RU2537263C2 - Method of screening and monitoring cancerous diseases and kit therefor (versions) - Google Patents
Method of screening and monitoring cancerous diseases and kit therefor (versions) Download PDFInfo
- Publication number
- RU2537263C2 RU2537263C2 RU2012144891/10A RU2012144891A RU2537263C2 RU 2537263 C2 RU2537263 C2 RU 2537263C2 RU 2012144891/10 A RU2012144891/10 A RU 2012144891/10A RU 2012144891 A RU2012144891 A RU 2012144891A RU 2537263 C2 RU2537263 C2 RU 2537263C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- mrna
- genes
- seq
- cancer
- trag3
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Группа изобретений относится к молекулярной биологии и биотехнологии, касается вариантов способа скрининга и мониторинга онкологических заболеваний и вариантов набора для его осуществления, которые могут быть использованы в медицине.The group of inventions relates to molecular biology and biotechnology, relates to variants of a method for screening and monitoring oncological diseases and variants of a kit for its implementation, which can be used in medicine.
Онкологические заболевания являются одной из наиболее распространенных причин смерти среди людей. Эффективность лечения рака во многом зависит от стадии заболевания. Выявление онкологического заболевания на ранней стадии повышает вероятность выздоровления.Cancer is one of the most common causes of death among people. The effectiveness of cancer treatment largely depends on the stage of the disease. Early detection of cancer increases the likelihood of recovery.
В настоящее время для скрининга злокачественных новообразований и мониторинга течения заболевания используются лабораторные методы и способы обнаружения белковых опухолевых маркеров, определяемые в сыворотке крови с помощью специфических моноклональных антител: СА125, раково-эмбрионального антигена СЕА (US 7056660, С07Н 21/04, CM2Q 1/68, опубл. 06.06.2006 г.), альфа рецептора интерлейкина 2 (RU 2144675, G01N 33/53, опубл. 20.01.2000 г.) или простат - специфического антигена (US 7622564, С07Н 21/04, С07К 14/705, С07К 14/82, С07К 16/30, C12N 15/09, С12Р 21/06, C12Q 1/68, опубл. 09.02.2006). Описаны методы диагностики онкологических заболеваний, в которых в качестве маркеров используются полинуклеотиды (RU 2174409, А61К 48/00, G12N 15/12, опубл. 20.05.2000 г.). внеклеточные нуклеиновые кислоты (RU 2251696, G01N 33/53, опубл. 27.01.2005 г.).Currently, laboratory methods and methods for detecting protein tumor markers detected in blood serum using specific monoclonal antibodies are used for screening malignant neoplasms and monitoring the course of the disease: CA125, CEA cancer-embryonic antigen (US 7056660, С07Н 21/04,
Недостатки данных способов выражаются в низкой чувствительности или недостаточной специфичности используемых маркеров, высоком проценте ложноположительных или ложноотрицательных результатов.The disadvantages of these methods are expressed in low sensitivity or insufficient specificity of the markers used, a high percentage of false positive or false negative results.
Представленные недостатки определили направленность научных исследований на поиск более специфичных маркеров онкологического процесса. Наиболее близкими к заявляемому проекту являются способы диагностики онкологических заболеваний, основанные на выявлении мРНК, специфичной для опухолевых клеток. К настоящему времени известна группа раково-тестикулярных (СТ - от английского cancer/testis) генов, характеризующаяся ограниченной экспрессией в клетках человека. Транскрипция СТ генов наблюдается в семенниках, клетках зародыша и плаценты, иногда в клетках иммунопривилегированных тканей, а также в неопластических клетках различного происхождения. В остальных клетках экспрессия СТ генов подавлена эпигенетически [Simpson A.J.G., Caballero О.L., Jungbluth А., et al. 2005. Cancer/testis antigens, gametogenesis and cancer. Nature reviews. 5, 615-625]. Ограниченная экспрессия СТ генов позволяет использовать их мРНК в качестве маркеров опухолевых клеток при различных онкологических заболеваниях.The presented shortcomings determined the focus of scientific research on the search for more specific markers of the oncological process. Closest to the claimed project are methods for the diagnosis of cancer based on the detection of mRNA specific for tumor cells. To date, a group of cancer-testicular (CT - from English cancer / testis) genes is known, characterized by limited expression in human cells. Transcription of CT genes is observed in the testes, embryo and placenta cells, sometimes in cells of immunoprivileged tissues, as well as in neoplastic cells of various origins. In the remaining cells, expression of CT genes is suppressed epigenetically [Simpson A.J.G., Caballero O. L., Jungbluth A., et al. 2005. Cancer / testis antigens, gametogenesis and cancer. Nature reviews. 5, 615-625]. Limited expression of CT genes allows the use of their mRNA as markers of tumor cells in various oncological diseases.
К настоящему моменту известны несколько методов обнаружения мРНК СТ генов методом обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) или количественной ПЦР. Тестируются образцы опухолей, полученные хирургически, или образцы биологических жидкостей. Непосредственно сразу после извлечения образцы замораживают в жидком азоте для хранения и транспортировки. Для анализа образца проводят выделение мРНК. На ее основе синтезируется комплементарная ДНК (кДНК), которая амплифицируется с использованием ПЦР. Результаты реакции регистрируются методом электрофореза нуклеиновых кислот.To date, several methods are known for detecting mRNA of ST genes by reverse transcription — polymerase chain reaction (RT-PCR) or quantitative PCR. Samples of tumors obtained surgically or samples of biological fluids are tested. Immediately after extraction, the samples are frozen in liquid nitrogen for storage and transportation. For analysis of the sample, mRNA is isolated. Based on it, complementary DNA (cDNA) is synthesized, which is amplified using PCR. Reaction results are recorded by nucleic acid electrophoresis.
Известны способы идентификации мРНК группы генов MAGE-A методом ОТ-ПЦР, включающие праймеры и наборы для осуществления методов, например: US 5612201, С07К 14/47, С07К 16/30, C12Q 1/68, А61К 38/00, А61К 39/00, С07Н 21/02, С07Н 21/04, С12Р 19/34, опубл. 18.03.1997 г.; US 6057105, C12Q 1/68, С07Н 21/00, С07Н 21/04, С12Р 19/34, 02.05.2000 г; US 6475727, C12N 15/09, C12Q 1/68, G01N 33/50, G01N 33/574, опубл. 05.11.2002 г.; US 6939671, C12Q 1/68, С07Н 21/04, С12Р 19/34, опубл. 24.10.2002 г.; US 7491814, С07К 14/47, С12Р 19/34, C12Q 1/68, опубл. 06.07.2006 г.), мРНК группы генов SSX (US 6287756, А61К 38/00, С07Н 21/04, С07К 14/82, C12N 15/09, C12N 5/10, С12Р 19/34, С12Р 21/04, C12Q 1/00, C12Q 1/68, опубл. 11.09.2001 г.) и мРНК группы генов GAGE (US 7098008, C12N 15/09, C12N 15/12, C12Q 1/68, G01N 27/447, G01N 33/483, G01N 33/50, С12Р 19/34, опубл. 05.06.2003 г.). Присутствие в биологическом образце молекул мРНК генов MAGE-A, SSX и GAGE является индикатором опухолевого процесса в организме человека.Known methods for identifying mRNA of a group of MAGE-A genes by RT-PCR, including primers and kits for implementing methods, for example: US 5612201, C07K 14/47, C07K 16/30,
К недостаткам данных методов можно отнести низкую частоту обнаружения каждой из мРНК данных СТ генов, вызванную гетерогенностью экспрессии генов в опухолевых клетках. Случайный характер экспрессии СТ генов является основной проблемой для использования их мРНК в качестве маркеров опухолевых клеток. Для увеличения эффективности диагностики используют комбинации из нескольких маркеров.The disadvantages of these methods include the low detection rate of each of the mRNAs of these CT genes, caused by heterogeneity of gene expression in tumor cells. The random nature of the expression of CT genes is a major problem for the use of their mRNA as markers of tumor cells. Combinations of several markers are used to increase diagnostic efficiency.
Известен метод детекции метастазирующих опухолевых клеток в периферической крови человека при заболевании раком молочной железы, раком желудка, раком поджелудочной железы, раком толстого кишечника и метастазирующей меланомой с помощью мультимаркерной количественной ОТ-ПЦР с регистрацией результатов реакции в режиме реального времени. Метод основан на использовании панели биологических маркеров, среди которых MAGE-А3, GalNAcT, MART-1. РАХ3, Mitf, TRP-2, тирозиназа и другие (US 7910295, С12Р 19/34, C12Q 1/68, G01N 33/53, опубл. 30.12.2004 г.). Описан способ детекции меланомных или карциномных клеток с использованием количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени. В качестве маркеров меланомы в данном изобретении используются мРНК GalNAc-T. MAGE-А3, MART-1, РАХ3 и TRP-2, маркеров карциномы - мРНК C-Met, MAGE-А3, Stanniocalcin 1, Stanniocalcin 2, mammaglobin, HSP27, GalNAc-T, CK20 и beta-HCG (US 8039218, C12P 19/34, C12Q 1/68, G01N 33/53, опубл. 01.06.2006 г.).A known method for detecting metastatic tumor cells in human peripheral blood with breast cancer, gastric cancer, pancreatic cancer, colon cancer and metastatic melanoma using multimarker quantitative RT-PCR with real-time response results is recorded. The method is based on the use of a panel of biological markers, including MAGE-A3, GalNAcT, MART-1. PAX3, Mitf, TRP-2, tyrosinase and others (US 7910295, C12P 19/34,
К недостаткам представленных методов относится присутствие мРНК генов, постоянно экспрессирующихся в клетках кожи и других тканей человека, что позволяет использовать эти маркеры только для количественного сравнения между образцами.The disadvantages of the presented methods include the presence of mRNA genes that are constantly expressed in cells of the skin and other human tissues, which allows the use of these markers only for quantitative comparison between samples.
Для увеличения эффективности диагностики используют комбинации большого количества мРНК маркеров. Используемые способы включают выделение РНК, синтез кДНК с использованием олиго-Т праймера, содержащего последовательность промотора для Т7 РНК-полимеразы, синтез комплементарной РНК с использованием дидезоксинуклеозидтрифосфатов, меченных флуоресцентными красителем, гибридизацию с олигонуклеотидами, ковалентно связанными с поверхностью чипа, регистрацию результатов реакции и сравнение профилей экспрессии исследуемых генов между образцами с использованием компьютерных программ. Такой метод позволяет анализировать характер экспрессии от нескольких десятков до нескольких тысяч генов в исследуемом образце.To increase the diagnostic efficiency, combinations of a large number of mRNA markers are used. Methods used include RNA isolation, cDNA synthesis using an oligo-T primer containing a promoter sequence for T7 RNA polymerase, complementary RNA synthesis using dideoxynucleoside triphosphates labeled with fluorescent dye, hybridization with oligonucleotides covalently linked to the comparison reaction surface, registration expression profiles of the studied genes between samples using computer programs. This method allows you to analyze the nature of expression from several tens to several thousand genes in the test sample.
