RU2642313C1

RU2642313C1 - Set of primers and method for dickeya solani bacteria determination

Info

Publication number: RU2642313C1
Application number: RU2016149036A
Authority: RU
Inventors: Константин Анатольевич Мирошников; Фёдор Владимирович Ширшиков
Original assignee: Общество с ограниченной ответственностью "Исследовательский Центр "ФитоИнженерия"
Priority date: 2016-12-14
Filing date: 2016-12-14
Publication date: 2018-01-24

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: group of objects, including method for Dickeya solani bacteria determination by loop isothermal amplification (LAMP), and a set of primers for Dickeya solani bacteria determination by loop isothermal amplification (LAMP). In one of the versions of the invention in the reaction of target gene sequence plot amplification, a set of oligonucleotide primers is used, including: a FIP primer with a nucleotide sequence SEQ ID NO: 7, or its homologue, a BIP primer with a nucleotide sequence SEQ ID NO: 8, or its homologue, an F3 primer with a nucleotide sequence SEQ ID NO: 9, or its homologue, a B3 primer with a nucleotide sequence SEQ ID NO: 10, or its homologue; with these FIP, BIP, F3 and B3 primer homologues having homology not less than 95% compared to the corresponding nucleotide markers sequences SEQ ID NOs: 7, 8, 9 and 10, provided that such homologous primers can hybridize with the target infB gene coding the translation initiation factor IF-2.

EFFECT: invention expands the arsenal of means for Dickeya solanibacteria determination.

8 cl, 3 dwg, 2 ex

Description

Область техникиTechnical field

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в сельском хозяйстве, в частности - картофелеводстве, и пищевой промышленности в качестве эффективного инструмента лабораторной диагностики бактериальных фитопатогенов, вызывающих болезни сельскохозяйственных культур. Более точно - изобретение позволяет селективно и с высокой чувствительностью определять наличие и проводить количественную оценку в биологических образцах фитопатогенной бактерии вида Dickeya solani в условиях одновременного присутствия в образце других бактерий, например, близкородственных бактерий, таких как штаммы пектолитических бактерий, принадлежащих к роду Pectobacterium - Pectobacterium atrosepticum и Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum. Способ согласно настоящему изобретению основан на методе петлевой изотермической амплификации (LAMP) участка последовательности целевого гена с использованием набора подобранных олигонуклеотидных праймеров.The present invention relates to the field of biotechnology and can be used in agriculture, in particular - potato growing, and the food industry as an effective tool for laboratory diagnosis of bacterial phytopathogens that cause diseases of crops. More precisely, the invention allows to selectively and with high sensitivity determine the presence and quantification of biological samples of phytopathogenic bacteria of the species Dickeya solani under the conditions of the simultaneous presence in the sample of other bacteria, for example, closely related bacteria, such as strains of pectolytic bacteria belonging to the genus Pectobacterium - Pectobacterium atrosepticum and Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum. The method according to the present invention is based on the method of loop isothermal amplification (LAMP) of a portion of the target gene sequence using a set of selected oligonucleotide primers.

Описание предшествующего уровня техникиDescription of the Related Art

Пектолитические бактерии представляют собой группу близкородственных микроорганизмов, вызывающих у картофеля такие заболевания, как «черная ножка», поражающая вегетирующие растения в полевых и тепличных условиях, и мокрая гниль клубней, которая распространяется при хранении и транспортировке картофеля (Czajkowski R. et al., Detection, identification and differentiation of Pectobacterium and Dickeya species causing potato blackleg and tuber soft rot: a review, Ann Appl Biol., 2015, 166: 18-38). Возбудители этих опасных болезней принадлежат к трем таксономическим рангам: i) третий биовар бактерии вида Dickeya dianthicola, рассматриваемый в настоящее время как новый вид - Dickeya solani (van der Wolf J.M. et al., Dickeya solani sp. nov., a pectinolytic plant-pathogenic bacterium isolated from potato (Solanum tuberosum), Int J Syst Evol Microbiol., 2014, 64: 768-774), поражающий картофель в регионах с влажным и теплым климатом; ii) Pectobacterium atrosepticum - возбудитель «черной ножки» картофеля в полях умеренных климатических поясов; и iii) Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum - подвид, вызывающий мокрую гниль клубней и представляющий особую опасность для картофеля в хранилищах и при транспортировке (Toth I.K. et al., Dickeya species: an emerging problem for potato production in Europe, Plant Pathol, 2011, 60: 385-399). В настоящее время эпифитотическая обстановка свидетельствует, что все три вида имеют общие пути распространения, часто одновременно присутствуют в инфицированном картофеле (Czajkowski R. et al., Detection, identification and differentiation of Pectobacterium and Dickeya species causing potato blackleg and tuber soft rot: a review, Ann Appl Biol., 2015, 166: 18-38) и обладают весьма схожими симптомами проявления инфекции (Toth I.К. et al., Dickeya species: an emerging problem for potato production in Europe, Plant Pathol, 2011, 60: 385-399). Обусловленная адаптацией к различным климатическим условиям агрессивность бактерий Dickeya solani, Pectobacterium atrosepticum и Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum, их широкое распространение и близкие экологические ниши - все эти факторы становятся причиной значительных экономических потерь в сфере картофелеводства и других отраслях растениеводства, в которых указанные выше фитопатогены находят растений-хозяев.Pectolytic bacteria are a group of closely related microorganisms that cause potato diseases such as the black leg, which affects vegetative plants in field and greenhouse conditions, and the wet rot of tubers, which spreads during storage and transportation of potatoes (Czajkowski R. et al., Detection , identification and differentiation of Pectobacterium and Dickeya species causing potato blackleg and tuber soft rot: a review, Ann Appl Biol., 2015, 166: 18-38). The causative agents of these dangerous diseases belong to three taxonomic ranks: i) the third biovar of a bacterium of the species Dickeya dianthicola, currently considered as a new species - Dickeya solani (van der Wolf JM et al., Dickeya solani sp. Nov., A pectinolytic plant-pathogenic bacterium isolated from potato (Solanum tuberosum), Int J Syst Evol Microbiol., 2014, 64: 768-774), affecting potatoes in regions with a humid and warm climate; ii) Pectobacterium atrosepticum - the causative agent of the "black leg" of potatoes in the fields of temperate climatic zones; and iii) Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum is a subspecies that causes wet rot of tubers and is particularly dangerous for potatoes in storage and transportation (Toth I.K. et al., Dickeya species: an emerging problem for potato production in Europe, Plant Pathol, 2011, 60: 385-399). At present, the epiphytotic setting indicates that all three species share common pathways, often simultaneously present in infected potatoes (Czajkowski R. et al., Detection, identification and differentiation of Pectobacterium and Dickeya species causing potato blackleg and tuber soft rot: a review , Ann Appl Biol., 2015, 166: 18-38) and have very similar symptoms of infection (Toth I.K. et al., Dickeya species: an emerging problem for potato production in Europe, Plant Pathol, 2011, 60: 385-399). The aggressiveness of the bacteria Dickeya solani, Pectobacterium atrosepticum and Pectobacterium carotovorum subsp. Due to adaptation to various climatic conditions. carotovorum, their wide distribution and close ecological niches - all these factors cause significant economic losses in the field of potato growing and other branches of plant growing, in which the above plant pathogens find host plants.

Для молекулярной диагностики бактерий, включающей определение таксономической принадлежности бактерий и их количественную оценку, используют известные специалисту в данной области техники способы увеличения количества копий (амплификации) фрагментов целевой ДНК, в частности - способ, основанный на методе петлевой изотермической амплификации (LAMP, loop-mediated isothermal amplification) участка последовательности целевого гена с использованием набора олигонуклеотидных праймеров. Исторически метод LAMP был разработан для преодоления недостатков полимеразной цепной реакции (ПЦР, Saiki R.K. et al., Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase, Science, 1988, 239: 487-491) при определении однонуклеотидных полиморфизмов в аллелях целевого гена. Метод LAMP и все его преимущества по сравнению с методом ПЦР подробно описаны в патенте Соединенных Штатов Америки US7494790 В2 (см. также патент-аналог Российской Федерации RU 2252964 С2), а также научных публикациях Notomi Т. et al., Loop-mediated isothermal amplification of DNA, Nucleic Acids Res., 2000, 28(12), е63 и Tomita N. et al., Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products, Nat Protoc, 2008, 3(5): 877-782.For molecular diagnosis of bacteria, including determining the taxonomic affiliation of bacteria and their quantitative assessment, methods known in the art are used to increase the number of copies (amplification) of fragments of the target DNA, in particular, a method based on the loop-isothermal amplification method (LAMP, loop-mediated isothermal amplification) region of the target gene sequence using a set of oligonucleotide primers. Historically, the LAMP method was developed to overcome the shortcomings of the polymerase chain reaction (PCR, Saiki RK et al., Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase, Science, 1988, 239: 487-491) in determining single nucleotide polymorphisms in the alleles of the target gene. The LAMP method and all its advantages compared to PCR are described in detail in United States Patent US7494790 B2 (see also patent of the Russian Federation RU 2252964 C2), as well as scientific publications Notomi T. et al., Loop-mediated isothermal amplification of DNA, Nucleic Acids Res., 2000, 28 (12), e63 and Tomita N. et al., Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products, Nat Protoc, 2008, 3 (5 ): 877-782.

Метод LAMP представляет собой один из способов амплификации определенных участков целевой ДНК при постоянной температуре с помощью ДНК-полимеразы и набора, содержащего четыре подобранных олигонуклеотидных праймера, которые комплементарны шести различным участкам на целевой (матричной) ДНК (Notomi Т. et al., Loop-mediated isothermal amplification of DNA, Nucleic Acids Res., 2000, 28(12), е63). Также, возможно использование набора, содержащего шесть подобранных олигонуклеотидных праймеров, которые комплементарны восьми различным участкам на целевой ДНК. Для диагностических целей в методе LAMP используются внутренние праймеры, которые на своих 5'-конце и 3'-конце содержат значительное количество нуклеотидов, комплементарных видоспецифичным позициям нуклеотидов в конкретном молекулярно-генетическом маркере исследуемого генома. В качестве молекулярно-генетического маркера может быть использована любая нуклеотидная последовательность, несущая видоспецифичные признаки в виде различных мутаций. Из механизма реакции амплификации целевой ДНК методом LAMP следует, что если концы внутренних праймеров не будут полностью гибридизоваться с комплементарной областью в выбранной маркерной последовательности, что может иметь место в случае присутствия в реакционной смеси неспецифичной гомологичной нуклеотидной последовательности, то эффективность амплификации будет значительно снижена или будет невозможна. На этом основан механизм избирательного действия набора праймеров по отношению к целевой нуклеотидной последовательности генома. Более того, учитывая большее количество (от четырех до шести) используемых праймеров по сравнению с классической ПЦР, где используется два праймера, метод LAMP обладает более высокой селективностью по отношению к целевой ДНК.The LAMP method is one of the methods for amplification of certain regions of the target DNA at a constant temperature using DNA polymerase and a kit containing four selected oligonucleotide primers that are complementary to six different regions on the target (template) DNA (Notomi T. et al., Loop- mediated isothermal amplification of DNA, Nucleic Acids Res., 2000, 28 (12), e63). It is also possible to use a kit containing six selected oligonucleotide primers that are complementary to eight different regions on the target DNA. For diagnostic purposes, the LAMP method uses internal primers, which at their 5'-end and 3'-end contain a significant number of nucleotides complementary to species-specific nucleotide positions in a particular molecular genetic marker of the genome under study. As the molecular genetic marker, any nucleotide sequence carrying species-specific characters in the form of various mutations can be used. From the mechanism of the amplification reaction of the target DNA by the LAMP method, it follows that if the ends of the internal primers do not fully hybridize with the complementary region in the selected marker sequence, which may occur if there is a non-specific homologous nucleotide sequence in the reaction mixture, the amplification efficiency will be significantly reduced or impossible. This is the basis for the mechanism of selective action of a set of primers in relation to the target nucleotide sequence of the genome. Moreover, given the greater number (from four to six) of the primers used compared to classical PCR, where two primers are used, the LAMP method has a higher selectivity for the target DNA.

