from clinical samples of tumor tissues (Biomedical Center).

Коды пациентов и соответствующий им гистологический диагноз: 3, 246, 250, 251 - рак молочной железы; 19 - аденокарцинома молочной железы; 9 - киста молочной железы с предраковой пролиферацией; 156, 270 - аденокарцинома эндометрия; 12, 14 - плоскоклеточный рак легкого; 7 - семинома яичка; 45, 63 - менингиома; 140 - аденома гипофиза; 2 - рак шейки матки, 2а-1, 2а-3, 2а-4 - метастазы опухоли №2 в тело матки, большой сальник, левый и правый яичник соответственно; 13 - миосаркома шейки матки; 1-2 - бластома яичника; 6 - рак яичника; 30 - хронический лимфолейкоз; 31 - неходжкинская T-клеточная лимфома; 67 - лимфоаденопатия неясного генеза, 82 - неходжкинская лимфома, 87, 108 - рак желудка; 92 - лимфогрануломатоз, рецидив; 94 - гемолитическая анемия неясного генеза, 102, 113 - неходжкинская лимфома; 27 - эмбрион 6-7 недель, -K - отрицательный контроль.Patient codes and their corresponding histological diagnosis: 3, 246, 250, 251 - breast cancer; 19 - breast adenocarcinoma; 9 - breast cyst with precancerous proliferation; 156, 270 - endometrial adenocarcinoma; 12, 14 - squamous cell lung cancer; 7 - testicular seminoma; 45, 63 - meningioma; 140 - pituitary adenoma; 2 - cervical cancer, 2a-1, 2a-3, 2a-4 - metastases of tumor No. 2 into the uterus, large omentum, left and right ovaries, respectively; 13 - cervical myosarcoma; 1-2 - ovarian blastoma; 6 - ovarian cancer; 30 - chronic lymphocytic leukemia; 31 - non-Hodgkin T-cell lymphoma; 67 - lymphadenopathy of unknown origin, 82 - non-Hodgkin's lymphoma, 87, 108 - stomach cancer; 92 - lymphogranulomatosis, relapse; 94 - hemolytic anemia of unknown origin, 102, 113 - non-Hodgkin's lymphoma; 27 - embryo 6-7 weeks, -K - negative control.

Полученные результаты показали, что заявляемый способ обладает большей широтой применения, занимает меньше времени и позволяет получать достаточно надежные и селективные результаты, что иллюстрируется следующими примерами.The results showed that the inventive method has a greater breadth of application, takes less time and allows to obtain sufficiently reliable and selective results, which is illustrated by the following examples.

Пример 1. Диагностику проводили по вышеописанной методике. При постановке ПЦР на наборе кДНК из нормальных тканей человека Human MTC Panel I и Human МТС Panel II, LINС00309-специфический фрагмент не образовывался ни в одном образце (фиг. 1). Амплификация LINC00309-специфического фрагмента не наблюдалась ни в одном образце тканей пищеварительной и иммунной системы (фиг. 2) и фетальных тканей (фиг. 3).Example 1. Diagnosis was carried out according to the above method. When PCR was performed on a set of cDNA from normal human tissues, Human MTC Panel I and Human MTC Panel II, the LINС00309-specific fragment was not formed in any sample (Fig. 1). Amplification of the LINC00309-specific fragment was not observed in any tissue sample of the digestive and immune system (Fig. 2) and fetal tissues (Fig. 3).