Известен способ обнаружения опухолевых клеток рака крови с использованием анализа экспрессии более чем семи тысяч генов человека. Метод основан на определении в образце биопсии паттернов мРНК 7074 генов, с использованием биочипов высокой плотности, которая сравнивается с паттерном мРНК тех же генов в образце, полученном от здорового человека. Основным недостатком этого метода является использование генов домашнего хозяйства для нормализации при сравнении паттернов мРНК между образцами и чипов высокой плотности, которая предполагает проведение исследования в нескольких повторах для исключения неспецифических сигналов (US 6936417, C12Q 1/68, 26.02.2004 г.).A known method for detecting tumor cells of blood cancer using analysis of the expression of more than seven thousand human genes. The method is based on the determination of 7074 genes mRNA patterns in a biopsy sample using high density biochips, which is compared with the mRNA pattern of the same genes in a sample obtained from a healthy person. The main drawback of this method is the use of housekeeping genes for normalization when comparing mRNA patterns between samples and high-density chips, which involves conducting a study in several repetitions to exclude non-specific signals (US 6936417,
Недостатками методов, основанных только на ОТ-ПЦР, является низкая частота обнаружения одного онкомаркера, а методов, основанных на использовании чипов высокой плотности, - низкая специфичность и сложность интерпретации результатов. Также они обладают общим недостатком - отсутствием метода хранения и транспортировки исследуемых образцов или использованием метода глубокой заморозки, при котором происходит деградация мРНК в момент оттаивания.The disadvantages of methods based only on RT-PCR are the low detection rate of one tumor marker, and methods based on the use of high-density chips are the low specificity and complexity of interpreting the results. They also have a common drawback - the lack of a method for storage and transportation of the studied samples or the use of the method of deep freezing, in which mRNA is degraded at the time of thawing.
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к предлагаемому изобретению является наиболее специфичный и чувствительный способ, основанный на выявлении мРНК двух семейств генов MAGEA и GAGE, включающий праймеры и набор для их использования (US 7098008, C12N 15/09, C12N 15/12, C12Q 1/68, G01N 27/447, G01N 33/483, G01N 33/50, С12Р 19/34, опубл. 05.06.2003 г.), выбранный в качестве ближайшего аналога (прототипа).The closest in technical essence and the achieved result to the present invention is the most specific and sensitive method based on the detection of mRNA of two families of the MAGEA and GAGE genes, including primers and a kit for their use (US 7098008, C12N 15/09, C12N 15/12, C12Q 1/68, G01N 27/447, G01N 33/483, G01N 33/50, C12P 19/34, published 05.06.2003), selected as the closest analogue (prototype).
В способе по прототипу праймеры получены на основе высокогомологичных последовательностей двенадцати субтипов гена MAGE и восьми субтипов гена GAGE. Диагностический набор предназначен для детекции мРНК шести субтипов гена MAGE и восьми субтипов гена GAGE методом ОТ-ПЦР для диагностики рака на начальных стадиях, мониторинга прогрессии заболевания и прогнозирования его течения.In the prototype method, primers are derived from highly homologous sequences of twelve subtypes of the MAGE gene and eight subtypes of the GAGE gene. The diagnostic kit is designed to detect mRNA of six subtypes of the MAGE gene and eight subtypes of the GAGE gene by RT-PCR for the diagnosis of cancer in the initial stages, monitoring the progression of the disease and predicting its course.
Недостатком способа является низкая частота обнаружения используемых маркеров в периферической крови (в 3 из 20 случаев).The disadvantage of this method is the low frequency of detection of used markers in peripheral blood (in 3 of 20 cases).
В задачу изобретения положено создание способа скрининга и мониторинга онкологических заболеваний с более высокой чувствительностью.The objective of the invention is the creation of a method for screening and monitoring of cancer with higher sensitivity.
Технический результат от использования изобретения заключается в повышении точности диагностики онкологических заболеваний различных органов.The technical result from the use of the invention is to improve the accuracy of diagnosis of cancer of various organs.
Это достигается тем, что в способе скрининга и мониторинга онкологических заболеваний путем выявления онкологических маркеров, состоящих из матричной РНК (мРНК) раково-тестикулярных генов MAGE и GAGE в образцах тканей человека, включающем забор образца ткани, выделение из образца ткани РНК, синтез кДНК и амплификацию методом множественной обратной транскрипции полимеразой цепной реакции с последующим анализом амплифицированных продуктов, дополнительно детектируют мРНК генов NY-ESO-1, SSX, XAGE1, TRAG3 и MAGEC1, при этом амплификацию проводят с композицией праймеров, специфических к мРНК генов MAGEA1-6, GAGE1-8, NY-ESO-1, SSX1, 2, 4, XAGE1, TRAG3 и MAGEC1, представленных последовательностями SEQ ID NO: 1-29; композицию праймеров используют для выявления онкологических маркеров, представляющих собой мРНК шести генов MAGEA (MAGEA1-6), мРНК восьми генов GAGE (GAGE1-8), мРНК трех генов SSX (SSX1, 2 и 4), мРНК NY-ESO-1, мРНК XAGE1, мРНК MAGEC1 и мРНК TRAG3; осуществляют консервацию образцов тканей путем смешивания образцов тканей с равным объемом консервирующего буфера.This is achieved by the fact that in a method for screening and monitoring oncological diseases by identifying oncological markers consisting of messenger RNA (mRNA) of the cancer testicular genes MAGE and GAGE in human tissue samples, including collecting a tissue sample, isolating RNA from a tissue sample, cDNA synthesis and amplification by multiple reverse transcription polymerase chain reaction followed by analysis of amplified products, mRNAs of the NY-ESO-1, SSX, XAGE1, TRAG3 and MAGEC1 genes are additionally detected, and amplification is carried out with it primers specific to mRNA of genes MAGEA1-6, GAGE1-8, NY-ESO-1, SSX1, 2, 4, XAGE1, TRAG3 and MAGEC1, represented by sequences SEQ ID NO: 1-29; the primer composition is used to identify oncological markers, which are mRNAs of six MAGEA genes (MAGEA1-6), mRNAs of eight GAGE genes (GAGE1-8), mRNAs of three SSX genes (SSX1, 2 and 4), NY-ESO-1 mRNA, mRNA XAGE1, MAGEC1 mRNA and TRAG3 mRNA; preserve tissue samples by mixing tissue samples with an equal volume of preservation buffer.
Это достигается также тем, что в способе скрининга и мониторинга онкологических заболеваний путем выявления онкологических маркеров, состоящих из матричной РНК (мРНК) раково-тестикулярных генов MAGE и GAGE в образцах тканей человека, включающем забор образца ткани, выделение из образца ткани РНК, синтез кДНК и амплификацию с последующим анализом амплифицированных продуктов, дополнительно детектируют мРНК генов NY-ESO-E SSX, XAGEE TRAG3 и MAGEC1, при этом амплификацию проводят с использованием нуклеозидтрифосфатов, меченных флуоресцентным красителем, и анализируют присутствие мРНК генов MAGEA1-6, GAGE1-8, NY-ESO-1, SSX1, 2, 4, XAGE1, TRAG3 и MAGEC1 методом гибридизации нуклеиновых кислот с использованием композиции праймеров, представленных последовательностями SEQ ID NO: 1-29, и зондов, представленных последовательностями SEQ ID NO: 30-37; используют композицию праймеров и зондов для выявления онкологических маркеров, представляющих собой мРНК шести генов MAGEA (MAGEA1-6), мРНК восьми генов GAGE (GAGEJ-8), мРНК трех генов SSX (SSX1, 2 и 4), мРНК NY-ESO-1, мРНК XAGE1, мРНК MAGEC1 и мРНК TRAG3; осуществляют консервацию образцов тканей путем смешивания образцов тканей с равным объемом консервирующего буфера.This is also achieved by the fact that in the method of screening and monitoring oncological diseases by identifying oncological markers consisting of messenger RNA (mRNA) of the cancer testicular genes MAGE and GAGE in human tissue samples, including sampling a tissue sample, isolating RNA from a tissue sample, cDNA synthesis and amplification followed by analysis of the amplified products, mRNAs of the NY-ESO-E SSX, XAGEE TRAG3 and MAGEC1 genes are additionally detected, the amplification being carried out using nucleoside triphosphates labeled with a fluorescent dye, and detect the presence of mRNA of the genes MAGEA1-6, GAGE1-8, NY-ESO-1, SSX1, 2, 4, XAGE1, TRAG3 and MAGEC1 by nucleic acid hybridization using a composition of primers represented by the sequences SEQ ID NO: 1-29 and probes represented by the sequences of SEQ ID NO: 30-37; use a composition of primers and probes to identify oncological markers, which are mRNAs of six MAGEA genes (MAGEA1-6), mRNAs of eight GAGE genes (GAGEJ-8), mRNAs of three SSX genes (SSX1, 2 and 4), NY-ESO-1 mRNA , XAGE1 mRNA, MAGEC1 mRNA and TRAG3 mRNA; preserve tissue samples by mixing tissue samples with an equal volume of preservation buffer.
Это достигается также тем, что набор для осуществления скрининга и мониторинга онкологических заболеваний включает праймеры, имеющие последовательности SEQ ID NO: 1-29.This is also achieved by the fact that the kit for screening and monitoring of cancer includes primers having the sequence of SEQ ID NO: 1-29.
Это достигается также тем, что набор для осуществления скрининга и мониторинга онкологических заболеваний включает праймеры, имеющие последовательности SEQ ID NO: 1-29, и зонды, имеющие последовательности SEQ ID NO: 1-37.This is also achieved by the fact that the kit for screening and monitoring cancer includes primers having the sequences of SEQ ID NO: 1-29, and probes having the sequence of SEQ ID NO: 1-37.
На фиг.1 представлены результаты обнаружения мРНК раково-тестикулярных генов в образце опухолевого очага больного раком толстого кишечника методом ОТ-ПЦР (электрофореграмма), б - мРНК TRAG3 (159 п.н.); в - мРНК MAGEC1 (138 п.н.); г - мРНК NY-ESO-1 (159 п.н.); д - мРНК SSXE2.4 (129 п.н.); е - мРНК MAGEA1-6 (265 п.н.); ж - мРНК XAGE1 (162 п.н.); з - мРНК GAGE 1-8 (170 п.н.).Figure 1 presents the results of detection of mRNA of cancer testicular genes in a sample of a tumor site of a patient with colon cancer by RT-PCR (electrophoregram), b - TRAG3 mRNA (159 bp); c - MAGEC1 mRNA (138 bp); g - mRNA NY-ESO-1 (159 bp); d - SSXE2.4 mRNA (129 bp); e - MAGEA1-6 mRNA (265 bp); g - XAGE1 mRNA (162 bp); h - GAGE 1-8 mRNA (170 bp).