Современные методы молекулярной диагностики фитопатогенных бактерий основаны на различных подходах к выбору молекулярно-генетического маркера, характерного для бактерий, наличие, количество и распространение которых необходимо контролировать. В качестве мишеней для определения бактериальных фитопатогенов могут быть использованы уникальные геномные последовательности, нуклеотидные последовательности генов факторов вирулентности и нуклеотидные последовательности генов основных метаболических путей, обладающих высокой консервативностью и называемые также генами «домашнего хозяйства». Набор олигонуклеотидных праймеров подбирается на основании данных о нуклеотидной последовательности выбранной ДНК-мишени. Уникальные нуклеотидные последовательности и гены факторов вирулентности представляют собой довольно протяженные участки генома, в то время как видоспецифичные участки генов «домашнего хозяйства» образованы за счет различных типов мутаций. Высокая селективность наборов праймеров для определения уникальных нуклеотидных последовательностей обусловлена отсутствием в геномах других организмов сайтов для отжига таких праймеров.Modern methods of molecular diagnostics of phytopathogenic bacteria are based on various approaches to the selection of a molecular genetic marker characteristic of bacteria, the presence, quantity and distribution of which must be controlled. As targets for determining bacterial phytopathogens, unique genomic sequences, nucleotide sequences of virulence factor genes and nucleotide sequences of genes of the main metabolic pathways that are highly conservative and also called “housekeeping” genes can be used. A set of oligonucleotide primers is selected based on the nucleotide sequence data of the selected target DNA. The unique nucleotide sequences and genes of virulence factors represent rather long sections of the genome, while species-specific sections of the “housekeeping” genes are formed due to various types of mutations. The high selectivity of primer sets to determine unique nucleotide sequences is due to the absence of sites for annealing such primers in the genomes of other organisms.

С точки зрения разработки высокоэффективных способов диагностики с использованием метода LAMP наиболее удобны уникальные последовательности, особенно те их них, длина которых составляет более 500 пар оснований. Гены факторов вирулентности лишь зачастую являются уникальными мишенями, поскольку многие патогенные и условно патогенные бактерии обладают способностью к горизонтальному транспорту генов, благодаря которому выбранный для диагностики ген-мишень может оказаться у любой другой бактерии из этой же экологической ниши, давая ложноположительные результаты лабораторной диагностики. Существенным недостатком использования уникальных нуклеотидных последовательностей и генов факторов вирулентности для целей селективного определения целевой фитопатогенной бактерии является отсутствие консервативности - такие участки генома не всегда жизненно необходимы для бактериальной клетки и их нуклеотидная последовательность подвержена мутационной изменчивости под действием различных факторов. Среди таких факторов необходимо учитывать также степень приспособленности бактерии к своему растению-хозяину. Более того, уникальные последовательности могут быть элиминированы из генома патогенного микроорганизма без потери самой бактерией вирулентности (степени патогенности) - в таком случае разработанные наборы праймеров на целевой участок генома потеряют свою применимость в лабораторной диагностике. Отслеживание таких генетических событий представляет собой весьма трудную задачу. Недостатком существующих способов диагностики фитопатогенных бактерий, основанных на применении генов «домашнего хозяйства», является низкая селективность таких способов и, как следствие, наличие высокой вероятности получения ложноположительных результатов лабораторной диагностики, что обусловлено высокой консервативностью и, как следствие, высокой идентичностью нуклеотидных последовательностей генов «домашнего хозяйства» даже у неблизкородственных бактериальных видов.From the point of view of developing highly effective diagnostic methods using the LAMP method, unique sequences are most convenient, especially those of them whose length is more than 500 base pairs. Genes of virulence factors are often often unique targets, since many pathogenic and conditionally pathogenic bacteria have the ability to horizontal gene transport, due to which the selected target gene for diagnosis can be in any other bacteria from the same ecological niche, giving false-positive results of laboratory diagnostics. A significant drawback of using unique nucleotide sequences and virulence factor genes for the selective determination of the target phytopathogenic bacterium is the lack of conservatism - such parts of the genome are not always vital for a bacterial cell and their nucleotide sequence is subject to mutational variability under the influence of various factors. Among these factors, it is also necessary to take into account the degree of fitness of the bacterium to its host plant. Moreover, unique sequences can be eliminated from the genome of a pathogenic microorganism without loss of virulence (pathogenicity) by the bacterium itself - in this case, the developed primer sets for the target genome will lose their applicability in laboratory diagnostics. Tracking such genetic events is a very difficult task. The disadvantage of existing methods for the diagnosis of phytopathogenic bacteria based on the use of “housekeeping” genes is the low selectivity of such methods and, as a result, the high probability of obtaining false-positive results of laboratory diagnostics, due to the high conservatism and, as a consequence, the high identity of the nucleotide sequences of the genes households ”even in non-related bacterial species.

Раскрыты способы диагностики бактериальных фитопатогенов, таких как, например Clavibacter michiganensis subsp. nebraskensis (патент Китайской народной республики CN 102382882 В) и Ralstonia solanacearum (заявка CN 105238876 А), основанные на применении метода LAMP. Известны другие способы определения фитопатогенных бактерий с помощью метода LAMP, основанные на применении наборов праймеров, комплементарных нуклеотидным последовательностям гена фактора вирулентности Pectobacterium atrosepticum (Li X. et al., Development and evaluation of a loop-mediated isothermal amplification assay for rapid detection and identification of Pectobacterium atrosepticum, Can J Plant Pathol, 2011, 33(4): 447-457), гена β (бета)-субъединицы ДНК-гиразы Pectobacterium atrosepticum (патент Китайской Народной Республики CN 104263841 В; Hu L.X. et al., Sensitive and rapid detection of Pectobacterium atrosepticum by targeting the gyrB gene using a real-time loop-mediated isothermal amplification assay, Lett Appl Microbiol, 2016, 63(4): 289-296) и различных генов биосинтеза бактериальной клеточной стенки Pectobacterium carotovorum (патент Республики Корея KR 101288419 B1; Yasuhara-Bell J et al., Specific detection of Pectobacterium carotovorum by loop-mediated isothermal amplification, Mol Plant Pathol, 2016, 17: 1499-1505).Methods for diagnosing bacterial phytopathogens, such as, for example, Clavibacter michiganensis subsp. nebraskensis (patent of the People's Republic of China CN 102382882 B) and Ralstonia solanacearum (application CN 105238876 A) based on the application of the LAMP method. Other methods for determining phytopathogenic bacteria using the LAMP method are known, based on the use of primer sets complementary to the nucleotide sequences of the virulence factor gene Pectobacterium atrosepticum (Li X. et al., Development and evaluation of a loop-mediated isothermal amplification assay for rapid detection and identification of Pectobacterium atrosepticum, Can J Plant Pathol, 2011, 33 (4): 447-457), the β (beta) gene of the Pectobacterium atrosepticum DNA gyrase (Patent of the People's Republic of China CN 104263841 B; Hu LX et al., Sensitive and rapid detection of Pectobacterium atrosepticum by targeting the gyrB gene using a real-time loop-mediated isothermal amplification assay, Lett Appl Microbiol, 2016, 63 (4): 289 -296) and various genes for biosynthesis of the bacterial cell wall of Pectobacterium carotovorum (Republic of Korea patent KR 101288419 B1; Yasuhara-Bell J et al., Specific detection of Pectobacterium carotovorum by loop-mediated isothermal amplification, Mol Plant Pathol, 2016, 17: 1499- 1505).

Однако, отсутствуют ранее представленные данные, которые бы описывали способ селективного определения фитопатогенной бактерии вида Dickeya solani с помощью метода LAMP с использованием в качестве молекулярно-генетического маркера высококонсервативного гена «домашнего хозяйства» infB, кодирующего фактор инициации трансляции IF-2, и набора подобранных олигонуклеотидных праймеров.However, there are no previously presented data that would describe a method for the selective determination of a phytopathogenic bacterium of the Dickeya solani species using the LAMP method using the highly conserved housekeeping gene infB as a molecular genetic marker encoding IF-2 translation initiation factor and a set of selected oligonucleotide primers.

Раскрытие сущности изобретенияDisclosure of the invention

Задачей настоящего изобретения является разработка селективного и высокочувствительного способа определения в биологических образцах (например, картофеле, почве, воде) фитопатогенной бактерии вида Dickeya solani, основанного на методе петлевой изотермической амплификации (LAMP) участка последовательности целевого гена с использованием набора подобранных олигонуклеотидных праймеров, в присутствии бактерий других видов. Более точно - задачей настоящего изобретения является разработка способа определения бактерии вида Dickeya solani, основанного на методе LAMP участка последовательности целевого гена с использованием набора подобранных олигонуклеотидных праймеров, в присутствии близкородственных пектолитических бактерий рода Pectobacterium, таких как Pectobacterium atrosepticum и Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum.The objective of the present invention is to develop a selective and highly sensitive method for determining in biological samples (for example, potato, soil, water) a phytopathogenic bacterium of the Dickeya solani species, based on the loop isothermal amplification (LAMP) method of a portion of the target gene sequence using a set of selected oligonucleotide primers in the presence of bacteria of other species. More precisely, it is an object of the present invention to provide a method for determining a Dickeya solani bacterium based on the LAMP method of a region of a target gene sequence using a set of selected oligonucleotide primers in the presence of closely related pectolytic bacteria of the genus Pectobacterium, such as Pectobacterium atrosepticum and Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum.