Вместе с тем, анализ образцов кДНК из опухолей показал наличие сильного генспецифического сигнала мРНК LINC00309 в образцах злокачественных опухолей самого различного происхождения. На панели кДНК опухолевых тканей производства фирмы Biochain Institute (CШA) сигналы наблюдаются на дорожках, соответствующих опухолям легкого, желчного пузыря, желудка, тонкого кишечника, предстательной железы, надпочечника, а также в образце из неходжкинской лимфомы (фиг. 4). Экспрессия гена LINC00309 была также выявлена в опухолевых образцах панели кДНК, производства Биомедицинского центра (Санкт-Петербург) (фиг. 5). ПЦР-фрагменты гена были выявлены в некоторых образцах рака молочной железы, рака легкого и рака шейки матки, семиномы яичка, а также во всех образцах лимфом и рака желудка. Таким образом, экспрессия гена LINC00309 отсутствовала в нормальных тканях и детектировалась только в опухолевых тканях человека, и данный способ может быть использован для выявления опухолей различных органов, как, например, опухолей легкого, желудка, молочной железы, шейки матки, предстательной железы и других.At the same time, analysis of cDNA samples from tumors showed the presence of a strong gene-specific LINC00309 mRNA signal in samples of malignant tumors of various origins. On the cDNA panel of tumor tissues manufactured by the Biochain Institute (CHA), signals are observed on paths corresponding to tumors of the lung, gall bladder, stomach, small intestine, prostate, adrenal gland, and also in a sample from non-Hodgkin's lymphoma (Fig. 4). The expression of the LINC00309 gene was also detected in tumor samples of the cDNA panel, manufactured by the Biomedical Center (St. Petersburg) (Fig. 5). PCR fragments of the gene were detected in some samples of breast cancer, lung cancer and cervical cancer, testicular seminomas, as well as in all samples of lymphomas and stomach cancer. Thus, the expression of the LINC00309 gene was absent in normal tissues and was detected only in human tumor tissues, and this method can be used to detect tumors of various organs, such as tumors of the lung, stomach, breast, cervix, prostate and others.

Пример 2. Детекция мРНК гена LINC00309 методом дот-гибридизации. В качестве пробы использовали двуцепочечный фрагмент кДНК гена LINC00309, полученный с помощью ОТ-ПЦР. Мечение зонда для гибридизации радиоактивным фосфором [α-32P] проводили с помощью набора HexaLabel™ DNA Labeling Kit (Fermentas, Литва) согласно протоколу производителя. Полученный зонд хранили при -70°C до использования, но не более 3 дней. Выделение и оценку качества РНК проводили с использованием технологии, описанной в примере 1. Для переноса РНК на мембрану брали по 10 мкг каждого образца РНК, разведенного в 10 мкл воды, и смешивали с 30 мкл денатурирующего раствора (660 мкл формамида, 210 мкл формальдегида, 130 мкл 10-кратного электрофорезного буфера MOPS pH=7,0), затем смесь инкубировали при 65°C в течение 5 минут и охлаждали на льду. Далее к смеси добавляли равный объем 20-кратного раствора SSC (3M NaCl, 0,3M цитрат натрия) и осуществляли точечный перенос РНК на смоченную в 10-кратном растворе SSC нейлоновую мембрану с помощью устройства для вакуумного переноса. После этого дважды промывали все точки 10-кратным раствором SSC и фиксировали РНК на мембране, облучая ее УФ-лучами на трансиллюминаторе в течение 3 минут. Мембрану помещали на 2 часа в 15 мл прегибридизационного раствора (0,5 М фосфат натрия pH=7,2, 7% SDS, 1 мМ ЭДТА pH=7,0) при температуре 68°C. Непосредственно перед использованием денатурировали гибридизационный зонд кипячением в течение 10 минут и последующим быстрым охлаждением на льду. Денатурированный зонд добавляли в прегибридизационный раствор и инкубировали 14 часов при температуре 68°C. Затем проводили следующие отмывки: один раз в 150 мл первого отмывочного раствора (1-кратный SSC и 1% SDS) в течение 10 минут при комнатной температуре и 3 раза в 150 мл второго отмывочного раствора (0,5-кратный SSC, 0,1% SDS), в течение 10 минут при 68°C. Далее мембрану сушили и экспонировали с рентгеновской пленкой в течение 48 часов при -70°C, после чего пленку проявляли по стандартной процедуре. По результатам гибридизации визуально анализировали силу сигнала в точках, соответствующих здоровым тканям и в точках, соответствующих опухолевым тканям. Для анализа были взяты клинические образцы опухолей, описанные в примере 1. При их изучении были обнаружены сигналы гибридизации в образцах 7 (семинома яичка), 30, 31, 92 (лимфомы), 87, 108 (рак желудка). Сопоставление результатов детекции мРНК LINC00309 обоими методами показало их сходство, однако данный метод менее чувствителен и более длителен.Example 2. Detection of mRNA of the LINC00309 gene by dot hybridization. A double-stranded cDNA fragment of the LINC00309 gene obtained by RT-PCR was used as a sample. Labeling of the probe for hybridization with radioactive phosphorus [α-32P] was performed using the HexaLabel ™ DNA Labeling Kit (Fermentas, Lithuania) according to the manufacturer's protocol. The resulting probe was stored at -70 ° C until use, but not more than 3 days. Isolation and quality assessment of RNA was performed using the technology described in example 1. To transfer RNA to the membrane, 10 μg of each RNA sample diluted in 10 μl of water was taken and mixed with 30 μl of denaturing solution (660 μl of formamide, 210 μl of formaldehyde, 130 μl of 10-fold electrophoresis buffer (MOPS pH = 7.0), then the mixture was incubated at 65 ° C for 5 minutes and cooled on ice. Next, an equal volume of a 20-fold SSC solution (3M NaCl, 0.3M sodium citrate) was added to the mixture, and RNA was spotted onto a nylon membrane moistened in a 10-fold SSC solution using a vacuum transfer device. After that, all points were washed twice with a 10-fold SSC solution and RNA was fixed on the membrane, irradiating it with UV rays on a transilluminator for 3 minutes. The membrane was placed for 2 hours in 15 ml prehybridization solution (0.5 M sodium phosphate pH = 7.2, 7% SDS, 1 mm EDTA pH = 7.0) at a temperature of 68 ° C. Immediately before use, the hybridization probe was denatured by boiling for 10 minutes and subsequent rapid cooling on ice. The denatured probe was added to the prehybridization solution and incubated for 14 hours at 68 ° C. Then, the following washes were performed: once in 150 ml of the first washing solution (1x SSC and 1% SDS) for 10 minutes at room temperature and 3 times in 150 ml of the second washing solution (0.5x SSC, 0.1 % SDS), for 10 minutes at 68 ° C. The membrane was then dried and exposed with an x-ray film for 48 hours at -70 ° C, after which the film was developed according to the standard procedure. According to the results of hybridization, the signal strength was visually analyzed at points corresponding to healthy tissues and at points corresponding to tumor tissues. The clinical samples of the tumors described in Example 1 were taken for analysis. During their study, hybridization signals were detected in samples 7 (testicular seminoma), 30, 31, 92 (lymphomas), 87, 108 (stomach cancer). Comparison of the results of detection of LINC00309 mRNA by both methods showed their similarity, however, this method is less sensitive and longer.