На фиг.2. представлена гибридизационная картина обнаружения мРНК раково-тестикулярных генов: 1 - мРНК MAGEA1-6, 2 и 8 - отрицательный контроль, 3 - мРНК NY-ESO-1, 4 - мРНК MAGEC1, 5 - мРНК TRAG3, 6 - мРНК SSX1, 2, 4, 7 - мРНК XAGE1, 9 - мРНК GAGE1-8.In figure 2. a hybridization picture of detection of cancer testicular genes mRNA is presented: 1 - MAGEA1-6 mRNA, 2 and 8 - negative control, 3 - NY-ESO-1 mRNA, 4 - MAGEC1 mRNA, 5 - TRAG3 mRNA, 6 - SSX1, 2 mRNA, 2, 4, 7 - mRNA XAGE1, 9 - mRNA GAGE1-8.
На фиг.3 представлена диаграмма частоты обнаружения мРНК MAGEA1-6, GAGE 1-8, NY-ESO-1, SSX1, 2, 4. XAGE1, TRAG3 и MAGE-C1 в опухолевых очагах и периферической крови онкологических больных (черная заливка - опухолевые очаги, серая заливка - периферическая кровь).Figure 3 presents a diagram of the frequency of detection of mAGNA MAGEA1-6, GAGE 1-8, NY-ESO-1, SSX1, 2, 4. XAGE1, TRAG3 and MAGE-C1 in tumor foci and peripheral blood of cancer patients (black fill - tumor foci, gray fill - peripheral blood).
В соответствии с изобретением по 1 варианту используют композиции из праймеров для выявления онкологических маркеров, представляющих собой мРНК шести генов MAGEA (MAGEA1-6), мРНК восьми генов GAGE (GAGE1-8), мРНК трех генов SSX (SSX1, 2 и 4), мРНК NY-ESO-1, мРНК XAGE1, мРНК MAGEC1 и мРНК TRAG3, и в соответствии с изобретением по 2 варианту используют композиции из праймеров и зондов для выявления онкологических маркеров, представляющих собой мРНК шести генов MAGEA (MAGEA 1-6), мРНК восьми генов GAGE (GAGE 1-8), мРНК трех генов SSX (SSX1, 2 и 4), мРНК NY-ESO-1, мРНК XAGE1, мРНК MAGEC1 и мРНК TRA.G3, которые с высокой частотой детектируются в образцах тканей больных раком, включая периферическую кровь, но не выявляется в периферической крови людей без онкологических заболеваний. Данное наблюдение позволило создать способ диагностики онкологических заболеваний, основанный на исследовании тканей человека на присутствие композиции маркеров и с высокой вероятностью диагностировать наличие новообразования в случае обнаружения одной или более мРНК из представленных в композиции.In accordance with the invention, according to
Обнаружение мРНК генов, входящих в композицию, осуществляют с помощью традиционных методов, например ОТ-ПЦР, гибридизации нуклеиновых кислот и т.д. Лучшие результаты достигались методом множественной ОТ-ПЦР с использованием оригинальных праймеров и гибридизацией нуклеиновых кислот с оригинальными олигонуклеотидными зондами. Образец ткани человека используют для анализа сразу после инвазивного вмешательства или помещают в консервирующий раствор, транспортируют до места использования или хранят при отрицательных температурах. Из образца выделяют РНК, которую превращают в кДНК и амплифицируют в присутствии оригинальных олигонуклеотидов и нуклеозидтрифосфатов, содержащих флуоресцентный краситель. Меченую кДНК гибридизуют с оригинальными олигонуклеотидными зондами, прикрепленными к подложке, и оценивают результат по присутствию флуоресценции. Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.Detection of mRNA of genes included in the composition is carried out using traditional methods, for example, RT-PCR, nucleic acid hybridization, etc. The best results were achieved by multiple RT-PCR using original primers and hybridization of nucleic acids with original oligonucleotide probes. A human tissue sample is used for analysis immediately after invasive intervention or is placed in a preservation solution, transported to the place of use, or stored at low temperatures. RNA is isolated from the sample, which is converted into cDNA and amplified in the presence of original oligonucleotides and nucleoside triphosphates containing a fluorescent dye. Labeled cDNAs are hybridized with the original oligonucleotide probes attached to the substrate, and the result is evaluated by the presence of fluorescence. The proposed method is as follows.
Используют следующие нуклеотидные последовательности mRNA, зарегистрированные и обозначенные в базе данных GenBank: Homo sapiens (далее - Hs) G antigen 1 (GAGE1), NM_001468; Hs G antigen 2 (GAGE2), NM_001472; Hs G antigen 3 (GAGE3), NM_001473; Hs G antigen 4 (GAGE4), NM__001474; Hs G antigen 5 (GAGE5), NM_001475; Hs G antigen 6 (GAGE6), NM_001476; Hs G antigen 7 (GAGE7), NM021123; Hs G antigen 8 (GAGE8), NM_012196; Hs G antigen, family D. 2 (XAGE1), NM 020411; Hs autoimmunogenic cancer/testis antigen NY-ESO-1, U87459; Hs melanoma antigen family С, 1 (MAGEC1), NM_005462 и XM_936930; Hs synovial sarcoma, X breakpoint 1 (SSX1), NM_005635 XM; Hs synovial sarcoma, X breakpoint 2 (SSX2), transcript variant 1, NM 003147; Hs synovial sarcoma, X breakpoint 4 (SSX4), transcript variant 1, NM_005636; Hs melanoma antigen family A, 1 (MAGEA1), NM_004988; Hs melanoma antigen family A, 2 (MAGEA2), NM_153488; Hs melanoma antigen family A, 3 (MAGEA3), NM_005362; Hs melanoma antigen family A, 4 (MAGEA4), NM 001011548; Hs melanoma antigen family A, 5 (MAGEA5), NM_021049; Hs melanoma antigen family A, 6 (MAGEA6), NM 005363; Hs taxol resistant associated protein (TRAG3), AF 080246.1.Use the following mRNA nucleotide sequences registered and indicated in the GenBank database: Homo sapiens (hereinafter referred to as Hs) G antigen 1 (GAGE1), NM_001468; Hs G antigen 2 (GAGE2), NM_001472; Hs G antigen 3 (GAGE3), NM_001473; Hs G antigen 4 (GAGE4), NM__001474; Hs G antigen 5 (GAGE5), NM_001475; Hs G antigen 6 (GAGE6), NM_001476; Hs G antigen 7 (GAGE7), NM021123; Hs G antigen 8 (GAGE8), NM_012196; Hs G antigen, family D. 2 (XAGE1), NM 020411; Hs autoimmunogenic cancer / testis antigen NY-ESO-1, U87459; Hs melanoma antigen family C, 1 (MAGEC1), NM_005462 and XM_936930; Hs synovial sarcoma, X breakpoint 1 (SSX1), NM_005635 XM; Hs synovial sarcoma, X breakpoint 2 (SSX2), transcript variant 1, NM 003147; Hs synovial sarcoma, X breakpoint 4 (SSX4), transcript variant 1, NM_005636; Hs melanoma antigen family A, 1 (MAGEA1), NM_004988; Hs melanoma antigen family A, 2 (MAGEA2), NM_153488; Hs melanoma antigen family A, 3 (MAGEA3), NM_005362; Hs melanoma antigen family A, 4 (MAGEA4), NM 001011548; Hs melanoma antigen family A, 5 (MAGEA5), NM_021049; Hs melanoma antigen family A, 6 (MAGEA6), NM 005363; Hs taxol resistant associated protein (TRAG3), AF 080246.1.
Анализ нуклеотидных последовательностей проводят с использованием ресурсов, доступных в интернете на портале NCBI, и компьютерной программы MEGA3.1.Analysis of nucleotide sequences is carried out using resources available on the Internet on the NCBI portal, and the computer program MEGA3.1.
На основе проведенного анализа, для каждой из исследуемых мРНК подбирают олигонуклеотидные праймеры, специфичные к местам соединения экзонов, что позволяло предотвратить амплификацию хромосомной ДНК при проведении ПЦР, и разрабатывают олигонуклеотидные зонды, специфичные к синтезируемой в ПЦР ДНК.Based on the analysis, oligonucleotide primers specific for exon junction sites are selected for each mRNA under study, which prevented amplification of chromosomal DNA during PCR, and oligonucleotide probes specific for the DNA synthesized in PCR are developed.
Для семейств генов MAGEA, GAGE, SSX конструируют универсальные праймеры и зонды, позволяющие одновременно детектировать мРНК шести генов MAGEA (MAGEA1-6), а также универсальные праймеры и зонды для мРНК восьми генов GAGE (GAGE 1-8) и праймеры и зонды, специфичные одновременно к мРНК трех генов SSX (SSX1, 2, 4).For the MAGEA, GAGE, SSX gene families, universal primers and probes are designed to simultaneously detect the mRNA of six MAGEA genes (MAGEA1-6), as well as universal primers and probes for the mRNA of the eight GAGE genes (GAGE 1-8) and primers and probes specific simultaneously to mRNA of three SSX genes (SSX1, 2, 4).
Праймеры используют в ОТ-ПЦР, а праймеры и зонды - в гибридизации нуклеиновых кислот.Primers are used in RT-PCR, and primers and probes are used in nucleic acid hybridization.
Для осуществления заявленного способа скрининга и мониторинга онкологических заболеваний используют следующий набор олигонуклеотидов в качестве праймеров и зондов для детекции и/или идентификации мРНК генов MAGEA1-6, GAGE 1-8, NY-ESO-1, SSX1, 2, 4, XAGE1, TRAG3 и MAGEC1.To implement the claimed method for screening and monitoring cancer, use the following set of oligonucleotides as primers and probes for detection and / or identification of mRNA genes MAGEA1-6, GAGE 1-8, NY-ESO-1, SSX1, 2, 4, XAGE1, TRAG3 and MAGEC1.