Таким образом, одним из аспектов настоящего изобретения является предоставление способа определения бактерии вида Dickeya solani методом петлевой изотермической амплификации, отличающегося тем, что в реакции амплификации участка последовательности целевого гена используют набор олигонуклеотидных праймеров, включающий:Thus, one aspect of the present invention is the provision of a method for determining bacteria of the Dickeya solani type by isothermal loop amplification, characterized in that a set of oligonucleotide primers is used in the amplification reaction of a portion of the target gene sequence, including:

(A) праймер FIP, имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 7, или его гомолог,(A) a FIP primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7, or a homologue thereof,

(B) праймер BIP, имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 8, или его гомолог,(B) a BIP primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8, or a homologue thereof,

(C) праймер F3, имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 9, или его гомолог,(C) a primer F3 having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9, or a homologue thereof,

(D) праймер В3, имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 10, или его гомолог.(D) a B3 primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10, or a homologue thereof.

Также аспект настоящего изобретения - предоставление вышеописанного способа, отличающегося тем, что целевой ген есть ген infB, кодирующий фактор инициации трансляции IF-2.Also, an aspect of the present invention is the provision of the above method, characterized in that the target gene is the infB gene encoding IF-2 translation initiation factor.

Также аспект настоящего изобретения - предоставление вышеописанного способа, отличающегося тем, что ген infB кодируется нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1 или гомологичной ей нуклеотидной последовательностью при условии, что такая гомологичная нуклеотидная последовательность может гибридизоваться с указанными выше праймерами.Another aspect of the present invention is the provision of the above method, characterized in that the infB gene is encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or a homologous nucleotide sequence provided that such a homologous nucleotide sequence can hybridize with the above primers.

Также аспект настоящего изобретения - предоставление вышеописанного способа, отличающегося тем, что гомологи указанных праймеров FIP, BIP, F3 и В3 имеют гомологию не менее чем 95% по сравнению с соответствующими нуклеотидными последовательностями SEQ ID NOs: 7, 8, 9 и 10 при условии, что такие гомологичные праймеры могут гибридизоваться с целевым геном infB.Also an aspect of the present invention is the provision of the above method, characterized in that the homologues of the indicated primers FIP, BIP, F3 and B3 have a homology of not less than 95% compared to the corresponding nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 7, 8, 9 and 10, provided that such homologous primers can hybridize to the target infB gene.

Также аспект настоящего изобретения - предоставление вышеописанного способа, отличающегося тем, что указанным способом определяют бактерию вида Dickeya solani в образцах картофеля, почвы или воды, или их комбинации.Also, an aspect of the present invention is the provision of the above method, characterized in that the bacterium of the species Dickeya solani in samples of potato, soil or water, or a combination thereof, is determined by this method.

Следующей задачей настоящего изобретения является предоставление набора олигонуклеотидных праймеров, при использовании которых возможно селективное и высокочувствительное определение фитопатогенной бактерии вида Dickeya solani методом LAMP в биологических образцах (например, клубнях картофеля, почве, воде), которые могут одновременно содержать бактерии других таксономических рангов, например, близкородственные пектолитические бактерии рода Pectobacterium, такие как Pectobacterium atrosepticum и Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum.The next objective of the present invention is the provision of a set of oligonucleotide primers, which can be used for selective and highly sensitive determination of phytopathogenic bacteria of the species Dickeya solani by LAMP method in biological samples (for example, potato tubers, soil, water), which can simultaneously contain bacteria of other taxonomic ranks, for example closely related pectolytic bacteria of the genus Pectobacterium, such as Pectobacterium atrosepticum and Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum.

Таким образом, другим аспектом настоящего изобретения является предоставление набора праймеров для определения бактерии вида Dickeya solani методом петлевой изотермической амплификации, содержащего:Thus, another aspect of the present invention is the provision of a set of primers for the determination of bacteria of the species Dickeya solani by loop isothermal amplification, containing:

(E) праймер FIP, имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 7, или его гомолог,(E) a FIP primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7, or a homologue thereof,

(F) праймер BIP, имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 8, или его гомолог,(F) a BIP primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8, or a homologue thereof,

(G) праймер F3, имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 9, или его гомолог,(G) a primer F3 having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9, or a homologue thereof,

(H) праймер В3, имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 10, или его гомолог.(H) a B3 primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10, or a homologue thereof.

Также аспект настоящего изобретения - предоставление вышеописанного набора праймеров, отличающегося тем, что гомологи указанных праймеров FIP, BIP, F3 и В3 имеют гомологию не менее чем 95% по сравнению с соответствующими нуклеотидными последовательностями SEQ ID NOs: 7, 8, 9 и 10 при условии, что такие гомологичные праймеры могут гибридизоваться с целевым геном infB.Another aspect of the present invention is the provision of the above primer set, characterized in that the homologues of said primers FIP, BIP, F3 and B3 have a homology of not less than 95% compared to the corresponding nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 7, 8, 9 and 10, provided such homologous primers can hybridize to the target infB gene.

Также аспект настоящего изобретения - предоставление вышеописанного набора праймеров, отличающегося тем, что указанный набор дополнительно содержит целевой ген infB, кодирующий фактор инициации трансляции IF-2.Also an aspect of the present invention is the provision of the primer set described above, characterized in that said set further comprises an infB target gene encoding an IF-2 translation initiation factor.

Также аспект настоящего изобретения - предоставление вышеописанного набора праймеров, отличающегося тем, что ген infB кодируется нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1 или гомологичной ей нуклеотидной последовательностью при условии, что такая гомологичная нуклеотидная последовательность может гибридизоваться с указанными выше праймерами.An aspect of the present invention is also the provision of the above primer set, characterized in that the infB gene is encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or a homologous nucleotide sequence provided that such a homologous nucleotide sequence can hybridize with the above primers.

Также аспект настоящего изобретения - предоставление вышеописанного набора праймеров, отличающегося тем, что указанный набор праймеров есть диагностический набор реагентов для анализа биологических образцов картофеля, почвы или воды, или их комбинации.Also, an aspect of the present invention is the provision of the primer set described above, characterized in that said set of primers is a diagnostic set of reagents for the analysis of biological samples of potato, soil or water, or a combination thereof.

Технический результат, достигаемый при использовании изобретений, заключается в селективном и высокочувствительном определении фитопатогенной бактерии вида Dickeya solani в биологических образцах (например, картофеле, почве, воде), которые могут одновременно содержать бактерии других таксономических рангов, например, близкородственные пектолитические бактерии рода Pectobacterium, такие как Pectobacterium atrosepticum и Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum. Настоящие изобретения позволяют определить наличие и количество фитопатогенной бактерии вида Dickeya solani в биологических образцах и контролировать ее распространение. При использовании настоящих изобретений возможно повысить контроль за распространением заболеваний растений в открытом и закрытом грунте, а также снизить потери при хранении и транспортировке собранного урожая или товарной продукции. Также, настоящие изобретения позволяют разработать принципиально новые и высокоэффективные методические подходы, направленные на совершенствование системы контроля качества и сертификации семенного материала в некоторых отраслях растениеводства, например, картофелеводстве.The technical result achieved by using the inventions is the selective and highly sensitive determination of phytopathogenic bacteria of the Dickeya solani species in biological samples (for example, potato, soil, water), which may simultaneously contain bacteria of other taxonomic ranks, for example, closely related pectolytic bacteria of the genus Pectobacterium, such as Pectobacterium atrosepticum and Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum. The present invention allows to determine the presence and quantity of phytopathogenic bacteria of the species Dickeya solani in biological samples and to control its distribution. When using the present inventions, it is possible to increase control over the spread of plant diseases in open and closed ground, as well as reduce losses during storage and transportation of harvested crops or marketable products. Also, the present inventions allow the development of fundamentally new and highly effective methodological approaches aimed at improving the quality control system and certification of seed in some sectors of crop production, for example, potato growing.

Указанные задачи и технические результаты были достигнуты благодаря обнаружению того факта, что применение в качестве молекулярно-генетического маркера высококонсервативного гена «домашнего хозяйства» infB, кодирующего фактор инициации трансляции IF-2, и набора из четырех подобранных олигонуклеотидных праймеров FIP, BIP, F3 и В3 в методе LAMP возможно селективное определение фитопатогенной бактерии вида Dickeya solani с высокой чувствительностью в условиях одновременного присутствия в биологическом образце близкородственных пектолитических бактерий рода Pectobacterium, таких как Pectobacterium atrosepticum и Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum.These tasks and technical results were achieved due to the discovery of the fact that the use of the highly conserved housekeeping gene infB as a molecular genetic marker encoding the translation initiation factor IF-2 and a set of four selected oligonucleotide primers FIP, BIP, F3 and B3 in the LAMP method, it is possible to selectively determine the phytopathogenic bacteria of the Dickeya solani species with high sensitivity under the conditions of the simultaneous presence in the biological sample of closely related pectolytic bacteria rye of the genus Pectobacterium, such as Pectobacterium atrosepticum and Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum.

Краткое описание ФигурShort Description of Shapes

Фигура 1 показывает представленные на электрофореграмме результаты петлевой изотермической амплификации по определению селективности диагностической реакции амплификации участка нуклеотидной последовательности гена infB. Обозначения: М - маркер длин ДНК (подписаны фрагменты длиной 200 и 500 пар оснований); N - отрицательный контроль; 1-3 - результат амплификации с геномной ДНК бактерий Dickeya solani штаммов DSO1001, DSO1002 и DSO1003, соответственно; 4-6 - результат амплификации с геномной ДНК бактерий Pectobacterium atrosepticum штаммов SCRI1043, 21А и PAT 1001, соответственно; 7-9 - результат амплификации с геномной ДНК бактерий Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum штаммов PCC1001, PCC1002 и NCPPB312, соответственно.Figure 1 shows the results of an isothermal loop amplification presented on an electrophoregram to determine the selectivity of the diagnostic amplification reaction of a section of the nucleotide sequence of the infB gene. Designations: M - marker of DNA lengths (fragments 200 and 500 base pairs long were signed); N - negative control; 1-3 - the result of amplification with the genomic DNA of the bacteria Dickeya solani strains DSO1001, DSO1002 and DSO1003, respectively; 4-6 - the result of amplification with the genomic DNA of bacteria Pectobacterium atrosepticum strains SCRI1043, 21A and PAT 1001, respectively; 7-9 - the result of amplification with the genomic DNA of bacteria Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum strains PCC1001, PCC1002 and NCPPB312, respectively.

Фигура 2 показывает представленные на электрофореграмме результаты петлевой изотермической амплификации по определению чувствительности диагностической реакции амплификации участка нуклеотидной последовательности гена infB. Обозначения: М - маркер длин ДНК (подписаны фрагменты длиной 200 и 500 пар оснований); N - отрицательный контроль; 1-9 - серия последовательных десятикратных разведений плазмиды на основе вектора pAL2-T со вставкой участка гена infB (штамм Dickeya solani DSO1001), начиная с концентрации 1×10^-9г/мкл (лунка №1) до 1×10^-17 г/мкл (лунка №9).Figure 2 shows the results of a loop isothermal amplification presented on an electrophoregram to determine the sensitivity of a diagnostic amplification reaction of a portion of the nucleotide sequence of the infB gene. Designations: M - marker of DNA lengths (fragments 200 and 500 base pairs long were signed); N - negative control; 1-9 is a series of ten-fold serial dilutions of a plasmid based on the pAL2-T vector with an insert of the infB gene region (Dickeya solani strain DSO1001), starting from a concentration of 1 × 10 ^-9 g / μl (well No. 1) to 1 × 10 ^-17 g / μl (well No. 9).