Приведенные выше экспериментальные данные свидетельствуют о том, что заявляемый способ может быть с высокой степенью надежности использован для выявления онкологических заболеваний различных органов.The above experimental data indicate that the inventive method can be used with a high degree of reliability to detect cancer of various organs.

Claims (2)

1. Способ диагностики онкологических заболеваний, включающий исследование образца, взятого у пациента, на выявление онкологического маркера и диагностирование онкологического заболевания, отличающийся тем, что при исследовании образца, взятого у пациента, выделяют суммарную РНК, получают кДНК и амплифицируют ее с помощью полимеразной цепной реакции с праймерами, специфическими к нуклеотидной последовательности гена LINC00309 (Long intergenic non-protein coding RNA 309), нуклеотидная последовательность которой представлена в SEQ ID NO 1, и диагностируют высокую вероятность онкологического заболевания при наличии ПЦР-продукта, соответствующего гену.1. A method for the diagnosis of cancer, including the study of a sample taken from a patient to identify a cancer marker and the diagnosis of cancer, characterized in that when examining a sample taken from a patient, total RNA is isolated, cDNA is obtained and amplified by polymerase chain reaction with primers specific for the nucleotide sequence of the LINC00309 gene (Long intergenic non-protein coding RNA 309), the nucleotide sequence of which is presented in SEQ ID NO 1, and diagnose high the likelihood of cancer in the presence of a PCR product corresponding to the gene. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что амплификацию проводят с использованием прямого праймера с последовательностью 5'-CATGTCAGTCCCACCTTGAA-3' и обратного праймера с последовательностью 5'-GAGGCAGTATCCAGGGCTTA-3'.2. The method according to p. 1, characterized in that the amplification is carried out using a forward primer with the sequence 5'-CATGTCAGTCCCACCTTGAA-3 'and a reverse primer with the sequence 5'-GAGGCAGTATCCAGGGCTTA-3'.
RU2016149978A 2016-12-19 2016-12-19 Method for oncological diseases diagnostics RU2642989C1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2016149978A RU2642989C1 (en) 2016-12-19 2016-12-19 Method for oncological diseases diagnostics