Количество последовательностей: 37Number of sequences: 37
№ последовательности: SEQ ID NO: 1Sequence No: SEQ ID NO: 1
Длина: 19 нуклеотидовLength: 19 nucleotides
Тип молекулы: одноцепочечная линейная ДНКMolecule type: single-stranded linear DNA
Происхождение: синтетическая последовательностьOrigin: synthetic sequence
Назначение: праймер для детекции и/или идентификации мРНК генов MAGEA1-6Purpose: primer for the detection and / or identification of mRNA genes MAGEA1-6
Описание последовательности SEQ ID NO: 1(5′-3′):Description of the sequence SEQ ID NO: 1 (5′-3 ′):
ACTGAAGGAGAAGATCTGCACTGAAGGAGAAGATCTGC
№ последовательности: SEQ ID NO: 2Sequence No: SEQ ID NO: 2
Длина: 19 нуклеотидовLength: 19 nucleotides
Тип молекулы: одноцепочечная линейная ДНКMolecule type: single-stranded linear DNA
Происхождение: синтетическая последовательностьOrigin: synthetic sequence
Назначение: праймер для детекции и/или идентификации мРНК генов MAGEA 1-6Purpose: primer for the detection and / or identification of mRNA genes MAGEA 1-6
Описание последовательности SEQ ID NO: 2(5′-3′):Description of the sequence SEQ ID NO: 2 (5′-3 ′):
GTGCTTGGCCCCTCCTCTTCGTGCTTGGCCCCTCCTCTTC
№ последовательности: SEQ ID NO :3Sequence No: SEQ ID NO: 3
Длина: 20 нуклеотидовLength: 20 nucleotides
Тип молекулы: одноцепочечная линейная ДНКMolecule type: single-stranded linear DNA
Происхождение: синтетическая последовательностьOrigin: synthetic sequence
Назначение: праймер для детекции и/или идентификации мРНК генов MAGEA 1-6Purpose: primer for the detection and / or identification of mRNA genes MAGEA 1-6
Описание последовательности SEQ ID NO: 3(5′-3′):Description of the sequence SEQ ID NO: 3 (5′-3 ′):
GAAGGAGAAGATCTGCCWGT (W=А или Т)GAAGGAGAAGATCTGCCWGT (W = A or T)
№ последовательности: SEQ ID NO:4Sequence No: SEQ ID NO: 4
Длина: 20 нуклеотидовLength: 20 nucleotides
Тип молекулы: одноцепочечная линейная ДНКMolecule type: single-stranded linear DNA
Происхождение: синтетическая последовательностьOrigin: synthetic sequence
Назначение: праймер для детекции и/или идентификации мРНК генов MAGEA 1-6Purpose: primer for the detection and / or identification of mRNA genes MAGEA 1-6
Описание последовательности SEQ ID NO: 4(5′-3′):Description of the sequence SEQ ID NO: 4 (5′-3 ′):
CTGGAGGCTCCCTGAGGACTCTGGAGGCTCCCTGAGGACT
№ последовательности: SEQ ID NO: 6Sequence No: SEQ ID NO: 6
Длина: 20 нуклеотидовLength: 20 nucleotides
Тип молекулы: одноцепочечная линейная ДНКMolecule type: single-stranded linear DNA
Происхождение: синтетическая последовательностьOrigin: synthetic sequence
Назначение: праймер для детекции и/или идентификации мРНК генов SSX1, 2, 4Purpose: primer for the detection and / or identification of mRNA genes SSX1, 2, 4
Описание последовательности SEQ ID NO: 5(5′-3′):Description of the sequence SEQ ID NO: 5 (5′-3 ′):
GAGAAGTTCCGAAAGGCCTTGAGAAGTTCCGAAAGGCCTT
№ последовательности: SEQ ID NO: 7Sequence No: SEQ ID NO: 7
Длина: 21 нуклеотидовLength: 21 nucleotides
Тип молекулы: одноцепочечная линейная ДНКMolecule type: single-stranded linear DNA
Происхождение: синтетическая последовательностьOrigin: synthetic sequence
Назначение: праймер для детекции и/или идентификации мРНК генов SSX1, 2, 4Purpose: primer for the detection and / or identification of mRNA genes SSX1, 2, 4
Описание последовательности SEQ ID NO: 7(5′-3′):Description of the sequence SEQ ID NO: 7 (5′-3 ′):
AGGTTATGACTAAACTAGGTAGGTTATGACTAAACTAGGT
№ последовательности: SEQ ID NO: 8Sequence No: SEQ ID NO: 8
Длина: 20 нуклеотидовLength: 20 nucleotides
Тип молекулы: одноцепочечная линейная ДНКMolecule type: single-stranded linear DNA
Происхождение: синтетическая последовательностьOrigin: synthetic sequence
Назначение: праймер для детекции и/или идентификации мРНК генов SSX1, 2, 4Purpose: primer for the detection and / or identification of mRNA genes SSX1, 2, 4
Описание последовательности SEQ ID NO: 8(5′-3′):Description of the sequence SEQ ID NO: 8 (5′-3 ′):
AAGTCATCTGAGGACGTTCAAAGTCATCTGAGGACGTTCA
№ последовательности: SEQ ID NO: 9Sequence No: SEQ ID NO: 9
Длина: 20 нуклеотидовLength: 20 nucleotides
Тип молекулы: одноцепочечная линейная ДНКMolecule type: single-stranded linear DNA
Происхождение: синтетическая последовательностьOrigin: synthetic sequence
Назначение: праймер для детекции и/или идентификации мРНК гена XAGE1Purpose: primer for the detection and / or identification of XAGE1 gene mRNA
Описание последовательности SEQ ID NO: 9(5′-3′):Description of the sequence SEQ ID NO: 9 (5′-3 ′):
CTACTGAGACACGGCGGACACTACTGAGACACGGCGGACA
№ последовательности: SEQ ID NO: 10Sequence No: SEQ ID NO: 10
Длина: 20 нуклеотидовLength: 20 nucleotides
Тип молекулы: одноцепочечная линейная ДНКMolecule type: single-stranded linear DNA
Происхождение: синтетическая последовательностьOrigin: synthetic sequence
Назначение: праймер для детекции и/или идентификации мРНК гена XAGE1Purpose: primer for the detection and / or identification of XAGE1 gene mRNA
Описание последовательности SEQ ID NO: 10(5′-3′):Description of the sequence SEQ ID NO: 10 (5′-3 ′):
TTGTTTCAGCTTGTCTTCATTTGTTTCAGCTTGTCTTCAT
№ последовательности: SEQ ID NO: 11Sequence No: SEQ ID NO: 11
Длина: 20 нуклеотидовLength: 20 nucleotides
Тип молекулы: одноцепочечная линейная ДНКMolecule type: single-stranded linear DNA
Происхождение: синтетическая последовательностьOrigin: synthetic sequence
Назначение: праймер для детекции и/или идентификации мРНК гена XAGE1Purpose: primer for the detection and / or identification of XAGE1 gene mRNA
Описание последовательности SEQ ID NO: 11(5′-3′):Description of the sequence SEQ ID NO: 11 (5′-3 ′):
ATACAGCTGAGATCCCAGTGATACAGCTGAGATCCCAGTG
№ последовательности: SEQ ID NO: 12Sequence No: SEQ ID NO: 12
Длина: 20 нуклеотидовLength: 20 nucleotides
Тип молекулы: одноцепочечная линейная ДНКMolecule type: single-stranded linear DNA
Происхождение: синтетическая последовательностьOrigin: synthetic sequence
Назначение: праймер для детекции и/или идентификации мРНК гена XAGE1Purpose: primer for the detection and / or identification of XAGE1 gene mRNA
Описание последовательности SEQ ID NO: 12(5′-3′):Description of the sequence SEQ ID NO: 12 (5′-3 ′):
TTGTGGTTGCTCTTCACCTGTTGTGGTTGCTCTTCACCTG
№ последовательности: SEQ ID NO: 13Sequence No: SEQ ID NO: 13
Длина: 20 нуклеотидовLength: 20 nucleotides
Тип молекулы: одноцепочечная линейная ДНКMolecule type: single-stranded linear DNA
Происхождение: синтетическая последовательностьOrigin: synthetic sequence
Назначение: праймер для детекции и/или идентификации мРНК гена MAGEC1Appointment: a primer for detection and / or identification of mRNA of the MAGEC1 gene
Описание последовательности SEQ ID NO: 13(5′-3′):Description of the sequence SEQ ID NO: 13 (5′-3 ′):
CCTATCCAGTCTTCAAGGTGCCTATCCAGTCTTCAAGGTG
№ последовательности: SEQ ID NO: 14Sequence No: SEQ ID NO: 14
Длина: 20 нуклеотидовLength: 20 nucleotides
Тип молекулы: одноцепочечная линейная ДНК Происхождение: синтетическая последовательностьMolecule type: single-stranded linear DNA Origin: synthetic sequence
Назначение: праймер для детекции и/или идентификации мРНК гена MAGEC1Appointment: a primer for detection and / or identification of mRNA of the MAGEC1 gene
Описание последовательности SEQ ID NO: 14(5′-3′):Description of the sequence SEQ ID NO: 14 (5′-3 ′):
CAGGACAACTCTGAGGACTCCAGGACAACTCTGAGGACTC
№ последовательности: SEQ ID NO: 15Sequence No: SEQ ID NO: 15
Длина: 20 нуклеотидовLength: 20 nucleotides
Тип молекулы: одноцепочечная линейная ДНКMolecule type: single-stranded linear DNA
Происхождение: синтетическая последовательностьOrigin: synthetic sequence
Назначение: праймер для детекции и/или идентификации мРНК гена MAGEC1Appointment: a primer for detection and / or identification of mRNA of the MAGEC1 gene
Описание последовательности SEQ ID NO: 15(5′-3′):Description of the sequence SEQ ID NO: 15 (5′-3 ′):
AGTGCCAGGAGTCAAGGTTCAGTGCCAGGAGTCAAGGTTC
№ последовательности: SEQ ID NO: 16Sequence No: SEQ ID NO: 16
Длина: 20 нуклеотидовLength: 20 nucleotides
Тип молекулы: одноцепочечная линейная ДНКMolecule type: single-stranded linear DNA
Происхождение: синтетическая последовательностьOrigin: synthetic sequence
Назначение: праймер для детекции и/или идентификации мРНК гена MAGEC1Appointment: a primer for detection and / or identification of mRNA of the MAGEC1 gene
Описание последовательности SEQ ID NO: 16(5′-3′):Description of the sequence SEQ ID NO: 16 (5′-3 ′):
GCATATCCTTGTCCCCCATGGCATATCCTTGTCCCCCATG
№ последовательности: SEQ ID NO: 17Sequence No: SEQ ID NO: 17
Длина: 20 нуклеотидовLength: 20 nucleotides
Тип молекулы: одноцепочечная линейная ДНКMolecule type: single-stranded linear DNA
Происхождение: синтетическая последовательностьOrigin: synthetic sequence
Назначение: праймер для детекции и/или идентификации мРНК гена NY-ESO-1Purpose: primer for the detection and / or identification of NY-ESO-1 gene mRNA
Описание последовательности SEQ ID NO: 17(5′-3′):Description of the sequence SEQ ID NO: 17 (5′-3 ′):
AGAGCCGCCTGCTTGAGTTCAGAGCCGCCTGCTTGAGTTC
№ последовательности: SEQ ID NO: 18Sequence No: SEQ ID NO: 18
Длина: 20 нуклеотидовLength: 20 nucleotides
Тип молекулы: одноцепочечная линейная ДНКMolecule type: single-stranded linear DNA
Происхождение: синтетическая последовательностьOrigin: synthetic sequence
Назначение: праймер для детекции и/или идентификации мРНК гена NY-ESO-1Purpose: primer for the detection and / or identification of NY-ESO-1 gene mRNA
Описание последовательности SEQ ID NO: 18(5′-3′):Description of the sequence SEQ ID NO: 18 (5′-3 ′):
TCTGCAGCAGTCAGTCGGATTCTGCAGCAGTCAGTCGGAT
№ последовательности: SEQ ID NO: 19Sequence No: SEQ ID NO: 19
Длина: 20 нуклеотидовLength: 20 nucleotides
Тип молекулы: одноцепочечная линейная ДНКMolecule type: single-stranded linear DNA
Происхождение: синтетическая последовательностьOrigin: synthetic sequence
Назначение: праймер для детекции и/или идентификации мРНК гена NY-ESO-1Purpose: primer for the detection and / or identification of NY-ESO-1 gene mRNA
Описание последовательности SEQ IDNO: 19(5′-3′):SEQ IDNO Sequence Description: 19 (5′-3 ′):