Фигура 3 показывает нуклеотидную последовательность на кодирующей цепи гена infB (SEQ ID NO: 1) из генома штамма Dickeya solani IPO2222. Черными прямоугольниками на кодирующей цепи гена выделены участки отжига праймеров и комплементарные им последовательности. Буква «-с» в названии сайтов означает комплементарный участок (например, сайту отжига F1 комплементарна последовательность F1c в составе олигонуклеотидного праймера FIP). Нуклеотидные последовательности сайтов отжига разработанного набора праймеров в гене infB штаммов Dickeya solani IPO2222 и DSO1001 по данным секвенирования идентичны на 100%.Figure 3 shows the nucleotide sequence on the coding chain of the infB gene (SEQ ID NO: 1) from the genome of the Dickeya solani strain IPO2222. Sections of primer annealing and complementary sequences to them are highlighted by black rectangles on the gene coding chain. The letter "-c" in the name of the sites means a complementary site (for example, the annealing site F1 complementary sequence F1c in the composition of the oligonucleotide primer FIP). The nucleotide sequences of the annealing sites of the developed primer set in the infB gene of the Dickeya solani IPO2222 and DSO1001 strains according to sequencing data are 100% identical.

Описание способов осуществления изобретенияDescription of the methods of carrying out the invention

Настоящее изобретение более подробно будет описано ниже с приведением не ограничивающих настоящее изобретение примеров.The present invention will be described in more detail below with non-limiting examples of the invention.

Ген infB кодирует белковый фактор инициации трансляции IF-2 (идентификаторы в базе данных GenBank; полный геном типового штамма Dickeya solani IPO2222: NZ_CP015137; локализация гена infB в геноме: 2,845,505-2,848,222; аминокислотная последовательность белка IF-2: WP_022632128). Нуклеотидная последовательность гена infB и аминокислотная последовательность белка IF-2, кодируемого геном infB, из штамма Dickeya solani IPO2222 приведены в SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, соответственно. Другие штаммы бактерии вида Dickeya solani также содержат ген infB и кодируемый им белок IF-2, например, штамм Dickeya solani MK10 (идентификатор в базе данных GenBank; полный геном штамма: NZ_CM001839).The infB gene encodes the IF-2 translation initiation protein factor (identifiers in the GenBank database; complete genome of a typical Dickeya solani strain IPO2222: NZ_CP015137; localization of the infB gene in the genome: 2,845,505-2,848,222; amino acid sequence of IF-2 protein: WP_022632128). The nucleotide sequence of the infB gene and the amino acid sequence of the IF-2 protein encoded by the infB gene from Dickeya solani strain IPO2222 are shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, respectively. Other bacterial strains of the Dickeya solani species also contain the infB gene and the IF-2 protein encoded by it, for example, the Dickeya solani MK10 strain (identifier in the GenBank database; full strain genome: NZ_CM001839).

Известны гомологи гена infB и белка IF-2 из штамма Dickeya solani IPO2222, присутствующие в бактерии вида Pectobacterium atrosepticum (идентификаторы в базе данных GenBank; полный геном типового штамма Pectobacterium atrosepticum SCRI1043: NC_004547; локализация гена в геноме: 779,306-782,008; аминокислотная последовательность белка IF-2: WP_011092323). Нуклеотидная последовательность гена infB и аминокислотная последовательность белка IF-2, кодируемого геном infB, из штамма Pectobacterium atrosepticum SCRI1043 приведены в SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4, соответственно. Нуклеотидные последовательности гена infB из бактерии Dickeya solani (SEQ ID NO: 1) и бактерии Pectobacterium atrosepticum (SEQ ID NO: 3) имеют идентичность 82%. Другие штаммы бактерии вида Pectobacterium atrosepticum также содержат ген infB и кодируемый им белок IF-2, например, штамм Pectobacterium atrosepticum 21А (идентификатор в базе данных GenBank; полный геном штамма: NZ_CP009125).The homologues of the infB gene and IF-2 protein from the Dickeya solani IPO2222 strain are known to be present in bacteria of the species Pectobacterium atrosepticum (identifiers in the GenBank database; the complete genome of the typical strain Pectobacterium atrosepticum SCRI1043: NC_004547; localization of the gene in the genome: 7,008,382; IF-2: WP_011092323). The nucleotide sequence of the infB gene and the amino acid sequence of the IF-2 protein encoded by the infB gene from the strain Pectobacterium atrosepticum SCRI1043 are shown in SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, respectively. The nucleotide sequences of the infB gene from the bacteria Dickeya solani (SEQ ID NO: 1) and the bacteria Pectobacterium atrosepticum (SEQ ID NO: 3) are 82% identical. Other strains of the bacterium of the species Pectobacterium atrosepticum also contain the infB gene and the IF-2 protein encoded by it, for example, the Pectobacterium atrosepticum 21A strain (identifier in the GenBank database; complete strain genome: NZ_CP009125).

Известны гомологи гена infB и белка IF-2 из штамма Dickeya solani IPO2222, присутствующие в бактерии подвида Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum (идентификаторы в базе данных GenBank; полный геном типового штамма Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum PCI: NC_012917; локализация гена в геноме: 681,463-684,162; аминокислотная последовательность белка IF-2: WP_012773288). Нуклеотидная последовательность гена infB и аминокислотная последовательность белка IF-2, кодируемого геном infB, из штамма Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum PCI приведены в SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6, соответственно. Нуклеотидные последовательности гена infB из бактерии Dickeya solani (SEQ ID NO: 1) и бактерии Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum (SEQ ID NO: 5) имеют идентичность 82%. Другие штаммы бактерии подвида Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum также содержат ген infB и кодируемый им белок IF-2, например, штамм Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum PCC21 (идентификатор в базе данных GenBank; полный геном штамма: NC_018525).The homologues of the infB gene and IF-2 protein from the Dickeya solani strain IPO2222 are known, which are present in the bacteria of the subspecies Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum (identifiers in the GenBank database; the complete genome of the typical strain Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum PCI: localization gene 680111717; -684.162; amino acid sequence of protein IF-2: WP_012773288). The nucleotide sequence of the infB gene and the amino acid sequence of the IF-2 protein encoded by the infB gene from the Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum PCI strain are shown in SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6, respectively. The nucleotide sequences of the infB gene from the bacteria Dickeya solani (SEQ ID NO: 1) and the bacteria Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum (SEQ ID NO: 5) are 82% identical. Other strains of the bacterium subspecies Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum also contains the infB gene and the IF-2 protein encoded by it, for example, the strain Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum PCC21 (identifier in the GenBank database; complete strain genome: NC_018525).

Для специалиста в данной области известно, что могут быть различные штаммы бактерий, принадлежащих к видам Dickeya solani, Pectobacterium atrosepticum и Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum, помимо тех штаммов, что приведены в описании. Такие виды бактерий и их штаммы могут быть использованы согласно настоящему изобретению. Штаммы бактерии вида Dickeya solani, такие как, например, типовой штамм IPO2222, могут быть получены из немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур, Брауншвейг, Германия (Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH;

7B, 38124 Braunschweig, Germany; веб-сайт: www.dsmz.de; идентификатор: DSM 28711). Штаммы бактерии вида Pectobacterium atrosepticum, такие как, например, типовой штамм SCRI1043 (идентификатор: ВАА-672) и штаммы бактерии подвида Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum, такие как, например, штамм NCPPB312 (идентификатор: 15713) могут быть получены из Американской коллекции типовых культур, Манассас, штат Виргиния, Соединенные Штаты Америки (АТСС, American Туре Culture Collection, Manassas, Virginia, U.S.A.; веб-сайт: www.lgcstandards-atcc.org). Штаммы бактерии вида Pectobacterium atrosepticum, такие как, например, штамм 21 А, могут быть получены из коллекции культур микроорганизмов лаборатории молекулярной биологии Казанского института биохимии и биофизики Казанского научного центра Российской академии наук (Казань, Республика Татарстан, Российская Федерация; веб-сайт: www.kibb.knc.ru/index.php/ru/researchunits/166-labmolbiol). Штаммы бактерии вида Dickeya solani, такие как, например, штаммы DSO1001, DSO1002, DSO1003, штаммы бактерии вида Pectobacterium atrosepticum, такие как, например, штамм PAT 1001, штаммы бактерии подвида Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum, такие как, например, штаммы РСС1001, РСС1002, могут быть получены из коллекции культур микроорганизмов лаборатории молекулярной биоинженерии Института биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (Москва, Российская Федерация; веб-сайт: www.ibch.ru/en/structure/groups/molbioeng).For a person skilled in the art it is known that there may be various strains of bacteria belonging to the species Dickeya solani, Pectobacterium atrosepticum and Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum, in addition to those strains that are described. Such types of bacteria and their strains can be used according to the present invention. Bacterial strains of the Dickeya solani species, such as, for example, the type strain IPO2222, can be obtained from the German collection of microorganisms and cell cultures, Braunschweig, Germany (Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH;

7B, 38124 Braunschweig, Germany; website: www.dsmz.de; ID: DSM 28711). Pectobacterium atrosepticum species bacterial strains, such as, for example, type strain SCRI1043 (identifier: BAA-672) and Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum subspecies bacterial strains, such as, for example, strain NCPPB312 (identifier: 15713) can be obtained from the American Type Collection Cultures, Manassas, Virginia, United States of America (ATCC, American Tour Culture Collection, Manassas, Virginia, USA; website: www.lgcstandards-atcc.org). Bacterial strains of the species Pectobacterium atrosepticum, such as, for example, strain 21 A, can be obtained from the microorganism culture collection of the Laboratory of Molecular Biology, Kazan Institute of Biochemistry and Biophysics, Kazan Scientific Center of the Russian Academy of Sciences (Kazan, Republic of Tatarstan, Russian Federation; website: www .kibb.knc.ru / index.php / ru / researchunits / 166-labmolbiol). Bacterial strains of the species Dickeya solani, such as, for example, strains DSO1001, DSO1002, DSO1003, strains of the bacterium of the species Pectobacterium atrosepticum, such as, for example, strain PAT 1001, strains of the bacterium subspecies Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum, such as, for example, strains PCC1001, PCC1002, can be obtained from a collection of microorganism cultures of the Laboratory of Molecular Bioengineering of the Institute of Bioorganic Chemistry named after Academicians M.M. Shemyakina and Yu.A. Ovchinnikov Russian Academy of Sciences (Moscow, Russian Federation; website: www.ibch.ru/en/structure/groups/molbioeng).