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2016149978A RU2642989C1 (en) 2016-12-19 2016-12-19 Method for oncological diseases diagnostics

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2642989C1 true RU2642989C1 (en) 2018-01-29

Family

ID=61173355

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2016149978A RU2642989C1 (en) 2016-12-19 2016-12-19 Method for oncological diseases diagnostics

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2642989C1 (en)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2779550C1 (en) * 2021-06-22 2022-09-08 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии" (ФГБНУ "НИИОПП") Method for diagnosing ovarian cancer based on a set of genes of long non-coding rna

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2204835C2 (en) * 1997-03-18 2003-05-20 Биохит Ойй Diagnostics of gastric cancer at its earlier stage

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2204835C2 (en) * 1997-03-18 2003-05-20 Биохит Ойй Diagnostics of gastric cancer at its earlier stage

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BADDUKE C. Functional genomic analysis of novel microdeletions and microduplications associated with intellectual disability. A thesis submitted in partial fulfillment of the requirements for the degree of doctor of philosophy. Vancouver, 2015, 241 с. *
BARANOVA A.V. et al. In silico screening for tumour-specific expressed sequences in human genome. FEBS Lett. 2001 Nov 9; 508(1): 143-8. *
BARANOVA A.V. et al. In silico screening for tumour-specific expressed sequences in human genome. FEBS Lett. 2001 Nov 9; 508(1): 143-8. BADDUKE C. Functional genomic analysis of novel microdeletions and microduplications associated with intellectual disability. A thesis submitted in partial fulfillment of the requirements for the degree of doctor of philosophy. Vancouver, 2015, 241 с. *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2779550C1 (en) * 2021-06-22 2022-09-08 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии" (ФГБНУ "НИИОПП") Method for diagnosing ovarian cancer based on a set of genes of long non-coding rna

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6483071B2 (en) Peptide cancer antigen-specific T cell receptor gene
CN107326066B (en) Urine markers for detection of bladder cancer
US8080378B2 (en) Method of detecting colon cancer marker
JP2012100536A (en) Genetic testing method for cancer by analysis of expression of cancer-relating gene utilizing monocyte contained in blood sample
CN110387421A (en) DNA methylation qPCR kit and application method for lung cancer detection
CN108070641B (en) Primers and probes for detecting AR-V7 and AR in vesicles based on qPCR or digital PCR technology
KR101320633B1 (en) Method of providing information for diagnosis of cancer using quantitative realtime PCR and diagnostic kit comprising thereof
CN114277141B (en) Application of exosomes CDA, MBOAT2 and the like in lung cancer diagnosis
Ghersevich et al. Mammaglobin A: review and clinical utility
Rodriguez et al. Molecular epidemiology of cutaneous leishmaniasis in Venezuela
RU2340896C1 (en) Method of diagnostics of oncologic diseases
RU2642989C1 (en) Method for oncological diseases diagnostics
US5985571A (en) Method for determining multiple myeloma by assaying for expression of mage genes
CN109825585A (en) A kind of biomarker of nasopharyngeal carcinoma diagnosis and/or prognosis evaluation
AU2009213671A1 (en) Colon cancer associated transcript 1 (CCAT1) as a cancer marker
Yehya et al. Pilot study of the sensitivity and specificity of the DNA integrity assay for stool-based detection of colorectal cancer in Malaysian patients
WO2005093063A1 (en) Kit for solid cancer diagnosis and medicine for solid cancer therapy
RU2384845C1 (en) Diagnostic technioque for oncological diseases
CN101519686B (en) Molecular detecting method used for detecting stomach cancer and transfer of stomach cancer tissues and kit
RU2537263C2 (en) Method of screening and monitoring cancerous diseases and kit therefor (versions)
CN101671728A (en) Method for detecting expression quantity of carcinoembryonic antigen mRNA and special kit thereof
US20160025728A1 (en) Brain-specific gene signature of tumor cells
JP6041297B2 (en) Diagnostic method and diagnostic kit for canine lymphoma
RU2721709C1 (en) Method for prediction of risk of renal cell carcinoma
CN108753950B (en) Application of LncRNA in serum as URSA diagnosis and pregnancy outcome assessment marker