CCTGCTTGAGTTCTACCTCGCCTGCTTGAGTTCTACCTCG
№ последовательности: SEQ ID NO: 20Sequence No: SEQ ID NO: 20
Длина: 20 нуклеотидовLength: 20 nucleotides
Тип молекулы: одноцепочечная линейная ДНКMolecule type: single-stranded linear DNA
Происхождение: синтетическая последовательностьOrigin: synthetic sequence
Назначение: праймер для детекции и/или идентификации мРНК гена NY-ESO-1Purpose: primer for the detection and / or identification of NY-ESO-1 gene mRNA
Описание последовательности SEQ ID NO: 20(5′-3′):Description of the sequence SEQ ID NO: 20 (5′-3 ′):
GCAGTCAGTCGGATAGTCAGGCAGTCAGTCGGATAGTCAG
№ последовательности: SEQ ID NO: 21Sequence No: SEQ ID NO: 21
Длина: 20 нуклеотидовLength: 20 nucleotides
Тип молекулы: одноцепочечная линейная ДНКMolecule type: single-stranded linear DNA
Происхождение: синтетическая последовательностьOrigin: synthetic sequence
Назначение: праймер для детекции и/или идентификации мРНК генов GAGE 1-8Purpose: primer for the detection and / or identification of mRNA genes GAGE 1-8
Описание последовательности SEQ ID NO: 21(5′-3′):Description of the sequence SEQ ID NO: 21 (5′-3 ′):
ATTGGGCCTATGCGGCCCGAATTGGGCCTATGCGGCCCGA
№ последовательности: SEQ ID NO: 22Sequence No: SEQ ID NO: 22
Длина: 20 нуклеотидовLength: 20 nucleotides
Тип молекулы: одноцепочечная линейная ДНКMolecule type: single-stranded linear DNA
Происхождение: синтетическая последовательностьOrigin: synthetic sequence
Назначение: праймер для детекции и/или идентификации мРНК генов GAGE 1-8Purpose: primer for the detection and / or identification of mRNA genes GAGE 1-8
Описание последовательности SEQ ID NO: 22(5′-3′):Description of the sequence SEQ ID NO: 22 (5′-3 ′):
TCCAACAYAGGAGCAGCCTG (Y=Т или С)TCCAACAYAGGAGCAGCCTG (Y = T or C)
№ последовательности: SEQ ID NO: 23Sequence No: SEQ ID NO: 23
Длина: 20 нуклеотидовLength: 20 nucleotides
Тип молекулы: одноцепочечная линейная ДНКMolecule type: single-stranded linear DNA
Происхождение: синтетическая последовательностьOrigin: synthetic sequence
Назначение: праймер для детекции и/или идентификации мРНК генов GAGE 1-8Purpose: primer for the detection and / or identification of mRNA genes GAGE 1-8
Описание последовательности SEQ ID NO: 23(5′-3′):Description of the sequence SEQ ID NO: 23 (5′-3 ′):
AGCATCTGCAGSTCAAGGGC (S=G или С)AGCATCTGCAGSTCAAGGGC (S = G or C)
№ последовательности: SEQ ID NO: 24Sequence No: SEQ ID NO: 24
Длина: 20 нуклеотидовLength: 20 nucleotides
Тип молекулы: одноцепочечная линейная ДНКMolecule type: single-stranded linear DNA
Происхождение: синтетическая последовательностьOrigin: synthetic sequence
Назначение: праймер для детекции и/или идентификации мРНК генов GAGE 1-8Purpose: primer for the detection and / or identification of mRNA genes GAGE 1-8
Описание последовательности SEQ ID NO: 24(5′-3′):Description of the sequence SEQ ID NO: 24 (5′-3 ′):
TCTTTTAACACTGTGATTGCTCTTTTAACACTGTGATTGC
№ последовательности: SEQ ID NO: 26Sequence No: SEQ ID NO: 26
Длина: 20 нуклеотидовLength: 20 nucleotides
Тип молекулы: одноцепочечная линейная ДНКMolecule type: single-stranded linear DNA
Происхождение: синтетическая последовательностьOrigin: synthetic sequence
Назначение: праймер для детекции и/или идентификации мРНК гена TRAG3Purpose: primer for the detection and / or identification of TRAG3 gene mRNA
Описание последовательности SEQ ID NO: 26(5′-3′):Description of the sequence SEQ ID NO: 26 (5′-3 ′):
AGAAGCCCTATCAAAGTTCCAGAAGCCCTATCAAAGTTCC
№ последовательности: SEQ ID NO: 27Sequence No: SEQ ID NO: 27
Длина: 20 нуклеотидовLength: 20 nucleotides
Тип молекулы: одноцепочечная линейная ДНКMolecule type: single-stranded linear DNA
Происхождение: синтетическая последовательностьOrigin: synthetic sequence
Назначение: праймер для детекции и/или идентификации мРНК гена TRAG3Purpose: primer for the detection and / or identification of TRAG3 gene mRNA
Описание последовательности SEQ ID NO: 27(5′-3′):Description of the sequence SEQ ID NO: 27 (5′-3 ′):
TTGTGGTCCCGCTATGGCTCTTGTGGTCCCGCTATGGCTC
№ последовательности: SEQ ID NO: 28Sequence No: SEQ ID NO: 28
Длина: 20 нуклеотидовLength: 20 nucleotides
Тип молекулы: одноцепочечная линейная ДНКMolecule type: single-stranded linear DNA
Происхождение: синтетическая последовательностьOrigin: synthetic sequence
Назначение: праймер для детекции и/или идентификации мРНК гена TRAG3Purpose: primer for the detection and / or identification of TRAG3 gene mRNA
Описание последовательности SEQ ID NO: 28(5′-3′):Description of the sequence SEQ ID NO: 28 (5′-3 ′):
AGAAGCCCTATCAAAGTTCCAGAAGCCCTATCAAAGTTCC
№ последовательности: SEQ ID NO: 29Sequence No: SEQ ID NO: 29
Длина: 20 нуклеотидовLength: 20 nucleotides
Тип молекулы: одноцепочечная линейная ДНКMolecule type: single-stranded linear DNA
Происхождение: синтетическая последовательностьOrigin: synthetic sequence
Назначение: праймер для детекции и/или идентификации мРНК гена TRAG3Purpose: primer for the detection and / or identification of TRAG3 gene mRNA
Описание последовательности SEQ ID NO: 29(5′-3′):Description of the sequence SEQ ID NO: 29 (5′-3 ′):
TCGTTCGGCTGGTCAGAGTGTCGTTCGGCTGGTCAGAGTG
№ последовательности: SEQ ID NO: 30Sequence No: SEQ ID NO: 30
Длина: 30 нуклеотидовLength: 30 nucleotides
Тип молекулы: одноцепочечная линейная ДНКMolecule type: single-stranded linear DNA
Происхождение: синтетическая последовательностьOrigin: synthetic sequence
Назначение: зонд для детекции и/или идентификации мРНК генов MAGEA1-6Purpose: probe for the detection and / or identification of mRNA genes MAGEA1-6
Описание последовательности SEQ ID NO: 30(5′-3′):Description of the sequence SEQ ID NO: 30 (5′-3 ′):
GGCATGATGACTCTGGTCAGGGCAACAGGCGGCATGATGACTCTGGTCAGGGCAACAGGC
№ последовательности: SEQ ID NO: 31Sequence No: SEQ ID NO: 31
Длина: 30 нуклеотидовLength: 30 nucleotides
Тип молекулы: одноцепочечная линейная ДНКMolecule type: single-stranded linear DNA
Происхождение: синтетическая последовательностьOrigin: synthetic sequence
Назначение: зонд для детекции и/или идентификации мРНК генов SSX 1, 2, 4Purpose: probe for detection and / or identification of
Описание последовательности SEQ ID NO: 31(5′-3′):Description of the sequence SEQ ID NO: 31 (5′-3 ′):
CCACGGTTAGGGTCATTATCCAAATCATTCCCACGGTTAGGGTCATTATCCAAATCATTC
№ последовательности: SEQ ID NO: 32Sequence No: SEQ ID NO: 32
Длина: 30 нуклеотидовLength: 30 nucleotides
Тип молекулы: одноцепочечная линейная ДНКMolecule type: single-stranded linear DNA
Происхождение: синтетическая последовательностьOrigin: synthetic sequence
Назначение: зонд для детекции и/или идентификации мРНК гена XAGE1Purpose: probe for detection and / or identification of XAGE1 gene mRNA
Описание последовательности SEQ ID NO: 32(5′-3′):Description of the sequence SEQ ID NO: 32 (5′-3 ′):
TGCATCAGTCAAACACCGGGGATAAATCTGTGCATCAGTCAAACACCGGGGATAAATCTG
№ последовательности: SEQ ID NO: 33Sequence No: SEQ ID NO: 33
Длина: 30 нуклеотидовLength: 30 nucleotides
Тип молекулы: одноцепочечная линейная ДНКMolecule type: single-stranded linear DNA
Происхождение: синтетическая последовательностьOrigin: synthetic sequence
Назначение: зонд для детекции и/или идентификации мРНК гена MAGEC1Purpose: probe for detection and / or identification of mRNA of the MAGEC1 gene
Описание последовательности SEQ ID NO: 33(5′-3′):Description of the sequence SEQ ID NO: 33 (5′-3 ′):
TAGAGCACCACCTTAAGAGAAGAAGAGCTGTAGAGCACCACCTTAAGAGAAGAAGAGCTG
№ последовательности: SEQ ID NO: 34Sequence No: SEQ ID NO: 34
Длина: 30 нуклеотидовLength: 30 nucleotides
Тип молекулы: одноцепочечная линейная ДНКMolecule type: single-stranded linear DNA
Происхождение: синтетическая последовательностьOrigin: synthetic sequence
Назначение: зонд для детекции и/или идентификации мРНК гена NY-ESO-1Purpose: probe for detection and / or identification of NY-ESO-1 gene mRNA
Описание последовательности SEQ ID NO: 33(5′-3′):Description of the sequence SEQ ID NO: 33 (5′-3 ′):
GCCAGCTCTGCTTCCATGGGTGTCGCGAAGCCAGCTCTGCTTCCATGGGTGTCGCGAA
№ последовательности: SEQ ID NO: 35Sequence No: SEQ ID NO: 35
Длина: 20 нуклеотидовLength: 20 nucleotides
Тип молекулы: одноцепочечная линейная ДНКMolecule type: single-stranded linear DNA
Происхождение: синтетическая последовательностьOrigin: synthetic sequence
Назначение: зонд для детекции и/или идентификации мРНК генов GAGE1-8Purpose: probe for the detection and / or identification of mRNA genes GAGE1-8
Описание последовательности SEQ ID NO: 35(5′-3′):Description of the sequence SEQ ID NO: 35 (5′-3 ′):
TGAAGATGGTCCTGATGGGCAGGAGATGGATGAAGATGGTCCTGATGGGCAGGAGATGGA
№ последовательности: SEQ ID NO: 37Sequence No: SEQ ID NO: 37
Длина: 30 нуклеотидовLength: 30 nucleotides
Тип молекулы: одноцепочечная линейная ДНКMolecule type: single-stranded linear DNA
Происхождение: синтетическая последовательностьOrigin: synthetic sequence
Назначение: зонд для детекции и/или идентификации мРНК гена TRAG3Purpose: probe for detection and / or identification of TRAG3 gene mRNA
Описание последовательности SEQ ID NO: 37(5′-3′):Description of the sequence SEQ ID NO: 37 (5′-3 ′):
GAGCCTTTTGTTCCTGGAACTTCCTTGATGGAGCCTTTTGTTCCTGGAACTTCCTTGATG
Исследуют образцы периферической крови и образцы опухолевых очагов, полученные после резекции опухоли. Для предотвращения деградации мРНК при хранении и транспортировке, например, 0,5 мл периферической крови или 0,5 г образца ткани смешивают с равным объемом консервирующего буфера, содержащего от 1 до 4 тМ гуанидинтиоционата, 250 тМ ацетата натрия и 1% Triton Х-100. При необходимости полученный консервант транспортируют на льду до места использования или хранят при минусовых температурах в течение года.Samples of peripheral blood and samples of tumor lesions obtained after tumor resection are examined. To prevent mRNA degradation during storage and transportation, for example, 0.5 ml of peripheral blood or 0.5 g of a tissue sample is mixed with an equal volume of preservation buffer containing 1 to 4 tM guanidine thiocyanate, 250 tM sodium acetate and 1% Triton X-100 . If necessary, the resulting preservative is transported on ice to the place of use or stored at sub-zero temperatures for a year.