Ген infB и кодируемый им белок IF-2 не ограничены, соответственно, нуклеотидными последовательностями (SEQ ID NOs: 1, 3 и 5) и аминокислотными последовательностями (SEQ ID NOs: 2, 4 и 6), но могут быть использованы также их гомологи ввиду того, что возможно существование некоторых отличий в последовательностях ДНК среди штаммов бактерий, принадлежащих к семейству Enterobacteriaceae, более точно - к родам Dickeya и Pectobacterium, еще более точно - к видам Dickeya solani и Pectobacterium atrosepticum, а также подвиду Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum. Также возможно существование гомологов нуклеотидных последовательностей гена infB ввиду того, что идентичные аминокислотные последовательности могут кодироваться различными нуклеотидными последовательностями ввиду вырожденности генетического кода в соответствии с таблицей стандартного генетического кода (см., например, Griffiths A.J.F. et al., An Introduction to Genetic Analysis. New York: W.H. Freeman; 2000). Также возможно существование гомологов нуклеотидных последовательностей гена infB ввиду возможности направленного изменения нуклеотидной последовательности нативного гена infB (SEQ ID NOs: 1, 3 и 5) с использованием методов генетической инженерии, например, сайт-специфического мутагенеза (см., например, Kunkel Т. A., Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Proc Natl Acad Sci USA, 1985, 82(2): 488-492).The infB gene and the IF-2 protein encoded by it are not limited, respectively, to the nucleotide sequences (SEQ ID NOs: 1, 3 and 5) and amino acid sequences (SEQ ID NOs: 2, 4 and 6), but their homologues can also be used in view of of the fact that there may be some differences in DNA sequences among bacterial strains belonging to the Enterobacteriaceae family, more precisely to the genera Dickeya and Pectobacterium, more precisely to the species Dickeya solani and Pectobacterium atrosepticum, as well as the subspecies Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum. Homologs of the nucleotide sequences of the infB gene may also exist due to the fact that identical amino acid sequences can be encoded by different nucleotide sequences due to the degeneracy of the genetic code in accordance with the standard genetic code table (see, for example, Griffiths AJF et al., An Introduction to Genetic Analysis. New York: WH Freeman; 2000). Homologs of nucleotide sequences of the infB gene are also possible due to the possibility of a directed change in the nucleotide sequence of the native infB gene (SEQ ID NOs: 1, 3, and 5) using genetic engineering methods, for example, site-specific mutagenesis (see, for example, Kunkel T. A ., Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Proc Natl Acad Sci USA, 1985, 82 (2): 488-492).

Такие «гомологи нуклеотидной последовательности гена infB» и «гомологи аминокислотной последовательности IF-2», кодируемой геном infB, могут иметь одно или несколько изменений в нуклеотидной и/или аминокислотной последовательности, соответственно, по сравнению с исходной нуклеотидной последовательностью SEQ ID NOs: 1, 3 и 5, или нативной аминокислотной последовательностью SEQ ID NOs: 2, 4 и 6, причем такими изменениями могут быть замена (также называется как замещение), инсерция (также называется как вставка) или делеция (также называется как удаление) одного или нескольких нуклеотидов и/или аминокислотных остатков при условии, что такая гомологичная нуклеотидная последовательность может быть использована в способе определения бактерии вида Dickeya solani согласно настоящему изобретению также, как и исходный ген infB, или такая гомологичная аминокислотная последовательность имеет такие же функцию и активность, как и нативный белок IF-2, или же трехмерная структура гомологичного белка IF-2 изменена незначительно по сравнению с нативным белком IF-2.Such “homologues of the nucleotide sequence of the infB gene” and “homologues of the amino acid sequence IF-2” encoded by the infB gene can have one or more changes in the nucleotide and / or amino acid sequence, respectively, compared with the original nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 1, 3 and 5, or the native amino acid sequence of SEQ ID NOs: 2, 4 and 6, and such changes can be a replacement (also called as substitution), insertion (also called as insert) or deletion (also called as removal) od one or more nucleotides and / or amino acid residues, provided that such a homologous nucleotide sequence can be used in the method for determining bacteria of the Dickeya solani species according to the present invention as well as the original infB gene, or such a homologous amino acid sequence has the same function and activity, like the native IF-2 protein, or the three-dimensional structure of the homologous IF-2 protein is slightly changed compared to the native IF-2 protein.

Термин «гомолог нуклеотидной последовательности гена infB» также может означать, но не ограничиваться данными примерами, нуклеотидную последовательность, которая гибридизуется в условиях проведения реакции амплификации с помощью метода LAMP последовательности с олигонуклеотидными праймерами согласно изобретению и может быть использована в способе определения бактерии вида Dickeya solani согласно изобретению. Более точно, термин «гомолог нуклеотидной последовательности гена infB» может означать нуклеотидную последовательность, которая гибридизуется в условиях проведения LAMP с олигонуклеотидными праймерами SEQ ID NOs: 7, 8, 9, 10 и может быть использована в способе определения бактерии вида Dickeya solani согласно изобретению. Гомолог нуклеотидной последовательности гена infB может иметь гомологию, определенную через параметр «идентичность» при использовании компьютерного алгоритма BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; веб-сайт: www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST), не менее чем 80%, не менее чем 85%, не менее чем 90%, не менее чем 95%, не менее чем 96%, не менее чем 97%, не менее чем 98% или не менее чем 99% по сравнению с исходной нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1, 3 или 5.The term “infB gene nucleotide sequence homologue” can also mean, but not limited to these examples, a nucleotide sequence that hybridizes under the conditions of an amplification reaction using the LAMP method with the oligonucleotide primers according to the invention and can be used in the method for determining bacteria of the Dickeya solani species according to invention. More specifically, the term “infB gene nucleotide sequence homologue” can mean a nucleotide sequence that hybridizes under the conditions of LAMP with oligonucleotide primers SEQ ID NOs: 7, 8, 9, 10 and can be used in the method for determining bacteria of the Dickeya solani species according to the invention. A homolog of the nucleotide sequence of the infB gene can have a homology determined through the “identity” parameter using the BLAST computer algorithm (Basic Local Alignment Search Tool; website: www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST), at least 80%, not less than 85%, not less than 90%, not less than 95%, not less than 96%, not less than 97%, not less than 98% or not less than 99% compared to the original nucleotide sequence of SEQ ID NO : 1, 3 or 5.

Набор олигонуклеотидных праймеров согласно настоящему изобретению содержит, по меньшей мере, четыре праймера, которые способны гибридизоваться в условиях проведения LAMP с нуклеотидной последовательностью гена infB или его гомолога, также обозначаемых как молекулярно-генетических маркер, ген-мишень, ДНК-мишень, целевой ген и тому подобное, которые могут быть использованы взаимозаменяемо, в способе определения бактерии вида Dickeya solani согласно изобретению. Более точно - в частном варианте осуществления настоящего изобретения набор олигонуклеотидных праймеров содержит четыре праймера, условно обозначаемые как FIP (SEQ ID NO: 7), BIP (SEQ ID NO: 8), F3 (SEQ ID NO: 9) и В3 (SEQ ID NO: 10), которые способны гибридизоваться в условиях проведения LAMP с нуклеотидной последовательностью гена infB или его гомолога и могут быть использованы в способе определения бактерии вида Dickeya solani согласно изобретению.The set of oligonucleotide primers according to the present invention contains at least four primers that are capable of hybridizing under conditions of LAMP with the nucleotide sequence of the infB gene or its homologue, also referred to as molecular genetic marker, target gene, target DNA, target gene, and the like, which can be used interchangeably, in a method for determining bacteria of the Dickeya solani species according to the invention. More specifically, in a particular embodiment of the present invention, the set of oligonucleotide primers contains four primers, conventionally designated as FIP (SEQ ID NO: 7), BIP (SEQ ID NO: 8), F3 (SEQ ID NO: 9) and B3 (SEQ ID NO: 10), which are capable of hybridizing under conditions of LAMP with the nucleotide sequence of the infB gene or its homologue and can be used in the method for determining bacteria of the Dickeya solani species according to the invention.

Набор праймеров FIP, BIP, F3 и В3 не ограничен нуклеотидными последовательностями SEQ ID NOs: 7, 8, 9 и 10, но могут быть использованы также их гомологи ввиду того, что возможно существование не только исходного гена infB из бактерии вида Dickeya solani, имеющего нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1, но и гомологов указанного гена infB, как разъяснено выше. Следовательно, набор праймеров также может включать, но не ограничиваться данными примерами, гомологичные праймеры, имеющие нуклеотидную последовательность, которая гибридизуется в условиях проведения LAMP с геном-мишенью infB или его гомологом в способе определения бактерии вида Dickeya solani согласно изобретению. Более точно - набор праймеров может включать праймеры, имеющие нуклеотидную последовательность, которая гибридизуется в условиях проведения LAMP с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1 или гомологичной ей нуклеотидной последовательностью в способе определения бактерии вида Dickeya solani согласно изобретению. Гомологи праймеров FIP, BIP, F3 и В3 могут иметь гомологию, определенную через параметр «идентичность» при использовании компьютерного алгоритма BLAST, не менее чем 95%, не менее чем 96%, не менее чем 97%, не менее чем 98% или не менее чем 99% по сравнению с исходными нуклеотидными последовательностями SEQ ID NOs: 7, 8, 9 и 10 при условии, что такие гомологичные праймеры способны гибридизоваться в условиях проведения LAMP с геном-мишенью infB или его гомологом согласно изобретению и могут быть использованы в способе определения бактерии вида Dickeya solani согласно изобретению.The set of primers FIP, BIP, F3 and B3 is not limited to the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 7, 8, 9 and 10, but their homologues can also be used because not only the original infB gene from a bacterium of the Dickeya solani species having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, but also homologs of the indicated infB gene, as explained above. Therefore, the primer kit may also include, but not limited to these examples, homologous primers having a nucleotide sequence that hybridizes under the conditions of the LAMP with the infB target gene or its homolog in the method for determining a Dickeya solani bacterium of the invention. More specifically, the primer set may include primers having a nucleotide sequence that hybridizes under the conditions of the LAMP with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or a homologous nucleotide sequence in the method for determining bacteria of the species Dickeya solani according to the invention. The homologues of the primers FIP, BIP, F3 and B3 can have the homology determined through the parameter “identity” using the BLAST computer algorithm, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or not less than 99% compared to the original nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 7, 8, 9 and 10, provided that such homologous primers are able to hybridize under the conditions of the LAMP with the target gene infB or its homologue according to the invention and can be used in the method for determining bacteria of the species Dickeya solani according to the invention uw.

Термин «способность гибридизоваться», употребляемый здесь в отношении любой нуклеотидной последовательности, например, целевого гена или праймера, означает, что в условиях проведения LAMP согласно изобретению возможно связывание нуклеотидной последовательности одного или нескольких олигонуклеотидных праймеров (или целевого гена) с нуклеотидной последовательностью целевого гена (или одного, либо нескольких олигонуклеотидных праймеров) с образованием комплекса(-ов), такого(-их) как дуплекс(-ы) ДНК таким образом, что возможно осуществление реакции амплификации целевого гена с помощью метода LAMP.The term “hybridization ability” as used herein with respect to any nucleotide sequence, for example, a target gene or primer, means that under the conditions of the LAMP according to the invention, it is possible to bind the nucleotide sequence of one or more oligonucleotide primers (or the target gene) to the nucleotide sequence of the target gene ( or one or more oligonucleotide primers) with the formation of complex (s), such (s) as duplex (s) of DNA in such a way that it is possible e the amplification reaction of the target gene using the LAMP method.

Термин «условия проведения LAMP согласно изобретению» означает такие условия, при которых возможна гибридизация олигонуклеотидных праймеров FIP, BIP, F3 и В3 с геном-мишенью infB и осуществление реакции амплификации последовательности гена infB с помощью метода LAMP с использованием указанных праймеров. В качестве условий проведения LAMP согласно изобретению могут быть выбраны такие условия, при которых гибридизацию осуществляют на стадии предварительного прогрева реакционной смеси без добавления ДНК-полимеразы при 95°C в течение 10 минут, затем при 60°C в течение 5 минут и последующим охлаждением до 12°C; реакцию амплификации проводят в изотермических условиях в интервале от 60 до 65°C, например, при 65°C, в течение 40 минут; реакцию останавливают при 95°C в течение 2 минут. В качестве ДНК-полимеразы может быть использована Bst-полимераза или ДНК-полимераза, обладающая подобной активностью. Чувствительность способа определения согласно изобретению изменяют, варьируя продолжительность реакции амплификации.The term “LAMP conditions according to the invention” means those conditions under which hybridization of the oligonucleotide primers FIP, BIP, F3 and B3 with the infB target gene is possible and the amplB reaction of the infB gene sequence is amplified using the LAMP method using the indicated primers. The conditions under which the LAMP according to the invention can be selected are those under which hybridization is carried out at the stage of preheating the reaction mixture without adding DNA polymerase at 95 ° C for 10 minutes, then at 60 ° C for 5 minutes and then cooling to 12 ° C; the amplification reaction is carried out in isothermal conditions in the range from 60 to 65 ° C, for example, at 65 ° C, for 40 minutes; the reaction is stopped at 95 ° C for 2 minutes. As a DNA polymerase, a Bst polymerase or a DNA polymerase having similar activity can be used. The sensitivity of the determination method according to the invention is changed by varying the duration of the amplification reaction.

Определение бактерии вида Dickeya solani осуществляют, выявляя образование продукта реакции амплификации участка гена-мишени или его отсутствие. В случае наличия бактерии вида Dickeya solani в анализируемой пробе происходит накопление продукта реакции амплификации. Методы приготовления растворов, праймеров, выделения ДНК, иные условия проведения реакции амплификации, визуализации продукта реакции амплификации и подобные им известны для специалиста в данной области техники, и такие методы описаны, например, в научных публикациях (см., например, Tomita N. et al., Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products, Nat Protoc, 2008, 3(5): 877-882; Goto M. et al., Colorimetric detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by using hydroxy naphthol blue, Biotechniques, 2009, 46(3): 167-172; Zhang X. et al., Brief review of monitoring methods for loop-mediated isothermal amplification (LAMP), Biosens Bioelectron., 2014, 61: 491-499) или нижеследующих Примерах.The determination of bacteria of the Dickeya solani species is carried out by detecting the formation of the product of the amplification reaction of the portion of the target gene or its absence. If a bacterium of the Dickeya solani species is present in the analyzed sample, the product of the amplification reaction accumulates. Methods for preparing solutions, primers, DNA isolation, other conditions for the amplification reaction, visualization of the amplification reaction product and the like are known to a person skilled in the art, and such methods are described, for example, in scientific publications (see, for example, Tomita N. et al., Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products, Nat Protoc, 2008, 3 (5): 877-882; Goto M. et al., Colorimetric detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by using hydroxy naphthol blue, Biotechniques, 2009, 46 (3): 167-172; Zhang X. et al., Brief review of monitoring methods for loop-mediated isothermal amplification (LAMP), Biosens Bioelectron., 2014, 61: 491-499) or below Eating Examples.

Набор олигонуклеотидных праймеров согласно изобретению содержит указанные выше праймеры FIP, BIP, F3 и В3. С целью повышения селективности анализа набор праймеров может дополнительно содержать другие олигонуклеотидные праймеры, например, другие два праймера, отличные от FIP, BIP, F3 и В3, которые могут быть использованы в способе определения бактерии вида Dickeya solani. Дополнительно набор праймеров может содержать ДНК, имеющую нуклеотидную последовательность гена infB, причем указанная ДНК может быть, например, в виде вставки полной или частичной нуклеотидной последовательности гена infB в плазмидный вектор, в виде очищенной геномной ДНК или в виде одной или нескольких клеток бактерий вида Dickeya solani, содержащей нуклеотидную последовательность гена infB. Таким образом, возможно, что набор праймеров согласно изобретению содержит, не ограничиваясь этим, клетки бактерии вида Dickeya solani или ее геномную ДНК, содержащую нуклеотидную последовательность гена infB, и олигонуклеотидные праймеры FIP, BIP, F3 и В3. В частном и не ограничивающем настоящее изобретение примере набор олигонуклеотидных праймеров согласно изобретению есть диагностический набор реагентов для анализа биологических образцов (например, картофеля, почвы или воды, или их комбинации). Такой диагностический набор реагентов содержит указанные выше праймеры FIP, BIP, F3 и В3, а также в качестве средства положительного контроля реакции амплификации ДНК, имеющую нуклеотидную последовательность гена infB, причем указанная ДНК может быть, например, в виде изолированной полной или частичной нуклеотидной последовательности гена infB, в виде вставки полной или частичной нуклеотидной последовательности гена infB в плазмидный вектор, в виде очищенной геномной ДНК или в виде клеток бактерий вида Dickeya solani. Таким образом, возможно, что диагностический набор содержит, не ограничиваясь этим, клетки бактерии вида Dickeya solani или. ее геномную ДНК, содержащую нуклеотидную последовательность гена infB и олигонуклеотидные праймеры FIP, BIP, F3 и В3.The set of oligonucleotide primers according to the invention contains the above primers FIP, BIP, F3 and B3. In order to increase the selectivity of the analysis, the primer set may additionally contain other oligonucleotide primers, for example, two other primers other than FIP, BIP, F3 and B3, which can be used in the method for determining bacteria of the Dickeya solani species. Additionally, the primer set may contain DNA having the nucleotide sequence of the infB gene, said DNA may be, for example, as an insertion of the full or partial nucleotide sequence of the infB gene into the plasmid vector, as a purified genomic DNA, or as one or more Dickeya bacteria cells solani containing the nucleotide sequence of the infB gene. Thus, it is possible that the primer set according to the invention contains, but is not limited to, Dickeya solani bacterial cells or its genomic DNA containing the nucleotide sequence of the infB gene and oligonucleotide primers FIP, BIP, F3 and B3. In a particular and non-limiting example of the present invention, the set of oligonucleotide primers according to the invention is a diagnostic set of reagents for the analysis of biological samples (for example, potatoes, soil or water, or a combination thereof). Such a diagnostic reagent kit contains the above primers FIP, BIP, F3 and B3, as well as a means of positive control of the amplification reaction of DNA having the nucleotide sequence of the infB gene, and this DNA can be, for example, in the form of an isolated full or partial nucleotide sequence of the gene infB, in the form of an insertion of the full or partial nucleotide sequence of the infB gene into a plasmid vector, in the form of purified genomic DNA, or in the form of bacterial cells of the species Dickeya solani. Thus, it is possible that the diagnostic kit contains, but is not limited to, cells of a bacterium of the species Dickeya solani or. its genomic DNA containing the nucleotide sequence of the infB gene and oligonucleotide primers FIP, BIP, F3 and B3.

Также, набор праймеров, включая диагностический набор реагентов, может дополнительно содержать компоненты, необходимые для осуществления способа определения бактерии вида Dickeya solani согласно настоящему изобретению, более точно - для проведения реакции амплификации с помощью метода LAMP участка последовательности целевого гена infB с использованием указанных выше праймеров FIP, BIP, F3 и В3 и гена-мишени infB. В качестве дополнительных компонентов могут быть использованы различные органические и неорганические вещества, необходимые для поддержания требуемого значения кислотности реакционной смеси и ее солевого состава, ферменты (например, ДНК-полимеразу, пирофосфатазу и подобные им ферменты), дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (dNTPs), минеральное масло, красители, интеркаляторы и другие компоненты, применяемые в молекулярной диагностике с помощью методов реакции амплификации с целью повышения ее эффективности.Also, the set of primers, including the diagnostic set of reagents, may additionally contain the components necessary for implementing the method for determining bacteria of the Dickeya solani type according to the present invention, more precisely, for carrying out the amplification reaction using the LAMP method of the sequence section of the target infB gene using the above FIP primers , BIP, F3, and B3; and the infB target gene. As additional components, various organic and inorganic substances necessary to maintain the required acidity of the reaction mixture and its salt composition, enzymes (for example, DNA polymerase, pyrophosphatase and similar enzymes), deoxyribonucleoside triphosphates (dNTPs), mineral oil, dyes can be used , intercalators and other components used in molecular diagnostics using amplification reaction methods to increase its effectiveness.