По 1 варианту осуществляют детекцию мРНК MAGEA1-6, GAGE1-8, NY-ESO-1, SSX 1, 2, 4. XAGE1, TRAG3 и MAGE-C1 методом ОТ-ПЦР.According to
Выделение нуклеиновых кислот проводят известными способами.Isolation of nucleic acids is carried out by known methods.
Например, к 200 мкл смеси образца и консервирующего буфера добавляют равный объем смеси фенола с хлороформом (1:1), перемешивают и центрифугируют. Супернатант переносят в новую пробирку, смешивают с равным объемом изопропанола, центрифугируют. Полученный осадок промывают этанолом, высушивают и разводят водой. Применяют также имеющиеся в продаже наборы реагентов для выделения нуклеиновых кислот согласно рекомендациям производителей. Для синтеза комплементарной ДНК (кДНК) используют обратную транскриптазу (ревертазу), например M-MuLV (Fermentas, ЕС) согласно рекомендациям производителя. В качестве затравки применяют гексануклеотиды, поли-Т олигонуклеотиды или праймеры, специфичные к мРНК раково-тестикулярных генов, представленные последовательностями SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18, 22 и 27, по отдельности или в различных комбинациях.For example, an equal volume of a mixture of phenol with chloroform (1: 1) is added to 200 μl of a mixture of sample and preservation buffer, mixed and centrifuged. The supernatant is transferred to a new tube, mixed with an equal volume of isopropanol, centrifuged. The resulting precipitate was washed with ethanol, dried and diluted with water. Commercially available reagent kits for the isolation of nucleic acids according to the recommendations of the manufacturers are also used. For the synthesis of complementary DNA (cDNA), reverse transcriptase (revertase) is used, for example, M-MuLV (Fermentas, EC) according to the manufacturer's recommendations. As a seed, hexanucleotides, poly-T oligonucleotides or primers specific for cancer testicular gene mRNA represented by SEQ ID NOs: 2, 6, 10, 14, 18, 22 and 27 are used individually or in various combinations.
Полученные образцы кДНК амплифицируют, используя метод ПЦР в два раунда.The resulting cDNA samples were amplified using a two-round PCR method.
В первом раунде проводят множественную ПЦР с использованием смеси праймеров, представленных последовательностями SEQ ID NO: 1, 2, 5, 6, 9, 10. 13, 14, 17, 18, 21, 22, 26 и 27. Например, используют реакционную смесь, содержащую следующие компоненты: 85 мМ ацетата калия, 25 мМ трицина, рН 8.7, 8% глицерина, 1% диметилсульфоксида, 1.5 мМ Mg2+, по 0.4 мМ дАТФ, дГТФ, дТТФ, дЦТФ, 10 рМ каждого из праймеров, 5 мкл кДНК и 5 е.a. Taq-полимеразы. Проводят горячий старт и 35 циклов ПЦР при условиях: 94°C - 30 сек, 55°C - 30 сек, 72°C - 45 сек.In the first round, multiple PCR was performed using a mixture of primers represented by the sequences SEQ ID NO: 1, 2, 5, 6, 9, 10. 13, 14, 17, 18, 21, 22, 26, and 27. For example, a reaction mixture was used containing the following components: 85 mM potassium acetate, 25 mM tricin, pH 8.7, 8% glycerol, 1% dimethyl sulfoxide, 1.5 mM Mg 2+ , 0.4 mM dATP, dGTP, dTTP, dTTP, 10 rM of each primer, 5 μl cDNA and 5 e.a. Taq polymerase. Perform a hot start and 35 cycles of PCR under conditions: 94 ° C - 30 sec, 55 ° C - 30 sec, 72 ° C - 45 sec.
Во втором раунде ПЦР проводят отдельную детекцию мРНК каждого из семейств генов: для мРНК MAGEA1-6 с праймерами, представленными последовательностями SEQ ID NO: 3 и 4; трех мРНК SSX1, 2, 4 с праймерами, представленными последовательностями SEQ ID NO: 7 и 8; мРНК XAGE1 с праймерами, представленными SEQ ID NO: 11 и 12; мРНК MAGEC1 с праймерами, представленными последовательностями SEQ ID NO: 15 и 16; мРНК NY-ESO-1 с праймерами, представленными последовательностями SEQ ID NO: 19 и 20; мРНК GAGE 1-8 с праймерами, представленными последовательностями SEQ ID NO: 23 и 24; мРНК TRAG3 с праймерами, представленными последовательностями SEQ ID NO: 28 и 29.In the second round of PCR, mRNA of each of the gene families is separately detected: for MAGEA1-6 mRNA with primers represented by the sequences SEQ ID NO: 3 and 4; three mRNA SSX1, 2, 4 with primers represented by the sequences of SEQ ID NO: 7 and 8; XAGE1 mRNA with primers represented by SEQ ID NO: 11 and 12; MAGEC1 mRNA with primers represented by the sequences of SEQ ID NO: 15 and 16; NY-ESO-1 mRNA with primers represented by the sequences of SEQ ID NO: 19 and 20; GAGE 1-8 mRNA with primers represented by the sequences of SEQ ID NO: 23 and 24; TRAG3 mRNA with primers represented by the sequences of SEQ ID NO: 28 and 29.
Результаты реакции регистрируют методом электрофореза в 2%-ном агарозном геле. О присутствии мРНК раково-тестикулярных генов судят по присутствию фрагментов кДНК размером: мРНК TRAG3 - 159 п.н.; мРНК MAGEC1 - 138 п.н.; мРНК NY-ESO-1 - 159 п.н.; мРНК SSX1.2.4 - 129 п.н.; мРНК MAGEA1-6 - 265 п.н.; мРНК XAGE1 - 162 п.н.; мРНК GAGE1-8 - 170 п.н.The reaction results are recorded by electrophoresis in a 2% agarose gel. The presence of cancer-testicular gene mRNA is judged by the presence of cDNA fragments of size: TRAG3 mRNA - 159 bp; MAGEC1 mRNA - 138 bp; mRNA NY-ESO-1 - 159 bp; SSX1.2.4 mRNA - 129 bp; MAGEA1-6 mRNA - 265 bp; XAGE1 mRNA - 162 bp; GAGE1-8 mRNA - 170 bp
Для подтверждения идентичности амплифицированные фрагменты кДНК выделяют из 2%-ного агарозного геля с использованием набора ′′DNA Extraction Kit′′ (′′Fermentas′′ ЕС). Очищенную кДНК секвенируют, используя набор BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (′′Applied Biosystems′′) на приборе ABI Prism 3130 (США) согласно рекомендациям производителей.To confirm the identity, amplified cDNA fragments were isolated from a 2% agarose gel using the DNA Extraction Kit (Fermentas EC). The purified cDNA was sequenced using the BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit ('' Applied Biosystems '') on an ABI Prism 3130 instrument (USA) according to the manufacturers recommendations.
Нуклеотидные последовательности сравнивают с представленными в базе данных GenBank, затем кДНК используют в дальнейшей работе в качестве маркеров размерности.The nucleotide sequences are compared with those presented in the GenBank database, then cDNA is used in further work as dimensional markers.
По 2 варианту детектируют мРНК генов MAGEA 1-6, GAGE 1-8, NY-ESO-1, SSX 1, 2, 4, XAGE1, TRAG3 и MAGE-C1 методом гибридизации нуклеиновых кислот на ДНК-чипе.In
Например, в качестве подложки используют предметные стекла для микроскопии с активированной поверхностью. На рабочей поверхности формируют реакционную камеру. ДНК-зонды наносят с использованием ротизированного устройства для автоматического пьезоэлектрического точечного нанесения ультрамалых объемов жидкостей. Для детекции мРНК MAGEA 1-6 наносят зонд, представленный последовательностью SEQ ID NO: 30; мРНК SSX 1, 2, 4 наносят зонд, представленный последовательностью SEQ ID NO: 31; мРНК XAGE1 наносят зонд, представленный последовательностью SEQ ID NO: 32; мРНК MAGE-C1 наносят зонд, представленный последовательностью SEQ ID NO: 33; мРНК NY-ESO-1 наносят зонд, представленный последовательностью SEQ ID NO: 34; мРНК GAGE 1-8 наносят зонд, представленный последовательностью SEQ ID NO: 35; мРНК TRAG3 наносят зонд, представленный последовательностью SEQ ID NO: 37.For example, slides for activated surface microscopy are used as the substrate. A reaction chamber is formed on the working surface. DNA probes are applied using a rotated device for the automatic piezoelectric point deposition of ultra-small volumes of liquids. For detection of MAGEA 1-6 mRNA, a probe, represented by the sequence of SEQ ID NO: 30;
Выделение нуклеиновых кислот, обратную транскрипцию и первый раунд ПЦР проводят, как описано выше. Проводят 30 циклов второго раунда асимметричной ПЦР при условиях: 94°C - 30 сек, 55°C - 30 сек, 72°C - 45 сек. В реакции используют праймеры, представленные последовательностями SEQ ID NO: 3, 4, 7. 8, 11, 12, 14, 15, 19, 20, 23, 24, 25, 28 и 29. Также используют нуклеозидтрифосфаты, меченные флуоресцентным красителем, например Су3- или Су5- дЦТФ. В данной реакции получают набор фрагментов кДНК, меченных флуоресцентным красителем, которые гибридизуют с олигонуклеотидными зондами, нанесенными на подложку. Результаты гибридизации оценивают с помощью любого устройства, способного регистрировать и оценивать флуоресцентный сигнал.Nucleic acid isolation, reverse transcription, and the first round of PCR are performed as described above. Conduct 30 cycles of the second round of asymmetric PCR under conditions: 94 ° C - 30 sec, 55 ° C - 30 sec, 72 ° C - 45 sec. The reaction uses primers represented by the sequences SEQ ID NO: 3, 4, 7, 8, 11, 12, 14, 15, 19, 20, 23, 24, 25, 28, and 29. Nucleoside triphosphates labeled with a fluorescent dye are also used, for example Su3- or Su5- dTCP. In this reaction, a set of cDNA fragments labeled with a fluorescent dye is obtained which hybridize with oligonucleotide probes supported on a substrate. Hybridization results are evaluated using any device capable of recording and evaluating a fluorescent signal.