ПримерыExamples

Реагенты, расходные материалы и оборудованиеReagents, supplies and equipment

Компоненты реакционной смеси: буфер Трис-HCl (Tris Buffer, pH 8,8; Sigma, каталожный номер Т9443), хлорид калия (KCl; Wako Pure Chemicals, каталожный номер 163-03545), гептагидрат сульфата магния (MgSO₄×7H₂O; Wako Pure Chemicals, каталожный номер 137-00402), сульфат аммония ((NH₄)₂SO₄; Kanto Chemical, каталожный номер 01322-00), Твин-20 (Tween 20; Tokyo Chemical Industry, каталожный номер Т0543), моногидрат бетаина (Betaine, 5 М; Sigma, каталожный номер В0300), дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (dNTP Set; Thermo Scientific, каталожный номер R0181), олигонуклеотидные праймеры FIP (SEQ ID NO: 7), BIP (SEQ ID NO: 8), F3 (SEQ ID NO: 9) и В3 (SEQ ID NO: 10), синтез которых был заказан в компании «Евроген», и Bst ДНК-полимераза (Bst DNA Polymerase, 8000 U ml^-1 (8000 Е/мл); New England Biolabs, каталожный номер M0275L). Для определения продукта реакции амплификации использовали агарозу (Top Vision Agarose; Thermo Scientific, каталожный номер R0491), раствор бромистого этидия (Ethidium Bromide, 10 mg ml^-1 (10 мг/мл); Nippon Gene, каталожный номер 315-9005), маркер длин ДНК (MassRuler DNA Ladder; Thermo Scientific, каталожный номер SM0403). Все реагенты для приготовления компонентов реакционной смеси хранили при -20°C.Components of the reaction mixture: Tris-HCl buffer (Tris Buffer, pH 8.8; Sigma, catalog number T9443), potassium chloride (KCl; Wako Pure Chemicals, catalog number 163-03545), magnesium sulfate heptahydrate (MgSO ₄ × 7H ₂ O ; Wako Pure Chemicals, catalog number 137-00402), ammonium sulfate ((NH ₄ ) ₂ SO ₄ ; Kanto Chemical, catalog number 01322-00), Tween-20 (Tween 20; Tokyo Chemical Industry, catalog number T0543), monohydrate betaine (Betaine, 5 M; Sigma, catalog number B0300), deoxyribonucleoside triphosphates (dNTP Set; Thermo Scientific, catalog number R0181), oligonucleotide primers FIP (SEQ ID NO: 7), BIP (SEQ ID NO: 8), F3 (SEQ ID NO: 8) ID NO: 9) and B3 (SEQ ID NO: 10), the synthesis of which was ordered in panii "Evrogen", and Bst DNA polymerase (Bst DNA Polymerase, 8000 U ml ^-1 (8000 U / ml); New England Biolabs, Catalog No. M0275L). Agarose (Top Vision Agarose; Thermo Scientific, catalog number R0491), ethidium bromide solution (Ethidium Bromide, 10 mg ml ^-1 (10 mg / ml); Nippon Gene, catalog number 315-9005), marker was used to determine the amplification reaction product. DNA lengths (MassRuler DNA Ladder; Thermo Scientific, catalog number SM0403). All reagents for preparing the components of the reaction mixture were stored at -20 ° C.

Расходные материалы: пробирки объемом 0,5 или 1,5 мл для приготовления компонентов реакционной смеси (Eppendorf), тонкостенные пробирки объемом 0,2 мл для проведения реакции амплификации, стерильные наконечники с фильтром для автоматических пипеток (SSI).Consumables: 0.5 ml or 1.5 ml tubes for preparing the components of the reaction mixture (Eppendorf), 0.2 ml thin-walled tubes for the amplification reaction, sterile tips with automatic pipette filter (SSI).

Оборудование: набор автоматических пипеток переменного объема (серия Research Plus; Eppendorf), твердотельный термостат (модель TDB-120; BioSan) или ДНК-амплификатор (модель Т100; BioRad), вортекс (модель MixMate; Eppendorf), микроцентрифуга (модель MiniSpin; Eppendorf), источник питания (модель PowerPac Basic; Bio-Rad), камера для горизонтального электрофореза в агарозном геле (модель Mini-Sub Cell GT cell; Bio-Rad), трансиллюминатор (модель ECX-F20; Vilber Lourmat) или гель-документирующая система (модель ChemiDoc MP; Bio-Rad).Equipment: a set of automatic pipettes of variable volume (Research Plus series; Eppendorf), solid-state thermostat (TDB-120 model; BioSan) or DNA amplifiers (T100 model; BioRad), vortex (MixMate model; Eppendorf), microcentrifuge (MiniSpin model; Eppendorff ), a power source (PowerPac Basic model; Bio-Rad), an agarose gel horizontal electrophoresis chamber (Mini-Sub Cell GT cell model; Bio-Rad), a transilluminator (ECX-F20 model; Vilber Lourmat), or a gel-documenting system (ChemiDoc MP model; Bio-Rad).

Состав реакционной смесиThe composition of the reaction mixture

Диагностическую реакцию по определению требуемого молекулярно-генетического маркера в заданной бактерии проводили, используя реакционную смесь общим объемом 25 мкл, которая содержала нижеследующие компоненты в конечной концентрации:A diagnostic reaction to determine the desired molecular genetic marker in a given bacterium was carried out using a reaction mixture with a total volume of 25 μl, which contained the following components in a final concentration:

Трис-HCl буфер, рН 8,8Tris-HCl buffer, pH 8.8 20 мМ20 mm KClKcl 10 мМ10 mm MgSO₄×7H₂OMgSO ₄ × 7H ₂ O 8 мМ8 mm (NH₄)₂SO₄ (NH ₄ ) ₂ SO ₄ 10 мМ10 mm Твин-20Twin 20 0,1% (по объему)0.1% (by volume) БетаинBetaine 1,6 M1,6 M dNTPsdNTPs 1,4 мМ (каждый)1.4 mm (each) FIΡFIΡ 40 пмоль40 pmol BIPBip 40 пмоль40 pmol F3F3 10 пмоль10 pmol В3IN 3 10 пмоль10 pmol Bst-полимеразаBst polymerase 8 Ε8 Ε Вода деионизированнаяDeionized water до 24 мклup to 24 μl Биологический образецBiological sample 1 мкл1 μl

Реакционную смесь из перечисленных выше компонентов готовили в день эксперимента.A reaction mixture of the above components was prepared on the day of the experiment.

Реакция амплификацииAmplification reaction

В тонкостенные пробирки вносили по 24 мкл реакционной смеси, содержащей Bsf-полимеразу. В пробирку с отрицательным контролем вносили 1 мкл стерильной денонсированной воды. В пробирку с положительным контролем добавляли 1 мкл водного раствора очищенной геномной ДНК бактерии Dickeya solani или плазмиды со вставкой сайта отжига диагностических праймеров FIP, BIP, F3, В3 в концентрации 1 нг/мкл. Плазмиду со вставкой участка гена infB изготавливали с помощью набора для быстрого клонирования ПЦР-продуктов в вектор pAL2-T («Евроген»; каталожный номер TAK02) и компетентных клеток штамма Escherichia coli XL 1-Blue для химической трансформации («Евроген»; каталожный номер СС001) с соблюдением идущих в комплекте протоколов. Далее в пробирки вносили по 1 мкл гомогената клубней картофеля, поливной воды или суспензии почвы с полей для выращивания картофеля. Содержимое пробирок перемешивали на вортексе. Реакционные смеси инкубировали при 65°C в течение 40 минут в ячейках твердотельного термостата или ДНК-амплификатора. Реакцию амплификации останавливали, нагревая пробирки до 95°C в течение 2 минут.24 μl of the reaction mixture containing Bsf polymerase was added to thin-walled tubes. 1 μl of sterile denounced water was added to the negative control tube. A positive control was added 1 μl of an aqueous solution of purified genomic DNA of the bacterium Dickeya solani or plasmid with an insert of the annealing site of diagnostic primers FIP, BIP, F3, B3 at a concentration of 1 ng / μl. A plasmid with an infB gene region insert was prepared using a kit for fast cloning of PCR products into pAL2-T vector (Eurogen; catalog number TAK02) and competent cells of the Escherichia coli strain XL 1-Blue for chemical transformation (Eurogen; catalog number SS001) in compliance with the protocols included in the kit. Then, 1 μl of a potato tuber homogenate, irrigation water, or soil suspension from potato fields was added to the tubes. The contents of the tubes were mixed on a vortex. The reaction mixtures were incubated at 65 ° C for 40 minutes in the cells of a solid state thermostat or DNA amplifier. The amplification reaction was stopped by heating the tubes to 95 ° C for 2 minutes.

Предварительный прогрев реакционный смесей позволял добиться большей чувствительности, если необходимо было детектировать количество пектолитических бактерий, значительно меньшее уровня латентной инфекции. Для проведения такой модификации лабораторной диагностики реакционную смесь готовили без добавления Bst-полимеразы и разливали по пробиркам в объеме 23 мкл. В пробирку с отрицательным контролем вносили 1 мкл стерильной деионизированной воды. В пробирку с положительным контролем добавляли 1 мкл водного раствора очищенной геномной ДНК бактерии Dickeya solani или плазмиды со вставкой сайта отжига диагностических праймеров FIP, BIP, F3, В3 в концентрации 1 нг/мкл. Далее в пробирки вносили по 1 мкл гомогената клубней картофеля, поливной воды или суспензии почвы с полей для выращивания картофеля. Содержимое пробирок перемешивали на вортексе и прогревали при 95°C в течение 10 минут, затем при 60°C в течение 5 минут и охлаждали до 12°C. Испарившуюся жидкость сбрасывали со стенок пробирок, используя микроцентрифугу. В каждую пробирку вносили по 1 мкл Bst-полимеразы и осторожно перемешивали содержимое пробирок. Реакционные смеси инкубировали при 65°C в течение 40 минут в ячейках твердотельного термостата или ДНК-амплификатора. Реакцию амплификации останавливали, нагревая пробирки до 95°C в течение 2 минут.Preliminary heating of the reaction mixtures made it possible to achieve greater sensitivity if it was necessary to detect the number of pectolytic bacteria significantly lower than the level of latent infection. To carry out such a modification of laboratory diagnostics, the reaction mixture was prepared without the addition of Bst polymerase and poured into tubes in a volume of 23 μl. 1 μl of sterile deionized water was added to the negative control tube. A positive control was added 1 μl of an aqueous solution of purified genomic DNA of the bacterium Dickeya solani or plasmid with an insert of the annealing site of diagnostic primers FIP, BIP, F3, B3 at a concentration of 1 ng / μl. Then, 1 μl of a potato tuber homogenate, irrigation water, or soil suspension from potato fields was added to the tubes. The contents of the tubes were vortexed and warmed at 95 ° C for 10 minutes, then at 60 ° C for 5 minutes and cooled to 12 ° C. Evaporated liquid was discarded from the walls of the tubes using a microcentrifuge. 1 μl of Bst polymerase was added to each tube and the contents of the tubes were gently mixed. The reaction mixtures were incubated at 65 ° C for 40 minutes in the cells of a solid state thermostat or DNA amplifier. The amplification reaction was stopped by heating the tubes to 95 ° C for 2 minutes.

Визуализация продукта реакции амплификации по пирофосфату магнияVisualization of Magnesium Pyrophosphate Amplification Reaction Product

Визуальную детекцию положительной реакции амплификации методом LAMP проводили, наблюдая образование взвеси осадка пирофосфата магния белого цвета. В пробирках с отрицательным контролем и отрицательными реакциями содержимое пробирок оставалось прозрачным. Согласно литературным данным, наличие взвеси осадка пирофосфата магния белого цвета находится в соответствии с данными турбидиметрии и означает положительную реакцию (Mori Y. et al., Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation, Biochem Biophys Res Commun., 2001, 289(1): 150-154). Данный способ является самым простым из всех существующих на сегодня в приложении к методу LAMP и позволяет провести качественный анализ реакции амплификации.Visual detection of a positive amplification reaction by the LAMP method was performed by observing the formation of a suspension of a white magnesium pyrophosphate precipitate. In tubes with negative controls and negative reactions, the contents of the tubes remained transparent. According to published data, the presence of a suspension of white magnesium pyrophosphate sediment is in accordance with turbidimetric data and means a positive reaction (Mori Y. et al., Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation, Biochem Biophys Res Commun. 2001, 289 (1): 150-154). This method is the simplest of all existing today in the application to the LAMP method and allows a qualitative analysis of the amplification reaction.