Сопоставление результатов детекции мРНК MAGEA 1-6. GAGE 1-8, NY-ESO-1, SSX 1, 2, 4, XAGE1. TRAG3 и MAGE-C1 обоими методами показало их сходство, однако данный метод менее длителен и трудоемок.Comparison of MAGEA 1-6 mRNA detection results. GAGE 1-8, NY-ESO-1,
Разработанный способ тестировали на возможность скрининга и мониторинга онкологических заболеваний. Исследовали частоту обнаружения двадцати двух мРНК (MAGEA1-6, GAGE1-8. NY-ESO-1, SSX1, 2, 4, XAGE1, TRA.G-3 и MAGE-C1) в образцах опухолевых очагов и периферической крови 30 больных раком легкого, 64 больных раком толстого кишечника. 40 больных раком молочной железы, 37 больных раком почки, 12 больных раком желудка, 18 больных меланомой, 63 больных раком эндометрия и 59 больных миомой матки. Также были исследованы перевиваемые клеточные линии, полученные из опухолей больных раком легкого (А549, NCI-H23), лейкемией (Jurkat, J937, HL60, CCRF- СЕМ, К6-1а): лимфомой (NCI-H78. Н9), лимфомой Беркитта (Ramos, Daudi), колоректальным раком (Colo205, НСТ116, НСТ15. SW-60, Т84, СаСо2), раком молочной железы (MCF-7, T47d, HS578), гепатоклеточной карциномой (Нер3В, HepG2), раком простаты (РС-3М, Du145, LNBupLN3), раком почки (А498, SN12C, http://CaK.il. ACHN) и яичников (SK-OV-3). В качестве контроля использовали образцы периферической крови 30 добровольцев без онкологических заболеваний.The developed method was tested for the possibility of screening and monitoring of cancer. We investigated the detection rate of twenty-two mRNAs (MAGEA1-6, GAGE1-8. NY-ESO-1, SSX1, 2, 4, XAGE1, TRA.G-3 and MAGE-C1) in samples of tumor foci and peripheral blood of 30 lung cancer patients , 64 patients with colon cancer. 40 patients with breast cancer, 37 patients with kidney cancer, 12 patients with stomach cancer, 18 patients with melanoma, 63 patients with endometrial cancer and 59 patients with uterine myoma. Also transplantable cell lines obtained from tumors of patients with lung cancer (A549, NCI-H23), leukemia (Jurkat, J937, HL60, CCRF-CEM, K6-1a): lymphoma (NCI-H78. H9), Burkitt's lymphoma (were investigated). Ramos, Daudi), colorectal cancer (Colo205, HCT116, HCT15. SW-60, T84, CaCO2), breast cancer (MCF-7, T47d, HS578), hepatocellular carcinoma (Hep3B, HepG2), prostate cancer (PC-3M , Du145, LNBupLN3), kidney cancer (A498, SN12C, http://CaK.il. ACHN) and ovaries (SK-OV-3). Peripheral blood samples from 30 volunteers without cancer were used as a control.
Установлено, что в образцах периферической крови людей без онкологических заболевай мРНК MAGEA1-6, GAGE1-8,NY-ESO-1, SSX1, 2, 4, XAGE1, TRAG3 и MAGE-C1 не выявляется. Результаты обнаружения мРНК СТ генов в образцах опухолевых очагов и периферической крови больных различными заболеваниями представлены на фиг. 3. В опухолевых очагах больных раком хотя бы одна из 22 мРНК была обнаружена в 83-100% образцов. В периферической крови больных раком легкого, молочной железы, почки, желудка и колоректальным раком мРНК 22 СТ генов была выявлена в 75-90% случаев. При меланоме, раке эндометрия и миоме тела матки - в 55-34% случаев. В клеточных линиях, полученных из опухолей больных колоректальным раком, гепатоклеточной карциномой и раком простаты, были обнаружены мРНК MAGEA1-6, XAGE1. SSX1, 2 и 4, MAGEC1 и TRAG3, раком легкого, молочной железы и почки - мРНК MAGEA1-6, SSX1, 2 и 4, XAGE1 и TRAG3, лимфомой -мРНК MAGEA1-6. XAGE1 и TRAG3, раком яичников - мРНК MAGEA1-6 и TRAG3, лимфомой Беркитта - мРНК MAGEA1-6. Из пяти исследованных клеточных линий от больных лимфомой мРНК РТ генов была обнаружена в CCRF-CEM (мРНК MAGEA1-6).1937 (мРНК XAGE1) и К6-1а (мРНК MAGEA1-6 и TRAG3) и не выявлялась в клетках Jurkat и HL60.It was found that in the peripheral blood samples of people without cancer, mAGNA1-6, GAGE1-8, NY-ESO-1, SSX1, 2, 4, XAGE1, TRAG3 and MAGE-C1 are not detected. The results of detection of mRNA CT genes in samples of tumor foci and peripheral blood of patients with various diseases are presented in FIG. 3. In the tumor foci of patients with cancer, at least one of the 22 mRNA was found in 83-100% of the samples. In the peripheral blood of patients with cancer of the lung, breast, kidney, stomach, and colorectal cancer, mRNA of 22 CT genes was detected in 75-90% of cases. With melanoma, endometrial cancer and uterine body myoma - in 55-34% of cases. MAGEA1-6, XAGE1 mRNAs were detected in cell lines obtained from tumors of patients with colorectal cancer, hepatocellular carcinoma and prostate cancer. SSX1, 2 and 4, MAGEC1 and TRAG3, lung, breast and kidney cancer - MAGEA1-6 mRNA, SSX1, 2 and 4, XAGE1 and TRAG3, MAGEA1-6 mRNA lymphoma. XAGE1 and TRAG3, ovarian cancer - MAGEA1-6 and TRAG3 mRNA, Burkitt's lymphoma - MAGEA1-6 mRNA. Of the five cell lines studied from patients with lymphoma, RT mRNA was found in CCRF-CEM (MAGEA1-6 mRNA) .1937 (XAGE1 mRNA) and K6-1a (MAGEA1-6 and TRAG3 mRNA) and was not detected in Jurkat and HL60 cells.
Проведено сравнение частоты обнаружения композиции мРНК СТ генов при использовании разных методов консервации образцов. Исследовали 63 образца опухолевых очагов рака тела матки. Из них 12 образцов ткани консервировалось с использованием метода заморозки до минус 70°C, а 41 образец с использованием консервирующего буфера, содержащего 4 М гуанидинтиоционата, 250 тМ ацетата натрия и 1% Triton Х-100 Установлено, что в образцах, консервированных простым замораживанием, мРНК СТ генов выявлялась в 4 из 12 образцов (25%), а в образцах, помещенных в консервирующий буфер, - 34 из 41 (83%).The frequency of detection of the composition of mRNA CT genes using different methods of preservation of samples was compared. Investigated 63 samples of tumor lesions of cancer of the uterus. Of these, 12 tissue samples were preserved using the freezing method to minus 70 ° C, and 41 samples were used using a preservation buffer containing 4 M guanidine thiocyanate, 250 tM sodium acetate and 1% Triton X-100. It was found that in samples preserved by simple freezing, ST mRNA of genes was detected in 4 of 12 samples (25%), and 34 of 41 (83%) in samples placed in a preservation buffer.
Для анализа возможности ранней диагностики онкологических заболеваний исследовали периферическую кровь больных первой стадией рака легкого, молочной железы, толстого кишечника и рака эндометрия на присутствие композиции мРНК СТ генов. Хотя бы одна из мРНК, представленных в композиции, была обнаружена в периферической крови у 58% (7 из 12) больных раком легкого, 50% (6 из 12) больных раком молочной железы, 66% (6 из 9) больных колоректальным раком и у 45% (18 из 40) больных раком эндометрия.To analyze the possibility of early diagnosis of cancer, the peripheral blood of patients with the first stage of cancer of the lung, breast, colon and endometrial cancer was examined for the presence of a composition of mRNA CT genes. At least one of the mRNAs presented in the composition was detected in peripheral blood in 58% (7 of 12) of patients with lung cancer, 50% (6 of 12) of patients with breast cancer, 66% (6 of 9) of patients with colorectal cancer and in 45% (18 of 40) of patients with endometrial cancer.