Визуализация продукта реакции амплификации с помощью электрофореза в агарозном гелеVisualization of the amplification reaction product by agarose gel electrophoresis

Альтернативным и более чувствительным методом анализа продуктов реакции амплификации является горизонтальный электрофорез в агарозном геле (Zhang X. et al., Brief review of monitoring methods for loop-mediated isothermal amplification (LAMP), Biosens Bioelectron., 2014, 61: 491-499). Содержимое пробирок с положительными реакциями имеет на агарозном геле характерное распределение продуктов амплификации в виде регулярной лесенки. Учитывая образование в ходе реакции амплификации продуктов различной молекулярной массы, для проведения электрофореза в агарозном геле использовали 2% (по массе) агарозу. Электрофорез проводили в течение 30 минут в присутствии 1-кратного Трис-ацетатного буфера (см. методику приготовления, например, в Green М.R. and Sambrook J., Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2012) при комнатной температуре и напряженности электрического поля 100 В/см. Визуализацию продуктов амплификации проводили на трансиллюминаторе или с помощью гель-документирующей системы за счет разгорания флюоресценции молекул бромистого этидия при интеркаляции в ДНК.An alternative and more sensitive method for analyzing amplification reaction products is horizontal agarose gel electrophoresis (Zhang X. et al., Brief review of monitoring methods for loop-mediated isothermal amplification (LAMP), Biosens Bioelectron., 2014, 61: 491-499) . The contents of test tubes with positive reactions on agarose gel have a characteristic distribution of amplification products in the form of a regular ladder. Given the formation of products of various molecular weights during the amplification reaction, 2% (by weight) agarose was used to conduct agarose gel electrophoresis. Electrophoresis was carried out for 30 minutes in the presence of 1-fold Tris-acetate buffer (see, for example, Green M.R. and Sambrook J., Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2012) at room temperature and electric field strength of 100 V / cm. The amplification products were visualized on a transilluminator or using a gel-documenting system due to the increase in fluorescence of ethidium bromide molecules during intercalation in DNA.

Пример 1. Селективность способаExample 1. The selectivity of the method

Селективность способа определения бактерии вида Dickeya solani по отношению к штаммам близкородственных фитопатогенных бактерий оценивали, проводя реакцию амплификации в разных пробирках с добавлением очищенной геномной ДНК штаммов Dickeya solani, Pectobacterium atrosepticum и Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum.The selectivity of the method for determining bacteria of the Dickeya solani species with respect to strains of closely related phytopathogenic bacteria was evaluated by conducting an amplification reaction in different tubes with the addition of purified genomic DNA of the Dickeya solani, Pectobacterium atrosepticum and Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum strains.

Результаты электрофореза показывают (Фигура 1), что предложенный способ, в котором используются набор олигонуклеотидных праймеров FIP (SEQ ID NO: 7), BIP (SEQ ID NO: 8), F3 (SEQ ID NO: 9) и В3 (SEQ ID NO: 10) и ген-мишень infB, позволяет определить наличие в биологических образцах только требуемой бактерии вида Dickeya solani, при этом близкородственные бактерии рода Pectobacterium указанным способом не определяются. Для специалиста в данной области очевидно, что иные бактерии, не являющиеся близкородственными к бактерии вида Dickeya solani, например, принадлежащие к другим бактериям семейства Enterobacteriaceae или иным семействам, предложенным способом также не будут определяться.Electrophoresis results show (Figure 1) that the proposed method, which uses a set of oligonucleotide primers FIP (SEQ ID NO: 7), BIP (SEQ ID NO: 8), F3 (SEQ ID NO: 9) and B3 (SEQ ID NO: : 10) and the target gene infB, it is possible to determine the presence in biological samples of only the required bacteria of the Dickeya solani species, while closely related bacteria of the genus Pectobacterium are not determined by this method. For a person skilled in the art it is obvious that other bacteria that are not closely related to bacteria of the Dickeya solani species, for example, belonging to other bacteria of the Enterobacteriaceae family or other families, the proposed method will also not be determined.

Пример 2. Чувствительность способаExample 2. The sensitivity of the method

Чувствительность способа определения бактерии вида Dickeya solani оценивали, используя набор праймеров FIP, BIP, F3, В3 и плазмиду pAL2-T, содержащую участок нуклеотидной последовательности гена infB из Dickeya solani, в котором локализованы комплементарные праймерам FIP, BIP, F3 и В3 сайты отжига. Для праймера FIP сайтами отжига являются F1 и F2c (Фигура 3), для праймера BIP-В1 и В2с, для праймера F3-F3c, а для праймера В3-В3с. Нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 11), представляющую собой участок гена infB (SEQ ID NO: 1) с сайтами отжига праймеров FIP, BIP, F3 и В3, клонировали в плазмиду pAL2-T («Евроген»; каталожный номер ТА002) из генома штамма Dickeya solani DSO1001 (штамм хранится в коллекции культур микроорганизмов лаборатории молекулярной биоинженерии Института биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, Москва, Российская Федерация). Идентичность клонированного фрагмента, соответствующему участку в гене infB, подтверждали с помощью секвенирования и сравнением с нуклеотидной последовательностью гена infB (SEQ ID NO: 1) из полного генома штамма Dickeya solani IPO2222, депонированного в базе данных GenBank (идентификатор: NZ_CP015137).The sensitivity of the method for determining bacteria of the Dickeya solani species was assessed using a set of primers FIP, BIP, F3, B3 and plasmid pAL2-T containing a section of the nucleotide sequence of the infB gene from Dickeya solani, in which annealing sites complementary to FIP, BIP, F3 and B3 primers are located. For the FIP primer, the annealing sites are F1 and F2c (Figure 3), for the primer BIP-B1 and B2c, for the primer F3-F3c, and for the primer B3-B3c. The nucleotide sequence (SEQ ID NO: 11), which is a region of the infB gene (SEQ ID NO: 1) with the annealing sites of the primers FIP, BIP, F3 and B3, was cloned into the plasmid pAL2-T (Eurogen; catalog number TA002) from genome of the Dickeya solani DSO1001 strain (the strain is stored in the microorganism culture collection of the Laboratory of Molecular Bioengineering of the Institute of Bioorganic Chemistry named after Academicians M.M. Shemyakin and Yu.A. Ovchinnikov of the Russian Academy of Sciences, Moscow, Russian Federation). The identity of the cloned fragment corresponding to the site in the infB gene was confirmed by sequencing and comparison with the nucleotide sequence of the infB gene (SEQ ID NO: 1) from the entire genome of the Dickeya solani IPO2222 strain deposited in the GenBank database (identifier: NZ_CP015137).

Результаты электрофореза показывают (Фигура 2), что предложенный способ, в котором используются набор олигонуклеотидных праймеров FIP (SEQ ID NO: 7), BIP (SEQ ID NO: 8), F3 (SEQ ID NO: 9) и В3 (SEQ ID NO: 10) и ген-мишень infB, позволяет определить наличие в биологических образцах требуемой бактерии вида Dickeya solani фемтограммовые количества ДНК (1×10^-15 г/мкл), что в пересчете на количество клеток составляет около 250 клеток на одну реакцию амплификации. Количественные данные получены с помощью пересчета данных о концентрации вносимой в реакцию плазмидной ДНК со вставкой сайтов отжига разработанных праймеров и данных о размере генома Dickeya solani IPO2222. При этом увеличение продолжительности реакции амплификации может повысить чувствительность предложенного способа.The results of electrophoresis show (Figure 2) that the proposed method, which uses a set of oligonucleotide primers FIP (SEQ ID NO: 7), BIP (SEQ ID NO: 8), F3 (SEQ ID NO: 9) and B3 (SEQ ID NO: : 10) and the infB target gene, it is possible to determine the presence of femtogram amounts of DNA (1 × 10 ^-15 g / μl) in biological samples of the required Dickeya solani species, which, in terms of the number of cells, is about 250 cells per amplification reaction. Quantitative data were obtained by recalculating data on the concentration of plasmid DNA introduced into the reaction with the insertion of annealing sites of the developed primers and data on the size of the Dickeya solani IPO2222 genome. Moreover, an increase in the duration of the amplification reaction can increase the sensitivity of the proposed method.

Хотя указанное изобретение описано в деталях со ссылкой на наилучшие способы осуществления изобретения, для специалиста в данной области техники очевидно, что могут быть совершены различные изменения и произведены эквивалентные замены, и такие изменения и замены не выходят за рамки настоящего изобретения.Although the invention has been described in detail with reference to the best modes of carrying out the invention, it will be apparent to those skilled in the art that various changes can be made and equivalent replacements made, and such changes and replacements are not outside the scope of the present invention.

Claims

1. The method of determining bacteria of the species Dickeya solani by loop isothermal amplification (LAMP), characterized in that in the amplification reaction of a portion of the target gene sequence using a set of oligonucleotide primers, including:

(A) a FIP primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7, or a homologue thereof,

(B) a BIP primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8, or a homologue thereof,

(C) a primer F3 having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9, or a homologue thereof,

(D) primer B3 having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10, or a homologue thereof;

moreover, these homologues of the primers FIP, BIP, F3 and B3 have a homology of not less than 95% compared with the corresponding nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 7, 8, 9 and 10, provided that such homologous primers can hybridize with the target infB gene encoding translation initiation factor IF-2.

2. The method according to p. 1, characterized in that the infB gene is encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or a homologous nucleotide sequence provided that such a homologous nucleotide sequence can hybridize with the indicated primers according to p. 1.

3. The method according to p. 1, characterized in that the specified method determines the bacterium of the species Dickeya solani in samples of potato, soil or water, or a combination thereof.

4. A set of primers for the determination of bacteria of the species Dickeya solani by loop isothermal amplification (LAMP), containing:

(E) a FIP primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7, or a homologue thereof,

(F) a BIP primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8, or a homologue thereof,

(G) a primer F3 having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9, or a homologue thereof,

(H) a B3 primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10, or a homologue thereof;

5. The primer set according to claim 4, characterized in that said homologous primers can hybridize with the target infB gene encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.

6. The primer set according to claim 4, characterized in that said set further comprises an infB target gene encoding an IF-2 translation initiation factor.

7. The primer set according to claim 6, characterized in that the infB gene is encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or a nucleotide sequence homologous to it, provided that such a homologous nucleotide sequence can hybridize with the indicated primers according to claim 4.

8. A set of primers according to any one of paragraphs. 4-7, characterized in that the specified set of primers is a diagnostic set of reagents for the analysis of biological samples of potatoes, soil or water, or a combination thereof.