Для установления источника происхождения мРНК СТ генов исследовали периферическую кровь больных колоректальным раком. Проводили разделение на клетки и фракции внеклеточных нуклеиновых кислот, как описано ранее [Рыкова Е.Ю., Скворцова Т.Э., Хоффман А.Л., и др. 2008. Циркулирующие внеклеточные ДНК и РНК крови в диагностике опухолей молочной железы. Биомедицинская химия. 54, 94-103]. Образцы периферической крови центрифугировали для получения плазмы и форменных элементов. Для элюции внеклеточных нуклеиновых кислот, связанных с поверхностью клеток крови через ионные взаимодействия, к суспензии клеток добавляли буфер, содержащий 15 mM EDTA и 0.9% NaCl, центрифугировали и отбирали надосадочную жидкость. Для протеолитического отщепления нуклеопротеидных комплексов к полученному осадку клеток добавляли равный объем 0.125% трипсина, инкубировали в течение 1 мин при помешивании, добавляли 5 мМ ингибитора сериновых протеаз PMSF и разделяли фракции центрифугированием. К полученным таким образом фракциям добавляли равный объем консервирующего буфера и тестировали на присутствие мРНК СТ генов. Во фракциях внеклеточных нуклеиновых кислот периферической крови мРНК СТ генов детектировалась только на III-IV стадиях заболевания. Во фракциях клеток крови, с поверхности которых были удалены внеклеточные нуклеиновые кислоты, мРНК СТ генов обнаруживалась на всех четырех стадиях заболевания. То есть на всех стадиях колоректального рака мРНК СТ генов обнаруживалась в клетках, циркулирующих в кровотоке. При этом на первой и второй стадиях заболевания мРНК СТ генов была обнаружена только в клетках крови и не выявлена во фракциях, содержащих внеклеточные нуклеиновые кислоты Таким образом, обнаружение хотя бы одной из двадцати двух используемых в композиции мРНК свидетельствует о присутствии в кровяном русле циркулирующих клеток опухоли. Это позволяет применять разработанный способ для обнаружения в периферической крови циркулирующих опухолевых клеток, что может быть использовано в прогностических целях и для мониторинга проводимой терапии онкологических заболеваний.To establish the source of the mRNA CT genes, the peripheral blood of patients with colorectal cancer was examined. Separation of extracellular nucleic acids into cells and fractions was performed as described previously [Rykova E.Yu., Skvortsova TE, Hoffman AL, et al. 2008. Circulating extracellular DNA and blood RNA in the diagnosis of breast tumors. Biomedical chemistry. 54, 94-103]. Peripheral blood samples were centrifuged to obtain plasma and cells. To elute extracellular nucleic acids bound to the surface of blood cells via ionic interactions, a buffer containing 15 mM EDTA and 0.9% NaCl was added to the cell suspension, centrifuged, and the supernatant was collected. For proteolytic cleavage of nucleoprotein complexes, an equal volume of 0.125% trypsin was added to the obtained cell pellet, incubated for 1 min with stirring, 5 mM PMSF serine protease inhibitor was added, and the fractions were separated by centrifugation. An equal volume of preservation buffer was added to the fractions thus obtained and tested for the presence of mRNA CT genes. In peripheral blood extracellular nucleic acid fractions, mRNA CT genes were detected only at stages III-IV of the disease. In the fractions of blood cells from the surface of which extracellular nucleic acids were removed, mRNA CT genes were detected at all four stages of the disease. That is, at all stages of colorectal cancer, mRNA CT genes were detected in cells circulating in the bloodstream. Moreover, at the first and second stages of the disease, mRNA CT genes were found only in blood cells and were not detected in fractions containing extracellular nucleic acids. Thus, the detection of at least one of the twenty-two mRNAs used in the composition indicates the presence of circulating tumor cells in the bloodstream . This makes it possible to apply the developed method for detecting circulating tumor cells in peripheral blood, which can be used for prognostic purposes and for monitoring ongoing cancer therapy.
Для исследования применимости метода обнаружения композиции мРНК СТ генов в мониторинге течения онкологических заболеваний проводили исследование периферической крови 15 больных колоректальным раком. Из них у 5 были обнаружены метастазы в лимфатические узлы. Тестировали периферическую кровь, взятую непосредственно перед удалением опухоли, и кровь тех же больных, взятую через 3-12 месяцев при их обращении в стационар с жалобами на ухудшение самочувствия. У больных без метастазов в периферической крови до операции и в течение года после проведения операции выявлялись одна или две мРНК СТ генов из тестируемой композиции. У группы больных с клинически подтвержденными метастазами до периферической крови до операции также обнаруживались одна или две мРНК из композиции. Через месяц после операции в крови обнаруживались больше наименований мРНК СТ генов или изменялся их качественный состав.To study the applicability of the method for detecting the composition of mRNA CT genes in monitoring the course of oncological diseases, the peripheral blood of 15 patients with colorectal cancer was studied. Of these, 5 metastases to the lymph nodes were detected. We tested peripheral blood taken immediately before the removal of the tumor, and the blood of the same patients, taken after 3-12 months when they went to the hospital with complaints of worsening well-being. In patients without metastases in the peripheral blood, before the operation and within a year after the operation, one or two mRNA CT genes from the tested composition were detected. One or two mRNAs from the composition were also found in a group of patients with clinically confirmed metastases to peripheral blood before surgery. A month after the operation, more names of mRNA CT genes were found in the blood or their qualitative composition changed.
Представленные экспериментальные данные свидетельствуют, что тест на присутствие 22 мРНК СТ генов применим для диагностики раковых клеток при таких заболеваниях, как Т-клеточный лейкоз, лимфома Беркитта, колоректальный рак, рак молочной железы, карцинома печени, рак желудка, рак легкого, почечноклеточный рак, карциномы яичников и простаты, рак эндометрия и миома тела матки. Исследование периферической крови свидетельствуют о том, что заявляемый способ может быть с высокой степенью надежности использован для скрининга групп риска на присутствие онкологических заболеваний различных органов и для мониторинга проводимой терапии больных онкологическими заболеваниями.The presented experimental data indicate that the test for the presence of 22 mRNA CT genes is applicable for the diagnosis of cancer cells in diseases such as T-cell leukemia, Burkitt’s lymphoma, colorectal cancer, breast cancer, liver carcinoma, stomach cancer, lung cancer, renal cell carcinoma, ovarian and prostate carcinomas, endometrial cancer and uterine myoma. A study of peripheral blood suggests that the inventive method can be used with a high degree of reliability for screening risk groups for the presence of cancer of various organs and for monitoring the ongoing treatment of cancer patients.
Таким образом, заявленный способ скрининга и мониторинга онкологических заболеваний обеспечивает точность диагностики онкологических заболеваний различных органов.Thus, the claimed method of screening and monitoring of cancer provides accurate diagnosis of cancer of various organs.
Claims (7)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012144891/10A RU2537263C2 (en) | 2012-10-22 | 2012-10-22 | Method of screening and monitoring cancerous diseases and kit therefor (versions) |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012144891/10A RU2537263C2 (en) | 2012-10-22 | 2012-10-22 | Method of screening and monitoring cancerous diseases and kit therefor (versions) |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2012144891A RU2012144891A (en) | 2014-05-27 |
| RU2537263C2 true RU2537263C2 (en) | 2014-12-27 |
Family
ID=50774912
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2012144891/10A RU2537263C2 (en) | 2012-10-22 | 2012-10-22 | Method of screening and monitoring cancerous diseases and kit therefor (versions) |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2537263C2 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2753677C2 (en) * | 2015-10-05 | 2021-08-19 | Фредакс Аб | Antibody polypeptides and their application |
| RU2778694C2 (en) * | 2016-01-08 | 2022-08-23 | Максион Терапьютикс Лимитед | Binding elements with modified diversified backbone domains |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996029430A1 (en) * | 1995-03-17 | 1996-09-26 | John Wayne Cancer Institute | Detection of melanoma or breast metastases with a multiple marker assay |
| US20050014208A1 (en) * | 2001-09-06 | 2005-01-20 | Alf-Andreas Krehan | Method and kit for diagnosing or controlling the treatment of breast cancer |
| US20120258462A1 (en) * | 2004-06-17 | 2012-10-11 | Mannkind Corporation | Combinations of tumor-associated antigens in diagnostics for various types of cancers |
-
2012
- 2012-10-22 RU RU2012144891/10A patent/RU2537263C2/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996029430A1 (en) * | 1995-03-17 | 1996-09-26 | John Wayne Cancer Institute | Detection of melanoma or breast metastases with a multiple marker assay |
| US20050014208A1 (en) * | 2001-09-06 | 2005-01-20 | Alf-Andreas Krehan | Method and kit for diagnosing or controlling the treatment of breast cancer |
| US20120258462A1 (en) * | 2004-06-17 | 2012-10-11 | Mannkind Corporation | Combinations of tumor-associated antigens in diagnostics for various types of cancers |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2753677C2 (en) * | 2015-10-05 | 2021-08-19 | Фредакс Аб | Antibody polypeptides and their application |
| US11332543B2 (en) | 2015-10-05 | 2022-05-17 | Fredax Ab | Antibody polypeptides and uses thereof |
| RU2778694C2 (en) * | 2016-01-08 | 2022-08-23 | Максион Терапьютикс Лимитед | Binding elements with modified diversified backbone domains |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2012144891A (en) | 2014-05-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2281416T3 (en) | METHODS, COMPOSITIONS AND SYSTEMS FOR THE DETECTION AND MONITORING OF CANCER OF BREAST. | |
| AU2013281355B2 (en) | Targeted RNA-seq methods and materials for the diagnosis of prostate cancer | |
| CN107326066B (en) | Urine markers for detection of bladder cancer | |
| US8030013B2 (en) | Methods and compositions for the diagnosis for early hepatocellular carcinoma | |
| ES2608322T3 (en) | Procedure to predict the response to chemotherapy in a patient who suffers or is at risk of developing recurrent breast cancer | |
| JP6745820B2 (en) | Prostate Cancer Prognosis Judgment Method | |
| CN108949992B (en) | Biomarker related to esophageal squamous carcinoma and grading thereof | |
| CN108949969B (en) | Application of long-chain non-coding RNA in colorectal cancer | |
| JP6638128B2 (en) | Test markers and test methods for malignancy of kidney cancer | |
| CN108949976A (en) | Purposes of the C12orf70 and/or C17orf107 gene in cancer of pancreas testing product | |
| RU2537263C2 (en) | Method of screening and monitoring cancerous diseases and kit therefor (versions) | |
| RU2393472C1 (en) | Diagnostic technique for clear cell renal adenocarcinoma and set for implementation thereof | |
| AU2009213671A1 (en) | Colon cancer associated transcript 1 (CCAT1) as a cancer marker | |
| JP2007082433A (en) | Malignant brain tumor marker gene and use of the same | |
| CN104450887B (en) | DNA probe, genetic chip and its application for detecting carcinoma of endometrium | |
| CN109439760B (en) | Application of ARRDC2 in evaluating development process of oral squamous cell carcinoma | |
| CN103436621B (en) | Method and kit for quickly detecting expression quantity of CK19 mRNA (messenger ribonucleic acid) | |
| RU2390780C1 (en) | Diagnostic technique for non-small cell carcinoma of lung and kit for implementation thereof | |
| KR20200001583A (en) | Gender-specific markers for diagnosing prognosis and determining treatment strategies of patient of clear cell renal cell carcinoma | |
| JP4207187B2 (en) | HURP gene as a molecular marker for bladder cancer | |
| US9976184B2 (en) | Mutations in pancreatic neoplasms | |
| EP2389450B1 (en) | Methods for determining a prognosis for survival for a patient with breast cancer | |
| JP2006166789A (en) | New method for diagnosing cancer | |
| ES2343996B1 (en) | METHOD FOR SUBCLASSIFICATION OF TUMORS. | |
| JP2005525810A (en) | Method for identifying pancreatic duct cancer-specific gene using pancreatic duct cells, method for examining pancreatic duct cancer using pancreatic duct cancer-specific gene identified by the same method, and method for screening drug candidate compounds for treatment or prevention of pancreatic duct cancer . |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD4A | Correction of name of patent owner | ||
| QB4A | Licence on use of patent |
Free format text: LICENCE Effective date: 20160419 |
|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20201023 |